We cloned a DREB2 homolog from maize, named ZmDREB2A, whose transcripts were accumulated by cold, dehydration, salt and high temperature stresses. Additionally, alternative splicing of ZmDREB2A was observed and quantitative real-time PCR revealed that the functional splicing form of ZmDREB2A transcript was more significantly accumulated under stress conditions. An enhanced drought stress tolerance was observed in 35S:ZmDREB2A and rd29A:ZmDREB2A plants. Twenty-two-thousand oligo microarray analyses of the 35S:ZmDREB2A plants revealed that in addition to genes encoding LEA proteins, some heat shock inducible genes were upregulated by ZmDREB2A. As expected, we found that the 35S:ZmDREB2A plants showed an improved thermotolerance compared with wild-type plants. In conclusion, ZmDREB2A plays an important role not only in water deficit response, but also involved in high temperature response in plant.

抄録全体を表示

アブシジン酸（ABA）は植物の乾燥ストレス応答や耐性の獲得に関わる重要な植物ホルモンである。これまで、乾燥ストレス下でABAが細胞内シグナル伝達や多くの遺伝子の発現誘導に重要な働きを行うことが報告されている。しかしながら、ABAが制御する代謝系に関しては、個別の研究のみで包括的な解析はあまり行われていない。そこで本研究では、乾燥ストレス下でABA合成が影響を及ぼす代謝物質のネットワークを明らかにすることを目的に、乾燥ストレス下でのABA合成を制御するシロイヌナズナNCED3の機能欠損変異体を用いて、トランスクリプトーム、メタボローム解析を行った。その結果、乾燥ストレス下で上昇する遺伝子の中、約50%の遺伝子がNCED3によって新規に合成されるABAの影響を受けていた。そして、それらのプロモーター配列上にはABA RESPONSIVE ELEMENT （ABRE）が高い確率で存在していた。またGC/MS・CE/MS解析の結果、乾燥ストレス下で増加するアミノ酸・中間代謝産物・糖の中、約90%の物質がABAの影響を受けていた。現在までに、プロリン代謝系、ポリアミン代謝系、分枝アミノ酸代謝系、リシン代謝系では遺伝子と代謝物質両方でABAによる影響を受けていることを明らかにした。今後はABA合成の影響を受ける代謝系と乾燥ストレス応答の関係をさらに追求していく予定である。

抄録全体を表示

AREB1は、シロイヌナズナの乾燥・塩応答性遺伝子RD29Bのプロモーター領域に存在するシス因子であるアブシジン酸(ABA)応答配列(ABRE)に結合するbZIP型の転写因子である。RD29B遺伝子の発現には、ABAによるAREB1遺伝子の転写誘導に加えてABA誘導性の転写後修飾が必要であることを報告した。本研究では、活性型AREB1発現植物を作製し、コントロール植物に比べてABA感受性および乾燥耐性が増加することを示した。また、マイクロアレイ解析により、ABA非存在下において8個の遺伝子の発現が顕著に誘導されていることを明らかにした。8個の下流遺伝子のうち4個はLEAタンパク質遺伝子であり、他の4個は制御関連遺伝子であった。これらの下流遺伝子はいずれもABAおよび乾燥誘導性遺伝子であり、そのプロモーター領域には2つ以上のABREが存在していた。一方、AREB1のloss-of-function変異体は、ABA非感受性を示した。また、AREB1のキメラリプレッサー発現植物はコントロール植物に比べて乾燥耐性が低下しており、活性型AREB1発現植物で発現レベルの増加がみられた8個の下流遺伝子のうち3個の遺伝子の発現をABA存在下でも顕著に抑制していた。さらに、乾燥ストレスあるいはABA処理により誘導されるAREB1遺伝子のスプライシングによる発現制御についてもあわせて報告する。

抄録全体を表示

シロイヌナズナにおける乾燥応答性遺伝子として単離されたRD20は、乾燥、高塩濃度、ABA処理などにより非常に強い発現応答性を示し、RD26 (NAC)やAREB1 (bZIP) など多くのストレス応答性転写因子の標的遺伝子としても同定されている。プロモーター解析の結果、RD20はストレスに応答して植物体全体で高発現すること、また、通常の生育条件下では花および鞘で強く発現することが明らかとなった。さらに、RD20のABA応答には、RD20プロモーター上のABRE配列を含む領域が必要であるが、乾燥ストレス応答には、さらに上流に存在する未知のシス配列が必要であることが示唆された。
RD20タンパク質はカルシウム結合ドメインであるEF-handモチーフを有しており、これまでにそのカルシウム結合性が報告されている。本研究では、RD20の詳細な機能解析を目的として、GFPおよびその誘導体との融合タンパクを用いた細胞内局在観察を行った結果、RD20は細胞質内の顆粒状構造に局在することを明らかにした。この構造物には、オイルボディを構成するオレオシンタンパク質が共局在することから、RD20はオイルボディに局在する可能性が示唆された。さらに、RD20 の過剰発現植物およびRNAiによる発現抑制植物体を作製した。各植物の表現型を報告すると共に、乾燥ストレスに応答における RD20 の機能について議論する。

抄録全体を表示

The ZFHD and NAC recognition sequences (ZFHDRS & NACRS) play an important role in the dehydration-inducible expression of the ERD1 gene. Using yeast one-hybrid system, we isolated a cDNA encoding ZFHD1 transcriptional activator that binds to the 62-bp promoter region of ERD1, which contains the ZFHDRS. Both in vitro and in vivo analyses confirmed specific binding of the ZFHD1 to ZFHDRS, and base substitution analyses identified several critical nucleotides, which may serve as a core-binding site. Expression of ZFHD1 was induced by drought, high salinity and ABA. Microarray analysis of transgenic plants overexpressing ZFHD1 revealed that several stress-inducible genes were upregulated in the transgenic plants, and the plants showed significantly increased drought stress tolerance. Moreover, cooverexpression of the ZFHD1 and NAC genes, whose products were shown to be able to interact using yeast two-hybrid system, is required for expression of the ERD1 gene in transgenic Arabidopsis plants under unstressed condition.

抄録全体を表示

陸生ラン藻のなかには、非常に強い乾燥耐性能をもったものがいる。本研究では、こうしたラン藻の乾燥耐性機構の解明を目指す。
前回の研究で、水生ラン藻であるAnabaena PCC 7120とその類縁株である乾燥耐性な陸生ラン藻Nostoc HK-01を材料として、乾燥過程におけるシグマ因子の遺伝子発現を比較検討した。その結果、Nostoc HK-01では、乾燥が始まると遺伝子発現が誘導される複数のシグマ因子が明らかになった。
今回は、乾燥応答型シグマ因子の制御遺伝子を把握するためにAnabaena PCC 7120を材料として、乾燥応答型シグマ因子の増産株を作製した。乾燥に応答するシグマ因子のうち、グループ3に属するシグマ因子について増産株を作製したところ、コントロール株と比べて乾燥耐性になっていることが明らかになった。またマイクロアレイを用いて、その遺伝子発現を解析した。

抄録全体を表示

RSOsPR10遺伝子(Root Specific Oryza sativa Pathogenesis-Related 10)は、イネの根において乾燥、塩処理により発現が誘導される遺伝子として単離された。この遺伝子は、既知のイネのストレス応答性タンパク質であるPBZ1遺伝子と高い相同性を示し、乾燥、塩、のほかプロベナゾール、ジャスモン酸処理でも、また、イネいもち病菌の感染によっても根に特異的に発現が誘導される（Hashimoto et al. 2004）。こうしたことからイネ根における防御反応に強く関与している可能性が考えられ、35Sプロモモーター::RSOsPR10を導入した形質転換体イネ(日本晴)の作成に取り組み、葉及び根でRSOsPR10 タンパク質を恒常的に発現するホモの個体を数系統得る事ができた。これら形質転換体の種子および幼植物体を用いてNaClや乾燥に対する耐性を観察したところ、野生型に比べて高い耐性を示す事がわかった。また、弱光下で生育させた時に、野生型に対して草丈、緑色などが増加する傾向が観察された。一方、アンチセンス遺伝子を導入した発現抑制体も同様に作成したが、第3葉が展開できず枯死する系統や、成体になった場合でも稔実率が野生型より低いものが多く見られた。これらの結果は、RSOsPR10遺伝子がイネにおける悪環境への耐性の付与に何らかの役割をしている事を示唆している。

抄録全体を表示

RSOsPR10(Root Specific Oryza sativa Pathogenesis-Related 10)は、イネの根におけるプロテオーム解析により乾燥、塩処理により発現が誘導されるタンパク質として検出された。RSOsPR10遺伝子は、既知のイネのストレス応答性タンパク質PBZ1と高い相同性を示した。RSOsPR10 mRNAは乾燥、塩、プロベナゾール、イネいもち病菌、ジャスモン酸（JA）によって根に特異的に発現が誘導されたが、低温、アブシジン酸、サリチル酸（SA）によっては増加しなかった（Hashimoto et al., PCP, 2004）。今回、RSOsPR10に対する特異的抗体を用いて、イネ幼植物体におけるRSOsPR10の誘導をタンパク質レベルで解析した。その結果、RSOsPR10タンパク質は塩、乾燥、傷害、JA処理により根のみで増加することが確認され、タンパク質レベルでも根特異的に発現することが明らかになった。また、このタンパク質はイネ貯蔵種子中にも大量に存在することも分かった。さらに、塩、傷害、JA処理による本タンパク質の発現誘導がSA処理によって抑制される傾向も観察され、現在検討中である。こうしたことから、塩および傷害処理におけるRSOsPR10の誘導はJAを介すること、さらにSAがJAに対して拮抗的に働いている可能性が示された。

抄録全体を表示

中国北部の塩類土壌地帯に自生するSuaeda salsaの2mM K－0,2,50,100,200mM NaClと2mM Na－0,2,50,100,200mM KClに対する生育反応ならびにNa・K吸収特性について検討した。2mM Na-2mM K区の地上部乾物重を100とした相対指数でNaClとKClに対する生育反応を評価すると、NaCl実験では50,100mMで最大の生育を示し、200mMでも2mMの生育とほぼ同等であったのに対し、KCl実験では2mMで最大の生育を示し、50,100mMでやや低下し200mMでは著しく低下した。各実験でのNa,K含有率を比較すると、NaCl濃度の上昇による地上部のNa含有率の上昇より、KCl濃度上昇による地上部のK含有率の方が高い結果となった。一方、NaCl濃度上昇による地上部K含有率の低下とKCl濃度上昇によるNa含有率の低下を比較すると、K含有率は緩やかに低下したのに対してNaは急激に低下した。さらに、培養液のNa/K比を植物体のNa/K比で割った両元素の根における選択性の比較よりNaよりKに対して選択性が強いことが示された。これらの結果から、高Na－低K濃度からなる塩類土壌に適応したS.salsaは、高NaCl低K濃度条件下でもKを十分に吸収するために、強いK吸収能を保持しており、K濃度が高い場合にはNaに対して強い選択性を発揮すると考えられた。

抄録全体を表示

不飽和脂肪酸は、生体膜の機能に影響を及ぼす要因の一つであり、塩ストレスによってその含有率が低下する。植物の耐塩性と不飽和脂肪酸との関連は、一部の植物でのみ示されており、その機構については不明な点が多い。そこで、本研究では、マメ科植物の中で耐塩性が高いエンドウと低いアズキを供試し、植物の耐塩性と不飽和脂肪酸組成との関係について検討した。
閉鎖系温室（25℃、自然光）にて、0mMから200mMのNaCl処理を施した各植物体について、地上部および根部の脂肪酸不飽和度（不飽和脂肪酸含有率／飽和脂肪酸含有率比）、およびNa含有率を測定した。その結果、地上部の脂肪酸不飽和度は、対照区ではエンドウ（3.5）>アズキ（2.6）、150mM NaCl処理区ではエンドウ（3.0）>アズキ（1.2）であり、耐塩性の低いアズキにおいてNaCl処理による脂肪酸不飽和度の低下が顕著であった。特にC18(3)脂肪酸含有率の低下、およびC16(0)脂肪酸含有率の増加が顕著であった。地上部のNa含有率（mg/g・D.W.）は、150mM NaCl処理区でエンドウ（36）<アズキ（68）であり、このようなNa含有率と脂肪酸不飽和度との間に認められる負の相関関係は根部においても同様に認められた。
以上のことから、脂肪酸不飽和度の保持がエンドウの耐塩性に関与すると考えられた。

抄録全体を表示

シロイヌナズナJB101株はω-3脂肪酸不飽和化酵素を欠損したfad7突然変異系統の一つである。この系統は、他のfad7系統とは異なり、塩ストレスに強いという特徴をもつ。JB101株に正常型FAD7遺伝子を導入し、fad7変異を相補させた形質転換植物においても、耐塩性を失わないことから、この株は、fad7変異とは異なる未同定の変異により耐塩性を獲得している可能性が考えられた。そこで、マップベースクローニングによってその原因遺伝子の同定を行ったところ、FAD7とは異なる遺伝子にナンセンス変異が存在することがわかった。遺伝学的相補性検定から、この遺伝子が原因遺伝子であることが確認された。新たに同定された遺伝子座をstm1(salt tolerant mutant1)と命名した。STM1遺伝子は、機能未知の膜貫通型Ankyrin repeat proteinをコードしている。プロモーターGUS実験およびRT-PCRによる発現解析から、STM1は根、葉、茎、花のいずれの器官においても発現していることがわかった。また、塩ストレス処理によりSTM1 mRNAの蓄積量が増加した。このことから、STM1の発現誘導が、塩ストレスによって植物が枯死に至るメカニズムに関与していると考えられる。GFP移送実験から、STM1タンパク質が細胞膜に局在することが示唆された。新規細胞膜タンパク質STM1の機能を解析することにより、植物の塩ストレス応答機構に関する新たな知見が得られると考えられる。

抄録全体を表示

植物が塩ストレスを受けると地上部の塩含量の増加に伴い障害発現が起こるが、塩含量と障害は一致しないことが示唆されている。組織の齢が若いと塩含量が高い場合においても障害程度が低いことから、障害程度は組織の齢に依存していることが考えられる。しかし、若い組織における塩ストレス障害抑制機構は調べられていない。塩ストレス障害には活性酸素障害が関与していることから、本研究ではイネ葉の基部・先端部の齢の違いを利用し、塩ストレス下における抗酸化酵素活性の変化を調べた。ストレス処理の間、齢の進んでいる先端部では塩含量の増加に伴い障害が発現し、CATおよびwater-water cycleの酵素活性の低下が観察された。一方、基部では塩含量が先端部と同程度に増加しても障害は観察されなかった。抗酸化酵素活性を測定したところ、塩処理開始直後から基部のみでCAT活性の増加が観察され、water-water cycleの酵素活性も維持されていた。これらの結果から、若い組織では塩ストレス下においても活性酸素を効率的に消去する耐塩性機構が備わっており、また、その機構は加齢に伴って失われていくことが示唆された。

抄録全体を表示

塩ストレス下では植物体内に過剰の塩分が蓄積されることによってその生産性が低下する。植物の耐塩性を向上させるためには細胞内へ過剰な塩分を流入させないことが重要である。これまでにアラビドプシスでは塩の輸送に関する遺伝子としてはhktやnhxなどの機能解析が行われてきた。本研究ではアラビドプシスのcation chloride cotransporter (AtCCC)遺伝子のT-DNA破壊株の表現型について調査した。ccc遺伝子は動物では複数コピー見られるがアラビドプシスでは1コピーのみであった。ccc遺伝子はアラビドプシスをK欠乏条件下で生育させると発現量が増加し、Kの添加によりその発現量は対照区と同程度にまで減少した。またNaClストレス処理を行うと、その発現量が減少したことからこれらのイオンの取り込みに機能しているのではないかと考えられた。そこで様々な濃度のKClやNaClストレス条件下での生育を調べたところ、K欠乏条件下でccc変異体では野生株と比較してクロロフィル含量の低下が著しかった。また高濃度のKClやNaCl処理下ではccc変異体では野生株よりも耐性を示し、生育への影響が少なかった。これらのことからccc遺伝子産物はアラビドプシスにおいて外部環境からのKやNaの取り込みに関与しているのでないかと推察された。

抄録全体を表示

硫黄は主要な一次代謝産物を構成する必須元素であり、植物は硫酸イオンを根から吸収することでその取り込みを行っている。根の表皮と皮層で発現する高親和型硫酸イオントランスポーターSULTR1;2は硫黄欠乏時に転写レベルで発現量を増加させることで硫酸イオンの吸収を促進させるが、転写因子の同定を始めとした詳細な分子機構の解明には至っていない。本研究はSULTR1;2遺伝子の発現量が変化した突然変異株を解析することで、制御に関わる因子の同定とその解析を目指している。
これまでにSULTR1;2遺伝子のプロモーター領域にGFP遺伝子を繋いだ融合遺伝子をもつトランスジェニック・シロイヌナズナが作出されている。この植物を硫黄欠乏条件下で生育させると根におけるGFP蛍光が増加する。今回、これを親株としてEMSにより突然誘起処理を行い、親株よりもさらに高いGFP蛍光を示す硫黄欠乏過剰応答株の分離を行った。得られた候補株の数株では実際にSULTR1;2遺伝子の発現量が増加していたことから、目的とする変異株であることが示唆された。

抄録全体を表示

植物が塩にさらされると、塩が体内に吸収・蓄積して障害が引き起こされる。したがって、植物の耐塩性強化のためには、塩輸送に関わる因子の探索および塩輸送機構の制御が重要である。我々はこれまでにシロイヌナズナ膜タンパク質RCI2Aの遺伝子破壊株を用いた解析を行い、RCI2Aが植物の塩の吸収抑制に関与することを見いだした。そこで本研究では、シロイヌナズナのRCI2A過剰発現株を作製し、塩の吸収および塩ストレス障害発現におけるRCI2Aの役割を調べた。
その結果、高NaCl処理下において、RCI2A過剰発現株のシュートでは野生株に比べてNa⁺の蓄積および生長の抑制が減少した。また、塩処理した植物ではクロロフィル含量の減少、MDA含量の増加およびH₂O₂生成の増加が見られたが、その程度はRCI2Aの過剰発現により緩和された。したがって、植物においてRCI2Aの高発現により塩ストレス下でのNa⁺の吸収が抑制された結果、Na⁺の増加に伴う生育の抑制や障害が緩和されたと考えられた。

抄録全体を表示

植物は、高塩濃度のもとにおかれると、生育が著しく阻害される。一方、植物は自身が持つ耐塩性機構によりその過酷な環境に抵抗する。これまでに、植物が塩に応答し合成する様々な物質が同定されている。そのうち、ポリアミン、コリン、適合溶質であるポリオール類やベタイン類など多くの物質がS-Adenosyl Methionine (SAM) より合成されることが知られており、このことからSAMの合成は植物の塩応答に重要であると考えられる。しかし、塩ストレス下の植物において、SAMの合成がどのように制御され、個体レベルの生育にどのような効果をもたらすのかははっきりしていない。
本研究では、シロイヌナズナにおいて、SAMの前駆物質であるMethionine (Met) が耐塩性にいかなる影響を及ぼすのかを調べた。塩処理下のシロイヌナズナでは、成長が抑制され、クロロフィル量が減少した。それらの障害は、MetのアナログであるEthionineを添加すると顕著になり、Metを添加すると緩和された。このことから、植物の個体レベルでの耐塩性におけるMetの重要性が示唆された。現在、塩ストレス下においてSAM合成系遺伝子群の発現が、どのように調節されているかを調査している。

抄録全体を表示

塩生植物Thellungiella halophilaはArabidopsisの近似種でありながら顕著な耐塩性および耐凍性を示す。これまでの研究により、T.halophilaはストレス非存在下においてArabidopsisで知られている様々な非生物ストレスおよび生物ストレス誘導性遺伝子を高発現させていることが明らかとなった。また我々のLC/MS, GC/MS, CE/MSを利用したメタボローム解析により、プロリンをはじめとする既知の適合溶質や抗酸化作用が知られる物質の他、様々な未同定物質がArabidopsisと比較して塩ストレス前後に蓄積していることが明らかとなった。
T.halophilaは中国の山東省で発見されて以来、世界各地でエコタイプが6種類発見されている。これらの塩ストレス耐性を確認した結果、全てのエコタイプが著しい耐塩性を示すことが明らかとなった。そこで今大会においては、これまでに発見されたT.halophilaの6つのエコタイプおよびArabidopsisを代表する2つのエコタイプをメタボローム解析することにより、T.halophilaとArabidopsisの代謝産物の違い、さらにはT.halophilaで共通してみられる耐塩性に重要な代謝産物を抽出することによりT.halophilaの耐塩性メカニズムの解明を試みている。

抄録全体を表示

アッケシソウ（Salicornia europaea L.）は、アカザ科に属する一年生草本で、塩湿地に生息する最も強力な耐塩性を有する塩生植物の1つである。本種は減少傾向にあり、その耐塩性機構については僅かな報告があるのみである。以前、本研究ではアッケシソウの耐塩性機構を遺伝子レベルで解析することを目的として、アッケシソウから抽出したmRNAを基にλZAPIIを用いてcDNAライブラリーを構築し、大腸菌を用いた機能スクリーニング法により、アッケシソウの耐塩性に関与する遺伝子の単離を試みた。その結果、シロイヌナズナのfasciclin-like arabinogalactan protein (FLA)とアミノ酸レベルで58%の相同性のある427アミノ酸からなるタンパク質をコードするcDNAが導入された大腸菌に耐塩性の向上が認められた。一般にFLAは、植物の細胞膜上や細胞壁に存在する糖タンパク質の一種であり、耐塩性機構との関連性は不明である。そこで本研究では、アッケシソウ由来のFLA (SeFLA) を過剰発現した酵母やタバコを作出し、それらの耐塩性に関わるキャラクタリゼーションを試みた。本研究の一部はNEDOからの平成15年度産業技術研究助成事業の助成で行われた。

抄録全体を表示

アイスプラント（Mesembryanthemum crystallinum）は、高塩濃度の土壌や乾燥地帯で生育するツルナ科の植物である。当研究室では大腸菌を用いた機能スクリーニング法で塩処理をしたアイスプラントの葉由来の cDNA ライブラリーから、大腸菌の耐塩性を向上させる因子として葉緑体型 RNA 結合タンパク質 (McRBP) をコードすると考えられる cDNA の単離に成功している。これまでに葉緑体型 RNA 結合タンパク質の発現と塩ストレス耐性の関連については全く明らかにされていない。一方、RBPと部分的な相同性を有するタンパク質であり、RNAシャペロンの一種として知られている大腸菌のcold shock protein (CspA) は、低温下で RNA の高次構造形成を阻害、転写を促進し、大腸菌が低温適応に関与していると考えられている。本研究ではCspAとRBPを比較しながら、RBPの耐塩性に関する未知の機能の解析を試みた。本研究の一部は NEDO からの平成 15 年度産業技術研究助成事業の助成で行われた。

抄録全体を表示

植物は環境変化に適応するために様々な応答をしており、遺伝子レベルでの応答機構に関する研究が広く行われているが、タンパク質の応答機構や翻訳後修飾に関しては不明な点が多い。実際の環境適応機構の解析のためには、タンパク質の発現量比較や、翻訳後修飾の解析が欠かせない。そこで本研究では、既にDNAマイクロアレイを用いた解析が多くなされているが、タンパク質レベルでの解析例が少ないSynechocystis sp. PCC 6803を用いて塩、浸透圧ストレスに対するプロテオーム解析を試みた。
塩、浸透圧ストレス処理には、終濃度0.35MになるようNaCl、sorbitolを加え、1週間培養を行った。この細胞を回収しガラスビーズで破砕した後、可溶性タンパク質と膜タンパク質に分離し、それぞれを二次元電気泳動とMALDI TOF-MSおよびLC-MSによるプロファイリングとタンパク質の同定を行った。その結果、イオン輸送、代謝に関連するタンパク質のほか機能未知のタンパク質の増減が確認され、DNAマイクロアレイでの結果とは異なるタンパク質も多かった。これらの結果と遺伝子レベルの結果を比較して、塩、浸透圧ストレスに対する応答機構に関して議論する。

抄録全体を表示

シアノバクテリアの一種Anabaena sp. PCC 7120（Anabaena）は2001年に全ゲノム配列が解読・公開されており、研究資料として広く用いられている光合成原核生物である。Aanabaenaゲノムのopen reading frame（ORF）の一つであるorrA (alr3768)はヘリックス－ターン－へリックスDNA結合ドメインを持つ二成分制御系のレスポンスレギュレーターであり、塩ストレス誘導性遺伝子の転写調節に関与しているとの報告がなされた。二成分制御系はバクテリアに広く用いられている環境適応に重要な役割をはたしているシグナル伝達様式である。我々は、Anabaenaのストレス応答のメカニズムを明らかにすることを目的としてorrAの解析を進めた。
我々は、当研究室で作成されたAnabaena染色体上に存在するほぼ全てのORFがスポットされたマイクロアレイ（Anabaena oligo nucleotide microarray）を用いい、OrrAに直接的、又は間接的に発現調節をされる遺伝子のスクリーニングを行った。また、OrrAによって直接的に制御される遺伝子を同定するために行ったHisタグ融合タンパク質、His-OrrA によるゲルシフト解析を行った。これらの結果について報告する。

抄録全体を表示

埋立焼却灰は水との接触により、複合的な負の化学因子（高pH、塩、重金属）を環境中に溶出させる可能性があり、灰由来の有害因子が周辺に生息する生物に与える影響を調べることは極めて重要である。私達はイネを用い、様々な種の灰溶出液をそれぞれ水耕液で希釈した試験液を根に投与し、1日後における葉身の光合成活性の減少を毒性の指標に灰溶出液の安全性評価を行ってきた。その過程で、毒性の強い灰溶出液にはpHが著しく高い傾向（試験液pHが11近傍）、Ca、Cu、Pbを多く含む傾向が見られた。そこで本研究では、弱酸性（pH5.5）、強アルカリ性条件（pH11）で試験液近傍の濃度でのCaCuPbの3元素がイネに与える毒性、その毒性に関与する因子についての解析を試みた。具体的には、両pH条件で水耕液に、CaCl₂（30 mM）、CuCl₂（130 µM）、PbCl₂（45 µM）の3化合物のうち0（Control）～3種（CaCuPb区）を加えた区を設定し毒性を比較した。その結果、両pH条件でCaCuPb区は毒性を示し、その毒性は主にpH5.5条件では（Cuの毒性）と（CaによるCuの毒性緩和効果）の和、pH11条件では（強アルカリ性自体の毒性）と（Caによる毒性）の和によると示唆された。Pbは本研究ではいずれのpH条件においても、毒性に顕著な影響は与えなかった。今後、イネ植物体における元素蓄積量の変化からも考察を進める予定である。なお、本研究は文部科学省リーディングプロジェクトの支援による。

抄録全体を表示

鉄、亜鉛、マンガン、銅、カドミウム、ニッケルなどの重金属は土壌や水に高濃度で蓄積すると、動物や植物を介して人間の健康に問題を引き起こす。植物自身も過剰な重金属により傷害を受ける。しかしながら、植物はこれらの過剰毒性に対し様々な防御のメカニズムを持つと考えられる。ニコチアナミン（NA）はS-アデノシルメチオニンの3分子重合により生合成され、鉄 (2価, 3価) や他の2価金属のキレーターである。また、NAは植物における金属の恒常性の維持に関与すると考えられている。本研究では、NAと重金属過剰耐性との関わりを調べるため、オオムギのニコチアナミン合成酵素遺伝子（HvNAS1）を過剰発現する形質転換植物シロイヌナズナとタバコを作成し、これを用いて解析した。いずれの形質転換植物もNAの生合成量が増大しており、重金属特にニッケルに対して高い耐性を示した。シロイヌナズナの4つのNAS遺伝子のプロモーターGUS解析の結果、すべてのNAS遺伝子の発現がニッケル過剰により増加した。このことはNAが植物においてニッケルの解毒に重要な働きをしていることを示唆していた。さらに、この形質転換タバコをニッケル過剰土壌で生育させるとニッケル過剰症は見られず顕著な耐性を示した。これらの結果によりNAは過剰なニッケルを解毒し, 植物に耐性を付与できることが明らかになった。

抄録全体を表示

ニコチアナミン（NA）は植物に広く存在する金属のキレーターであり、植物体内の金属輸送や金属の恒常性の維持に関係すると考えられている。ムギネ酸類（MAs）はイネ科植物に特異的な金属のキレーターであり、NAを前駆体として合成される。MAsは根から根圏へ分泌され、金属キレート複合体として再吸収される。さらに根圏に分泌されないNAと同様に植物体内においても金属輸送を行うと考えられる。本研究では、イネの生殖成長および胚発生過程におけるNAおよびMAsの役割を明らかにすることを目的とした。
生殖器官および種子への鉄の輸送形態を探るため、Fe(II)-NA, Mn(II)-NA錯体のトランスポーター遺伝子をコードするOsYSL2遺伝子、Fe(III)- デオキシムギネ酸（DMA）錯体のトランスポーターをコードするOsYSL15遺伝子、Fe(II)のトランスポーターOsIRT1遺伝子の花や種子における発現を解析した。また、放射性同位元素を用いて金属、NAおよびDMAの花や種子への移行を調べた。生殖成長および種子成熟期における金属栄養関連の遺伝子発現を調べるため、マイクロアレイ解析を行った。さらに完熟種子の部位別の金属濃度、NAおよびDMA濃度を測定した。これらの結果から、イネにおいてNAおよびDMAのいずれもが種子への金属輸送に重要であることが示唆された。

抄録全体を表示

オオムギは，鉄欠乏条件下で多量のムギネ酸類を分泌し，その分泌パターンは日周性を示すことが知られている．オオムギのムギネ酸類分泌は，夜明けと共に開始され最大に達した後，数時間の間で減少し，再び基底状態にもどる．鉄欠乏のオオムギの根では，ムギネ酸顆粒と呼ばれる細胞内小胞の数の増加が認められる．さらに，夜明け前には，この顆粒が細胞の表層近くに密集していることから，この顆粒のムギネ酸分泌への関与が示唆されている．現在までに，ムギネ酸類の生合成経路の遺伝子をはじめとする，多くの鉄吸収に関わる遺伝子群が単離，解析されている．しかしながら，ムギネ酸類の分泌に関与する遺伝子については未知のままである．本研究では，25Kのオオムギマイクロアレイを用いて，ムギネ酸類分泌機構に関与する遺伝子の同定を試みた．
オオムギの遺伝子発現を，鉄欠乏誘導性と日周変動の二つの条件について比較した．鉄欠乏誘導性を示した遺伝子の多くは，ムギネ酸類生合成や，前駆体であるメチオニンの供給に関わる既知の遺伝子で占められていた．このことは，このマイクロアレイ解析結果の信頼性が高いことを示していた．また，これらの既知の遺伝子以外に新規の鉄欠乏誘導性遺伝子群が見いだされた．これらの遺伝子群の中にムギネ酸類の分泌機構に関与する遺伝子が含まれていることが考えられるので，それらの遺伝子について機能の解析を進めている．

抄録全体を表示

イネの栽培において、幼穂形成期から乳熟期に落水処理すると玄米へのカドミウムの蓄積量が増加する。農水省の「水稲のカドミウム吸収抑制のための対策技術マニュアル」では、できるだけ湛水状態を長く維持することがカドミウム低減のための対策技術の一つとして推奨されている。土壌中でのカドミウムと鉄の可溶性の動態は表裏の関係にある。すなわち、酸化的な状態では鉄は不溶性となり、カドミウムは可溶性のイオンとなる。鉄欠乏状態のイネの根においては鉄吸収のための2価鉄トランスポーター、OsIRT1、OsIRT2やムギネ酸による鉄吸収に関わる遺伝子群の発現が誘導される。この2価鉄トランスポーターによるカドミウムの吸収について実験を行った。¹⁰⁹Cdを用いて吸収実験を行ったところ、鉄欠乏処理を行うと、イネのカドミウム吸収は上昇した。また、この際に水耕液に鉄を添加すると、地上部へのカドミウムの移行量が増加した。このことはイネがカドミウムを鉄と同じ吸収・移行経路を使って吸収・輸送していることを示している。鉄の吸収に変異を持つ酵母(fet3fet4)においてOsIRT1、OsIRT2を発現させ、カドミウム存在下での生育を見たところ、生育が低下した。また、OsIRT1、OsIRT2導入酵母における¹⁰⁹Cd吸収も確認された。これらのことから、イネにおいて生体内で鉄欠乏状態が生じた場合に鉄の吸収・移行系を誘導し、これがカドミウムの蓄積に関与していると考えられる。

抄録全体を表示

イネ科植物は、三価鉄のキレーターであるムギネ酸類を分泌し、土壌中で不溶態鉄と錯体を形成することにより可溶化して吸収する。この「三価鉄ムギネ酸類」錯体を吸収するトランスポーターZmYS1の遺伝子が、トウモロコシの変異体の研究によって単離された。イネゲノム中には、18個のZmYS1-like遺伝子、OsYSL遺伝子が存在する。
本研究では、これらのうち2つのOsYSL遺伝子が根からの鉄吸収、植物体内の鉄移行に関わることを示す。OsYSL15は、「三価鉄―デオキシムギネ酸」錯体を輸送基質とし、プロモーターGUS実験により根の表皮細胞で発現する事が明らかになった。鉄欠乏の根で強く誘導されるOsYSL15は、根での鉄吸収に主要な役割を果たすと考えられる。
OsYSL2は鉄欠乏の地上部で発現することを新潟大会で報告した。さらに、OsYSL2は種子登熟過程で発現することが明らかとなっており、種子中へ鉄を輸送するために重要な役割を果たす可能性がある。現在、RNAi法によりOsYSL2遺伝子の発現抑制を試みており、遺伝子抑制による種子への鉄の移行を解析中である。

抄録全体を表示

われわれはこれまでに鉄欠乏応答性シスエレメントIDE1、IDE2を同定したが、イネ科植物の鉄欠乏応答における遺伝子の発現制御機構については未だほとんどわかっていない。本研究では、鉄吸収にかかわる遺伝子群の発現制御機構を解明するため、イネのマイクロアレイ解析により見いだされた鉄欠乏誘導性bHLH型転写因子OsIRO2に着目し解析を行った。OsIRO2は地上部・地下部ともに鉄欠乏により強く発現が誘導された。OsIRO2の発現上昇は、亜鉛、銅、マンガン欠乏では誘導されず、鉄欠乏に特異的であった。OsIRO2のDNA結合配列をCyclic Amplification and Selecting Targets (CASTing) 実験により決定した。その結果、OsIRO2はG-box (CACGTG) を含む 5’-ACCACGTGGTTTT-3’という配列に結合しやすいことがわかった。さらにEMSA解析により、G-boxがOsIRO2の結合におけるコア配列であり、その周辺の配列は結合活性をより高めることが明らかになった。この配列に相同性の高い配列が、いくつかの鉄吸収に関わる遺伝子の上流に存在し、OsIRO2がこれらの遺伝子発現を制御する可能性が示唆された。OsIRO2の過剰発現形質転換イネとRNAiによる発現抑制形質転換イネを作製し解析を行った。

抄録全体を表示

ラン藻Synechococcus sp. PCC 7942は重金属ストレスに応答してメタロチオネイン様タンパク質SmtAを発現し、Zn²⁺やCd²⁺などをキレートして毒性から回避する。組み換えタンパク質として発現したSmtAでは、N末端側の領域(Met1～Cys47)に2個、C末端側の領域（Gly43～Gly56）に1個のZn²⁺が結合すると推測されている。smtA遺伝子にそのN末端領域のDNA断片を複数個接続し、これをGSTとの融合タンパク質として大腸菌で発現させ、SmtAの N末端領域が連続的に接続されたポリペプチドを作製した。これらの組み換えタンパク質およびこれを発現する大腸菌について、金属蓄積能および、金属選択性を解析した。
SmtAおよび分子改変したSmtAを発現する大腸菌はZn²⁺存在下で生育させると、野生株より数倍のZn²⁺を含んでいた。Zn²⁺とCd²⁺の両方を含む培地中で生育させた場合には、菌体内のCd²⁺のZn²⁺に対する存在比は培地中よりも明らかに大きくなった。また精製した改変SmtAに結合しているZn²⁺の80％以上は容易にCd²⁺に置換された。これらの結果からSmtAの組み換えタンパク質、特に複数のN末端側の領域を接続したものは、Cd²⁺に対してより高い親和性を持ち、また細胞内における重金属蓄積においてより効果的に機能すると考えられる。

抄録全体を表示

土壌の重金属汚染は多くの動物等に重篤な被害をもたらす危険性を有し、特にカドミウムはその高い水溶性と毒性から最も深刻な被害をもたらす汚染重金属の一つとされている。これまでに様々なモデル生物を用いた解析から、カドミウム解毒機構としてphytochelatin等によるキレート化、Yeast Cadmium FactorやCAX2など輸送体による液胞への隔離等が明らかとされてきた。しかしながら、これだけではカドミウム耐性生物の重金属耐性機構を説明するには不十分で、これら以外にも新規な解毒機構が存在すると予想されている。そこで本研究では新規なカドミウム遺伝子の同定を目的として、多様な毒性物質に耐性を示すオウレン培養細胞由来のcDNAライブラリーを作成し、形質転換酵母をカドミウム培地上でスクリーニングを行った。得られたカドミウム耐性遺伝子は二種あり、一方は金属耐性の知られるmetallothionein、もう一方はBowman-Birk Proteinase Inhibitor (CjBBI)をコードしていた。酵母を用いた解析において、CjBBIはカドミウムに加えてニコチンやローダミンといった有機化合物に対しても耐性を付与し、本タンパク質が植物の多剤耐性に関与することが示唆された。その植物体における発現を調べた所、地上部において強いことが明らかとなった。

抄録全体を表示

鉄は生物にとって必須の因子であるが、反応性が高いためラジカルを発生し生体に対し重篤な影響を及ぼす。したがって、細胞中の鉄は高度に制御される必要がある。鉄貯蔵タンパク質として知られるフェリチンは24量体の袋状構造を持ちその中に、最大4500の鉄原子を蓄積することが知られており、生体内の鉄代謝に対して重要な働きを担っている。近年、植物フェリチンの遺伝子は配列の解析によりファミリーを構成することが明らかとなってきたが、一部の遺伝子を除いて、その発現や機能はほとんど明らかにされていない。そこで、我々は、アラビドプシスのフェリチン遺伝子(AtFer1-4)を用いて、個々の遺伝子が外部からの鉄やその他のストレスに対してどのような応答をするのかを明らかにする目的で発現解析をおこなった。各遺伝子間の相同性は高いために、葉緑体等への輸送に関与すると推定されるTransit peptide (TP) をコードしている約200bpをプローブとしてノーザン解析をおこなった。まず、過剰な鉄の刺激に対する応答を調べた。その結果、AtFer1 およびAtFer3は発現量が著しく高まったが、他の遺伝子には強い変化は認められなかった。現在、GUS遺伝子の上流に各フェリチンプロモータを融合した遺伝子を植物へ導入して解析中である。あわせて報告する。

抄録全体を表示

アサガオはオゾン感受性が高いことが知られている。特に、品種スカーレットオハラ(SO)は高感受性で、野外で80ppb程度のオキシダントに数時間暴露されると翌日に葉に明瞭な可視障害を生じることから、1970年代から光化学オキシダントの指標植物として広く用いられてきた。ところが、アサガオのオゾンによる障害の機構については全く調べられていなかった。オゾンの植生に対する影響を把握するためには、鋭敏な指標植物であるアサガオを用いて、分子的メカニズムに裏付けられた正確な実態調査を行うことが有意義であると考え、そのオゾン応答機構の解明に着手した。200ppbのオゾンに9時間暴露したアサガオ(SO)葉では、可視障害の出現にともなって傷害ホルモンのエチレンの生成量が上昇した。一方、エチレンの作用阻害剤である1-methylcyclopropeneを前処理してオゾン暴露を行ったところ、100ppbオゾンでは未処理の個体と比べ可視障害の軽減が観察されたが、200ppbオゾンでは可視障害の軽減は認められなかった。また、オゾン暴露中にアスコルビン酸含量の低下が見られた。これらのことから、アサガオ葉ではオゾンストレス時に発生するエチレンの細胞死の促進への関与は限定的であることと、酸化的ストレスにより抗酸化能の低下が起きていることが示唆された。現在、オゾン応答に関連する遺伝子の発現を解析中である。

抄録全体を表示

オゾンに暴露されたシロイヌナズナではサリチル酸 (SA) が合成され、SAは防御機構を誘導する。これまで、オゾン暴露時に合成されるSAの量がどのように調節されているかについてはほとんど調べられていなかったので、オゾン暴露時のシロイヌナズナのSA合成調節機構に着目し、解析を行った。
昨年私たちは、SA合成に関与する遺伝子の発現解析や遺伝学的な解析から、オゾンに暴露されたシロイヌナズナではisochorismate synthase 1 (ICS1) の発現が増加し、SAはchorismateからisochorismateを介する経路で合成されることを明らかにした。今回、その合成がどのように調節されているのかを調べるため、SAシグナル欠損変異体nonexpresser of PR genes 1 (npr1) の解析を行った。オゾンに暴露されたnpr1では、ICS1発現量、ICS活性やSA量が、野生型よりも高いことが明らかになった。また、野生型シロイヌナズナのオゾン暴露時のICS誘導はSA投与により抑制された。従って、オゾン暴露時SAシグナルがSA量を負に制御している可能性が示唆された。

抄録全体を表示

植物は環境ストレスに晒されており、その多くが植物内で活性酸素を生じさせることから、活性酸素に対する植物の応答機構の研究が注目されている。これまでに酸化的ストレスにおけるサリチル酸（SA）とエチレン（ET）の研究は数多く報告されており、細胞死を誘導・増幅するシグナル物質として知られている。しかし、酸化的ストレス源の一種であるオゾンに対して耐性を持つシロイヌナズナ野生型Col-0のSAおよびETシグナル変異体にオゾンを暴露したところ、Col-0に比べて若干の障害が現れることがわかった。このことはSAとETの細胞死誘導・増幅への関与だけでは説明できない現象であり、SAとETが防御的にも働くことを示唆している。これまでにSAとETの防御的役割を言及している研究は、ほとんどなく詳細な研究がなされていない。そこで本研究ではオゾン暴露ストレスにおけるSA、ETによる防御機構を解明することを目的として研究を行った。SA、ETシグナルが働かない場合の可視障害を明確にするために、オゾン暴露後に可視障害が見られるCol-0由来のアスコルビン酸合成変異体vtc1とSA合成変異体sid2、ETシグナル変異体ein2との二重変異体を作製し、そのオゾン感受性を調べた。その結果、各二重変異体はvtc1よりも顕著なオゾン感受性を示し、SAとETがオゾン暴露ストレスに対して防御的に働く側面を持つことが明らかとなった。

抄録全体を表示

ジャスモン酸（JA）は傷害・病害等の植物のストレス応答に関与するシグナル物質である。JAシグナルはストレス耐性の獲得において重要であるにも関わらず、JAシグナルがどのような機構を介してストレス耐性に寄与しているかは明らかになっていない。本研究では、シロイヌナズナにおいてJAにより制御される代謝経路を同定するために、8384遺伝子を含むcDNAマクロアレイを用いた解析を行った。その結果、JA処理によってアスコルビン酸およびグルタチオン代謝の各ステップを担う遺伝子群が誘導され、アスコルビン酸再生経路の酵素活性の上昇や、これらの抗酸化物質の含量増加が起こることを明らかにした。
抗酸化物質代謝経路は酸化的ストレスに対する防御機構において重要であることが知られている。そこで酸化的ストレスの1種であるオゾン曝露下において、抗酸化物質代謝遺伝子の発現応答を調べた。野生株においては抗酸化物質代謝遺伝子群の発現誘導が見られたが、JA生合成酵素である12-oxo-phytodienoic acid reductaseの欠損した変異体（opr3）では、それらの遺伝子の発現誘導は見られなかった。またopr3では野生株よりオゾン曝露に対する感受性が高まっていた。これらの結果は、JAによる抗酸化物質代謝の協調的活性化が酸化ストレスを伴う種々の環境ストレスへの抵抗性を高めていることを示唆している。

抄録全体を表示

緑藻Spirogyra (アオミドロ)は陸上植物の系統進化上の祖先と考えられる藻類に属し、藻類と陸上植物を結ぶ生物である。三種のSODアイソザイムの内、CuZn-SODは大部分の緑藻には存在しないが、Spirogyraの葉緑体には陸上植物と同様、CuZn-SODが含まれる。またSpirogyraは一種類しか持たない陸上植物とは異なり、藻類型と陸上植物型とに区別できる二種のミトコンドリア局在性Mn-SODを含んでいる。本研究では両Mn-SODの関係を明らかにするために、二種のMn-SODのゲノム遺伝子構造とその産物のタンパク化学的性質について検討した。
藻類型Mn-SOD遺伝子(2.9 kbp)は6つのエキソンより構成され、アミノ酸配列上でのイントロン部位は陸上植物型Mn-SOD遺伝子のものとは一致せず、両者のエキソン・イントロン構造は異なっていることが示された。一方、陸上植物型Mn-SOD遺伝子(2.2 kbp)も6つのエキソンを持つが、イントロンの位置はArabidopsisの二つのMn-SOD遺伝子と同一であった。藻類型および陸上植物型Mn-SODの組換えタンパク質を作成してそのサブユニット構造を調べた結果、藻類型Mn-SODは分子量が50.1 kDaのホモ二量体で陸上植物型Mn-SODは79.8 kDaのホモ四量体であることが示された。以上の結果から、藻類型と陸上植物型Mn-SODは遺伝子のエキソン・イントロン構造もタンパクのサブユニット構造も異なっており、両者の分岐はMn-SODの分子進化のかなり早い時期に生じたことが示唆された。

抄録全体を表示

Ascorbate (AsA) is a potent antioxidant protecting plants against oxidative damage imposed by environmental stresses such as ozone, drought and salt stress. In this study we demonstrated the enhancement of oxidative stress tolerance in transgenic tobacco (Nicotiana tabacum) overexpressing either cytosolic dehydroascorbate reductase (DHAR) or cytosolic monodehydroascorbate reductase (MDAR). Incorporation of the transgenes in the genome of tobacco plants was confirmed by PCR and Southern blot analysis and its expression was confirmed by Northern and Western blot analyses. DHAR transgenic plants exhibited 2.3 to 3.1 folds higher DHAR activity and 1.9 to 2.1 folds higher level of reduced AsA compared to non-transformed plants. MDAR transgenic plants exhibited 1.2 to 2.1 folds higher MDAR activity and 2.0 folds higher level of reduced AsA. These transgenic plants showed maintained redox status of AsA and exhibited an enhanced tolerance to ozone, drought, salt, and polyethylene glycol stresses in term of higher net photosynthesis.

抄録全体を表示

これまでに当研究室において、ADP-リボース加水分解活性を有するシロイヌナズナNudix hydrolase (AtNUDX2, 7)の過剰発現により、酸化的ストレス耐性能が向上することを明らかにした。ADP-リボースはDNA修復などに機能するタンパク質のポリ (ADP-リボシル)化反応の分解産物であり、その過剰蓄積は様々な細胞障害の原因となる。しかし、植物におけるポリ (ADP-リボース)代謝とストレス耐性との関連性には不明な点が多く残っている。そこで、シロイヌナズナにおけるポリ (ADP-リボシル)化反応に関わる酵素群および代謝産物のストレス応答性について検討した。
種々のストレス（パラコート、乾燥、塩、強光）に対する応答性について解析した結果、AtNUDX7、ポリ (ADP-リボース)ポリメラーゼおよびポリ (ADP-リボース)グリコヒドロラーゼの転写レベルはすべてのストレス条件下で増加した。さらに、AtNUDX2, 7過剰発現株では野生株と比較して、パラコート処理によるNAD+およびATP量の減少率が抑制されていた。以上より、シロイヌナズナにおけるポリ (ADP-リボシル)化反応はストレス条件下において活性化されており、AtNUDX2, 7はそれにより蓄積したADP-リボースを分解することで、ヌクレオチドのリサイクル (NAD+およびATP量の維持)に機能していることが示唆された。

抄録全体を表示

植物の葉の展開方向や展開角度は様々で、種によって固有の位置を保つように見られるがそれらが何によって決められているのかは明らかとなっていない。私達はこれまでの解析から、植物体を正立状態で暗所に置くと葉が立ち上がり、上下逆の状態で暗所に置くと葉が反り返るという葉の重力応答を明らかにしてきた。また、暗所での葉の動きは、負の重力屈性運動と、シュート軸に対して閉じるように動く暗所傾性運動との、足し合わせであることも明らかにしてきた。
以上の葉の動きは連続光条件下で見られないことから、光によって制御されていると考えられる。そこで、野生型シロイヌナズナのロゼット葉に対し、大型スペクトログラフ(基礎生物学研究所)で5波長の単色光（450, 520, 630, 370, 730 nm）をそれぞれ9時間照射し、照射前後の葉の動きを比較した。また、赤色光（660 nm）、青色光（470 nm）を照射しながら植物体を上下逆にし、葉の動きを観察した。赤色光照射下でも植物は重力応答反応を示したが、葉が立ち上がる暗所傾性反応は示さなかった。一方、青色光照射下では暗所傾性反応は示したが、重力応答反応は示さなかった。このことから、赤色光照射下では暗所傾性運動を、青色光照射下では重力屈性運動を制御している可能性がある。以上の結果より、シロイヌナズナの葉は2つの異なる制御系の総和によって位置決定されていることが明らかとなった。

抄録全体を表示

植物特異的なDof転写因子はシロイヌナズナでは36の遺伝子からなる遺伝子ファミリーによってコードされており、これまでに7遺伝子についての解析が報告されている。他の植物種における研究から、シロイヌナズナのDof転写因子は現在報告されているよりも多様な役割を果たしていることが予想される。そこで半定量的RT-PCR法により網羅的にシロイヌナズナのDof遺伝子ファミリーの発現解析を行い、発現パターンから各々のDof遺伝子の機能を推測しようと試みた。いくつかのDof遺伝子の発現はアブシジン酸、オーキシンなどの植物ホルモンに応答していた。また、その発現が糖によって発現が抑制されるもの、もしくは糖処理に伴う浸透圧上昇によって発現が影響されるものも見られた。多くのDof遺伝子はほとんどの器官で発現していたが、地上部において特異的に発現しているもの、根での発現が強いものなどもあった。現在いくつかのDof遺伝子のプロモーター::GUS形質転換体を作成しており、これらについての解析も報告する予定である。

抄録全体を表示

植物が乾燥や塩などのストレスを受けると、プロリンや糖などの適合溶質と呼ばれる物質を細胞内に蓄積し、細胞内の浸透圧調節や生体内物質の保護を行うことが知られている。我々は、シロイヌナズナにおけるプロリン代謝の律速酵素をコードするProDH遺伝子が乾燥後の再吸水や低浸透圧及びプロリンにより発現誘導されること、ProDH遺伝子の低浸透圧及びプロリン応答性シス因子がACTCAT配列であることを示した。また、ACTCAT配列を介してProDH遺伝子を発現制御している転写因子の同定を試みたところ、ACTCAT配列にbZIPタンパク質が結合する可能性が示された。プロトプラストを用いた一過性発現実験から、4つの遺伝子から成るATB2サブグループがACTCAT配列特異的にレポーター遺伝子を活性化し、さらにその活性化は低浸透圧処理により上昇することが示された。細胞内局在性解析の結果、ATB2は核に局在した。よって、ATB2サブグループがProDH遺伝子の低浸透圧応答性発現に関与する転写因子として機能することが示された。今回我々はATB2サブグループを恒常的に発現させた形質転換シロイヌナズナを作出し、解析を行った。これらの植物では、低浸透圧処理なしでProDH遺伝子の発現量の増加が見られた。さらにこれらの形質転換体では、コントロール植物に比べてプロリン含量が減少していた。現在、これら植物のより詳細な解析を行っている。

抄録全体を表示

我々は、パルプ特性に優れた遺伝子組換えユーカリの作出を目的とし、木繊維形成過程の遺伝子発現制御機構の解析を行っている。既にマイクロアレイ解析によってユーカリにおける木繊維細胞のセルロース・リグニン合成、伸長に関わる遺伝子群とその制御に関わる転写因子群の候補を選抜した。これら遺伝子群のプロモーターと転写因子の相互作用を解析している。
これまで、in vitroでの DNA-タンパク質相互作用の解析は、ゲルシフトアッセイなどが行われてきたが、本実験では、これまで以上に迅速かつ大量に解析できる手法として一分子蛍光分析法を用いた。本方法は、蛍光標識したDNA断片とタンパク質が溶液中で結合することによる分子運動（並進時間と呼ぶ）の変化から、相互作用の有無をみるものである。実験系を検証するために、解析済みのモデル系としてシロイヌナズナのrd29AプロモーターのDRE配列を含むDNA断片と、転写因子DREB1Aを用いた。その結果、両者が共存する時のみに並進時間の増加が見られた。これらの実験から、一分子蛍光分析法は転写因子と結合するプロモーターのシス配列の特定に、迅速かつ大量に解析する手法として有用であると考えられた。今後、この方法を用いて、ユーカリ木繊維形成遺伝子群のプロモーターと転写因子との相互作用解析を網羅的に行っていく。

抄録全体を表示

糸状性ラン藻Anabaena sp. PCC 7120において、cAMPの存在は確認されているものの、その機能は未解明である。近年Anabaena sp. PCC 7120においてcAMP受容体タンパク質が二種類同定され、それぞれAnCrpA、AnCrpAと名付けられた。一連の生化学的解析の結果、AnCrpAがより高いcAMP親和性を示したため、ancrpA遺伝子破壊株を作成し、DNAマイクロアレイを用いてAnCrpA標的遺伝子をスクリーニングした。その結果、ancrpA破壊株において、窒素固定関連遺伝子群の転写量が著しく減少した。その一方で、酸化ストレスに応答して発現誘導がかかる遺伝子群や、乾燥ストレス時に遺伝子発現量が変化することが知られている糖転移酵素群やトレハロース代謝酵素群をコードする遺伝子の発現量は増加した。これら発現変動は、細胞のヘテロシスト分化が完全に抑制されている培養条件下では観察されなかった。またリアルタイムRT-PCRを用いた実験においても同様の結果が確認された。さらに、ancrpA破壊によって発現が抑制された遺伝子の上流領域に対するAnCrpAの結合性をゲルシフト分析によって解析したところ、cAMP存在下において、いくつかの遺伝子の上流領域にAnCrpA結合性が確認された。現在は、in vitro selectionを行うことにより、AnCrpAの認識配列を探索している。

抄録全体を表示

これまでの我々の研究で、シアノバクテリアSynechocystis sp. PCC 6803のシグマ因子SigEは暗条件下で解糖系、酸化的ペントースリン酸経路、グリコーゲン異化の遺伝子群の発現を正に制御していることが示されている (Osanai et al., 2005)。一方、SigEの発現は窒素欠乏時に転写誘導されることが知られており、糖代謝と窒素栄養状態との相関が示唆された。今回我々は野生株を用いてトランスクリプトーム解析を行い、糖異化遺伝子群のmRNA量が、窒素欠乏時に増加することを見いだした。実際に酵素活性レベルでも、酸化的ペントースリン酸経路の主要な酵素であるグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの活性は上昇していた。さらにsigE欠損株でも窒素欠乏下でこれらの発現誘導がおこることから、この誘導がSigEとは独立した現象であることが明らかとなった。次に、窒素のグローバルな転写因子として知られるNtcAの変異株を用いて同様の実験を行ったところ、ntcA変異株では、窒素欠乏時の糖異化遺伝子群の発現誘導が著しく低下した。これらの結果より、糖異化遺伝子群の発現がSigE, NtcAなどによる多重制御を受けている可能性が示唆された。

抄録全体を表示

高等植物葉緑体ゲノムの転写は、少なくとも NEP （ファージ型）と PEP （原核生物型）と呼ばれる二種類の RNA polymerase によりなされる。特に PEP コア酵素は、multiple-catalytic subunit (α₂, β, β', β'') より構成され、これに転写開始因子である σ 因子が合わさり、ホロ酵素として機能すると考えられる。イネにおいては、これまでに6種類（SIG1, SIG2A, SIG2B, SIG3, SIG5, SIG6）の σ 因子遺伝子が同定されており、それぞれの σ 因子のプロモーター認識特異性の役割分担に興味が持たれている。
そこで、本研究では、イネの PEP コア酵素と σ 因子を再構成させた in vitro 転写実験系を確立し、σ 因子の機能解析を目的とした。 その手始めとして、OsSig5 の大量発現・精製に成功した。現在、コア酵素各サブユニットの大量発現と精製を試みており、これら成果をまとめて報告する。

抄録全体を表示

高等植物の葉緑体では、RNAエディティングによって、転写後にRNA上の特定のCがUに変換される。エディティング部位は葉緑体ゲノムあたり数十カ所であるが、それらの周辺には共通の塩基配列が見出されず、個々の部位は、それぞれ個別のシス・トランス因子によって認識されると予想されている。本研究では、タバコ葉緑体から調製したin vitro エディティング系を使い、エディティングに関与するトランス因子について、エディティング部位間の共通性・特異性を検討した。まず、エディティングをうける標的塩基、またはその近傍にあるシス因子に、それぞれ³²Pで標識を導入した基質RNAを調製した。次いで、in vitro エディティング系を用いてUVクロスリンク実験を行い、上記の標識ヌクレオチドに結合するタンパク質をSDSPAGEによって解析した。これまでの解析から、psbE-1部位では、標的C塩基とシス因子の双方が、ともに同一の56 kDaタンパク質によって認識されており、さらにpetB-1部位でも、双方が同一の70 kDaのタンパク質によって認識されることが示されていた。今回の研究では、さらに多くの箇所について同様の解析を行ったところ、標的C 塩基に結合するタンパク質の分子量が、rpoA-1部位、rpoB-2部位、rpoB-3部位ですべて異なっていた。現在、これらの部位のシス因子についても結合タンパク質の解析を進めており、それらの結果から、葉緑体RNAエディティングの分子機構について考察したい。

抄録全体を表示

RNA編集は、RNA上の塩基配列を置換する転写後調節過程の一つである。植物オルガネラRNA編集の大部分はC-to-U変換で、変異した遺伝情報を修復する役割を担っている。
シロイヌナズナcrr4（chlororespiratory reduction）変異株は葉緑体コードのサブユニットを含むNDH（NAD(P)H dehydrogenase）複合体活性を欠く変異株の一つとして単離された。crr4変異株は葉緑体移行シグナルを持つPPRタンパク質に異常を持ち、ndhDの翻訳開始コドンを作製するRNA編集が特異的に減少していた。これらの結果から、PPRタンパク質が葉緑体のRNA編集に必須であることが明らかになった。
PPRタンパク質の機能は、PPRモチーフを重複することで、特異的にRNAまたはタンパク質と相互作用するのではないかと考えられている。CRR4は11個のPPRモチーフ以外にシチジン脱アミノ化に関わると考えられるモチーフを持っていないことから、ndhD開始コドン作製のRNA編集における標的RNAを認識する役割を担っていることが推測される。そこでまず、CRR4がRNA編集における部位特異的因子として働くかを明らかにするために、in vitroで合成したCRR4と標的RNAとの結合の可能性を検討している。

抄録全体を表示

植物のシステミックジーンサイレンシングでは、局所的に生じたRNAサイレンシングは植物体全身へと拡散してゆき、植物全体がRNAサイレンシングを示すようになる。植物体全身へと情報を伝えるサイレンシングシグナルについてはいまだ明らかになっていない部分が多いが、RNAサイレンシングの鍵となる21～25ntの小さい2本鎖RNA（siRNA）が関わっていると予想されている。本研究では、ω-3脂肪酸不飽和化酵素遺伝子（NtFAD3）のサイレンシングについて解析した。台木としてヘアピンRNA（hpRNA）によりNtFAD3遺伝子の発現が抑制されているRNA干渉（RNAi）個体を用意し、その上にNtFAD3遺伝子の過剰発現個体を接木したところ、台木からサイレンシングシグナルが伝わり、接ぎ穂の部分も発現抑制が生じた。そこで、接ぎ穂から抽出した低分子RNAについて、3種類の異なる領域（hpRNAのターゲット領域とその上流、下流領域）のプローブを使用してノーザン解析、また、パーティクルガンを用いた簡易的なRNAサイレンシングの評価方法を用いることで、システミックジーンサイレンシングが起きた部分での二次的siRNAについて解析した。その結果、接ぎ穂では台木でのRNAサイレンシングの標的領域よりも、NtFAD3遺伝子の下流側にsiRNAが形成されていることが明らかとなった。

抄録全体を表示

Nonsense-mediated mRNA decay (NMD)は真核生物が備えるpremature termination codon (PTC)を持つmRNAの排除に関わるmRNA監視機構である。NMDの主要因子であるUPF1 RNA helicase は真核生物に高く保存されているが、植物UPF1の機能については不明であった。我々が先に単離した主要β－アミラーゼ遺伝子 (At β-Amy)の糖誘導性発現が低く抑えられたlba1変異株は、アントシアニンやクロロフィル含量低下に加えて、花成促進、短日条件下での生育阻害、種子重量増加、発芽のグルコースやABAに対する高感受性とマンノースに対する耐性、といった多面的な表現型を示した。lba1変異は5番染色体の61-kbの領域にマップされ、その全塩基配列を決定したところ、AtUPF1遺伝子コード領域に一塩基置換が見つかった。lba1に35S::AtUPF1-cDNAを導入したところ、種々の表現型が相補され、lba1の多面的表現型はAtUPF1の1アミノ酸置換によると考えられた。AtUPF1遺伝子の内部エキソンにT-DNAが挿入された破壊株のホモ体はseedling lethalの表現型を示し、この致死性も部分的に相補されたことから、AtUPF1は生育に必須であることが示された。最近、動物や酵母のUPF1 はNMD以外にも翻訳の効率や正確さ、テロメア維持、DNA損傷応答、擬遺伝子の発現抑制、RNAiに関与することが報告されている。AtUPF1は個体成長の様々な段階で重要な役割を担うことが示唆され、lba1は植物UPF1の機能解析に有効と思われる。

抄録全体を表示

ナンセンス変異をもつmRNAから翻訳された不完全なタンパク質は生体に異常を引き起こす危険をもつ。生物はそのような異常なmRNAを監視し、分解する機能を持つ。これはNMD（nonsense-mediated mRNA decay）として動物および酵母においてよく知られている現象である。植物においてもNMDの中で重要な因子であるUPF1、UPF2、UPF3に高い相同性を持つタンパク質の存在がシロイヌナズナのゲノム情報上推定されており、NMD機構の存在が予測されているが、詳細な解析はなされていなかった。
本研究では配列データベースから375遺伝子のNMD標的遺伝子候補を予測し、さらにこの中で5つのNMD標的遺伝子候補の遺伝子構造を解析した結果、選択的スプライシングによりナンセンス変異を持つmRNAと持たないものmRNAが生じていることがあきらかとなった。このナンセンス変異を持つmRNA が実際にNMDの標的になっているかを、UPF3の機能が破壊されているatupf3-1変異体と野生型を用いて確認した結果、atupf3-1変異体においてナンセンス変異を持つmRNA は蓄積量および安定性ともに上昇していた。以上により植物にもNMDに類似した機構が存在し、UPF3が関与していることを示した。また植物においてNMDが選択的スプライシングから生じる異常なmRNAを抑制する働きがあることが示唆された。

抄録全体を表示