【目的】我々が開発してきたラットの胎児を体外に取り出し培養し、医薬品の毒性を観察する方法は哺乳類胎児の脳神経系の発達を解析するのに最適の実験系である。今回、MAM誘発性小頭症を改善あるいはその発現を防ぐ医薬品の検索目的でニセルゴリン（NSG）の培養ラット胎児への影響を観たので報告する。
【方法】妊娠11日目のラット胎児を体外に取り出し48時間の培養を行った。検査化合物はニセルゴリン(NSG)　20μｇ/mlとし、培養液内処理とした。
【結果】ニセルゴリン（NSG）全処理群は培養ラット胎児の成長指標である、胎児頂殿長、胎児心拍動数、総体節数、胎児蛋白量において対照群と差は無かった。また、外表形態においても異常は認められなかった。
【考察】このNSGの臨床血中量処理がMAM処理培養ラット胎児の発現小頭症にどのような影響を及ぼすか併用実験を現在進行中である。

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【目的】我々が開発してきたラットの胎児を体外に取り出し培養し、医薬品の毒性を観察する方法は長期間の正常培養が目標である。これら哺乳類の全胚培養が失敗するのは、ラットの母体外へ胎児を摘出する時の出血量が原因である。今回の報告はこれらの出血を止血する化合物の培養ラット胎児への影響を観察した。
【方法】妊娠11日目のラット胎児を体外に取り出し48時間の培養を行った。検査化合物はメシル酸アドレノクロムモノアミノグアニジン（MAMG）50，100μｇ/mlとし、培養液内処理とした。
【結果】MAMG全処理群は培養ラット胎児の成長指標である、胎児頂殿長、胎児心拍動数、総体節数、胎児蛋白量において対照群と差は無かった。また、外表形態においても異常は認められなかった。
【考察】このMAMGの低用量処理が止血効果を生み出し培養全体の時間を長期化できる可能性が出てきた。

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【目的】我々が開発してきたラットの胎児を体外に取り出し培養し、医薬品の毒性を観察する方法は長期間の正常培養が目標である。これら哺乳類の全胚培養が失敗するのは、ラットの母体外へ胎児を摘出する時の出血量が原因である。今回の報告はこれらの出血を止血する化合物の培養ラット胎児への影響を観察した。
【方法】妊娠11日目のラット胎児を体外に取り出し48時間の培養を行った。検査化合物はトラネキサム酸10，50，100μｇ/mlとし、培養液内処理とした。
【結果】トラネキサム酸（TRK）全処理群は培養ラット胎児の成長指標である、胎児頂殿長、胎児心拍動数、総体節数、胎児蛋白量において対照群と差は無かった。少し培養初期段階で培養ラット胎児の卵黄嚢の血液循環にばらつきが観られたが直ぐに修復した。また、外表形態においても異常は認められなかった。
【考察】このTRKの低用量処理が止血効果を生み出し培養全体の時間を長期化できる可能性が出てきた。

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【目的】我々が開発してきたラットの胎児を体外に取り出し培養し、医薬品の効果を観察する方法は哺乳類胎児の脳神経系の発達を解析するのに最適の実験系である。今回、MAM誘発性小頭症を改善あるいはその発現を防ぐ医薬品の検索目的でアデホスコーワ（ADK）の培養ラット胎児への影響を観たので報告する。
【方法】妊娠11日目のラット胎児を体外に取り出し48時間の培養を行った。検査化合物はアデホスコーワ(ADK)　30μｇ/mlとし、培養液内処理とした。
【結果】アデホスコーワ（ADK）全処理群は培養ラット胎児の成長指標である、胎児頂殿長、胎児心拍動数、総体節数、胎児蛋白量において対照群と差は無かった。また、外表形態においても異常は認められなかった。
【考察】このADKの臨床血中量処理がMAM処理培養ラット胎児の発現小頭症にどのような影響を及ぼすか併用実験を現在進行中である。

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PCBの2,4,5-三塩素置換であるCB118、CB138、CB153およびCB180は海洋哺乳動物やヒトを含む各種動物の肝臓、脂肪組織、母乳中などに高濃度に検出される。そこで我々はCB77、CB118およびCB52を合成して、ラット胎児培養法を用いてこれらPCBの胎児毒性を調べたので報告する。
　ラット胎齢11.5日目の胎児を母獣より取り出し、48時間培養を行った。培養開始2時間後に、CB52、CB118および CB77を培養液中に10および100ppmの濃度になるよう添加した。また対照群は溶媒として使用したDMSOのみを添加した。そして培養中の胎児心拍動数、および培養終了時の胎児の形態形成について検討した。
　CB52, CB77, CB118は100ppmまで検討したが、培養胎児心拍動数に作用を持たなかった。CB52は、10ppm 処理群で培養48時間後に後肢に浮腫を発現させたのみで他に異常を起こさなかった。100ppm処置群でも曲尾を発現させたのみであった。一方、CB118は10ppm処置群で顔面部の出血や短尾などを起こし、100ppm処理群では前頭部発育遅延、上顎の低形成、口唇裂さらに全身性の発育遅延などを発現させた。CB77は10ppm処理群で上顎の低形成や口唇裂を誘発させ、100ppm処理群ではさらに全身性の出血などを起こした。CB77の組織に変化を及ぼす作用に濃度依存性が認められた。以上の結果から、WHOの毒性評価に準じて評価すれば、CB77およびCB118に強い胎児毒性が認められた。胎児に対する毒性の強さは、置換塩素の数よりも位置より変化することが示唆された。さらに、これら誘導体は心拍数に変化を及ぼさなかったことから、組織に及ぼす作用は循環障害による二次的な作用ではなくこの薬物の持つ直接作用と考えられる。今回CB52に浮腫の発現が認められたことから、毒性対象外となっている物質についても、さらに検討が必要と考えられた。

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【目的】幼若動物における酵素誘導についてのデータを収集するために，日齢の異なるラットを用いて，PPAR alpha agonistであるClofibrate(CL)によって酵素誘導処理したときの肝cytochrome P450（CYP），およびperoxisome酵素の変化について検討した。
【方法】生後12日齢，26日齢，および7.5週齢のCrl:CD(SD)雌雄ラットにそれぞれCL（150 mg/kg）4日間投与群と無処置群を設定した（12日齢：雌雄各20匹，他：雌雄各6匹）。肝臓の重量を測定した後，Microsomeおよびperoxisomeを調製し，Ethoxyresorufin O-deethylase，Methoxyresorufin O-demethylase，Testosterone 2 alpha-，7 alpha-，16 alpha-，6 beta-(T6B)， 16 beta- hydroxylase，peroxisomal beta-oxidation(PBO)，peroxisomal Acyl-CoA oxidase(ACO)，peroxisomal catalase(CAT)活性を測定した。
【結果】CL投与によりすべての日齢の雌雄で相対肝重量が増加した。肝重量は12日齢群(約40%)の方が26日齢群(約10%)に比べて大きく増加した。CLのCYPへの影響は，12日齢群および7.5週齢群の雌雄でT6Bが上昇したことを除けば，すべての日齢でほとんど認められなかった。一方peroxisomeでは，すべての日齢で雌雄ともに無処置群と比較してPBOの上昇が認められ，12日齢群(8-10倍)の方が26日齢群(2-3倍)に比べて大きく上昇した。また，7.5週齢でみられたCLによるPBOの上昇の性差は12日齢と26日齢ではみられなかった。ACOに関してもPBOと同様な傾向が認められた。CATでは12日齢群の雌雄のみに有意な上昇がみられた。
【まとめ】以上より，幼若ラットでは7.5週齢と同様にCLによってCYPに大きな変化は起こらないが，peroxisomeの酵素が誘導されることが示され，肝重量の増加と酵素活性の上昇に相関がみられた。また7.5週齢でみられるCLによるPBOおよびACOの酵素誘導の性差は12日齢と26日齢ではほとんどみられないことが示された。

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【目的】我々は第32回本学会学術年会において，幼若動物における酵素誘導の影響について調べ，Phenobarbital(PB)を投与したラットの肝cytochrome P450(CYP)活性が日齢により変化することを報告した。今回さらにPBによる酵素誘導処理後の肝CYPにおけるmRNA発現の変化について検討したので報告する。
【方法】生後12日齢，26日齢，および7.5週齢のCrl:CD(SD)雌雄ラットにPB(80 mg/kg)を4日間投与し，同時に無処置群を設定した(12日齢：雌雄各20匹，他：雌雄各6匹)。投与期間終了後肝臓を摘出し，CYP2A1，2A2，2B1，2B2，2C6，2C11，3A1，3A2およびGAPDHについてリアルタイムPCR(ABI PRISM 7000)によりmRNA発現を定量した。
【結果】無処置群において，7.5週齡ではCYP2A2，2C11，3A2のmRNA発現に大きな性差がみられたが(雄＞雌)，12日齢および26日齢では顕著な性差はみられなかった。また，雄のCYP2A2，2C11，3A2のmRNA発現に日齢差が認められた(12日齡≦26日齢＜7.5週齡)。PB投与群において，7.5週齢ではCYP2B1，2B2，2C6，3A1のmRNA発現が雌雄ともに増加し，CYP3A2は雄のみ，CYP2A1は雌のみ増加した。26日齢ではCYP2A1，2B1，2B2，2C6，3A1および3A2のmRNA発現が雌雄ともに増加し，12日齢ではCYP2A1，2B1，2B2，2C6，3A1のmRNA発現が雌雄ともに増加した。CYP2A2，2C11のmRNA発現は，PB投与でいずれの日齢にも変化がみられなかった。
【まとめ】PB投与により，幼若ラットにおいてもCYP2B1，2B2，2C6，3A1が誘導されることが示された。また，CYP3A2はPB投与により雌雄ともに26日齢で誘導され，7.5週齢では雄のみ誘導されることが示された。前回報告したPBによるTestosterone 2 alpha-，7 alpha-，6 beta-，16 beta- hydroxylase活性の変化と，それぞれに対応する各CYPのmRNA発現の変化はほぼ相関しており，今回の実験から幼若ラットにおける肝CYPの誘導の詳細が明らかになった。

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【目的】Phenobarbital(PB)は抗不安薬・抗てんかん薬として広く使われており，ホルモンへの影響を及ぼすことが知られている。特に，ヒトで幼少期に投与することにより，性成熟の遅延，生殖能の低下が引き起こされることが知られている。そこで，本実験では日齢の異なるラットを用いて，PBが血清中テストステロン（Ts）およびLH濃度へ及ぼす影響を調べた。
【方法】生後12日齢，26日齢，54日齢，および78日齢のCrl:CD(SD)雄ラットにそれぞれPB（80mg/kg）を4日間腹腔内投与した群と無処置群を設定した（12日齢：20 rats/sex/group，他：6 rats/sex/group）。各動物からイソフルラン麻酔下にて腹大静脈より採血を行った後，ELISAにより血清中のTs，LH濃度を測定した。 また，ステロイドホルモンの代謝に関わると言われているcytochrome P450（CYP）の変化を調べるため，肝臓からMicrosomeを調製し，Testosterone 6 beta-（T6B），16 alpha-（T16A），16 beta-（T16B）hydroxylase活性を測定した。
【結果】血清中Ts濃度は12日齢PB投与群では無処置群と比較して約0.3倍と減少傾向を示し，26，54，78日齢PB投与群では各日齢の無処置群と比較してそれぞれ1.2倍，1.7倍，1.2倍とやや増加傾向が見られた。また，血清中LH濃度は12日齢PB投与群では無処置群と比較して約2倍と増加傾向を示し，26，54，78日齢PB投与群では各日齢の無処置群と比較して約0.7倍，0.9倍，0.6倍とやや減少傾向を示した。また，各CYP活性はPB投与により全ての日齢で無処置群と比較して上昇を示した。
【まとめ】PB投与により12日齢ではTsの減少傾向とLHの増加傾向が見られ，その他の日齢ではTsの増加傾向とLHの減少傾向が見られた。一方，CYPはPB投与により12，26日齢においても54，78日齢とほぼ同程度に誘導された。以上の結果より，PB投与による血清中Ts，LH濃度への影響は12日齢とその他の日齢では異なることが示唆された。

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【目的】性ホルモンは性成熟のみならず，幼若期には脳の性分化などに関わることが知られており，幼若期に受けた性ホルモンの変化による影響は成熟期に現れることもある。したがって幼若動物における性ホルモン濃度の変化を知る事は毒性予測の面から重要であるが，幼若動物の性ホルモンに関する基礎的なデータは少ない。そこで，本実験では日齢の異なるラットを用いて，血清中のテストステロンおよびLH濃度の成長に伴う変化を調べた。
【方法】生後16日齢，27日齢，30日齢，58日齢，および82日齢のCrl:CD(SD)雌雄ラットよりイソフルラン麻酔下にて腹大静脈より採血を行った後，ELISAにより血清中のテストステロン，LH濃度を測定した（16日齢：8 rats/sex，他：6 rats/sex/group）。
【結果】雄では，血清中テストステロン濃度は16日齢，27日齢，および30日齢では大きな変化はなかったが（0.26-0.36 ng/ml），58日齢および82日齢では16日齢に比べてそれぞれ約3倍（0.77 ng/ml），約12倍の高値を示した（3.16 ng/ml）。雌ではテストステロン濃度は全ての日齢で低い値（0.03-0.12 ng/ml）を示し，大きな変化は見られなかった。一方，血清中LH濃度については，雌雄共に30日齢までは大きな変化は見られないが（1.57-3.05 ng/ml），58日齢（3.09-5.82 ng/ml）から82日齢（5.85-6.58 ng/ml）にかけて増加傾向が認められた。
【まとめ】血清中テストステロン濃度は，雄では生後58日から82日齢で急激に増加し，雌では日齢に関わらず低値を示した。また，LH濃度は，雌雄共に30日齢以降で成長に伴い増加することが示された。

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［目的］これまでの医薬品では、成人による臨床試験及び成熟動物による非臨床試験のみで有効性・安全性が確かめられている場合が多いため、小児への適応外使用(Off-label use)が問題とされてきた。近年、臨床ではICH においてE11「小児集団における医薬品の臨床試験におけるガイダンス」が日米欧で合意に達し、2000年12月15日に通知が発せられた。一方、非臨床についてもFDAやEMEAから幼若動物毒性試験法ガイダンス（案）が発表された。そこで、日本製薬工業協会／基礎研究部会／タスクフォース14 小児用医薬品開発のための非臨床試験検討では、申請資料調査、アンケートの実施及びガイダンス検討を行い、幼若動物毒性試験に関する現状についての検討を行った。本発表では、申請資料調査の結果について報告する。［方法］平成11年9月から平成17年4月までに国内で小児適応を取得した医薬品について、公開されている申請資料・審査資料・添付文書をもとに、小児適応の内容及び取得時期、幼若動物試験の実施状況及び試験内容について調査した。［結果及び考察］対象となる期間中、31品目の医薬品で小児適応が取得されていた。成人での承認取得と同時／成人での承認取得後の適応取得がほぼ同数で、小児のみの承認取得も3品目あった。小児適応の年齢については、半数の薬剤で具体的な年齢の記載がなかった。18品目で幼若動物試験が実施されていたが、安全性薬理試験は実施されておらず、薬効薬理試験や薬物動態試験を実施した薬剤も少数であった。幼若動物試験を実施した18品目は、少なくとも1試験以上の毒性試験を実施していた。使用した動物種は1種あるいは2種で、そのほとんどがラットあるいはイヌを用いていた。また、用いた動物の投与開始日齢／週齢、投与量設定の根拠、成熟動物での毒性試験成績との相違点、等についての集計／解析についても紹介する。

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日本製薬工業協会（製薬協）／基礎研究部会では小児用医薬品開発のための幼若動物を用いた非臨床試験に関する検討を行っている。製薬協では、2001年度にも同様の検討を行っているが、近年の小児用医薬品開発における幼若動物試験の重要性に関する議論の高まりを受けて、2005年度、新たに「小児適用医薬品開発のための非臨床試験検討」タスクフォースを立ち上げ、この問題について情報収集を行い、政策提言を目標として活動している。本テーマについて、2001年度の製薬協における検討の中では、製薬協加盟各社に対してアンケート調査が行われたが、その当時は小児用医薬品開発のために幼若動物を用いた非臨床試験を実施するという概念が明確ではなく、関連する情報もほとんどなかった。しかし、その後FDAおよびEMEAからドラフトガイダンスが提出され、セミナーや学会でも幼若動物試験について数多く取り上げられるようになった。その結果、製薬企業各社の取り組みや研究者の意識に変化がもたらされていると推察される。そこで、再度、アンケート調査を行い、幼若動物試験の実施経験、被験物質の薬効分類、GLPの適否、試験デザイン、動物種、動物数、投与開始日、投与期間、投与経路、観察項目およびTKなどの試験方法、幼若動物と成熟動物との間での毒性発現の差異および血中薬物濃度の比較、幼若動物に特異的変化の有無などの試験結果、さらに、申請資料としての利用状況についても回答を求めた。今回の発表では、アンケート結果に基づき、前回の調査から5年間における幼若動物試験に対する取り組みや意識の変化を比較検討し、現状を把握すると共に今後の方向性について報告する。

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近年、小児用医薬品開発のための幼若動物を用いた非臨床安全性試験の重要性が注目されている。これを受けて、日本製薬工業協会／基礎研究部会では小児用医薬品開発のための幼若動物を用いた非臨床試験に関する検討を行っている。今回、欧米における幼若動物試験に関する基本的な考え方を理解するため、FDAにより2006年に発行されたガイダンス (FDA-GD) とEMEAより2005年に示されたドラフトガイドライン (EMEA-GL) を比較検討した。FDA-GD, EMEA-GLとも、必ずしもすべての小児用医薬品に対して幼若動物試験の実施を要求しているわけではなかった。成人での安全性データ、既存の成熟動物試験データから対象となる小児での安全性を十分評価することができない場合、毒性標的器官が神経系や生殖系など生後に発達する器官とみなされる場合には実施すべきであると示されていた。推奨する試験デザインは動物種、投与経路、投与期間、エンドポイントなどに関して両者に大差はなかった。しかし、用量設定については以下の相違がみられた。FDA-GDでは用量-反応関係がみられるように、高用量は毒性がみられる量、低用量は毒性がほとんど認められない量を設定するとされていた。EMEA-GLでは高用量は明らかな毒性を生じない量、低用量では臨床曝露に近い量に設定し、成熟動物試験と共通の用量を含めることも求められていた。この用量設定に関する相違は両者における幼若動物試験の目的の違いに起因していると考えられた。すなわち、FDA-GDでは既存データで検討されていない成長・発達への影響の評価に主眼が置かれていることに対して、EMEA-GLでは成熟動物との薬物に対する反応性の違いや生後に発達する器官への影響を明らかにすることに主眼が置かれていた。今後、この幼若動物試験の目的に関する議論を深める必要性が示唆された。

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【目的】Benzophenone (BP)は紫外線防止剤として広く用いられている．我々はBPの代謝物4-hydroxybenzophenone (HBP)にin vitro, in vivo共に女性ホルモン様作用を有することを報告した(Toxicol 2000, Arch Toxicol 2001 & 2002)．しかしin vivoでHBPの雄性生殖器系への影響を調べた報告は少ない．そこで，感受性の高い哺乳期雄性ラットへのHBP投与を行い，その影響を調べた．【方法】妊娠Crj:CD(SD)IGSを購入し，雄産仔について出生2日目より21日目までHBP〔0 (DMSO; 溶媒対照), 0.01, 0.1, 1, 10, 50, 100 mg /kg/day〕および17β- estradiol 〔陽性対照; 0.001mg /kg/day〕を皮下投与した． 一部は22日齢で，残りは離乳後，13週齢で剖検した．体重は離乳まで毎日，その後毎週測定した．剖検時に生殖器系の臓器重量を測定し，ホルマリン固定標本について病理組織変化を観察した．13週齢では精子パラメ_-_タ（精子数・運動性等）についても粒子計測装置・精子分析器による方法(Reprod Toxicol印刷中)で検討した．【結果および考察】HBP投与群の体重は対照群と比べ高濃度群で小さい傾向を示した．臓器重量は，22日齢ではHBP高濃度群で前立腺・精巣上体の絶対重量に減少がみられたが，相対重量には変化はなかった．13週齢では各臓器の絶対・相対重量に差は認められなかった．22日齢および13週齢の病理組織学的観察ではHBP投与による明らかな変化はみられなかった．また精子パラメ_-_タにも影響はみられなかった．22日齢の高濃度群での臓器重量の減少は体重の低下傾向の影響であると考えられた．以上より哺乳期雄性ラットへのHBP 投与(0.01-100 mg/kg) は生殖器系には影響を及ぼさないことが示唆された．

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The Bovine Corneal Opacity and Permeability Assay (BCP-P assay) has been accepted by the EU national coordinators at their 28th meeting as an alternative to the Draize rabbit eye irritation test and is used to classify a chemical as irritant (R41). The BCO-P assay may be routinely used for assessment of safety and as a test to classify and label chemicals as “severely irritating to the eyes”. This organotypic assay is considered acceptable by the national authorities where a positive result in respect to severe irritancy is obtained. In this case no further animal testing is necessary. Normally in the BCO-P assay the bovine eyes are collected as fresh as possible after slaughter from an abattoir. The corneas are isolated shortly and the tests are performed as soon as possible (no longer than 12 hours). In order to optimize the test conditions, we have performed some validation studies to estimate the differences of the test results between applying fresh bovine eyes and using eyes which are preserved in MEDIUM 199 Modified supplemented with Dextran. We have also compared the BCO-P results, in which the corneas from the animals in different ages were used. In the validation studies three positive control substances, 2-ethoxyethanol, imidazol (20%) and benzalkoniumchlorid, have been tested for various treatment times. The validation studies are useful for further optimizing the BCO-P test conditions and increasing the reliability of this method.

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【目的】陸生野生哺乳類に対する環境汚染物質の生体影響を調べた研究報告は極めて少ない。本研究では身近な野生動物であるドブネズミの汚染とその生体影響を検討することを目的とした。【方法】ドブネズミは実験動物ラットと同種のため、ラットを対照として用い、北海道のゴミ埋め立て処理場、東京の新宿駅、池袋駅周辺、大阪の梅田駅、難波駅周辺より採集した。水晶体重量より週齢を推算し、性成熟後の雄固体を解析に用いた。肝臓に蓄積するダイオキシン類、臭素系難燃剤、有機塩素系農薬について化学分析を行い、クラスター解析を用いて主要な汚染源の推測を行った。また、精巣への影響について、Affimetrix社のGene chipを用いて発現遺伝子の変動についてスクリーニングをし、変動を同定した遺伝子の発現量測定をリアルタイムＰＣＲで行い、発現量と環境汚染物質蓄積との関係を個体ごとに解析した。【結果および考察】ダイオキシン毒性換算当量(以下TEQ)が顕著に高い新宿由来の1個体の精巣において、テストステロン合成に重要な酵素CYP17,CYP11AおよびStAR蛋白の明らかな低値が見られた。また、CYP1A1においては全ての個体の精巣で発現が誘導された。また、遺伝子スクリーニングの結果から、実験動物ラットの精巣に比べて、アポトーシス関連遺伝子の変動も観察され、精子形成のエネルギー産生に重要な遺伝子の上昇などが認められた。今回、精巣に発現するステロイド代謝関連遺伝子の変動から、食物連鎖の下位に位置する野生げっ歯類においても環境汚染物質暴露の影響が現れている実例が存在することが明らかになった。

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【目的】ラットはヒトと比べて体重あたりのエネルギー消費量が多く、消灯時の活動期に断続的な摂食活動を継続しなければ正常な発育を維持することができない。一方、ラットの毒性試験では、血液検査条件の標準化や肝臓の病理組織学的検査の精度向上などを目的として剖検前夜の消灯前から絶食処置を施すことが多い。しかし、絶食開始から剖検までのエネルギー代謝の変動を経時的に調べた報告は少ない。本報告では、ラットにおける絶食条件下のエネルギー代謝の経時変動を調べた。【方法】消灯1時間前から絶食を開始し、25時間後までの肝臓や血液などにおける糖新生酵素PEPCK、β酸化、蛋白分解酵素をはじめとするエネルギー代謝関連項目を測定し、絶食処置を施さなかった場合と比較した。【結果及び考察】絶食処置を施したラットでは、絶食後5時間以内に肝グリコーゲンが急速に枯渇する一方、速やかに肝臓及び腎臓のPEPCKの活性が亢進した。また、糖新生の活性化と関連して、肝臓の細胞質あるいはミトコンドリア画分及び血中においてAST/ALTの高値が確認された。しかし、血糖値の低下を止めるには至らず、糖新生による血糖維持には限界があることが示唆された。これらの変動とほぼ並行して、代替エネルギー源である遊離脂肪酸やケトン体の血中濃度の増加がみられ、特に、ケトン体は絶食3時間後より増加し、その後著しく上昇した。ラットにおけるこれらの変化は、ヒトの絶食時の変動と比較して、非常に短時間で生じることが特徴的であった。以上の結果から、ラットではヒトと異なり、短時間の絶食がエネルギー代謝に著しい影響を及ぼすことが示唆された。エネルギー代謝系に何らかの影響を及ぼす被験物質では、げっ歯類の非絶食時やヒトの絶食時には発現しない、げっ歯類の絶食時に特有の変化が投薬によって顕在化する可能性があると考えられた。

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【目的】我々は、細胞増殖を抑制することが知られている物質のひとつである2-amino-bicyclo-(2,2,1)-heptane-2-carboxylic acid (BCH)を、化学発癌誘発ラット膀胱癌に投与することで膀胱癌が縮小することを報告した。今回はBCHによる腫瘍抑制の作用機序を明らかにすることを目的として、ヒト膀胱癌培養細胞株T24を対象として、マイクロアレイ解析を行い遺伝子発現プロファイルの検討し、候補遺伝子を探索する。【方法】T24細胞にBCHを添加後、1、4、6、12、24時間後の発現変動遺伝子をHuman Whole Genomeアレイ（Code Link）を用いて約53000遺伝子についてBCH投与群、未投与群間の比較検討を行った。2倍以上の発現変量が認められた遺伝子群を対象としてGene Ontology (GO)分類に基づいた機能分類を行った。さらに経時的発現変化についてパスウェイ解析の検討を行った。【結果】BCH処理後の経時的変化から、処理後6時間で発現上昇遺伝子のピークを認めた。これに対し、処理後24時間で発現減少遺伝子のピークが認められた。機能分類ではCell Signaling, Molecular Transport, Cell Cycle, Cell Deathが認められ、パスウェイ解析ではCell Cycle, Cellular Movement, Cancer, Cell Signaling, Repair, Cell Deathといった細胞のプロセスが認められた。【総括】遺伝子発現解析でBCHのT24細胞への作用は投与後6？24時間の間であった。さらに、変動遺伝子の分析から作用機序に関連する候補遺伝子の検討を行う。

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Positive Reinforcement Training (PRT) is widely acknowledged amongst animal behaviourists as the most effective and welfare enhancing method of achieving co-operation from animals in a wide range of situations where human/animal interaction takes place. A co-operative animal is a less stressed animal and therefore a more accurate model for toxicity testing. PRT has been well documented in a laboratory setting particularly in academic behavioural research. However, the use of PRT in dogs and macaques involved in regulatory toxicity testing is less well defined. In toxicity studies there are a number of challenges regarding the use of “nutritional treats” as a positive reinforcement such as the possible compromise of food intake measurement or use of unanalysed food products. The complex and intensive nature of toxicity studies also compromises the effectiveness of such training as it may be difficult to overcome the aversive nature of repeated procedures. It is however, possible to overcome these challenges and maintain study integrity whilst enhancing the welfare of both the animals and personnel involved.

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【目的】日本製薬工業協会（製薬協）では、新薬の創製に不可欠な動物実験の適正な実施に取り組んでおり、その成果のひとつとして2005年1月に「動物実験に関するガイダンス（製薬協ガイダンス）」を発出した。この間、2002年に「動物の愛護及び管理に関する法律」の見直しの動きに呼応して、「動物福祉への取り組み状況」を調査する目的で製薬協会員会社へのアンケートを実施した。2005年6月には改正「動物愛護管理法」が公布された。このような状況に鑑み、製薬協ガイダンスに沿った自主管理への取り組み状況を把握する目的で、改めてアンケート調査を実施した。
【方法】2005年10月に製薬協基礎研究部会加盟の74社に対しアンケート調査を実施した。設問は、製薬協ガイダンスに沿って(1)製薬協ガイダンスの認知度、(2)動物実験の実施、(3)動物実験に係る社内規則の作成、(4)実験動物の飼育管理及び動物実験に係わる施設を管理する者（管理者）の設置、(5)動物実験委員会の設置、(6)実験動物の飼育管理及び動物実験に関わる規則等の整備、(7)動物実験計画書の作成・承認、(8)教育訓練、(9)記録の保存とした。
【結果】アンケートの回答率は100％であった。そのうち自社内で動物実験を行っている会社(2)は82.4％（61社）であった。動物実験を実施している61社の項目別回答内訳は、(1)製薬協ガイダンスの認知度：100％、(3)社内規則の作成：98.4％、(4)管理者の設置：96.7％、(5)動物実験委員会の設置：90.2％、(6)諸規則等の整備：96.7％、(7)計画書の作成・承認：93.4％、(8)教育訓練の実施：82.0％、(9)記録の保存：98.4％であった。
　前回アンケート結果と比較し、自主管理への取り組みが進んでいると推察された。

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　GHS（Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals）では、化学物質の健康有害性に関し、急性毒性、刺激性、発がん性など10項目についてGHS基準に従い有害性を分類しなければならない。そのためには、効果的な毒性情報の収集・評価が不可欠である。毒性情報は学術報告に基づくが、GHS分類のために個々の既存物質の論文を調査することは現実的ではなく、また相反する知見もあり統一的結論を導きにくい。そこで、汎用されている毒性情報源について、どの情報をどのように利用するのが効果的か検討した。各情報源を、広範性（対象毒性ならびに物性等の付随情報の有無）、深度（総合評価/結果収載/要約のいずれか）、情報トレース性（引用文献の有無、一次文献主体か否か）、国際性（審査過程の範囲/有無）、対象化学物質数、使用言語、利用容易性（ネット/成書、有料/無料）について評価した。EHC、CICAD、EU Risk Assessment Report、SIDS、ATSDR Toxicology Profiles、DFG Occupational Toxicantsなどの国際/主要各国政府機関作成の総合評価文書は、一次文献に基づいた広範な動物およびヒトにおける毒性情報やヒト疫学情報から、当該データの適切性をも考慮した独自の評価を提示している点で有用性が認められた。一方、特定分野、例えば、急性毒性、発がん性/遺伝毒性および特定標的臓器では、それぞれRTECS、IARCおよびACGIH/ICSCが有用であった。呼吸器感作性や吸引性呼吸器有害性の情報は、どの情報源においても極めて少なかった。精度の高い分類には、毒性情報の作成年次やその特徴を考慮し、複数の情報源を相補的に利用することが必要と考えられた。

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臨床試験に参加する被験者の安全性確保は、試験実施上の重要な課題である。過去に実施した臨床薬理試験（第I相試験）で発生した重篤な有害事象について、多数の医療機関を調査する事で、より安全性の高い試験の推進に有用なデータが提供されることから、臨試協では表題について定期的に調査している。第1回調査として、1993_から_1998年に実施された健康成人を対象とした臨床薬理試験の結果は、本学会第28回年会（2001）で発表した。〈BR〉今回、第2回として、1998年10月から2004年9月の6年間に、加盟17機関で実施された同種の1865試験（延べ参加被験者数47,845名）を対象に、重篤な有害事象について調査した。重篤な有害事象は33件（0.069%）で、その内訳は、投与との因果関係が否定できない事象が18件（0.038%）、因果関係が否定できる事象が15件（0.031%）であった。〈BR〉厚労省の労働災害統計における死亡及び休業4日以上の労働災害発生率0.189％（2003年度資料）と比較すると、これら発現率は一桁低い水準であった。因果関係の否定できない有害事象の発現率は、前回調査（0.01％）と比べ約4倍高かった。この理由は、1997年に施行されたGCPが普及定着して有害事象報告への対応が重視され、発生した有害事象と治験薬との因果関係の区分けに、より精度が要求されると共に、医療機関側として有害事象の取扱いに、より慎重な対応を取るようになったためと推測される。因果関係の否定できない重篤な有害事象としては、薬物の薬理作用の過剰発現に起因（4件）、ショック・アレルギー（2件）、生体反応に起因（2件）などであった。投与経路については経口投与での事象も多く認められた。なお、有害事象発現時の医療機関の対応は適切になされていた。〈BR〉臨試協としては、今後も加盟機関の管理者、医師、医療スタッフに対する教育の一層の充実を図り、臨床薬理試験における健康成人被験者の安全性確保に努めたい。

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単回投与毒性試験や反復投与毒性試験の実施方法については，すでにICHでも議論されており3極が合意したガイダンスも各極で発出されている。しかし，新医療用配合剤の申請に必要なこれらの毒性試験の考え方については，ICHで議論されることなく現在にいたっている。そのために，配合剤の申請に必要な毒性試験に関しては，日米欧で大きな違いが存在し，たとえば，日本では海外のように配合剤の申請に必要な毒性試験に特化したガイダンスは存在せず，また，配合剤の種類，例えば既承認薬同士の組み合わせ，既承認薬と新規化合物との組み合わせを考慮した上での，毒性試験の必要性についても明らかではない。本発表では，日米欧間でのこれらの違いについて解説するとともに，そのような違いが発生している背景，そしてこれらの違いに対し申請者側はどのように対応していくべきか，について考察する。

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ワクチンは生物学的製剤という特殊性により、その非臨床安全性評価において通常の医薬品を対象とした医薬品毒性試験法ガイドラインが必ずしも合致しているとは限らない。我が国にはワクチンの非臨床安全性試験に関するガイドラインがなく、現在、厚生労働科学研究班においてガイドラインの検討が行われている。日本製薬工業協会（製薬協）においてもワクチンの非臨床安全性試験タスクフォースが組織され、検討を行ってきた。今回、タスクフォースにおいて欧米におけるワクチンの非臨床安全性評価に関するガイドライン等を比較し、我が国のワクチンの非臨床安全性試験のあり方について検討を行った結果について、製薬協加盟企業に対して実施したアンケート結果も含めて報告する。
試験に使用する動物種については、製剤に感受性を有する動物種を選択することが重要であり、一般毒性及び生殖発生毒性の評価では、製剤の臨床での使用方法や薬効として惹起される免疫反応なども考慮した試験設計が必要と考えられた。また、製剤が生ワクチンであるか不活化ワクチンであるかにより、試験設計や安全性評価上の留意点も異なると考えられた。一方、ワクチンでは一般にその有効成分は分子量が大きな蛋白質であり、臨床投与回数も少ないことから、遺伝毒性及びがん原性評価の必要性は、通常の医薬品に比べて低いと考えられた。

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抗悪性腫瘍薬は副作用が発現する用量で投薬される等の特殊性のために，一般の医薬品とは異なる毒性パッケージを整えるケースが想定されている。製薬協基礎研究部会では，抗悪性腫瘍薬の非臨床安全性試験実施に関する問題点・疑問点等を明らかにすることを目的として，2005年6月6日から6月30日の間に自由記載方式によるアンケート調査を実施した。
製薬協加盟76社（調査実施時）中35社から回答があり，その内訳は内資系22社（12社が抗悪性腫瘍薬の開発経験あり），外資系13社（9社が抗悪性腫瘍薬の開発経験あり）であった。回答総数は89項目であり，主な回答としては，反復投与毒性試験関連の質問18項目，生殖発生毒性試験関連の質問16項目，臨床（初回投与量の設定根拠等）関連の質問9項目，毒性パッケージ関連の質問11項目であった。その他の回答としては，薬剤の分類に関する質問が4項目，遺伝毒性試験・がん原性試験・免疫毒性試験・併用毒性試験・無毒性量算出の必要性に関する質問がそれぞれ3項目，安全性薬理試験・試験の実施時期に関する質問がそれぞれ2項目，単回投与毒性試験・薬効薬理試験・ADME試験に関する質問がそれぞれ1項目あった。これら89項目の回答を整理し，抗悪性腫瘍薬の非臨床安全性試験に関するQ&Aの質問として21項目にまとめた。発表では，これらの質問への回答案並びに第I相臨床試験開始まで及び承認申請までに必要な非臨床安全性試験パッケージについても提案する。

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【目的】製薬企業における非臨床安全性評価を取り巻く環境が変化している。研究部門が縮小・閉鎖され、非臨床試験は創薬・探索試験へ集中化される傾向がみられる。この結果、安全性試験実務の機会が減少し、安全性試験の実務を修得する機会が失われていることが懸念される。日本製薬工業協会（製薬協）基礎研究部会では、非臨床安全性研究担当者育成の教育に関するアンケート調査を行った。本演題では、調査結果から、非臨床安全性研究担当者の教育の現状と課題を明らかにし、今後の教育の在り方を探る。
【方法】製薬協基礎研究部会加盟73社を対象に、2005年10月から11月にかけてアンケート調査を実施し、61社より得られた回答を検討した。
【結果および考察】全体の84％の企業で他業務とは独立した安全性評価組織を保持していた。しかし、全体の35％の企業では安全性の試験施設を保有していなかった。GLP試験に関しほぼすべてを社内で実施している企業は3％にすぎず、49%の企業が一部、28%の企業ですべて外注していた。97％にあたる57社では非臨床安全性研究担当者の育成のために、実務経験や学会参加なども含めて何らかの教育活動を実施していた。しかし、「教育活動に満足していない」とする企業は75％に及んだ。満足しない理由として最も多かったのは、治験薬概要書作成や申請対応などで必要とされる総合的安全性評価能力に関する教育の不足であった。
教育内容の充実が必要な教育として、総合的安全性評価、レギュレーション対応、認定トキシコロジスト等資格制度が挙げられ、これらの教育推進や教育プログラムの提供を関連学会に期待する企業が多かった。
発表では、社外教育の活用状況、今後必要と感じている教育内容およびプログラムを含む日本の製薬企業における実施状況についても報告する。また、欧米での教育に関する情報を入手し、日本での教育との比較を行う。

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【目的および方法】製薬協基礎研究部会「教育」タスクフォースが実施したアンケート結果(本学会:浅見ら)から、安全性試験実務者に対する教育の現状と課題を報告する。
【結果および考察】「動物の取扱いや一般的な実験技術」や「病理検査等の専門性の高い教育」など技術習得が必要な教育、「TK分析や安全性以外の専門知識(薬物動態や統計等」の習得を目的とした教育は、国内に安全性試験施設を保有する企業(37社)の90％以上で実施しているのに対し、国内に安全性試験施設を持たない企業(20社)での教育の割合は低かった。その教育活動は社内講師による新人教育や実務経験(OJT)が多く、次いで日本トキシコロジー学会等の社外教育や毒性病理専門家等の資格制度を利用していた。
　一方、「GLP教育」や「レギュレーションや規制当局対応に関する教育」は、施設保有の有無に関わらず多くの企業で実施され、その教育手段はGLP研修会など社外教育や実務経験による教育が多かった。教育対象者は試験施設を保有する企業では安全性試験実務者であったが、施設を持たない企業では実務者よりも総合的安全性評価担当者であった。
　このように、安全性試験施設保有状況の違いなど、各企業が必要に応じて教育内容を選択し、教育活動は実務経験と社外教育を併用していることが明らかとなった。個々の教育の内容や活動に「満足している」と回答した企業は何れの教育内容も約50％で、「満足していない」との回答は約30％であった。安全性試験施設保有の有無に関わらず多くの企業で、「専門性の高い教育」や「レギュレーションや規制当局対応に関する教育」の内容の充実が必要と回答した。また試験施設を持たない企業の70％で、「技術修得が不可欠である業務の教育」は必要と回答した。以上から、多くの企業が、安全性試験実務者の教育の現状に十分満足していないことが明らかとなった。発表では、その要因と課題を報告する。

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【目的および方法】製薬協基礎研究部会「教育」タスクフォースが実施した非臨床安全性研究担当者の教育に関するアンケート調査結果（本学会：浅見ら）から、特に非臨床試験成績から臨床での安全性を総合的に判断できる総合的安全性評価者の教育の現状と課題について報告する。
【結果および考察】アンケートの回答が得られた企業の95％にあたる58社において、非臨床安全性研究担当者の育成のための教育活動が実施されていた。しかし、その教育活動に「満足している」との回答は18%にすぎず、75%が「満足していない」と回答していた。満足しない理由として最も多かったのが、治験薬概要書作成や申請対応などで必要とされる総合的安全性評価能力に関する教育の不足であった。総合的安全性評価に関する教育として主に実施されている活動は実務経験（OJT）によるものであった。また34%の企業では総合的安全性評価に関する教育は実施されていなかった。
このような総合的安全性評価の教育の現状に「満足している」との回答は35％であったのに対し、「満足していない」との回答は50％であった。総合的安全性評価者の教育手段は、国内に安全性試験実施施設保有の有無に関わらず、実務経験が主体であったが、その教育の現状に「満足していない」との回答が、安全性試験実施施設を保有する企業での61%に比べ、保有しない企業では40%とやや低かった。これは安全性試験施設を保有しない外資系企業の多くが、総合的安全性評価の一部を海外本社に依存することによる違いを反映したものとも考えられる。
これらの調査結果から、多くの企業で総合的安全性評価者に対する教育は必要と考えてはいるものの、実務教育以外の有効な教育手段を見出せていないという課題が示唆された。発表では、様々な角度から層別解析した結果についても報告し、総合的安全性評価の教育の在り方について提言する。

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[目的] 心筋トロポニンT(cTnT)は臨床試験において心筋傷害のバイオマーカーとして用いられ，非臨床試験においても心毒性評価の新規バイオマーカーとして注目されている。我々はisoproterenolを投与したラットにおいて，薬物誘発性心筋傷害の検出感度の観点からcTnTが他の心毒性バイオマーカー(CK-MB，LDH_1,2)に比較して有用であることを第32回本学術年会で報告した。一方，ラットでは加齢に伴い自然発生性の心筋症が増加し，薬物誘発性心筋傷害を検出する際のcTnT測定の特異性が懸念されることから，この所見のcTnT測定に与える影響について検討した。
[方法] 無処置の雄性SD系ラット[Crl:CD(SD)]10匹について，6から20週齢時まで2週間間隔で鎖骨下静脈より採血し，全血中のcTnTの試験紙測定を行った。全例を20週齢時に解剖し，血漿中のCK-MB及びLDH_{1, 2}を測定するとともに，心臓の病理組織学的検査を行った。同様に，同一ロットの無処置の雄性SD系ラット10匹について，6週齢時にcTnT，CK-MB及びLDH_{1, 2}測定，心臓の病理組織学的検査を行った。
[結果] 20週齢時の心臓の病理組織学的検査では，軽度ながらほぼ全例で自然発生性心筋症が認められたが，6週齢時の心臓に同様の所見はほとんど認められなかった。6から20週齢時のいずれの測定時点においてもcTnTは陰性を示した。また，6及び20週齢時のいずれにおいても，CK-MB及びLDH_{1, 2}の明らかな増加はなかった。
[考察] 加齢に伴うラット自然発生性心筋症の増加によってcTnTが陽性を示す可能性は極めて低く，薬物誘発性心筋傷害の検出の観点からcTnT測定の特異性は高いと考えられる。

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Cardio toxicity assessment by troponin analysis is uncertain in non-clinical research due to unavailability of published data. The purpose of this study was to establish analytical methods for cardiac troponin in non-human primates and to determine troponin response to drug-induced cardio-toxicity. To confirm the analytical specificity, samples were prepared by extracting protein from heart and non-heart tissues and cTnI and cTnT levels were measured by cTnI (Life Diagnostics Inc.) and cTnT (Roche) EIA systems. Method validations were performed following FDA guidelines. Approximately, 100-fold higher values of cTnI and cTnT were observed in the heart tissue origin samples compared to those from non-heart tissue origins. To determine troponin responses to drug-induced cardio toxicity, Cynomolgus Monkeys were treated with 2 mg/kg/dose (10 mg/kg at last dose) of doxorubicin up to 38 mg/kg, and troponin levels were determined on Pre-, 6 and 24 hrs Post-dosing samples, depending on animal condition. The first cTnI elevation was observed after the second doxorubicin administration in high responding animal, and the frequency of positive troponin detection increased in a dose-dependant manner. Histopathological examination confirmed doxorubicin-induced myocardial damage, microvacuolation/degeneration of myocardial fiber, in troponin positive animals. Significant correlations were observed between cTnI and common biochemical/ECG parameters. These data suggested that cardiac troponin analyses are useful tools to assess drug-induced cardio toxicity in Cynomolgus Monkeys.

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Glutamate dehydrogenase (GLDH)は，細胞のミトコンドリアに存在し，特に肝細胞中に多く認められる。細胞が障害を受けると細胞外に漏出することから，肝細胞障害のバイオマーカーとしての可能性が注目されている。そこで，我々はGLDHの肝細胞障害に対するバイオマーカーとしての有用性を検討するため，ラット(Crl:CD[SD]) に肝臓小葉中心性の肝細胞壊死を誘発するアセトアミノフェン (APAP, 500, 750 or 1000 mg/kg)，あるいは肝小葉辺縁性に肝細胞壊死を惹起するアリルアルコール (AA, 30, 45 or 60 mg/kg)をそれぞれ経口投与した後，経時的に採血し，GLDH，LDH，ALT，AST，ALP，g-GTP および a-GSTを測定した。さらに投与72時間後にラットを安楽殺した後，肝臓を採取し，病理組織学的検査に供した。APAP1000 mg/kg投与では投与32時間後にGLDHは対照群の39倍に上昇し，投与72時間後まで，統計学的有意差を伴う高値を示した。ALT, AST, a-GSTは32時間後に6_から_9倍の上昇が見られた。APAP750 mg/kg投与ではGLDHが14倍に増加したが，それらの個体の病理組織学的検査で肝細胞壊死は観察されなかった。AA60 mg/kg投与では投与24から48時間後にGLDHが対照群と比較し7_から_11倍上昇した。ALT, AST, a-GSTは投与32時間後に1.1_から_2.6倍の上昇を示したのみであった。これらのことから，GLDHは，他の肝臓関連の検査項目に比較して，極軽度あるいは壊死に至らない程度の変化を含む細胞障害に対する感受性が高く，GLDH値の増加率が極めて高く，また，他のパラメーターに比較し高値が長期間持続するため，急性期の肝細胞障害パラメーターとしての有用性が示唆された。

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[目的]Flt3は血液細胞の分化・増殖に重要な役割を果たしている受容体型チロシンキナーゼである。近年，Flt3が急性骨髄性白血病の患者で高発現していることやFlt3リガンド（FL）が化学療法後の患者血清で増加することが報告されており，血液中FL濃度は臨床における骨髄あるいは白血球造血機能のマーカーと考えられている。一方，実験動物においては，放射線処理による報告はあるものの，低分子化合物の骨髄における白血球造血機能への影響とFLの関係を検討した報告はほとんどみられない。本発表では，骨髄毒性物質を投与したマウスを用いて，血液中の白血球数（WBC），好中球数（Neu）及び血漿中FL濃度を測定し，非臨床試験の白血球造血機能評価に対するFLの有用性を検討した。
[方法]10週齢の雄性Crlj:CD1(ICR)マウスにシクロホスファミド（CP）を100mg/kgの用量で単回腹腔内投与した。投与前及び投与3，7，10，14，21日後に，採血日あたり4-5匹のマウスを割り当て，エーテル麻酔下で腹大動脈より採血して自動血液分析装置によってWBC，Neu等を測定した。また，同時にヘパリン血漿を分離してELISA法によりFL濃度を測定した。
[結果及び考察]CP群では投与3日後にWBC及びNeuの顕著な減少が認められ，骨髄毒性が発現していると考えられた。WBCは投与7日後以降，Neuは投与10日後以降に回復傾向を示し，WBCは投与21日後，Neuは投与10日後に対照群と同等のレベルまで回復した。一方，FL濃度は投与3日後から明らかな増加を示し，投与7日後には対照群の1.5倍となった。投与10日後以降のFL濃度は対照群と同等であった。以上の通り，CP投与により骨髄毒性が発現したマウスでは， FL濃度の増加に続いてWBCやNeuの明らかな増加が認められた。これらの結果は，血漿中FL濃度が白血球造血機能の回復を早期かつ鋭敏に検出できる指標になりうることを示唆している。

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There is much anecdotal evidence on the benefits of group housing of non-human primates. Outwardly animals housed in groups make less noise, show less aggression to staff, are easier to handle, habituate to study procedures and show more natural behaviours than animals housed in single cages. However there is little scientific data to support the statement that group housed non-human primates are less stressed than those housed in single caging due to difficulties in measuring physiological parameters that would provide an accurate reflection of the animals state of well being. The performance of many sampling procedures will potentially elevate these parameters so the means of measurement adopted should be non-invasive and non-disruptive to the animals.An investigation was conducted in to the suitability of measuring faecal corticosteriod levels as an indicator of the physiological well being of group housed animals. This method is non-invasive and consequently the results would not be compromised by handling or sampling activities associated with other methods. Faecal samples were collected from 3 male and 3 female pens consecutively for 11 weeks and subject to extraction procedures prior to LC-MS analysis for the determination of androstan and cortisol levels. The methods of extraction and analysis were shown to be capable of detecting and measuring the target hormones. The results indicate that the animals did habituate to the procedures performed during the study. From the data gathered to date further investigation on the usefulness of this measurement is warranted.

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【目的】近年、脂肪滴形成に特異的なPATファミリー蛋白アディポフィリン、ペリリピンおよびTail-Interacting Protein of 47kDa(TIP47)と脂質代謝の関連が注目されている。今回、我々は正常ラットの全身諸臓器におけるアディポフィリン陽性の脂肪滴含有細胞の分布とそれらの細胞内局在を免疫組織化学的に検討した。【材料・方法】雌雄Crl:CD(SD)ラットの全身諸臓器を10%中性緩衝ホルマリン液に固定後、常法に従ってパラフィン包埋連続切片を作製した。一次抗体には抗アディポフィリン抗体（Progen社）を用い，アビチン・ビオチン標識酵素複合体法で免疫組織化学的に染色し鏡検した。【結果・考察】免疫組織化学的に抗アディポフィリン抗体に陽性の脂肪滴は肝細胞、胆管上皮、腎近位尿細管上皮、_II_型肺胞上皮、精巣セルトリー細胞および間細胞、精巣上体clear細胞、前立腺上皮細胞、卵巣顆粒膜ルテイン細胞および卵胞膜ルテイン細胞、子宮内膜上皮、皮脂線上皮、乳腺上皮、上皮小体細胞、副腎皮質細胞、膵外分泌細胞および腺胃絨毛先端部の上皮細胞にみられた。肝細胞では小型の脂肪滴が毛細血管極に規則正しく配列し、腎近位尿細管上皮、精巣セルトリー細胞、前立腺上皮、子宮内膜上皮、上皮小体細胞および膵臓外分泌細胞では主に核下方の基底側に局在していた。その他の上記細胞ではアディポフィリン陽性の脂肪滴が細胞質内に充満するかび漫性に認められた。なお、白色脂肪および褐色脂肪は陰性であった。以上、アディポフィリンの免疫組織化学的染色は肝臓や腎臓をはじめとする全身諸臓器における脂質代謝の形態学的検査に適用できることが示唆された。

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未分化な造血前駆細胞のもつ異物代謝性化学物質受容体arylhydrocarbon receptor (AhR)は細胞増殖の抑制シグナルを惹起する。このことは、無処置のAhR-knockout（KO）マウスで観察される白血球数の増加によって背理的に示され、同様に種々の骨髄前駆細胞CFU-S-9やCFU-S-13の数でも有意な増加が認められる。無処置の野生型(Wt)マウスにおけるこうした造血の抑制シグナルを惹起するAhRに対する生理的リガンドは明らかではないが、AhRを介した異物の侵襲下で、造血前駆細胞が細胞周期からはずれてdormant分画に入り込むとするならば、合目的的ではある。ここで生ずる疑問は、そうした造血前駆細胞にAhRが局在するものの、異物代謝の場は肝臓にゆだねられるとした場合の不合理にある。この疑問を解決するため、Wtマウスに致死線量の放射線を照射した後、AhR-KOマウスの骨髄細胞を移植することで、Wtマウスの骨髄を再建した際の造血障害の発生の有無を検討した。結果として興味深いことに、AhR-KOマウス由来骨髄細胞で再建したマウスにベンゼンを暴露しても、造血障害は発生しなかった。このことは、Wtマウスにベンゼン暴露をした後の骨髄に、CYP2E1の高発現が観察されたことによっても裏付けられ、ベンゼンの造血毒性が骨髄特異的な異物代謝産物によって惹起される可能性を示している。今後AhR-KOマウスをWt骨髄細胞で再建する裏実験の結果が得られれば、以上の推測は明確化する。肝の異物代謝の役割については、いっそう疑問が残るのでこれについても明らかにしたい。

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亜ヒ酸は環境汚染物質として慢性中毒の原因となる一方で、急性前骨髄球性白血病の特効薬として臨床応用されている。慢性ヒ素中毒を発症している患者の血中ヒ素濃度、及びヒ素治療中の白血病患者における有効血中ヒ素濃度は、共に数百nM程度と低く、通常このレベルの亜ヒ酸には殺細胞作用は無いので、いわゆる急性毒性は発現しないとされる。しかし、極微量の亜ヒ酸による“見え難い”生体作用を正確に把握することは、慢性ヒ素中毒の予防、或はヒ素治療を受けている白血病患者での副作用発現の予防などにおいて、極めて重要である。最近我々は、ヒト末梢血単球をGM-CSFの存在下in vitroでマクロファージに成熟分化させる系に、nMレベルの亜ヒ酸を添加した所、非付着性で突起を多数もつ特異なマクロファージ（arsenite-induced macrophage; As-Mp）に分化することを見出した（Int. Immunopharmacol.,4,1661-1673,2004; Toxicol. Appl. Pharmacol.,203,145-153(2005)）。As-Mpは樹状細胞の細胞表面マーカーであるCD1a、CD80などは発現しておらず、マクロファージのマーカーであるCD14及びHLA-DRを強発現し、中程度の貪食能とT細胞活性化能を有していた。さらにLPS、LTA、β-glucanなど様々な外来異物に敏感に反応して大量のIL-1αやTNFαを産生放出する特徴を持っていた。また、他の微量元素や環境ホルモンなど、亜ヒ酸以外の化学物質では同様の作用は全く観察されなかった。亜ヒ酸によるこの特異な免疫撹乱作用が、ヒトにとって正か負かは現時点では不明であるが、nMレベルの亜ヒ酸がヒトの細胞に明確な作用を示した例は他にあまり報告がなく、興味深い知見である。

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【目的】クロム・銅・ヒ素化合物系木材防腐剤（CCA）のリスク評価に必要な毒性情報を集積する目的で、CCAをラットに反復経口投与し、造血器系への毒性影響について検索した。【方法】Wistar系ラット（BrlHan:Wist@Jcl）の雌雄動物にCCAを0、8、40および80mg/kg/dayの用量で、4週間に亘り毎日強制経口投与し、末梢血の血液学的検査、大腿骨骨髄の有核細胞数の測定と細胞分類、剖検、臓器重量測定および病理組織学検査を行なった。骨髄細胞検査では、骨髄塗抹により各細胞種の分類を行い、これに骨髄有核細胞数を乗じ各細胞数を算出した。【結果および考察】80および40mg/kg投与群では、雌においてヘマトクリット値（Ht）、血色素量 (Hb)、平均赤血球容積（MCV）、平均赤血球血色素量 (MCH)、平均赤血球血色素濃度（MCHC)が減少し、小球性低色素性貧血が認められた。また、雌雄ともリンパ球増加を伴った白血球数の増加がみられ、雌では網状赤血球数も増加した。80mg/kg投与群では、雄においてもHb、MCH、MCHCが減少し軽微ながら貧血傾向がみられた。骨髄有核細胞数は雌雄ともに変化はなかったが、骨髄細胞分類の結果、雌の80mg/kg投与群において赤芽球の増加ならびにリンパ球、好中球、M/E比の減少がみられた。さらに、胸腺重量の低下が雌雄ともに80および40mg/kg投与群の雌雄および8mg/kg投与群の雌に認められた。貧血に関しては、CCAの主成分の一つであるヒ素のヘム合成抑制作用により誘発された可能性が示唆された。【まとめ】CCAをラットに反復経口投与した場合、造血器系に対し毒性を発現することが明らかとなった。本研究は厚生労働科学研究費補助金（化学物質リスク研究事業）の「木材防腐剤として使用される化学物質のリスク評価に関する研究」プロジェクトの一環として実施された。

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【目的】化学物質の安全性試験において、骨髄検査は被験物質の造血器系への影響を検索する上で極めて重要な検査項目の１つであり、骨髄塗抹標本を用いた形態学的検査や自動計測装置による骨髄有核細胞数の測定が実施されている。我々は、本学会第31回大会において自動計測装置を用いたラットの骨髄有核細胞数の測定方法ついて発表した。今回、同手法を用いて検索したラットの骨髄検査成績のうち無処置対照動物から得られた背景データを対象に系統差、週齢差および性差について検討を加えたので報告する。【方法】今回の解析データは、農薬の28日、90日および1年間反復投与毒性試験に供した雌雄のWistar系あるいはF344ラットの無処置対照動物から得た骨髄検査成績で、検査時の動物の週齢はそれぞれ9、18、57週齢であった。検査方法は、これらの動物から採取した大腿骨の骨髄細胞浮遊液を調製し、自動血液検査装置ADVIA120 (Bayer Corp.)を用いて骨髄有核細胞数の測定を行った。加えて、骨髄塗抹により分類された各細胞種の割合に有核細胞数を乗じ各細胞数を算出した。【結果】動物の系統間で比較した場合には、骨髄有核細胞数は全般にWistarラットの方がF344ラットに比べ高値を示す傾向にあった。週齢の比較では、骨髄有核細胞数は18と57週齢時では差はなかったが、赤芽球系および顆粒球系細胞数は18週齢に比べ57週齢では高値を示した。また、赤芽球系細胞の増加比が大きいため顆粒球系/赤芽球系細胞比（M/E比）が減少した。その他、リンパ球は加齢とともに漸次減少した。一方、性差に関しては全般に雄の方が雌よりも高値を示す傾向にあったが、その差は18週齢時の肥満細胞および形質細胞数において顕著であった。以上の結果より、安全性試験における骨髄検査では動物の系統、週齢および性差を十分考慮した上で評価する必要があることが示唆された。

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目的：フローサイトメーター（FCM）によるラットの骨髄細胞分類について，2つの方法を検討し，有核細胞数との同時測定も試みた。
方法：骨髄細胞はラット（Crl:CD(SD)系，雄）の大腿骨から得た。FCMによる方法は，（1）DNA蛍光染色と標識抗体による方法（DNA染色法），および（2）蛍光色素2’,7’-dichlorofluorescinによるペルオキシダーゼ活性を指標とする方法（DCF法）を用いた。前者では，有核細胞集団と内部標準の比較から，有核細胞数も計数した。FCMはCoulter Cytomics FC500を用いた。また，有核細胞数測定の比較のためSysmex F-820（電気抵抗法）も使用した。
結果：（1）DNA染色法では，DNA蛍光染色剤DRAQ5による有核細胞集団区分を基本として，第1試験管にてCD11b/c-FITCとCD71-PEで顆粒球系と赤芽球系細胞を分類し，第2試験管にてCD3-FITCとCD45RA-PEでTとBリンパ球を分類した。いずれの試験管でも有核細胞集団と内部標準（Flow Count）の比率から，有核細胞数算定が可能であった。（2）DCF法では，DCF蛍光と細胞径を指標に，顆粒球系集団と他の細胞集団（赤芽球系＋リンパ球系）を区分した。DNA染色法の第二試験管のリンパ球比率を用いることで，赤芽球系の比率も算出可能であった。（3）DNA染色法とDCF法による細胞分類比率は，いずれも目算の値と同等であった。また，DNA染色法の有核細胞数は，電気抵抗法と同等であった。
結論：今回の成績は，FCMによりラットの主要な骨髄細胞の分類と有核細胞数測定が可能であること示している。FCMは，細胞分類を免疫学的・生化学的観点から行うことができ，細胞形態観察と組合せることで，より多面的で精度の高い毒性評価が期待される。

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目的： DNA蛍光染色剤DRAQ5は，生きた細胞の核に結合し，その蛍光は赤色波長域で検出される。このDNA染色剤は有核細胞を染色するため，通常実施される測定前の溶血処置（NH₄Clなどによる溶血処置）を省くことができる。今回，DNA蛍光染色剤を用いたラット胸腺，脾臓および骨髄の免疫・造血系細胞のフローサイト解析について検討を行った。
方法：胸腺，脾臓および骨髄（大腿骨）はCrl:CD(SD)系ラットより得た。胸腺と脾臓からの細胞回収にはCell Strainerを用いた。細胞をリン酸緩衝生理食塩液（3％牛血清含有）に浮遊させ，各種蛍光標識抗体を加えた。一定時間後に遠心洗浄し，DRAQ5を加えた後，フローサイトメーター（Coulter Cytomics FC500）で測定・解析した。
結果：胸腺，脾臓および骨髄のいずれにおいても，DRAQ5により有核細胞集団を区分できた。この集団について，CD3-FITC陽性細胞（Tリンパ球），CD45RA-PE陽性細胞（Bリンパ球），CD161a-PE陽性細胞（NK細胞）を分類することができた。脾臓と骨髄については，CD11b/c-FITCとCD71-PEにて，顆粒球系と赤芽球系細胞の分類も可能であった。胸腺については，CD4-PEおよびCD8a-FITCにて，CD4とCD8の陰性・陽性細胞を分類できた。いずれの解析でも，FL1（FITC標識），FL2（PE標識）およびFL4（DRAQ5染色）のコンペンセーション上の問題はみられなかった。
結論：今回の成績は，DNA蛍光染色と蛍光標識抗体を用いることで，ラットの胸腺，脾臓および骨髄について，各種の免疫・造血系細胞の分類が可能であることを示している。測定前の溶血処置を行わない本方法は，毒性試験へのフローサイト適応において，簡便性の面で有用である思われる。

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　免疫毒性試験のリンパ球サブセット検査はフローサイトメトリー法で実施されており、各サブセットを正確に算出するためには、リンパ球領域の設定（ゲーティング）はきわめて重要である。リンパ球集団の設定には前方散乱光、側方散乱光を利用するリンパ球集団の識別法やCD45等の抗体を用いたゲーティング法が用いられているが、現在確立した方法がない。今回、我々はＴ細胞サブセットの比（CD4+/CD8+）を解析するため、以下を検討した。(1).散乱光によるゲーティング；(2).CD45/SSCドットプロットによるCD45^high 細胞集団のゲーティング；(3). CD3+ 細胞集団のゲーティング。
【方法】8週齢のCrl:CD(SD)系雄性ラットの末梢血を試料として、抗ラットFITC-CD4, PE-CD8, PerCP -CD45, APC-CD3抗体で染色し、死細胞染色にはPropidium iodideを使用した。解析にはBD社のFACSCaliburを用いた。
【結果・考察】(1) と(3)のゲーティングでは死細胞の除去により、CD4+、CD8+の絶対数の減少が見られた。また、(2)のゲーティングのCD45^high 細胞集団にはリンパ球以外の細胞を含んでいることが明らかになり、これらの細胞を除去することにより、CD4+/CD8+に変化が見られた。さらに、CD3ゲーティングで得たCD4+/CD8+はCD45ゲーティング（散乱光によるリンパ球領域のゲーティングを加えた）で得たそれより高値を示した。この差はCD45+CD3-CD4+ とCD45+CD3-CD8+ 細胞集団に含まれるT細胞以外の細胞の存在に基づくことが示唆された。
【結論】CD45のゲーティングはリンパ球サブセットの解析に常用されているが、Ｔ細胞サブセットの比（CD4+/CD8+）の解析には死細胞を除去したCD3+のゲーティングがより適切であると判断された。フローサイトメーターを用いた免疫毒性試験法の確立のためには、各検査法の標準化が必要であると考えられた。

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【目的】薬物は一般に低分子量（分子量1,000以下）なので、抗原性を示さず、生体内高分子と結合した時、アレルギー反応を引き起こすと考えられている。しかしながら、そのアレルギー発現メカニズムに関する明確な報告は少ない。そこで、低分子量薬物のモデルとして蛍光物質であるDansyl chloride (DC)を繰り返しモルモット腹腔内に投与し、DCが生体内高分子と結合するのか検討を行った。その結果、モルモット(gp）肝可溶性画分中よりDCの蛍光を有する分子量約25 kDaのGlutathione S-Transferase(GST)M1サブユニットがSDS-PAGE法により検出された。また、DC非投与モルモット肝よりgpGSTM1-1分子種を単離•精製し、DCを反応させ、DC-gpGSTM1-1結合体を調製した。そしてその抗原性を皮膚反応で検討した結果、抗原性を示すことが明らかとなった。これらの結果は、DCが生体内においてGSTM1-1分子種と結合し、抗原性を獲得することを強く示唆するものであり、多くの種における重要な解毒代謝酵素として知られるGSTが薬物アレルギーにおけるキャリアと成りうることを強く示唆する始めての結果となった。現在、モルモットにおいてその存在が知られているその他の分子種(gpGSTsM1-2, M1-3^*, A1-1)とDCの結合性の比較も合せて報告する。

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It has been noted that the vehicles applied in the LLNA can have impact on the accuracy of skin sensitizer identification. For some vehicle matrices, different effects may occur and there exists a variety of mechanisms or ways in which the vehicles may influence the expression of skin sensitizing activity of a presented chemical. In this presentation, a series of vehicle matrices, including AOO, DMF, BN, PG and DMSO, all of which are recommended by international guidelines, were assayed in different groups each of five CBA/CaHsdRcc(SPF) mice. As EtOH70% has previously been rationalized as a suitable vehicle for use in the LLNA tests, this matrix was also included and tested in this study. The results are summarized in the poster.The vehicle control validation studies demonstrated that DMSO shows a significantly high DPM/LN level compared with that in both the naive control group and the other five vehicle groups. Consistent results have also been obtained comparing measures of LN weight and LNC number of the six vehicle groups and the naive control group. The test results indicated that the viability of LNC in the six vehicle groups presents no statistically significant differences compared with that in the naive control group. The primary results might reveal that certain sensitizing responses can augment the draining LN weight, the LNC number and the LNC proliferative activity, but there is no significant change of the viability of the draining LNC.

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近年，Local Lymph Node Assay（LLNA）が新しい感作性試験として注目されている。我々の研究所では，³H-methyl thymidineを用いたLLNAに替わる方法として，OECDガイドラインの試験スケジュールに準拠し，複数のパラメーターを用いたNon-RI LLNAの検討を実施した。
実験では，8週齢の雌性CBA/Jnマウスに感作性物質であるTrimellitic anhydride (TMA; 1, 2.5, 5%)およびHexylciannamic aldehyde (HCA; 10, 25, 50%)，刺激性物質であるSodium dodecyl sulfate（SDS; 5, 10, 25%）を 3日間（Day1-3，左右耳介に25μL）塗布した。Day6にBrdU 200mg/kgを腹腔内投与し，その2時間後，耳下リンパ節を採取した。検査項目として，耳下リンパ節重量，リンパ球数（コールターカウンター），リンパ球細胞1×10^４個あたりのATP活性（ルシフェラーゼ発光法）とBrdU 取り込み量（ELISA法）を測定した。
リンパ節重量およびリンパ球数は，TMA群全濃度およびHCA群25%以上で有意な増加を示した。また，その増加は用量依存性であった。SDS群では有意な増加をしめしたものの，用量依存性の変化ではなかった。ATP活性はTMAおよびHCA群の全濃度で有意な増加を示し，用量依存性の変化が認められた。SDS群では有意な増加はみられなかった。BrdU取り込み量は，TMA群の全濃度で有意に増加し，用量依存性の変化が認められた。HCA群は有意な増加はみられなかったものの，用量依存性の増加が認められた。SDS群では有意な増加はみられなかった。
以上の結果から我々の実施したLLNA法では，刺激性物質と感作性物質の鑑別が可能であることが示唆された。現在も様々な化学物質を対象に検討を継続中である。

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Local lymph node assay (LLNA)は試験物質の皮膚感作性を検出する方法として新たにOECDガイドラインに採用された。本研究では、LLNAにおける感作性物質によるリンパ節活性化反応をラジオアイソトープ(RI)を用いずに判定する非RI-LLNAの確立を目的として、近年報告されている種々の指標の検出感度を比較するとともに、新たに蛍光色素の取り込みを指標とする方法を提案する。24,-Dinitorochlorobenzene (DNCB)及びhexyl cinnamic aldehyde (HCA)をBALB/cマウスに3日間塗布した後、6日目に耳介リンパ節を取り出し、リンパ節重量を測定した。リンパ節細胞数は血球計算盤を用いて求めた。BrdU取り込み量はELISAによる吸光度を、細胞内ATP量は発光量を市販キットにより測定した。また、alamarBlue取り込み量を蛍光強度から求め、試験群の各測定値を溶媒塗布対照群のそれらと比較し、それぞれの指標について増加率(stimulation index, SI)を求めた。DNCBを投与した場合、リンパ節重量は溶媒対照の3.1倍になり、細胞数、ATP量及びalamarBlue取り込み量は5倍以上になった。HCAの場合、リンパ節重量におけるSI値は2.2で、他の測定指標では3から4となった。一方、BrdU取り込み量での判定では他の指標よりは低いSI値を示した。非RIエンドポイントのいくつかは、³HTdRのin vitro取り込み量による判定と同等のSI値を示し、短時間に、かつ同時に多検体の測定を実施できる利点があり、有用と思われた。

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In the liver, metabolism of xenobiotics to reactive species is mainly performed by the CYP superfamily and is a major cause of damage to this organ. In vitro use of hepatocytes for predicting such side effects is hampered by the rapid decrease of expression levels of CYP enzymes that produce these toxic metabolites. The ability to maintain high expression levels of drug metabolising enzymes for longer periods of time is paramount to the study of hepatotoxicty in vitro. Here we report our findings regarding effect of culture conditions on drug metabolising enzymes. Williams E basal medium supplemented with either foetal bovine serum or ITS, Lanfords medium and a commercial serum free medium were tested for their ability to maintain differentiation of hepatocytes over 96 h. Hepatocytes were extracted from 10-week-old male Sprague-Dawley rats and maintained in their respective media. Metabolic activity was monitored by AlamarBlue reduction while structural damage to cells was assayed by LDH leakage. Secretion of albumin was used as a biomarker for differentiation. Time-course metabolic activity at 0, 12, 24, 48, 72 and 96h was monitored by LC/MS/MS for phase I and II drug metabolising enzymes. Corresponding gene expression was examined by RT-PCR. We found that serum-containing medium was least effective in maintaining differentiation over the time course studied. While transferrin and hydrocortisone were found to be critical in maintaining differentiation, addition of numerous additional supplements did not necessarily improve medium performance.

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[目的]
培養ヒト肝細胞は、創薬を始めとする研究において非常に有用な実験系として利用されている。しかしながら、ヒト肝細胞の入手は容易ではなく、また培養後もその機能は早期に消失するという問題がある。今回我々は、九大・船津らが開発した、中空糸内腔に細胞組織体形成を誘導する遠心充填法を用いて、凍結ヒト肝細胞の３次元培養を簡便かつ長期間行える培養系を確立し、その肝細胞機能を調べるとともに肝細胞実験および毒性試験への有用性を検討した。
[方法]
セルローストリアセテート製の中空糸(内径285μm、外径387μm、平均ポアサイズ0.2μm、長さ1.5cm)2本からなるバンドルを作製し、この中空糸内腔に蘇生した凍結ヒト肝細胞を遠心力を利用し充填した。１つあたり約3.3×10⁵個のヒト肝細胞が充填された中空糸バンドルを１２ウェルプレートに移し、ヒト肝細胞培養用の無血清培地中にて振とう培養を行った。この３次元培養ヒト肝細胞について、アンモニア代謝能、薬物代謝酵素活性などの肝細胞機能について調べた。
[結果]
中空糸内腔に遠心充填されたヒト肝細胞は、約１週間の培養後、中空糸内腔において円柱状の組織体を形成した。肝細胞の機能を経日的に調べた結果、アンモニア代謝能、アルブミン産生能、薬物代謝酵素活性は培養１ヶ月以上にわたり高いレベルで維持された。現在、毒性をもつ化合物に対する反応性についても調査中であり本学会にて発表する予定である。
この新規な３次元培養ヒト肝細胞は、肝細胞機能を維持して長期培養を簡便に行うことが出来るため、創薬、医薬等における研究に幅広く応用できるものと期待できる。

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現在，Peroxisome proliferator-activated receptors（PPARs）を標的とした薬剤は，抗高脂血症，抗糖尿病，抗腫瘍薬として多くの製薬企業で上市もしくは開発中である。一方，PPARアゴニストに対する生体の反応性には種差があることが報告されている。したがって，PPARアゴニストの反応の種差を評価しておくことは医薬品開発のリスク評価に重要である。今回，我々はラット・マウス・イヌおよびサルの初代培養肝細胞を用いて，PPARアゴニストの反応性をLDH/WST-8 assayから算出した細胞生存率および網羅的遺伝子発現解析（GeneChip）で評価した。PPARαアゴニストとしてClofibric acid，CiprofibrateおよびWy-14,643，PPARγアゴニストとして15-deoxy-Δ^12,14-prostagrandin J2，PioglitazoneおよびRosiglitazone，PPARβ/δアゴニストとしてGW501516を用いた。24時間曝露において，PPARαアゴニストではラットのWy-14,643のみで細胞生存率の低下が認められた。一方，PPARγアゴニストおよびPPARβ/δアゴニストの場合，イヌのPioglitazoneおよびRosiglitazoneでは細胞生存率に変化は認められなかったが，その他の化合物，動物種では細胞生存率の低下が観察され，その程度には種差が認められた。さらに遺伝子発現解析では，PPARαアゴニストにおいてげっ歯類で認められるCYP4AやAcox1などの脂肪酸β酸化に関する遺伝子発現の亢進がイヌやサルではほとんど見られなかった。本発表では，細胞生存率および網羅的遺伝子発現解析からPPARアゴニストの反応性における種差を考察する。

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【目的】アンジオテンシンII受容体拮抗薬テルミサルタン(Tel)は、経口投与後、一部が腸管でグルクロン抱合をうけ、未変化体およびグルクロン酸抱合体(Tel-glu)が肝臓に選択的に集積する。肝臓に取り込まれた未変化体はグルクロン酸抱合をうけ、Tel-gluとして胆汁中に排泄される。TelおよびTel-gluの肝取り込み・排泄に関与するトランスポーターの同定及び寄与率の解析は本薬剤の薬効・副作用を考える上で重要であると考えられ、本研究において解析を行った。
【方法】薬物輸送活性は、各種ヒトOATP類を安定発現させたHEK293細胞、OATP1B1/OATP1B3とMRP2/MDR1/BCRPの各取り込み・排泄両トランスポーターを共発現したMDCKＩＩ細胞及び複数のドナー由来のヒト凍結肝細胞を用いて、薬物の輸送量を測定することにより評価した。
【結果および考察】TelおよびTel-gluのOATP1B3発現細胞への取り込みは対照細胞と比べ有意に高かった。TelおよびTel-gluはヒト肝細胞に時間、濃度依存的に取り込まれ、その取り込みはOATP1B1選択的阻害剤estrone-3-sulfateで阻害されなかった。従って、TelおよびTel-gluの肝取り込みに主としてOATP1B3が関与していることが考えられた。また、Tel-gluの胆汁排泄に関わるトランスポーターを同定するため、取り込み・排泄両トランスポーター共発現系を用いた解析を行った。その結果、OATP1B3/MRP2、OATP1B3/BCRP、OATP1B1/MRP2共発現系で、Tel-gluの基底膜側から頂端膜側への方向性のある経細胞輸送が観察できた。よって、Tel-gluの胆汁排泄にMRP2、BCRPのトランスポーターが寄与する可能性が示唆された。

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【目的】我々は, 前回の本学会で, 培養細胞を用い蛍光標識リン脂質（NBD-PC）の取り込み量から、フォスフォリピドーシス（PL）の感度および精度の高い迅速な測定系（HTS-PL-assay）を確立し, 報告した。本研究では、このHTS-PL-assayをより再現性が高く安定した測定系にするためにプロトコールの詳細について検討を行った。【検討項目】_丸1_播種細胞数(5000, 20000, 40000個/well)、_丸2_NBD-PC取り込み後の洗浄培養時間（0, 1, 2, 4, 8hr培養）、_丸3_培地中の血清濃度（1　or 10% FCS）【結果および考察】播種細胞数が5000個/wellの場合は、毒性が強く出現し、且つ細胞が十分コンフレントではないため、細胞がはがれやすく、データのばらつきが認められた。また、NBD-PCの洗浄培養を実施しない場合は検出感度が低かったが、洗浄培養を実施すると検出感度が高まった。しかし、4時間以上洗浄培養を行うと弱いPL誘導剤の検出感度が低くなった。血清濃度の違いは、PLの感度にはほとんど影響しなかった。以上、我々は、PLの検出感度が高く、安定した測定系を確立した。

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Some of the principal requisites of toxicity screening methods in drug discovery are their ease to perform and high throughput, as well as the possibility to predict for the occurrence of clinical events. Phospholipidosis is one of the toxicities often induced by potential drugs. Several physicochemical methods for the prediction of phospholipidosis have been reported. The purpose of the present study was to examine the predictability of methods based on lipophilicity and charge parameters. We employed a test set of 33 compounds including 11 in-house compounds. The phospholipidosis-inducing potential (PLIP) of the test set compounds was determined by the fluorescence-labeled lipid accumulation assay using isolated rat hepatocytes. This assay was verified by transmission electron microscopy (EM). The usefulness of the ClogP - most basic pKa (pKa – MB) plot to predict the PLIP compounds was examined. This plot was unable to predict the PLIP of zwitterions. In order to improve its predictability, the net charge of a given molecule (NC) was introduced instead of pKa – MB, since the NC directly corresponds to the ionization state of compounds in the organelles. Compounds with high ClogP (> 1) and high NC (1≦NC≦2) tended to be positive. This finding was also confirmed using 30 additional validation set compounds obtained from the literature. The ClogP – NC plot differentiated positive and negative compounds with more than 98% accuracy (62/63), indicating its usefulness in drug discovery.

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