私達はモデルマメ科植物ミヤコグサを用いてアクティベーションタギングを行い、共生窒素固定根粒形成に関わる新たな遺伝子を単離しようと試みた。根粒形成ができないcastor変異体を材料にして毛状根形質転換法により6回縦列35Sエンハンサーをランダムに導入したアクティベーションタグラインを約4,000ライン作成し、それらの根粒形成能を調べた。その結果、根粒を形成した形質転換体が8個体あり、このうち1つの毛状根にタグが挿入されていた。TAIR-PCRおよびinverse PCRを用いてタグ近傍配列を単離・解析したところ、転写因子をコードしていると思われる配列が見出された。このDNA断片をプローブにしてcDNAライブラリーのスクリーニングを行った結果、転写因子の保存配列を含む全長クローンを得た。この遺伝子を暫定的にTOPAZ (tag-associated object in putative activation zone)と名付けた。TOPAZプロモーター-GUSコンストラクトを導入した根は、根粒基部、側根基部および根端において高いプロモーター活性を示した。これによりTOPAZが根粒形成に関わる遺伝子であることが示唆された。TOPAZ機能を確認するため、castor変異体に35S::TOPAZを導入して過剰発現させることを試みたが、根粒形成は起こらなかった。そこで、RNAi法によって野生株のTOPAZ遺伝子をノックダウンし、根粒形成への影響を検討することを計画している。

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LjnsRING（Lotus japonicus nodule-specific RING finger gene） は根粒形成過程に伴って発現増幅されていることがマクロアレイ解析で確認されている。このことから、根粒形成や共生窒素固定に関係した役割を有することが予想された。LjnsRING はRING-H2fingerモチーフをもち、イビキチンリガーゼと推定され、ホモロジー検索の結果、シロイヌナズナ、イネにもオルソログが見出された。加えて、ゲノミックサザンブロットによって、他のマメ科植物にも広く保存されていることが示唆された。詳細な発現解析によって、LjnsRINGは根粒菌感染後、4日目から発現が増幅し、根粒の感染細胞に局在していることが明らかとなった。LjnsRINGの機能を推測するために、毛状根形質転換系を利用し、LjnsRING遺伝子に対するRNAサイレンシングを試みた。LjnsRINGのdsRNAを発現させた毛状根では根粒菌の感染頻度が著しく減少し、根粒をほとんど着生しなかった。同時に落葉、根の伸長阻害、側根形成の増大が確認された。LjnsRINGの発現は根粒特異的であるが、発現抑制の影響は根粒形成だけではなく、根の成長と地上部の生育にも及んでいることから、LjnsRINGは根粒形成以外にも役割を有すると予想された。

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Nitrogen-fixing symbiosis between legume plants and rhizobia is established on complex interactions between two symbiotic partners. To identify the host legume genes that play crucial roles in such interactions that are responsible in establishment of functional symbiosis, we isolated a Fix^- mutant Ljsym105 from a model legume Lotus japonicus MG-20 regenerated from hypocotyl-derived calli after extensive in vitro culture. The Ljsym105 plants displayed nitrogen deficiency symptoms under symbiotic condition and formed small pale-pink nodules with acetylene reduction activity less than half of the wild type. Microscopic observations revealed that the Ljsym105 nodule infected cells underwent deterioration and/or degradation of the symbiosomes prematurely as well as disintegration of the whole infected cell cytoplasm. Genetic analysis revealed that Ljsym105 was monogenic and recessive, and genetic linkage analysis using DNA markers indicated that Ljsym105 locates on upper portion of chromosome 4 of Lotus japonicus. Map based cloning of Ljsym105 is in progress.

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Laser Microdissection（LMD）は、組織切片から目的の組織や細胞を単離するのに非常に有効な技術である。これまで、網羅的な遺伝子発現解析には、葉や根といった器官全体を用いることが多かったため、組織間での遺伝子発現量の差を比較することが困難であった。LMDは微細な組織のみを純粋に単離することができる方法であるため、マイクロアレイ解析を組み合わせることによって、形態的・生理的変化が生じた特定の組織や細胞における遺伝子発現量の変化を解析するのに重要なツールであると考えられる。
冠水条件下で発芽したイネは、シュノーケルの役割を果たす器官である子葉鞘を特異的に伸長させる。本研究では、発芽しても子葉鞘が伸長しない変異体であるreduced adh activity（rad）変異体の子葉鞘を用いて、子葉鞘の伸長に関わる因子を同定することを試みた。LMDを用いることで、吸水後2日目の野生型及び変異体の子葉鞘を純粋に単離することに成功した。そこから抽出したRNAを用いて網羅的な遺伝子発現解析を行ったところ、野生型と比較して、発現量が3倍以上に増加していた遺伝子を40個、発現量が3倍以下に減少していた遺伝子を25個見つけ出すことができた。

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植物のmitogen-activated protein kinase (MAPK)の中には、様々なストレスによって活性化され、そのシグナルを下流に伝える重要な分子が存在することが広く知られている。今回、恒常的な全身獲得抵抗性を示し、ジャスモン酸シグナル非感受性になるArabidopsis mpk4 mutantの原因遺伝子AtMPK4のタバコホモログ、NtMPK4を単離し、タバコにおける機能を解析した。
NtMPK4の発現を抑制した形質転換タバコはmpk4と同様に矮性の表現型を示し、この植物中では塩基性PR-1遺伝子の傷害応答性が抑制されていた。次にNtMPK4のエチレンやジャスモン酸シグナルへの関与を明らかにするために、両シグナルが拮抗的に働くといわれるオゾンを形質転換タバコに暴露した。エチレンシグナルはオゾン暴露による細胞死を誘導し、ジャスモン酸シグナルは逆にこの細胞死を抑制することが知られている。オゾン暴露の結果、NtMPK4抑制タバコはオゾンに対してより感受性になった。この感受性の原因を解析したところ、気孔の開閉が異常であることが明らかとなった。さらに、この抑制個体のアブシジン酸処理に対する気孔の閉鎖は正常であったことから、NtMKP4はアブシジン酸非依存的な気孔の開閉に関与していることが示唆された。

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高等植物の遺伝子変異の特性を調べるために、in vivoにおける変異をポジティブディテクションできる変異解析システムを開発した。その概要は次の通りである。変異の標的遺伝子として大腸菌由来のrpsL遺伝子を植物に導入する。この形質転換植物あるいはその種子を変異原処理して発芽生育させ、プラスミドレスキュー法によりrpsL遺伝子を回収する。このプラスミドをストレプトマイシン(Sm)耐性の大腸菌に導入し、Smを含むLB培地で変異の選別を行う。Sm感受性はSm耐性に対して優性であるので、変異rpsL遺伝子が導入された大腸菌だけがSm存在下でもコロニーを形成することができる。シロイヌナズナで本システムの実用性を検討した。rpsL遺伝子を導入するために、植物形質転換用のベクターpCGN5138に組み込んだ。floral dip法によりrpsL遺伝子導入シロイヌナズナの形質転換体を作製した。変異解析の実効性を実際に確認するため、形質転換体からプラスミドレスキューでrpsL遺伝子を回収しSm培地で変異クローンの検出を試みた。Sm耐性コロニーの形成が認められ、塩基配列解析の結果それらから抽出したプラスミドのrpsL遺伝子に変異が確認できた。よって、本システムは高等植物の遺伝子変異解析に有効であることが示された。本システムを用いてEMS誘導変異を解析したところ、塩基置換型変異などが見い出された。

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Through the analysis of mutants and gene expression studies, we are beginning to understand proteins involved during acclimation to adverse environmental conditions. In addition, there are many biological signalling events occurring that do not involve a change in protein level, but rather protein activity. It is generally difficult to study such signalling events in plants and there is limited information on upstream signalling events during acclimation responses.

We are developing technology and novel indicators that will allow real-time imaging of such signalling events (calcium changes, phosphorylation events) at high resolution in living tissues as they actually respond to altered environmental conditions. This will allow us to determine the temporal and spatial interactions between specific signalling events. Combined with extensive genetic tools available, we aim to understand which specific signalling events are involved and how they contribute to respective acclimation responses.

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Rad54, one of the Rad52 epistasis group proteins involving in homologous recombination (HR), is a member of the SNF2/SWI2 superfamily of chromatin remodeling factors defined by the presence of conserved helicase motifs. Rad54 is thought to exert its stimulatory effect on the DNA pairing activity of Rad51 by binding to the Rad51 - single-strand DNA nucleoprotein filament. Recent studies with yeast and vertebrates, Rad54 can translocate on DNA, generate super-helical torsion, and furthermore enhance the accessibility to nucleosomal DNA.
We identified a sequence that resembles known RAD54 genes in the Arabidopsis genome, and cloned the corresponding cDNA (AtRAD54). According to analyses of the expression pattern, the protein-protein interaction, and a T-DNA insertion mutant, AtRAD54 is a counterpart gene of RAD54 in Arabidopsis, and is important for HR repair in plants. Currently, we are analyzing AtRAD54 over-expressing Arabidopsis lines to test whether the over-expressed AtRad54 enhances HR.

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シアノバクテリア Synechococus sp. PCC 7942株( 以下7942株 )には、3種の dnaKパラログ（ dnaK1, K2, K3）及び4種のdnaJ パラログ（ dnaJ1, J2, J3, J4 ）が同定されている。当研究室はこれまでに、DnaK2, K3 およびDnaJ1, J2,J3 が生育に必須であり、DnaK3, DnaJ3 がチラコイド膜上に比較的多く表在していることを明らかにしている。また前回の本大会において dnaK2 が一般的なストレスに応答することを報告した。本研究では7942株における各DnaK, DnaJの特異的機能を探ることを目的とし解析を行った。
初めに、熱及び強光ストレスに対する各 dnaJ の転写産物をRT-PCRにより解析したところ、各ストレスにおいて dnaJ2 が顕著に応答した。この結果から、各DnaJはそれぞれ異なる発現調節を受け、通常時及びストレス時において使い分けがされていることが示唆された。
また、各DnaK, DnaJはその組み合わせにより特異的な機能を分担している可能性を考え、これらのパートナーシップを解析した。基質に変性させたルシフェラーゼを用い、そのリフォールディング活性を指標として、3種のDnaKと4種のDnaJの異なる組み合わせによるシャペロン活性を比較検討する。

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シアノバクテリア Synechococcus sp. PCC7942株には分子シャペロンDnaJパラログが4つ存在している。我々はその内のDnaJ3蛋白質が必須遺伝子であること、DnaK3とともにチラコイド膜画分に多く存在すること、dnaJ3 遺伝子の温度感受性変異をsyc1092 の欠損変異が抑圧するということを明らかにしている。Syc1092蛋白質はシアノバクテリアや高等植物に高度に保存された遺伝子であるが機能未知であったため、その機能解析を目的として酵母2ハイブリッド法を用いたSyc1092と相互作用する蛋白質のスクリーニングを行った。すると、RNAPのβ’サブユニットであるRpoC2と特異的に相互作用することを見出した。また、野生株とsyc1092 過剰発現株を用いて、熱による転写誘導が知られているhspAの転写産物をRT-PCRにより解析した。すると、syc1092 過剰発現株においてhspA のmRNAレベルが野生株に対して低下し、Syc1092がhspA の熱ストレス応答に対して負に作用することが示唆された。syc1092 過剰発現株は生育が温度感受性を示すため、この結果は非常に興味深い。また、Syc1092の二次構造予測において大腸菌の転写因子との類似性が見出された。このことからもSyc1092が光合成生物特異的な転写制御因子である可能性を考え、転写に関わる役割を解析中である。

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HtpGは原核生物におけるHsp90のホモログである。Hsp90は真核生物においてシグナル伝達や遺伝子の変異の潜在化など重要な働きを担っていることが知られている。昨年の本大会において、我々はシアノバクテリアSynechococcus sp. PCC7942のHtpGタンパク質がHemE (ウロポルフィリノーゲンデカルボキシラーゼ) と特異的に相互作用することを報告した。ポルフィリン生合成酵素であるHemEはバクテリアから高等真核生物まで広く保存されており、特にシアノバクテリアではヘム、クロロフィル合成経路とビタミンB12合成経路の分岐点にあたる反応を触媒する重要な鍵酵素である。HtpGによるHemEの酵素活性への影響を調べるため、HemEの基質であるウロポルフィリノーゲンに野生株、htpG破壊株、htpG過剰発現株の細胞抽出液を添加して、生成物であるcoproporphyrinの量を比較した。、その結果、HemE活性はhtpG破壊株で増加し、htpG過剰発現株では減少した。このことからHtpGはHemE活性に対して負に作用することが示唆された。またhtpG過剰発現株では誘導12時間後から生育が阻害された。大腸菌や枯草菌ではこのような報告はなく、HtpGはシアノバクテリアにおいて重要な機能を持つことが考えられる。HemEとの関連も含めて考察したい。

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真核生物においてHsp90はシグナル伝達などの重要な機能を担っているが、原核生物における機能についてはほとんど明らかになっていない。
我々は、シアノバクテリアSynechococcus sp. PCC 7942株において、HtpG（原核生物におけるHsp90のホモログ）が、高温、強光、酸化などのストレスに重要な役割を果たすこと、さらにhtpG破壊株のフィコシアニン量やクロロフィル量が野生株に比べ減少していることを見いだしてきた。
昨年の本大会で我々は、HtpGのN末側ドメイン（ATPaseドメイン）をbaitとして酵母2ハイブリッドスクリーニングを行った結果、uroporphyrinogen decarboxylase（HemE）が特異的に相互作用することを報告した。HemEは原核生物から高等真核生物まで保存されており、ヘムやクロロフィル生合成経路に関与する必須酵素である。
我々は、このHtpGとHemEとの相互作用をin vitroで解析するため、HtpG及びHemEにHisタグを付加し、大腸菌で過剰発現するようなコンストラクトを作製し、Niカラムにより精製した。現在これら精製したタンパク質を用いて、プルダウン法等によるタンパク質間相互作用の解析、native-PAGEやゲルろ過法等による複合体の検出、及びHtpGがHemEの酵素活性に与える影響等について解析中である。

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オオムギ低温応答性遺伝子blt101 (GenBank Z25537)のイネホモログ遺伝子OsMLT1 (AY554051)を、発芽後7日の若いイネの乾燥ストレス・ディファレンシャルクローンの中に見い出した。OsMLT1cDNAは547bpのORFをもち、55個のアミノ酸残基をコードし、推定分子量が6.0kDaで推定等電点が6.9であった。また、OsMLT1の推定アミノ酸配列は、オオムギblt101遺伝子のそれと約54%の相同性を示した。遺伝子データベースの相同性検索の結果、イネには複数のオオムギblt101遺伝子のホモログ遺伝子が存在することが分かった。ゲノムDNAをBamHI, BglII, EcoRI, HindIIIで消化し、OsMLT1の3-非転写領域の塩基配列から作製したプローブを用いてサザン解析を行った。その結果、いずれのレーンにも単一のバンドが検出され、プローブの遺伝子特異性が証明された。この遺伝子特異的プローブを用いて、乾燥ストレス・ディファレンシャルスクリーニングで得られたOsMLT1の環境ストレス応答性を調べた。予想されるようにOsMLT1は乾燥ストレスによって強く発現することが確認された。さらに低温応答性を詳しく調べると、OsMLT1は5℃の低い低温には全く応答せず、12℃の穏やかな低温にのみ強く応答するという新しい知見が得られた。

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shaggy-like kinaseは高等動植物から酵母まで保存されている細胞内シグナル伝達に関わるタンパク質リン酸化酵素であり、植物では花の形態形成、植物ホルモンブラシノステロイドのシグナル伝達に関与することが知られている。
我々は、マクロアレイ法により低温に曝したコムギクラウン組織中で遺伝子の変動を調べたところ、シロイヌナズナの shaggy-like kinaseである AtSK1, AtSK2, AtSK5と高い相同性を示す新規shaggy-like kinase遺伝子(TaSK5)の発現量が増加することを見いだした。ノーザン解析の結果、TaSK5は低温及び塩処理により顕著に誘導される一方、ABA及び乾燥処理における誘導は僅少であった。TaSK5の機能を明らかにするため、塩及び低温に対し感受性を示す出芽酵母のshaggy-like kinase破壊株(Δmck1)を用い相補試験を行ったところ、塩及び低温耐性が復帰した。また、TaSK5を過剰に発現させたシロイヌナズナを作出した。TaSK過剰発現株は、通常の条件下では野生株と顕著な表現型の差はみられなかったが、乾燥に対して耐性を獲得した。しかし、予想に反して塩及び低温耐性においては顕著な差はみられなかった。マイクロアレイ解析により、TaSK5過剰発現株では非生物ストレスに応答する遺伝子が構成的に発現していることが明らかとなった。

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秋季の低温を認識し、耐凍性を獲得する低温馴化には，生体膜の低温適応が必要であるが，その詳細な分子機構は不明である．生体膜の主要なリン脂質，Phosphatidylethanolamine(PE)及びPhosphatidylcholine(PC)は三段階の反応によって生合成される．我々は，現在までに，コムギにおいて低温馴化によりPEが増加すること，またPE生合成の第二段階酵素遺伝子の発現が低温で強く誘導されることを見いだしている．本研究では，コムギよりPE/PC生合成の最終段階に関わる2つのAAPT遺伝子TaAAPT1,TaAAPT2を単離した．AAPTはDAGとCDP-ethanolamine (eth)/choline(cho)からPE/PCを合成する酵素である．両遺伝子に相当する出芽酵母AAPT遺伝子の二重酵母変異株を作製し，TaAAPT1，2をそれぞれ導入したところ，低温感受性が相補された．次にTaAAPT1，2を導入した変異株より膜画分を調製し，酵素活性を測定した．その結果，TaAAPT1は主にCDP-ethを基質とし，TaAAPT2は主にCDP-choを基質とした．RealTime-PCRによる発現解析を行ったところ，TaAAPT1の発現は低温により誘導され，TaAAPT2は，誘導されなかった．これらの結果から，低温馴化時にTaAAPT1が関与するPE生合成経路が特異的に活性化されることが示唆された．さらにGFPによる細胞内局在解析の結果，TaAAPT1，2ともに小胞体とゴルジ体に局在することが明らかになった．この結果から，PE/PC生合成の最終段階は，小胞体とゴルジ体でおこることが示された.

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トレハロースは酵母や昆虫等で多量に蓄積され，貯蔵糖及び乾燥ストレス保護物質として機能する．植物では，トレハロースは極微量でありこれらとは異なる機能を持つと考えられる．トレハロース生合成は，TPS(trehalose-6-phosphate synthase)，TPP(trehalose-6-phosphate phosphatase)による二段階の反応で行われる．我々はイネよりトレハロース生合成遺伝子OsTPP1，OsTPP2を単離し，その発現が低温処理(12°C)によって一過的に誘導されることを示した．OsTPP1mRNA の蓄積に呼応して，細胞内総 TPP 活性及びトレハロース蓄積量が一過的に上昇することも明らかにしている(Pramanik, M.H.R. and Imai Plant Mol Biol. 58: 751-762, 2005)．また，大腸菌内より組換えOsTPP1，OsTPP2タンパク質を精製しその酵素特性を明らかにした．OsTPP1，OsTPP2は両酵素とも微生物由来のTPPと比べ，トレハロース-6-リン酸に対し基質特異性が高く，著しく低いK_m値を示した．また，熱に対し不安定であった．これらの酵素特性の違いは，微生物と植物間でのトレハロースの機能分化を示唆している．現在，OsTPP1のイネTOS17挿入変異株及び過剰発現体の解析を行っており，その結果についても併せて報告する．

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大腸菌の低温馴化においては，RNAシャペロンとして機能する一群の低温ショックタンパク質（CSPs）が蓄積する．我々は，コムギの低温馴化で高度に蓄積するタンパク質WCSP1を同定した．WCSP1は N末端側にCSPsと相同な低温ショックドメイン（cold shock domain ; CSD）をもち，C末端側のGlyリッチ（GR），CCHCジンクフィンガー（ZF）モチーフから構成される（CSD-GR/ZF）．我々は，WCSP1とGSTの融合タンパク質が核酸結合活性を持つことを報告したが，今回はWCSP1のみでの核酸結合活性を検討した．その結果，組換えWCSP1タンパク質はss/dsDNAおよびmRNAに対して結合活性を示した．さらに， WCSP1のC末端側欠失変異体を作製し，核酸結合性を検討したところ，CSDのみをもつタンパク質ではssDNA/RNAに対する結合活性が消失した．しかし，CSDと一番目のGRのみをもつタンパク質はssDNA/RNA結合活性を保持していた．また，我々は精製の過程でWCSP1が煮沸後も可溶性を維持することを見出した．CDスペクトル測定の結果，WCSP1は煮沸処理でいったんアンフォールドするが，続く冷却処理で元の構造に戻ることが分かった．またこの時，WCSP1はその核酸結合活性を維持していた．さらに，CSDのみをもつタンパク質でも同様に煮沸後，可溶性であった．以上の結果より， WCSP1の一番目のGRは核酸結合活性には必要であるものの，煮沸後のリフォールディングには必要でないことが明らかとなった．

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低温馴化過程の細胞膜タンパク質の機能を研究する目的で、低温馴化した冬コムギcDNAライブラリーから疎水性の高いタンパク質をコードする遺伝子wpi6のcDNAを単離した。wpi6遺伝子は推定上の2つの膜貫通ドメインを持つ5.9kDaのポリペプチドをコードしており、そのアミノ酸配列は植物及び酵母のBLT101ファミリータンパク質と極めて近かった。wpi6遺伝子の発現は低温処理（4℃ ）した冬コムギ及び春コムギの根とシュートで強く誘導された。オオムギ低温誘導性遺伝子blt101とは異なり、wpi6遺伝子は乾燥、NaCl、及び外からのABA投与によっても冬コムギの根とシュートで発現が誘導された。タマネギの皮層細胞においてwpi6とGFPの融合遺伝子を発現させたとき、WPI6::GFPタンパク質はタマネギ皮層細胞の細胞膜に局在することが明らかになった。これらの結果はWPI6タンパク質がコムギの低温馴化過程で細胞膜の機能を維持する何らかの保護的な役割を担っていること示唆した。wpi6とblt101のプロモーター領域をIPCRにより単離して配列を比較したところ、両者は比較的保存されていたが、blt101プロモーターのみにトランスポゾン様配列Xumetが挿入されていることを見いだした。このXumetの特徴付けを試みたのでその結果についても併せて報告する。

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大腸菌の低温馴化においては，RNAシャペロンとして機能する低温ショックタンパク質（CSPs）が蓄積する．植物の低温ショックドメイン（cold shock domain ; CSD）タンパク質は細菌のCSPsと高度に保存されたCSDをもつ．我々は，コムギの低温ショックタンパク質WCSP1を同定し，それがRNAシャペロン活性を持つことを報告した．今回，我々はシロイヌナズナの4つのCSDタンパク質のうち，AtCSP3についての機能解析の結果を報告する．まず，組換えAtCSP3を用いて，RNAシャペロン活性に必要な核酸結合性を検討した．その結果，AtCSP3はss/dsDNAに対して結合活性を示した．また，RT-PCRによりストレス応答性発現を検討したところ，AtCSP3は低温処理（4℃）により誘導されることが分かった．Promoter-GUS融合遺伝子の発現解析により，AtCSP3は葯，幼苗の成長点および根の先端組織で特異的に発現することが明らかとなった．AtCSP3ノックアウト変異株では，低温馴化処理にかかわらず，野生株と比較して耐凍性が低下していた．一方，AtCSP3過剰発現体では，野生株と比較して耐凍性が向上していた．これらの結果から，AtCSP3は低温馴化過程で誘導され，耐凍性獲得に必要であることが明らかとなった．

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Bromegrass is an extremely cold hardy perrenial grass and its suspension culture provides a unique system where freezing tolerance can be induced by two different stimuli, cold and ABA. The latter process has an optimum temperature at 25C or over. The objective is to characterize each process and find common phenomena. We analyzed gene expression profiles during these two freezing tolerance induction processes (4C vs. ABA at 25C) using rice micro-arrays. We focused on genes expressed after 7 days of treatment. Cold induced many genes involved in protein synthesis, RNA functioning and protein degradation while ABA induced many stress-related genes and genes involved in storage compounds. These processes involve expression of fairly different sets of genes but have some common processes such as induction of anti-oxidating enzymes and cell wall alterations. Plasma membrane ATPase was up-regulated by cold (in agreement of physiological studies) and ABA.

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植物では氷点に近い低温に一定期間さらされると耐凍性が上昇する現象が知られており、低温馴化と呼ばれている。低温馴化は主として寒冷な地域に分布する陸上植物で知られている。陸上植物の祖先にあたる緑藻の中でもシャジクモ綱は陸上植物により近縁であり、陸上植物の低温馴化の原型となる機構を持つと考えられる。そこで本研究ではシャジクモ綱に属し寒冷な地域に広く分布するKlebsormidium flaccidumの低温馴化過程での耐凍性、細胞構造および適合溶質組成の変化を調べた。その結果、18°Cで培養したK. flaccidumを2°Cで低温馴化させると7日間以内に耐凍性が有意に上昇した。未馴化細胞では-10°Cで生存率は10%以下であったが、7日間の低温馴化で80%以上に生存率が上がった。また、その過程で細胞構造を観察すると葉緑体内のデンプン粒の大きさと数が急激に増加し、液胞の小型化や細胞壁の肥厚などの変化が見られた。さらに低温馴化過程では細胞内浸透濃度の上昇も見られ、適合溶質であるSucroseを含めたいくつかの可溶性糖やグルタミンやアラニンなどのアミノ酸の蓄積が見られた。これら細胞構造および適合溶質組成の変化はK. flaccidumの低温馴化過程での耐凍性上昇に寄与していることが予想される。

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アフリカスミレ（セントポーリア）の葉は、急激な温度降下に対応できずに傷害を生じる。傷害を受けた葉は褐色に変化し、光照射下で数日後に白化することが知られている。この傷害は、葉温が25℃から10℃に降下した場合ばかりでなく、35℃から20℃に降下したときにも生じた。葉温を穏やかに5℃まで降下させた場合では、傷害は生じなかった。傷害を受けた葉の柵状組織は収縮し、大きく損傷していた。一方、表皮細胞と海綿状組織は全く損傷していなかった。pH感受性の蛍光色素（BCECF-AM）で葉肉細胞を染色して温度降下処理を施すと、処理の間に柵状組織の細胞質pHが低下していることが明らかになった。このpH低下は、表皮細胞、海綿状組織では観察されなかった。柵状組織に含まれる葉緑体のクロロフィル蛍光は温度降下処理後も引き続き消光し、光化学系ΙΙの量子収率は温度降下から数分以内に大きく減少した。一方、葉から単離した無傷葉緑体では、温度降下によるクロロフィル蛍光の消光は観察されなかった。これらの結果は、温度降下に誘起されるセントポーリア葉の傷害が柵状組織の液胞膜の崩壊に起因し、液胞内容物の流出が他のオルガネラの損傷を引き起こす誘起機構を示唆している。

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潮間帯などの環境中の塩濃度変化が激しい場所に生息するヒラアオノリ(Enteromorpha compressa)は、細胞内に適合溶質としてDMSP(dimethylsulfoniopropionate)を蓄積する。DMSPは多くの海産性藻類、一部の高等植物に蓄積され、メチオニンを直接の前駆体として合成されることが知られる適合溶質である。本研究は、ヒラアオノリにおけるDMSP生合成代謝調節機構を明らかにすることを目的とした。
ヒラアオノリに放射性同位体で標識されたメチオニン等の化合物を与え、各前駆体からのDMSP合成能の変化を検証するトレーサー実験から、高塩濃度環境下において、メチオニン供給量が細胞内DMSP量を制御する重要な調節因子であるという結果を得た。この結果を受け我々は「ヒラアオノリが高塩濃度環境へ馴化する際には、メチオニン合成系遺伝子の発現が誘導されDMSP蓄積量が増加する」という仮説を立てた。この仮説の真偽について検討するため、植物におけるメチオニン生合成の鍵酵素として知られるCGS（シスタチオニン-γ-シンターゼ）遺伝子、その他メチオニン生合成に関わる遺伝子群をヒラアオノリからRT-PCR法により単離し、その発現量と外界の塩濃度との相関関係について検証した。

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植物病原性微生物の一部は植物の根に感染して，地上部を萎凋させる場合がある．これは，その病原微生物が導管内に侵入して導管を閉塞させることにより，地上部への水分輸送を阻害するためと考えられている．ここで，ウリ類の根に感染する糸状菌 Phomopsis sclerotioides も宿主に萎凋症状を引き起こすことから，その発生メカニズムを解析した．本菌はキュウリ苗の根部組織内に菌糸を蔓延させたが，導管への侵入は認められなかった．そこで，キュウリ苗に本菌を接種して経時的に導管液量を測定したところ，接種21日後に萎凋症状を示した植物体では，無接種健全植物体と比較して導管液量が約1/10まで低下していた．また，萎凋症状を示していない接種植物体でも導管液量の低下が見られた．次に，1個体の健全植物に別個体の根部を接ぎ木して根部を2個持つ植物体を作成し，一方の根だけに接種して根部を別々のポットで管理した．接種根側では病原菌の侵入が認められたが，地上部の萎凋症状は見られなかった．これらのことから，本試験で地上部に認められた萎凋症状は感染した本菌が根部組織に障害を与え，導管液量を低下させることにより引き起こされていると考えられる．このことは本菌の感染により，宿主の根部組織において菌糸による導管閉塞以外の要因によって水分動態のかく乱が起きている可能性を示唆する

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根は重力屈性に加え、高水分側へと屈曲・伸長させる水分屈性を示す。本研究では、水分屈性において機能する細胞群とそこでの生体反応を同定することを目的として実験を行った。方法は、シロイヌナズナ根端にレーザー照射、および、重イオンビーム照射を行い、特定の数細胞を破壊し、それらの個体について重力屈性および水分屈性を確認することにより行った。まず、細胞そのものを破壊するレーザー照射をコルメラ細胞および、伸長領域に対して行った結果、重力屈性、水分屈性ともに顕著に低下し、また伸長領域に照射した個体では顕著な伸長量の低下も観察された。このことは、両細胞群の存在が両屈性に必須であることを示している。また、細胞を非破壊的に不活化する重イオンマイクロビームを伸長領域に照射したところ、レーザー照射と同様に伸長量および屈性能の低下が認められた。一方、重イオンマイクロビームをコルメラ細胞に照射したところ、両屈性において有意な伸長量、屈性能の低下は認められなかった。これらの結果は、水分屈性、重力屈性ともに、それらの発現過程でコルメラ細胞、伸長領域の細胞群が機能することを明確に示すとともに、伸長領域では新規の遺伝子発現が屈性発現に必要である一方、コルメラ細胞における生体反応には新規の遺伝子発現を伴わないことを示唆するものと考えられた。尚、本研究課題の一部は生研センター基礎研究推進事業により実施されたものである。

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低温及び乾燥環境下では、数種の代謝関連遺伝子が転写レベルで制御されていることが知られている。また、シロイヌナズナのDREB1A遺伝子は低温ストレス、DREB2A遺伝子は乾燥や塩ストレスによって発現が誘導される。この2つの転写因子をそれぞれ恒常的に過剰発現させた形質転換植物は、低温・乾燥・塩ストレスに対する耐性能が向上することが示されている。このため2つの転写因子が制御する下流遺伝子は、低温・乾燥・塩ストレスに対する耐性において重要な機能を果たしていると考えられた。
本研究では、低温及び乾燥環境下で発現誘導される遺伝子とDREB1A及びDREB2A過剰発現植物体で発現誘導されている遺伝子を22Kオリゴアレイを用いて比較解析した。さらに、代謝関連遺伝子に着目し、低温及び乾燥環境下でカギとなる代謝関連遺伝子を検討した。その結果、DREB1A及びDREB2A遺伝子は、いくつかの代謝関連遺伝子の発現制御に関わっていることが明らかになった。また、低温及び乾燥環境下で蓄積する代謝産物とDREB1A及びDREB2A過剰発現植物体内に蓄積する代謝産物をLC/MS、GC/MS、CE/MSを用いて検出し比較した。その結果、低温及び乾燥ストレス環境下で蓄積する代謝産物とDREB1AおよびDREB2A過剰発現植物体で蓄積する代謝産物には、それぞれ類似性があることが示された。これらの解析からDREB1AおよびDREB2A遺伝子が制御する下流遺伝子の機能およびストレス耐性の獲得機構について考察する。

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シロイヌナズナのDREB2Aタンパク質は、乾燥、塩ストレス応答に関与する転写因子であり、ストレス誘導性遺伝子のプロモーター領域に存在するDRE/CRT配列に特異的に結合する。しかし、DREB2Aをシロイヌナズナ中で過剰発現させてもターゲット遺伝子の発現はほとんど変化せず、DREB2Aタンパク質の活性化には翻訳後の修飾が必要であると考えられる。我々はこれまでにDREB2Aタンパク質の詳細なドメイン解析を行い、アミノ酸136-165の領域が活性を負に調節していること、この領域を削除することで恒常的活性型となる事を明らかにした。この活性型DREB2Aを、35Sプロモーターと結合して過剰発現させた形質転換シロイヌナズナの解析を行った。マイクロアレイ解析の結果この過剰発現植物では、LEAタンパク質遺伝子などの水ストレス耐性獲得に関与する多数の遺伝子の発現が野生型に比べ増加していた。また、数種の高温ストレス応答性の遺伝子についても発現の増加が見られた。DREB2Aの高温ストレス時における発現を確認したところ、37度処理により一過的に強い発現誘導を受ける事が明らかとなり、DREB2Aが高温ストレス耐性にも関与している事が示唆された。

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