葉緑体における光合成タンパク質の高蓄積は、核遺伝子由来の多数の因子の機能に大きく依存している。我々は、正の遺伝学的解析により、RuBisCOを含めた光合成タンパク質の高蓄積に関わる新規な因子を同定することを目的に、EMS処理により突然変異を誘起したシロイヌナズナの中から、RuBisCO蓄積量が低下したnara (genes necessary for the achievement of RuBisCO accumulation ) 変異体を選抜した。その中で、nara5-1 は最もRuBisCO蓄積量が低下した変異体であり、RuBisCOのみならずプラスチド遺伝子にコードされる光合成タンパク質量の著しい低下を示した。マップベースクローニングにより、nara5-1 は機能未知のphosphofructokinase(pfkB) -type carbohydrate kinase family proteinをコードするAt4g27600の点変異体であることが判明した。nara5-1とNARA5を欠損したT-DNA挿入株を用いた緑化過程における葉緑体遺伝子の発現解析から、NARA5はrbcLを含むいくつかの光合成遺伝子群の高発現に大きく寄与していることが明らかとなった。本発表では、NARA5と葉緑体の光合成遺伝子発現について議論する。

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DEAD-boxファミリータンパク質は、ほとんど全ての生物種に存在しており、酵母を中心とした遺伝学的解析から、RNAスプライシング、リボソーム生合成、翻訳等の様々な細胞内プロセスに関わることが知られている。しかしながら、高等植物のDEAD-boxタンパク質についての知見は非常に乏しく、特に葉緑体での機能はこれまで明らかにされていない。RuBisCOの蓄積量が低下した変異体として単離されたシロイヌナズナnara12-1 (necessary for the achievement of RuBisCO accumulation) の原因遺伝子は、DEAD-boxタンパク質のひとつであるRH39をコードしていた。RH39のN末端領域とGFPの融合タンパク質のタバコ葉を用いた一過的発現解析から、RH39は植物細胞内において葉緑体で機能することが確認された。またノザン解析の結果、nara12-1 変異体は葉緑体rRNAのプロセシングに異常があることが明らかとなった。さらにRH39遺伝子のT-DNA挿入変異体nara12-2 は種子形成が異常なため致死であった。以上の結果から、RH39は葉緑体rRNAの成熟化と植物の正常な発達に不可欠であることが示唆された。

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陸上植物の葉緑体で機能する転写・翻訳装置はバクテリア起源のものが多く、緊縮応答に関わる酵素タンパク質もその一例である。我々はモデル植物のppGpp合成酵素遺伝子を複数単離し、それらのタンパク質機能を生化学的に解析してきたが、平行して、バクテリアからも新規ppGpp合成酵素遺伝子を単離し、生化学的・遺伝学的解析を進めてきた。植物からは、大腸菌ppGpp合成酵素（RelAおよびSpoT）に類似のppGpp合成ドメインに加えカルシウム結合型EF-handモチーフを有する酵素（Calcium-activated RelA SpoT Homolog, CRSH）を、枯草菌からは、ppGpp合成酵素ドメインのみからなる小分子量のppGpp合成酵素（Small Alarmone Synthase, SAS）をそれぞれ新たに見出し報告している。CRSHは葉緑体に局在し、カルシウムイオン濃度依存的にppGpp合成を司ることを明らかにし、一方、枯草菌SASに関しては、分子遺伝学的機能解析より転写制御によるストレス誘導性のppGpp合成酵素機能を示唆する結果を得ている。これらの結果は、global regulatorの別称を持つppGppの生理学的機能が、従来予想されてきた以上にグローバルであることを改めて示唆するものである。

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シロイヌナズナ斑入り変異体var2は、光化学系II修復サイクルに機能するチラコイド膜局在型メタロプロテアーゼFtsH2を欠損している。修復サイクルに遅延が起こる結果、var2の葉は光障害に感受性を示す。我々はこれまでの発表で、var2の葉において高レベルの活性酸素が蓄積することを報告している。斑入り葉の詳細な解析から、活性酸素は主に緑色セクターの葉緑体で顕著に検出されるのに対し、APXやSODなどの抗酸化酵素は、RNAレベル、タンパク質レベルともに白色セクターで高発現しているという興味深い結果が得られた。活性酸素の蓄積と消去系酵素の局在がセクター間で異なる理由は不明だが、我々はこれら斑入り葉における葉緑体分化と活性酸素蓄積が自然免疫に関与する可能性について評価した。var2に病害細菌であるPst DC3000を接種した結果、緑色セクターでは葉緑体特異的に蓄積している活性酸素種(ROS)の直接的な抗菌効果と考えられる増殖抑制効果が認められた。また白色セクターにおいても、細菌の侵入効率は高いがその後の増殖が抑制されていた。しかし、両セクターともPst DC3000の抵抗性に寄与するとされる抵抗性遺伝子の高発現及びサリチル酸蓄積は検出されなかった。斑入り変異体で高発現するこれら抗酸化酵素の役割と意義について議論したい。

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植物細胞は核以外に色素体とミトコンドリアに独自のオルガネラDNAを保持している。オルガネラDNAの量は、植物の発生段階によって変動し一定では無い。特に、花粉の発生過程において、栄養細胞(後に花粉管に分化する細胞)ならびに雄原細胞(後に精細胞に分化する細胞)の形成時に、オルガネラDNAが劇的に減少することが知られているが、その分子機構は不明である。我々は、DNA特異的結合試薬であるDAPIによる染色法を用いて、花粉におけるオルガネラDNAの減少が起きないdpd1変異体 (defective in pollen organellar DNA degradation)の単離に成功した。dpd1変異体では栄養細胞の細胞質に野生型では観察されないDAPIのシグナルが多数観察される。花粉における色素体とミトコンドリアの可視化系 (Plant Cell Physiology 49: 81-91, 2008)を構築し、二重染色実験を行った結果、dpd1変異体で観察される細胞質のDAPIシグナルは色素体とミトコンドリアの両方に共局在していた。このことは、dpd1変異体は両方のオルガネラDNAの分解系に異常を持つことを示している。本発表ではdpd1変異体の表現型解析、原因遺伝子の単離とその機能解析の結果について報告し、花粉におけるオルガネラDNA分解の生物学的意義について考察する。

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好熱・好酸性の原始紅藻Cyanidioschyzon merolaeのチラコイド膜をn-dodecyl-β-D-maltosideで可溶化し、陰イオン交換カラムにより光化学系II（系II）複合体を精製した。系II複合体の約80%が分子量620 kDaの二量体として精製され、その酸素発生活性は3,300 μmol O₂/mg Chl/hであった。また、約20%程度が分子量440 kDaの単量体として精製されたが、その活性は2,900 μmol O₂/mg Chl/hであり、二量体よりも若干低い程度であった。電子顕微鏡による観察では、二量体は25 nm x 40 nm程度、単量体は25 nm x 15 nm程度の大きさであった。タンパク質組成を解析した結果、単量体にはPsb27が含まれていたが、二量体には含まれていなかった。また、酸素発生活性の2,5-dichlorobenzoquinoneやduroquinone濃度依存性から、これらキノンに対するKm等の生化学的特徴を分析したので、報告する

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光化学系II複合体(PSII)の結晶構造解析はこれまで原核生物のシアノバクテリアについて行われてきたが、真核生物由来のものについては報告されていない。また紅藻PSIIには、シアノバクテリアに存在しない、20kDaの表在性タンパク質が結合している。そのため本研究では、真核藻類である紅藻由来PSIIの結晶構造解析を目指している。昨年度の本年会において、我々は紅藻Cyanidium caldarium由来PSIIについて、分解能3.8-4.0Åの結晶化について報告した。今回、精製と結晶化条件の改良、及び結晶の脱水処理を行うことにより分解能を3.5Åに向上させることに成功したため、その詳細を報告する。析出した結晶を脱水処理することにより、3.5Å分解能の回折データを与える結晶が得られた。得られた結晶の空間群はP2₁2₁2₁でシアノバクテリア由来PSII結晶と同じであったが、格子定数はa=209.2Åb=237.5Å, c=299.8Åであり、シアノバクテリアのものと大きく異なっていた。収集したX線回折データを用い、シアノバクテリアのPSII二量体構造をサーチモデルとして分子置換法を行った。その結果、紅藻PSII結晶中の分子パッキングには、結晶格子中の非対称単位に2つのPSII二量体、単位格子中に16個のPSII単量体が存在していることが明らかになった。

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珪藻は、地球上の全植物が行う光合成の25%もの炭酸同化を行っており、水域圏における生態系、炭素循環において最も重要な位置を占める藻類である。しかし、酸素発生光化学系II複合体（PSII）を構成する詳細なサブユニット組成は未だ明らかにされていない。我々は、これまで、中心目珪藻Chaetoceros gracilisから凍結融解法により細胞を破砕し、PSII標品を精製することに成功した[Nagao et al. (2007) Biochim. Biophys. Acta 1767: 1353-1362.]。しかし、この凍結融解法は中心目珪藻の細胞破砕には有効であるが、羽状目珪藻では細胞が破砕されなかった。今回、ゲノム解析がなされている羽状目珪藻Phaeodactylum tricornutumの細胞をエアブラシで温和に破砕できることを見出し、酸素発生活性を持つチラコイド膜の調製に成功した。このチラコイド膜を可溶化した後、遠心分画法やショ糖密度勾配遠心法により高い酸素発生能を保持したPSII標品を得た。この標品にはC. gracilisのPSIIで発見された新規の表在性タンパクであるPsb31も含まれていた。現在、LC-MS/MSおよびN末端アミノ酸配列決定により、PSIIのサブユニット組成を解析中である。これらの解析結果も含めて報告したい。

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最近、我々は、常温性の中心目珪藻Chaetoceros gracilisから、酸素発生光化学系II（PSII）標品を単離し、その諸性質を明らかにしてきた。しかし、このPSIIは失活しやすい不安定な標品で、大量のFCPが結合している。そこで、本研究では、より安定なPSIIを精製する目的で、石垣島から採集された中心目珪藻Chaetoceros neogracileを用いてPSIIの精製を試みた。この珪藻は、35℃で最もよく生育し、40℃でも生育可能な中等度好熱性珪藻である。35℃で培養した珪藻を凍結融解により細胞破壊した後、チラコイド膜を調製した。チラコイド膜をTriton X-100処理した後、遠心分画により粗PSIIを得た。この粗PSIIには大量のFCPが結合していたので、再度Triton X-100処理した後、イオン交換カラムにより、FCPを除去したPSIIを精製した。この精製したPSIIは、PsbO, PsbQ’, PsbV, Psb31, PsbUの5種の表在性蛋白を結合し、約2,000 μmol O₂/mg Chl/hの高い酸素発生活性を示した。活性にイオン要求性はみられず、DCMUにより完全に阻害され、還元側も酸化側も正常な標品である。この標品の熱安定性や色素組成について報告する予定である。

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珪藻から精製した酸素発生光化学系II標品（Crude PSII）には、PsbO, PsbQ', PsbV, Psb31, PsbUの5種の表在性蛋白が結合している。これらの表在性蛋白の結合様式と機能を明らかにするため、5種の表在性蛋白を精製し、再構成実験を行った。まず、Crude PSIIをアルカリTris処理することにより全表在性蛋白を遊離した後、各種pHで陰、陽イオン交換カラムにかけ、5種の表在性蛋白の精製に成功した。なお、Crude PSIIは不安定で失活しやすいので、Crude PSIIをTriton X-100により可溶化した後、DEAEカラムにより精製したPure PSIIを再構成実験に用いた。Pure PSIIを4 M urea/0.2 M NaCl処理することにより全表在性蛋白を遊離したPSIIに、精製した5種の表在性蛋白をいろいろな組み合わせで再構成した。その結果、PsbOとPsb31は単独でPSIIに完全に、PsbQ’は部分的に結合したが、PsbVとPsbUは単独ではほとんど結合しなかった。PsbVとPsbUの結合には、PsbOあるいはPsb31の存在が必要であった。これらの結果を元に、珪藻の表在性蛋白の結合様式のモデルを作成するとともに、種々の組み合わせで表在性蛋白を再結合したPSIIの酸素発生活性の回復から、5種の表在性蛋白の機能について報告する予定である。

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光化学系IIは、一次電子供与体P680（P）と一次電子受容体フェオフィチンa（Ph）の間で生じる光誘起電荷分離を駆動力とし、一連の電子伝達と酸素発生を伴う水の酸化を行う。水を酸化するほどの高い酸化力の源は電荷分離で生じるPの正孔とされるが、酸化力の指標となる酸化還元電位E(P/P⁺)の実測例はなく、推測の域にとどまる。この推測を裏付ける実験的証拠の一つに、Phの電子受容電位、すなわち酸化還元電位E(Ph/Ph^-)が挙げられ、30年程前に-610 ± 30 mV vs. SHEと報告された値（Klimov et al. 1979）が重視されてきた。しかし、誤差が大きいだけでなく、信頼性にたるとも言い切れない。それは、追試も一件あるが、いずれも滴定法が用いられ、滴定剤の還元力を高める目的でサンプルのpHを生理的条件から外れた11.0としているため、実態を表していない可能性があるからである。そこで我々は、分光電気化学的手法の適用により、pH 6.5でE(Ph/Ph^-)の実測を試みた。シアノバクテリアの一種T. elongatusから分画した光化学系IIを対象に測定したところ、-505 mV程度（誤差±10mV含む）と求められ、従来の値より100 mV程度貴であることを明らかにした。この結果より、E(P/P⁺)も同様にこれまでの値より100 mV程貴だと推測される。

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光化学系II(PSII)おいて、第二キノン電子受容体Q_Bは弱く結合しており、二電子還元によりPSIIから遊離し、別のプラストキノン(PQ)と置き換わる。一方、第一キノン電子受容体Q_Aは強く結合しているため容易に交換されず、その再構成のためには、コア蛋白質を構成するサブユニットの分離と再構成が必要であると考えられてきた。本研究では、PSIIコア蛋白質のサブユニット構造を保持したまま、PQ によるQ_Aの再構成を試みた。ジチオナイト処理によりQ_Aを除去したシアノバクテリアT. elongatusのPSIIコア蛋白質にPQを過剰に加え、室温で24時間放置した。210 KにおいてQ_Aの光還元によるフーリエ変換赤外（FTIR）差スペクトルを測定することにより、活性のあるQ_Aの量を評価した。その結果、PQ添加により70%以上のQ_Aが再構成されることが示された。また、再構成したQ_AのFTIRスペクトルはコントロールスペクトルと基本的に同じであったことから、PQはQ_A部位に正しく再結合し、本来の蛋白質との相互作用構造を回復したことが示された。PQの再結合は、¹³CラベルしたPQの添加により、PQ由来のFTIRバンドが低波数シフトすることによっても確認された。PSIIにおけるQ_Aの再構成は、蛋白質中におけるQ_Aの相互作用の詳細と酸化還元反応のメカニズムの解明に極めて有用な手段になると考えられる。

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光合成水分解反応は光化学系II（PSII）において行われ、2分子の水が1分子の酸素と4つのプロトンに分解する。この反応は、S状態と呼ばれる中間状態 (S₀-S₄) の光誘起サイクルにより進行することが知られているが、基質水分子の反応メカニズムについては、未だほとんど解明されていない。本研究では、フーリエ変換赤外 (FTIR)法を用いて、水分解系に存在する水分子（D₂O）のDOD変角振動を検出し、その反応過程を調べた。D₂¹⁶O及びD₂¹⁸Oで水和したT. elongatusのPSIIコア蛋白質に閃光を照射し、各S状態遷移によるFTIR差スペクトルを測定した。得られたスペクトルのDOD変角振動領域（1250-1150 cm^-1）には、D₂¹⁶OとD₂¹⁸O間で明らかな違いが観測された。D₂¹⁶O-D₂¹⁸O二重差スペクトルを計算することにより、反応に関与するD₂O分子のみのDOD変角バンドを得た。各スペクトルにおいて、6-8つのピークが観測されたことから、どの遷移においても少なくとも2分子の水が関与していることが示された。S₂→S₃及びS₃→S₀遷移における1240 cm^-1付近の負のバンドに対応するバンドが他の遷移に観測されないことから、基質水分子はこれらの遷移において蛋白質内水クラスターから水分解系に取り込まれることが示唆された。

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光化学系?において、水分子はH⁺、電子と酸素に分解される。この水分解反応はS状態と呼ばれる中間状態（S₀-S₄）のS状態サイクルによって行われることが知られているが、反応の分子機構にはまだ不明な点が多い。最近、この触媒中心がMn₄Caクラスターであることが明らかになったが、これらに結合するアミノ酸側鎖とS状態サイクルにおけるそれぞれの役割については不明である。本研究では、Mn₄CaクラスターのMnのリガンドであるD1のHis332をGlnおよびSerに置換した好熱ラン藻Thermosynechococcus elongatusの組換え体の光化学系IIを用いて、水の分解機能への影響を調べた。連続光照射下における酸素発生活性は、変異体ではWT*の70～80%であった。しかし、閃光照射下でのS₃からS₀への酸素発生キネティクスは、変異体とWT*で大きな差は認められなかった。S₃とQ_B^-の電荷再結合時の熱発光は、D1-H332QではWT*よりも6°C、D1-H332Sでは3°C低い温度に現れ、変異によりS₃の酸化還元電位が高くなることが示唆された。また、D1-H332QではS₂とQ_A^-の再結合速度がWT*よりも速くなっていた。これらの結果から、His332は水の酸化反応過程において、S₂およびS₃の熱力学的性質に影響するが、S₃Tyr_Z°からS₀への遷移には影響しない可能性が示唆された。

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中心目珪藻Chaetoceros gracilisから部分的に精製した酸素発生光化学系II標品（crude PSII）は暗所、室温で放置するだけで、PSIIを構成するほとんどのサブユニットがランダムに激しく限定分解されることを見出した。このような限定分解は、高等植物などのPSIIでは見られず、珪藻の粗PSIIには独特の強力なプロテアーゼが存在する可能性が高い。この限定分解は、EDTA、PMSF、Cuイオンにより、大きく阻害されるので、金属プロテアーゼやセリンプロテアーゼが関与すると考えられる。40～45℃で最も高い分解活性を示し、50℃以上で分解は抑制された。また、PSIIを構成するサブユニットによって、pHにより分解活性が異なるので、pH依存性の異なる複数のプロテアーゼが存在すると思われる。これらのプロテアーゼの局在性を調べる目的で、crude PSIIを1% Triton X-100で可溶化してから、DEAE トヨパールカラムにかけ、FCPを含まないpure PSIIを精製したところ、pure PSIIでは、crude PSIIで見られたような激しい限定分解は観察されなかった。従って、crude PSIIに存在していたプロテアーゼは、カラム操作過程で遊離したと考えられる。現在、遊離したプロテアーゼを含む画分を検索している。その結果についても報告する予定である。

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シアノバクテリアは光合成の集光装置としてフィコビリソームを持つ。ある種のシアノバクテリアのフィコビリソームでは、赤色光吸収タンパク質であるフィコシアニンと、緑色光吸収タンパク質であるフィコエリスリンの組成が緑・赤色光に応答して調節される（補色順化）。既に我々は、シアノバクテリア独自の光受容体（シアノバクテリオクロム）の1つであるCcaSが、フィコエリスリンを持たないSynechocystis sp. PCC 6803においてフィコビリソームのリンカータンパク質の発現調節を行なうことを示した（片山ら2004植物生理学会）。また、CcaSが緑・赤色光によって可逆的に光変換し、転写因子CcaRをリン酸化する緑色光受容体であることを示した（Hirose et al. 2008 PNAS 105, 9528-9533）。CcaSおよびCcaRオルソログは、フィコエリスリン含量のみが調節（2型補色順化）されるNostoc punctiforme ATCC 29133にも存在するが、その機能は不明である。今回、我々はNostocのccaSおよびccaR破壊株を作製した。どちらの破壊株でも細胞のフィコエリスリン含量が大きく低下していた。これは、CcaSおよびCcaRが緑色光下のフィコエリスリン蓄積を制御することを示す。CcaSの活性型とCcaR下流の遺伝子は、2型補色順化と密接な関係があるだろう。

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PixJ1は単細胞性シアノバクテリアSynechocystis sp. PCC 6803の正の走光性に必至なフィトクロム様光受容体であり、青色光吸収型（Pb型、最大吸収435 nm）と緑色光吸収型（Pg型、最大吸収535 nm）の間を可逆的に光変換する光受容体である。第48回本年会では、77-298 Kの範囲でPb型からPg型、またはPg型からPb型への紫外／可視吸収スペクトル変化を解析し、光反応初期過程を推測した。本発表では、励起光、測定温度などの条件を改良して低温紫外／可視吸収スペクトル測定し、より詳細な光反応初期過程に関する以下の結果を得たので報告する。(1)（Pb->Pg変換）Pb型には2つの異なる電子基底状態があり、異なる光反応過程を経てPg型へ変換する可能性が示唆された。(2)（Pg->Pb変換）250 Kで最終反応物(Pg型)よりも長波長領域（560 nm）に吸収ピークを示す中間体について既に報告したが、さらに580 nm吸収型中間体を経てPbを生成することを見いだした。

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ミヤコグサから根粒数が減少した2つの変異体を単離した。これらは共生以外の表現型としてクロロフィル含量が低く徒長の表現型を示した。さらに光に対する応答解析から、赤色光（R）に対する反応が野生型とは異なることが判明した。このような表現型はシロイヌナズナのphyB変異体のものと同様なため，PHYB遺伝子の塩基配列を解析したところ両系統において変異を見いだした．さらにGifu B129とのバッククロスF2世代を用い、これらの変異に対してdCAPS解析を行ったところ、表現型と遺伝子型は常にリンクしていたことから、2つの変異体の原因遺伝子はPHYBであると結論づけた。
これらの変異体の芽生えを用いてR下で根粒着生試験をしたところ全く根粒が形成されなかった．これはRの受容が根粒形成に必要であることを示している． PHYBは光合成器官の発達に重要であることから，光合成産物の不足が理由の1つと考えられる．それ以外の理由はないのだろうか？そこで一定期間連続白色光下で生育させた野性型およびphyB変異体を用い，Rを一定にし，遠赤色光（FR）の値を増減させて根粒着生試験をおこなったところ，低R/FR比の場合は根粒数が激減した．また、この時の根におけるsucrose含量は低R/FRの方が高い傾向にあった。以上の結果は、ミヤコグサにおける根粒形成がR/FR比受容反応であることを示唆している。

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自ら動くことの出来ない植物は、外界から光を集め、光合成を行うことで自立的に成長することが出来る。植物にとって必須である光合成を行う場は葉緑体であるが、葉緑体発達のメカニズムについては未解明の部分が多い。これまでに我々は、GARP型転写因子であるOsGLK1をイネで異所的に強発現させると、通常は2,4-D存在下で黄白色を呈するカルスが緑化すること (Nakamura et al., Plant Mol. Biol. 65: 357-71, 2007)、さらにOsGLK1強発現カルスでは、光合成関連遺伝子群の発現が軒並み大きく上昇していること等を見出した。これらの知見は、OsGLK1が葉緑体発達を司る鍵因子であることを如実に示している。
イネのゲノム上には、OsGLK1に加え、そのパラログであるOsGLK2が存在する。そこで我々は、OsGLK2の機能を探るべく、OsGLK2強発現イネを新たに作出した。その結果、OsGLK2強発現カルスでは、OsGLK1強発現カルス同様、緑色を呈した。このことは、OsGLK1のみならずOsGLK2も葉緑体発達を司る鍵因子であることを示唆する。現在、OsGLK1とOsGLK2の機能分担について明らかにすべく、両遺伝子の組織特異的発現パターンの違いや、オリゴマイクロアレイ等を用いた解析により、2つの因子が制御する遺伝子群の相違について解析を進めている。

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イネのphyB変異株を連続赤色光（Rc）で育てると、クロロフィルは野生株（日本晴）の20%しか蓄積せず、葉緑体チラコイド膜の発達は抑制される。このことは、phyB特異的な赤色光情報伝達経路が存在し、これが葉緑体発達に重要な役割を果たしていることを示している。我々は、この経路に関わる因子を探索することを目的に、phyB変異株と日本晴の芽生えにRc照射し、それらの間の遺伝子発現をマイクロアレイで比較した。その結果、クロロフィル合成の鍵酵素であるMgキラターゼHサブユニットをコードする遺伝子（OsChlH）の発現と薄緑葉表現型との間に相関がある可能性が示された。そこで、暗所で8日間育てたphyB変異株と日本晴にRc照射し、OsChlHの発現量、クロロフィル量、その前駆体量を経時的に測定して比較した。Rc照射開始3時間までは、これら3つに有意な差が見られなかったが、Rc照射6時間目に、phyB変異株ではOsChlHの発現が低下した。Rc照射9時間目のphyB変異株では、Mgキラターゼの生産物であるMg protoporphyrin IXの含量が激減した。このクロロフィル前駆体の激減に続いてクロロフィル蓄積量が低下した。これまでの結果は、OsChlH遺伝子発現がphyB変異株で特異的に低下し、これが薄緑葉表現型の誘因となっていることを示している。

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イネの環境ストレス応答機構は、未解明の部分が多く残されている。我々は、マイクロアレイ解析によりイネの環境ストレス応答性遺伝子を数多く見出した。本研究ではそれらのうち、乾燥ストレスによって発現量が著しく減少し、シロイヌナズナのPhytochrome Interacting Factor (PIF)と高い相同性を示すOsPIF1遺伝子に関して解析を行っている。これまでに、OsPIF1遺伝子の非ストレス条件下での明期における発現上昇が乾燥ストレス処理によって消失すること、OsPIF1過剰発現イネでは節間伸長が促進されること、逆にリプレッションドメインを利用したOsPIF1機能欠損イネでは節間伸長が抑制されること等を示してきた。これらの結果は、OsPIF1が乾燥ストレス応答機構においてイネの節間伸長を制御している重要な因子である可能性を示唆している。最近、G-boxシスエレメントを含むプロモーターをGUS遺伝子に繋いだレポーターと特定の領域を削除したOsPIF1遺伝子をイネ培養細胞中で一過的に発現させて解析を行った。その結果、フィトクローム結合領域であるAPBモチーフがGUSレポーター遺伝子の発現上昇に重要であることが示された。現在、形質転換イネの局所的な部位を用いたオリゴマイクロアレイ解析により、OsPIF1の下流遺伝子の同定を試みている。

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シロイヌナズナは生育環境に適応して形態を変化させる。特に高温条件では、低 R/FR条件下や低光量条件下と同様に、著しい胚軸伸長と葉柄伸長ならびに葉面積の減少が観察される。我々は、高温による形態変化機構を分子レベルで解明することを目的として研究を行っている。
本発表では、まず、高温条件下で見出される葉柄などの伸長成長が高光量条件下では観察されず、高温条件における形態変化が光量依存的であることを報告する。このことは、形態形成において、光シグナルと温度シグナルがクロストークしていることを示唆している。これに関わる遺伝子を探索するため、28℃という生育条件においてスクリーニングを行い、高温による胚軸伸長や葉柄伸長を示さない遺伝子欠損株を単離した。単離した遺伝子欠損株の一つでは、 Phytochrome Interacting Factor4 (PIF4)遺伝子にT-DNAが挿入されており、 PIF4の発現が転写レベルで抑制されていた。また、野生株において、22℃で生育させた場合と比較して28℃では PIF4 mRNA量が増大していることが分かった。これらの結果は、温度上昇に伴うシロイヌナズナの形態変化には、少なくとも PIF4の機能亢進が寄与していることを示している。

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phyBが関与する生理応答の一つである避陰応答とは、R/FR比が低い(陰)環境下にある植物が、光をより受けるために茎や葉柄の伸長を促進させる応答である。この応答は、植物を明所から暗所に移す直前にFRを照射し、安定なPfrを全てPr型に戻す光処理（EOD-FR）によってもみられる(Franklin, 2008)。シロイヌナズナの避陰応答においては、a;芽生えでは胚軸伸長が、ロゼット葉では葉柄伸長が促進される、b;転写因子であるHFR1やATHB-2の発現上昇が早い段階でみられる、c;数時間以内にオーキシン関連遺伝子の発現上昇がおきることなどが知られている。しかし、避陰応答における器官・組織間制御機構はよく分かっていない。そこで本研究では、EOD-FR処理をロゼット葉の葉柄と葉身に部分的に施し、葉柄伸長や遺伝子発現にいずれの部位のphyBが関わっているのか調べた。4つの照射条件（a;葉身と葉柄、b;葉身のみ、c;葉柄のみ、d;処理なし）の効果を比較したところ、葉身に照射した場合（aとb）に葉柄伸長と葉柄でAuxin応答性遺伝子の一つであるIAA6の発現上昇が起きることが分かった。これらの結果より、主要なEOD-FR感知部位は葉身であり、葉身から葉柄へ向けた器官・組織間シグナル伝達の存在が示唆された。現在、同様の検討を芽生えの子葉と胚軸を用いて解析中であり、その結果も併せて報告する。

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エネルギー代謝補酵素（NAD(P)(H)）は、生体内で数百に及ぶ酸化還元反応を触媒する脱水素酵素の補酵素である。従来、これらの補酵素は細胞内レドックスの調節因子と考えられてきたが、近年の研究から、補酵素自体の量も重要であることがわかってきている。NAD(P)(H)の合成経路には、NAD合成酵素、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼ、NADリン酸化酵素（NADK）の3種類の鍵酵素が存在し、主にこれらの酵素群によって量的変動が制御されていると考えられる。本研究では、NAD(P)(H)量の変動による植物代謝への影響を見出し、NAD(P)(H)による代謝調節機構を明らかにする。
NAD代謝を改変したシロイヌナズナ形質転換体を代謝解析した結果、NADP量の減少によって光合成が阻害された。さらにNAD(P(H)を変動させることで代謝の変動を示唆する結果も得られたことから、NAD(P)(H)は植物代謝の調節因子であることが予想された。今後の解析から、個々の補酵素の代謝調節因子としての働きが明らかになると考えられる。NAD(P)(H)を利用した代謝改変技術が確立すれば、植物の能力や品質向上を目的としたデザイン育種の新たな戦略として、応用が期待できる。

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窒素は、イネの成育にとって不足しやすい栄養素であり、収量を大きく左右する要因のひとつである。イネの窒素利用において、NADH依存性グルタミン酸合成酵素1(NADH-GOGAT1)は、吸収したNH₄⁺の初期同化並びに、未抽出葉身や穂において老化器官から転流してきたGlnの再同化に関与すると考えられてきた。本研究では、NADH-GOGAT1の機能を証明する目的で、NADH-GOGAT1の機能欠損イネを獲得し、生理学的な解析を行った。
OsNADH-GOGAT1遺伝子にレトロトランスポゾンTos17が挿入された系統について、リアルタイムRT-PCR法並びにウエスタンブロッティング法により、NADH-GOGAT1のmRNAとタンパク質がそれぞれ検出できないことを確認した。 NADH-GOGAT1欠損変異体(nadh-gogat1) の幼植物では、5 mM NH₄Cl供給後、根の伸長が抑制され、また根における遊離NH₄⁺の蓄積量が増加し、Glu, Asn, Aspなどの遊離アミノ酸の蓄積量は野生型より減少した。
nadh-gogat1を水田にて栽培した場合、野生型と比較して稈長や穂数が減少し、地上部乾物重も野生型の約70%に低下した。現在、根における植物ホルモンの解析を進めるとともに、NADH-GOGAT1の収量に与える影響を調べるために収量構成要素を測定している。

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植物ホルモンの1種であるサイトカイニンはその機能の1つとして、根圏の窒素栄養情報を地上部へ伝える働きをもつことが示唆されてきた。以前シロイヌナズナの研究で我々は、窒素栄養によるサイトカイニン含量増加の原因がサイトカイニン合成酵素isopentenyltransferase (IPT) 遺伝子の窒素栄養による発現誘導であることを明らかにした。窒素栄養は作物の生育、収量を規定する重要な因子であることから、本研究では有用作物の1つであるイネにおける窒素誘導性IPT遺伝子を同定し、その遺伝子の窒素による発現誘導機構を詳細に解析した。
イネにはサイトカイニン合成活性をもつIPT遺伝子が7つ（OsIPT1-5, 7-8）存在する。我々はその遺伝子産物がそれぞれプラスチド、ミトコンドリア、サイトゾルに分かれて局在し、窒素栄養によってプラスチド型のOsIPT4とOsIPT5の遺伝子発現が誘導されることを明らかにした。これらの遺伝子発現誘導は硝酸イオンよりもアンモニウムイオンに強く応答しておこり、グルタミン合成酵素の阻害剤であるMSXで前処理を行うことにより阻害された。一方MSXでの前処理後も窒素源としてグルタミンを与えた場合は遺伝子発現誘導が見られ、OsIPT4, OsIPT5の窒素栄養による遺伝子発現誘導は、グルタミンまたは関連する代謝系によって制御されていることが示唆された。

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イネの窒素利用上の鍵酵素であるNADH-グルタミン酸合成酵素1とNAD-イソクエン酸脱水素酵素の遺伝子発現はグルタミン(Gln)により調節される。このことは、イネにおけるGln情報伝達系の存在を示唆するが、その分子機構は不明である。演者らは、イネのGln情報伝達系のGlnセンサー候補として、核に局在し、かつ、上記のGln応答性遺伝子が発現するNH₄⁺処理後の根や若い葉身の細胞群に蓄積するACTドメインリピートタンパク質9(OsACR9)に着目した。まず、演者らは、RNAi法によりOsACR9発現抑制イネ(OsACR9-KD)を作出した。次に、トランスクリプトーム解析によりGlnとOsACR9依存的に発現調節されるイネ遺伝子候補群を探索した。Gln合成酵素反応の阻害剤のメチオニンスルフォキシミン存在下でのNH₄⁺またはGln処理後の日本晴の根の解析から、388個のGln応答性遺伝子候補を見いだした。また、NH₄⁺処理後のOsACR9-KDの根で、日本晴と比較して、発現量が有意に変化した遺伝子群を選抜した。比較解析の結果、イネ根での59遺伝子のGln応答的発現に、OsACR9が関与する可能性が示唆された。現在、酵母two-hybrid法により、OsACR9と相互作用するイネタンパク質の探索も行っている。以上を基に、イネにおけるOsACR9のGln情報伝達系への関与の可能性を議論する。

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我々はイネにおいて窒素供給による遺伝子発現制御の分子機構を明らかにするために、マイクロアレイを用いて窒素応答に関わる転写制御因子の探索を行ってきた。OsMYB-NR2は硝酸処理に迅速に応答して発現誘導される転写因子である。今回、MYB-NR2の標的遺伝子と生理的役割を明らかにするために、MYB-NR2をUbiquitinプロモーターの制御下で過剰発現している形質転換カルスを作出し、これを用いたマイクロアレイ解析を行った。次に、この結果からいくつかの遺伝子をMYB-NR2の標的遺伝子の候補として選び、これら遺伝子プロモーターが本当にMYB-NR2によって活性化されるかをトウモロコシのプロトプラストを用いたtransactivation実験にて検討した。その結果、トリプトファン合成経路の一部であるトリプトファンシンターゼαサブユニットをコードする遺伝子と、トリプトファン二次代謝の最初の段階を担うトリプトファンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子のプロモーターがMYB-NR2によって活性化されることが示された。さらに、MYB-NR2過剰発現イネにおけるトリプトファンおよびその二次代謝産物の一つであるセロトニンの蓄積量を測定し、MYB-NR2の生理機能について議論する。本研究は生研センター「新技術・新分野創出のための基礎研究推進事業」に基づくものである。

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我々はこれまでに、公開されているマイクロアレイから算出された遺伝子発現相関表を利用して、シロイヌナズナの窒素代謝に関与する遺伝子群に対して共発現解析を行い、葉緑体型グルタミン合成酵素（GS2）遺伝子と高い発現相関を示す新規な遺伝子を見出した。この遺伝子は、大腸菌のグルタミンセンサーGlnDのアミノ酸結合ドメイン（ACTドメイン）を有しており、ACT1（ACT domain containing protein 1）と命名した。シロイヌナズナデータベースへのBLAST検索の結果、シロイヌナズナは2種類のACTホモログ遺伝子を有することが判明した（ ACT1, ACT2）。本研究では、 ACT1および ACT2をシロイヌナズナより単離し、その発現特性の解析を行なうと共に、シロイヌナズナの ACT1遺伝子破壊株および ACT2遺伝子破壊株を用いて機能解析を行った。
RT-PCR解析の結果、 ACT1および ACT2の転写産物は、それぞれシロイヌナズナのロゼット葉および根において主に蓄積が認められた。シロイヌナズナの野生株、 ACT1遺伝子破壊株、および ACT2遺伝子破壊株の生育調査の結果、いずれの遺伝子破壊株においても、野生株と比較して生育の遅延が認められた。現在、それぞれの遺伝子破壊株について、詳細な遺伝子発現、および代謝産物の蓄積量変化について解析を行っている。

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植物では多くの場合、窒素は土壌から硝酸態として吸収され、還元されてアミノ酸へと同化され、必要な器官へと転流される。この一連の同化反応には多くの還元力が必要である。この反応経路のうち、硝酸還元酵素(NR)に触媒される硝酸から亜硝酸への還元反応以外は色素体で行なわれる。光照射下の光合成器官では必要な還元力とATPを光合成系から直接得ることができ、反応のためのコストを抑えることができる。しかしこの同化反応に関わる酵素群は非光合成器官においても存在し、実際に硝酸還元が行われている。この硝酸還元の器官依存性は、種、環境条件、成長段階によって大きく異なるが、この違いの意義は未だ不明である。本研究では植物個体の各器官の硝酸還元量と同化された有機態窒素の転流量を詳細に調べることで、硝酸還元の場に関する定量的理解のためのモデルを確立することを目的とした。材料として水耕栽培したキク科ヒャクニチソウを用いた。NRの反応は一連の窒素同化反応における律速過程であるので、ソース葉、シンク葉、根、茎におけるNR活性の日周変化を測定し、それらの積分値を硝酸同化量とした。同時に有機態窒素量の時間変化を測定し、NR活性の積分値と有機態窒素量の増分値から転流量を求めた。これらのデータをもとにして、各器官が有機態窒素をどの程度自立的に同化しているか、また非光合成器官で硝酸還元を行う利点は何か、という問題について考察する。

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Leaves represent the largest pool of nitrogen in vegetative grasses. As leaves expand, large quantities of nitrogen flux into them; with more than 60% of this deriving from internal remobilization. As leaves age, influx decreases and efflux becomes the major factor determining leaf N content. N flux within the plant should therefore be non-uniform through time. Leaves connect together at a small organ through which all leaf N must pass, known as the tiller axis. To test our hypothesis of non-uniform N concentrations in the tiller axis, we measured the N concentration in ryegrass, barley and wheat, finding strong evidence of a steady oscillation, which correlates with leaf growth and developmental patterns, and is hypothesized to be a potential control mechanism. This oscillation appears to be genotype specific, predominantly driven by protein turnover, and sensitive to environmental conditions, such as exogenous N supply and temperature.

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イネは、土壌中の窒素を根で吸収、同化しており、その機構は様々な因子によって制御されている。イネは、環境中の窒素を効率的に利用するために、窒素の供給量に応じて根の形態を変化させる。KoshihikariとKasalathに由来する染色体断片置換系統群を用いた解析から、低NH₄⁺濃度で根長を支配しているQTLを、第8染色体の長腕側に検出した。このQTLがKasalath型であるSL-225と遺伝背景であるKoshihikariを、5-500 μM NH₄⁺濃度で栽培し、根長を比較した。SL-225の根長は、供試した全てのNH₄⁺濃度でKoshihikariよりも有意に増加しており、特に5 μM NH₄⁺濃度で、根長が大きく増加した。同位体で標識したNH₄⁺を用い窒素吸収量を測定したところ、50 μM NH₄⁺濃度で、SL-225の窒素吸収量はKoshihikariよりも減少していた。QTL原因遺伝子の同定を目的として、SL-225をKoshihikariに戻し交配し、F₂ 、F₃世代を作出すると共に、大規模集団からの染色体組換え系統の選抜を行った。これらの系統群を用いて、少なくとも2つのQTL原因遺伝子の存在を確認し、より効果の強いQTLを第8染色体の長腕末端付近、約40 kbの領域に絞り込んだ。

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ダイズの根に共生する根粒菌は根粒を形成し、空中の窒素を固定する。根粒は固定した窒素（固定窒素）を他の部位に輸送することで植物体に窒素栄養を供給する役割を持つ。これまで、高等植物における窒素固定や固定窒素の輸送といった窒素の動態に関する研究は、主に安定同位体の¹⁵Nにより窒素を標識する方法が用いられてきた。しかし、安定同位体を用いる方法は侵襲的な分析を必要とするため、例えば光や温度の変化に対する数時間内の窒素の固定や固定窒素の輸送の変化といった、環境変化に対する短時間の生理的な応答を解析することは難しかった。
そこで本研究では、放射性同位体の¹³N（半減期9.97分）により標識した窒素ガスを用いることにより、窒素の固定および固定窒素の輸送の非侵襲的なイメージングを実現すること、さらに生理機能の定量的な解析を実現することを目的とした。本発表では、1)高純度の¹³N標識窒素ガスの製造法を開発し、一定の酸素、窒素を含むガスを調製し、2)根粒を形成したダイズ植物個体の地下部に与え、根粒に固定される窒素をPETIS（positron-emitting tracer imaging system）により非侵襲的にイメージングし、3)短時間（10分間）の窒素固定速度を定量することに成功したので報告する。

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根粒菌が分泌するNod ファクター(NF)は共生の開始シグナルであり、根粒菌共生時に観察される現象の多くをNFのみで誘導することができる。NFはN-アセチルグルコサミンの3-5量体(キチン)を基本骨格とし、非還元末端側にアシル基が結合した構造を持つ。一方でキチンは菌類の細胞壁成分であり、キチンオリゴマーは植物に防御応答を誘導するエリシターとして研究されている。我々はNFシグナリングとキチンシグナリングの関係に着目して研究を行った。
ミヤコグサを用いて、根におけるキチンおよびNF応答遺伝子を解析したところ、どちらの処理でもファイトアレキシン合成遺伝子をはじめ防御応答関連遺伝子の発現が誘導された。NF受容体の機能を欠損したnfr1変異体では、キチンによる防御応答遺伝子の誘導は正常であるが、NFによる発現誘導は見られなかった。さらにIn-gel kinase assay を行ったところ、NF処理したミヤコグサの根でタバコのSIPK, WIPKに相当する活性が検出された。これらの結果からNFは共生シグナルであると同時に防御応答を誘導するエリシターとしても働くことが示唆された。これらの防御応答の誘導は一過的であり、NF処理後7時間で処理前のレベルになることから、共生シグナルの下流で防御応答を抑制する機構の存在が考えられる。

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マメ科植物は、根に形成された根粒において根粒菌と共生関係を築いている。近年、マメ科モデル植物を利用した分子遺伝学的な解析によって、マメ科植物と根粒菌の共生に必要な複数の因子が明らかとなってきた。しかしながら、共生系確立過程全体の解明には程遠く、特に感染糸形成の分子メカニズムはほとんど解明されていない。そこで、我々はミヤコグサの感染糸形成突然変異体alb1を選抜し、解析を行ってきた。窒素制限下で根粒菌を感染させて栽培すると、alb1は野生型に比べて著しい生育阻害を示した。この変異体の根を観察すると、皮層細胞が分裂した瘤状の未成熟根粒が多数形成されていたが、成熟根粒は見られなかった。また、根粒切片の観察から、alb1の未成熟根粒内に根粒菌は取り込まれていないことが明らかとなった。そこで、感染糸形成の観察を行ったところ、alb1では感染糸形成が表皮細胞中で阻害され、皮層細胞への感染糸の伸長が抑制されていた。これらの結果から、ALB1は感染糸形成に関与していることが示唆された。そこで、マップベースクローニングによって、alb1の原因遺伝子の同定を試みた。その結果、ALB1はLRRレセプター様キナーゼをコードしていることが明らかとなった。現在、ALB1の機能解析を進めており、本発表ではそれらの結果について報告する。

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マメ科植物は根粒を形成して根粒菌と共生し、窒素固定を行う。近年、ミヤコグサ等のマメ科モデル植物の共生変異体を用いた分子遺伝学的解析により、根粒菌との共生初期過程の分子機構が明らかになりつつある。しかしながら、その後の細胞内共生成立から窒素固定活性発現、維持の機構についてはほとんど解明されていない。そこで我々は、窒素固定系成立、維持に関与する植物側の因子を明らかにする目的で、新規のミヤコグサ有効根粒形成不全変異体（Fix^-変異体）Ljsym102に着目し、その解析を行った。Ljsym102変異体は、窒素栄養制限下で根粒菌を感染させると根粒を形成するが、地上部および根部ともに野性型に比べ生長が抑制され、窒素肥料含有培土への移植により生育が回復する。根粒の窒素固定活性（アセチレン還元活性）はきわめて低く、根粒切片の顕微鏡観察で、根粒組織は野性型同様に発達していたが、感染細胞内では顆粒化等早期老化の兆候が見られたことなどから、本変異体では、根粒の機能不全が窒素不足を引き起こしたと考えられた。しかしながら、KNO₃存在下の栽培試験で生育は完全には回復しなかったことから、Ljsym102は窒素固定活性ばかりではなく、生長自体にも問題が生じている変異体であると思われた。そこで、我々は本変異体の原因遺伝子を明らかにするため、マップベースクローニングを行った。本発表ではこれらの結果について報告する。

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根粒菌の多くは、宿主であるマメ科植物に形成された根粒細胞内に感染しバクテロイドへと分化した時にのみ窒素固定活性を発現し、単生状態では窒素固定を行わない。このことは、根粒菌の窒素固定能が宿主植物遺伝子によって制御されていることを示唆する。しかしながら、バクテロイドの窒素固定能を制御する宿主植物機構には不明な点が多く残されている。
ミヤコグサのFix^-突然変異体fen1は、無窒素条件で栽培すると、著しい窒素欠乏症状を呈する。このfen1変異体に形成される根粒は、野生型に比べて小さく、薄いピンク色を呈する。また、fen1根粒に感染している根粒菌はバクテロイドへと分化しているように見えるが、fen1根粒のアセチレン還元活性は野生型根粒と比べて極めて低い。すなわち、fen1変異体の原因遺伝子Fen1は、根粒菌のニトロゲナーゼ複合体の活性を制御していると推測される。我々は、map-base cloning法を用いてFen1遺伝子を同定した。さらに、酵母形質転換系を用いた機能相補試験を行った。これらの結果を基に、バクテロイドが窒素固定能を発現する過程において、FEN1タンパク質が果たす役割について報告する。

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塩ストレスとブラシノステロイド(BR)がミヤコグサの根粒着生に及ぼす影響を調べた。培地に加えた塩化ナトリウム(NaCl)は、根粒着生とミヤコグサ実生の生育を濃度依存的に抑制した。すなわち、100～150 mMのNaCl存在下では根粒はできたが着生数が減少した。また、根粒着生に伴う実生の生育促進は制限され、レグヘモグロビン由来の赤色を呈する根粒に代わり白色のものが多くなった。続いて、細菌数を比較したところ、赤に比べ白い根粒中で有意に増えていた。これらの結果から着生した白い根粒は正常に機能していないと考えられた。さらにNaCl濃度を上げる（175 mM以上）と根粒がほとんど着生しなくなった。しかし、この塩濃度の下でも根粒菌が増殖できたことから根粒着生の抑制は宿主であるミヤコグサが塩ストレスを受けたためと推察される。一方、塩を含まない培地に加えた活性型BR・ブラシノライド(BL; 10^-9～10^-5 M)とBR合成阻害剤・ブラシナゾール（10^-7～10^-5 M）は、ミヤコグサ実生の生育を変化させたが根粒着生には全く影響しなかった。しかし、100～150 mMのNaCl存在下では、BLは根粒着生を有意に阻害した。上記の結果に基づき、本発表では塩ストレスが誘導する根粒着生の阻害とそれに対するBRの相乗作用について議論する。

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マメ科植物と根粒菌の共生窒素固定系は、細胞内共生の最もよいモデルである。しかし、根粒菌を共生状態へと誘導・維持する植物側因子についての知見は乏しい。タルウマゴヤシやエンドウとミヤコグサやダイズの根粒内部の根粒菌（バクテロイド）は、形態的・生理的に大きく異なる。これは、細胞内共生の成立に関わる植物側の分子戦略の違いを反映しているものと考えられる。
タルウマゴヤシ根粒中には、NCRと総称されるペプチドが存在する。4または6システイン残基を保存するディフェンシン様ペプチドであり、400を超える遺伝子ファミリーを構成している。いずれの遺伝子もミヤコグサゲノムには存在しておらず、その発現は、根粒特異的である。NCR001と084は、感染細胞に特異的に存在しており、合成NCR001と035をアルファルファ根粒菌に添加すると、バクテロイドに特徴的な変化を誘導した。NCR遺伝子を発現するミヤコグサ形質転換毛状根を誘導し、ミヤコグサ根粒菌を接種して根粒を着生させた。そのバクテロイドは、ミヤコグサ根粒菌であるにも関わらず、タルウマゴヤシ根粒中のバクテロイドと共通した特徴を呈していた。このことは、タルウマゴヤシ根粒では、NCRペプチド群の複合的な作用が、根粒菌のバクテロイド化とその維持に関与していることを示唆している。

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根粒菌とマメ科植物の共生関係が成立し、窒素固定活性を発現するまでには様々なタンパク質が関与し短い期間で大規模に変化している。ダイズ根粒菌バクテロイドタンパク質のプロテオーム解析から同定したBj880遺伝子は、真核生物COX17様なCytochrome C oxidase (CcO) へCu輸送を媒介する金属シャペロンCOX17が保存する配列(H(M)X₁₁MX₂₂HXM)を保有していた。この遺伝子を欠損させたBj880変異株をダイズに感染させると、窒素固定活性の低下が確認された。さらにBj880変異株感染ダイズのバクテロイドシトクロームCオキシダーゼ活性の低下も確認された。真核生物ではミトコンドリアへの銅輸送のため、COX17は、Sco1を介してシトクロームCオキシダーゼへ輸送する。そこでダイズ根粒菌からSco1ホモログであるBj131を検索し、Bj880-131二重変異体の作製を行った結果、顕著な窒素固定活性の低下が確認できた。感染後28日目のバクテロイドを抽出後、CcO活性を測定した結果、Bj880-131 のCcOは、ほとんど検出できなかったが、free living では野生株と変わらないCcO活性を示した。以上の結果から、Bj880はバクテロイド下で誘導される金属シャペロンであり、Bj880で輸送されたCuはBj131を介してCcOへCuを受け渡していると予想される。

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マイクロアレイで得たデータを解析するための、パラメトリックなフレームワーク^*を紹介する。マイクロアレイはトランスクリプトームを網羅的に解析するためによく使われており、複数の種類のチップと検出方法が用いられる。ところが、しばしばチップの種類によって異なる測定結果が得られ、それぞれの測定結果の信頼性に疑問が呈されている。こうした測定結果の不一致は、多く、それらのチップが異なるフレームワークで数値処理されていることに起因する。これまでに多様な考えに基づいて様々なフレームワークが提出されているが、それらは科学的な・統計学的な裏づけを欠いていたため、得られたデータには一般性がなかった。ここで紹介するのフレームワークはパラメトリックな統計学と、細胞のトランスクリプトーム形成を説明する熱力学モデルに準拠するものである。これを使って、複数のスライドグラスタイプのチップおよびGeneChipのデータが一致することを確認した。これまでのフレームワークを用いた例との比較結果とともに紹介する。

^*データの解析には仮定・理論・考え方といった前提が必要である。ここではその前提をフレームワーク(Intellectual Framework)と称する。

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マイクロアレイ技術の普及に伴い、公共のデータベースには多くの遺伝子発現データが蓄積してきた。共発現する遺伝子間には機能的関連が期待できることから、共発現遺伝子群を用いて実験ターゲットを絞り、遺伝子破壊等で機能同定を行う研究手法が近年増えつつある。
我々は植物ではシロイヌナズナ（ATTED-II, http://atted.jp）、動物ではヒト、マウス、ラット（COXPRESdb, http://coxpresdb.hgc.jp）について遺伝子共発現データベースを公開している。遺伝子共発現の指標には、通常ピアソンの相関係数が用いられるが、この2つのデータベースでは2008年3月（ATTED-II ver. 5.0及び COXPRESdb ver. 3.0）から相互ランクMRを採用している。
本演題では、この共発現指標MRについて我々が見出した以下の特長を発表する。
・ 遺伝子機能予測能が高いこと
・ GeneChipの数や補正法、また遺伝子の種類に依存しないこと
・ 疎なネットワークの描画が可能であること

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シロイヌナズナにおける遺伝子機能に関する知見が急速に蓄積されつつあり、有益な機能を有する遺伝子の発現制御機構の解明が急務である。そうした制御機構に関する情報を大規模に集積することを目的に、本報では、187個のシロイヌナズナ遺伝子に注目し、それらを過剰発現、および発現抑制させたT87培養細胞を中心として、214枚のDNAマイクロアレイチップを用いた発現分析を実施した。このマイクロアレイデータセットにおいて、各遺伝子の発現量に対して標準化処理を施した。標準化した発現量に基づいて、注目遺伝子の過剰発現、および発現抑制実験において特異的な発現傾向を示す遺伝子を探索し、注目遺伝子からの発現制御候補として関連付けた。これらのT87培養細胞における関連情報に基づいた発現制御ネットワークを作成した。本解析結果をデータベース(RnR: Regulatory-network Research; http://pmnedo.kazusa.or.jp/kagiana/rnr/)上に公開予定である。ここでは、本データベースの利用法を紹介し、数例の発現制御機構について解説する。

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ゲノム情報は膨大で、種間で同じ機能を持つと推測される蛋白質をコンピューター上で整理整頓することは、非常に手間がかかる。そこで我々は、植物種を超えて遺伝子の機能を推定するのに役立つ、SALAD database (http://salad.dna.affrc.go.jp/salad/) を開発した。SALAD databaseは、種内・種間で進化において保存されてきた様々なアミノ酸配列（モチーフ）の組み合わせによりタンパク質を分類することができるゲノム比較データベースで、非常に簡単な操作で短時間に蛋白質のアミノ酸配列の類似性の解析が可能である。今回、そのデータベースのver.2として新たに生物種を7種（イネ、ソルガム、シロイヌナズナ、ヒメツリガネゴケ、紅藻、緑藻、酵母）に増やした。これらの種を追加したことで、単子葉で保存されているモチーフや、植物の陸上化に伴って獲得したと考えられるモチーフなど、さらに多くの比較解析が可能となった。さらに、SALAD databaseとマイクロアレイデータを組み合わせた新しいViewer （SALAD on ARRAYs）を開発し、イネの花粉のLM マイクロアレイデータを公開している。この機能をつかえば、目的とする遺伝子とパラロガスな（もしくは機能的に近い）遺伝子間の発現比較が簡単に行え、マイクロアレイのデータ解析の強力な手助けとなる。

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DNAマイクロアレイは生理活性化学物や遺伝子の機能解析に広く用いられている。Gene Expression Omnibus (GEO) 等のアレイデータの一次データベースには既に多様な実験データが公開されている。羅病による遺伝子の発現変動のような、研究ターゲットとするプロファイルと、これらの公開データの遺伝子発現プロファイルの比較解析は、創薬や遺伝子機能を推定するin silicoスクリーニング法として有効と考えられる。しかしながらマイクロアレイデータには実験環境やサンプルに起因する多くの情報（ノイズ）が含まれているため、大規模な実験セットの横断的な解析は精度が低い。
そこで、処理特異的に変動するマーカー遺伝子群 (module) の発現プロファイルを用いて実験データの類似性を調べるCo-module解析を発展させ、実験データの生理的なつながりを網羅的に表すネットワーク型解析法を開発した。モデルには、均質で大規模なマイクロアレイ実験データAtGenExpressが整備されているシロイヌナズナを用いた。解析の結果、本手法は従来型のクラスター解析では検出できなかった部分的な相似性や負の関係性も検出し、既知の植物ホルモンと阻害剤の関係性などが精度よく検出されることを実証した。本解析結果を公開したデータベース及び、これを用いたスクリーニングによって得られた新奇知見についても報告する。

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高速液体クロマトグラフィー(LC)-質量分析(MS)において、検出されたピーク化合物を推定するためには、1) イオン化状態（付加体）の判別とそれに基づく分子量の推定、¹³C同位体ピーク、多価体ピーク、分解ピークの判別など、ピークを特徴づける情報の収集、2) MS/MS分析やUV吸収による部分構造の推定、3) 化合物データベースや文献の調査を元に、これらの総合評価による分子構造の推定を行うという、研究者による高度な判断プロセスが必要である。このため、検出されたピークすべてを網羅するような解析には莫大な時間と労力が必要であり、メタボロームの網羅性を拡張することを困難としている一要因となっている。そこで我々は、遺伝子配列解析におけるBLASTプログラムの様に、取得した分析データの解釈を加速することを目指して、労力をかけて行われたピークの解釈（アノテーション）情報を蓄積し参照できる新たなデータベースの構築を進めている（KOMICS, http://webs2.kazusa.or.jp/komics/）。この講演では、LC-フーリエ変換イオンサイクロトロン(FT-ICR)-MSによる分析結果をもとにアノテーション作業を効率化するためのソフトウェアPowerFTの開発と、KOMICSの構築について発表する。

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RARGE: RIKEN Arabidopsis Genome Encyclopedia (http://rarge.psc.riken.jp/) では、シロイヌナズナの基礎的なリソース情報をWeb上で提供している。特に完全長cDNA、トランスポゾン挿入変異体データの一次提供元として位置づけが強かったが、今回新たに、遺伝子破壊株の表現形質観察に関する2種類のデータの拡充を中心に大幅なデータ拡充を行った。これまでに、黒森らによってトランスポゾン挿入変異体の網羅的な表現形質の観察が行われ、これらのデータを検索・閲覧できるシステムを開発した。また、明賀らによって葉緑体移行タンパク質の候補遺伝子を破壊しているトランスポゾン挿入変異体およびT-DNA挿入変異体の解析が行われ、これらのデータを検索・閲覧できるシステムを開発した。これらの情報はそれぞれ個別にも提供されているが、RARGE上に統合して閲覧できるように開発した。

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シロイヌナズナを含む形質転換植物は，植物科学研究の発展に大きく貢献している．形質転換植物の選抜には原核生物由来の薬剤耐性遺伝子が広く用いられているが，薬剤耐性遺伝子水平伝搬による環境破壊が問題視されている．また，従来法による形質転換植物作製はホモ接合系統を得るまでに長い時間を要するという欠点がある．私達は上記の欠点を克服した新しい選抜法を確立し，FAST法(Fluorescence-Accumulating-Seed Technology法)と命名した．この新手法開発の端緒となったのは「オレオシンGFP融合タンパク質（OLE1-GFP）を発現する種子は蛍光を発する」という発見である．このOLE1-GFPをFAST法の選抜マーカーとしてを用いた．FAST法では，実体顕微鏡下でGFP蛍光を発する種子を選抜することで，形質転換第一世代（T1）の種子集団からT1ヘテロ接合種子を選抜することが可能になる．さらに，ホモ接合系統，ヘテロ接合系統，野生型が共存する形質転換第二世代（T2）の種子集団からGFP蛍光を強く発する種子を選び取ることで，99%以上の確率でT2ホモ接合種子を選抜することに成功した．FAST法は薬剤が不要なだけでなく，無菌操作や植物体を大量に育成する必要がない，簡便な方法である．FAST法は基礎研究だけでなく，安全な遺伝子組換え作物の作製や維持に用いることができると期待される．

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相同組換えを利用したジーンターゲッティング（GT）は、従来の遺伝子導入方法とは異なり、標的遺伝子だけを狙い通りに改変することができる非常に有用な技術である。本研究では、GT技術を活用し、トリプトファン（Trp）合成の鍵酵素であるアントラニル酸合成酵素をコードするOASA2遺伝子に変異を導入した。その結果、Trpアナログである5メチルTrp（5MT）に耐性を示し、遊離Trpが高蓄積するイネを作出することに成功した。
Trp高蓄積型の2点変異（S126F/L530D）を有するが、5’領域を欠損しているために機能的ではないOASA2遺伝子の断片7.0kbをアグロバクテリウム法によりイネカルス（品種日本晴）に導入した。その結果、850個のカルスから、内在性のOASA2遺伝子に変異を導入することに成功し、5MT耐性を示すイネを1個体獲得した。得られたT₀及びT₁個体を用いたサザン解析から内在性OASA2遺伝子を予想通りに改変することに成功していることが示された。さらに、GTによる改変型OASA2遺伝子をホモで持つ個体の葉身では、高濃度の遊離Trpが蓄積していることが示された。また、S126F/L530D以外の変異についても導入することに成功しているので、併せて報告したい。

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ゲノム上に誘発されるDNA二重鎖切断は、その切断部位において、相同組換え反応による遺伝子ターゲッティング、あるいは非相同組換え修復による遺伝子変異を高頻度にもたらす。2つの異なる修復メカニズムは特定の遺伝子を改変するという育種手法において重要な手法となり得るが、特定の遺伝子上にDSBを誘発させることはこれまで困難であった。
近年、人工制限酵素であるジンクフィンガーヌクレアーゼ (ZFN) が開発され、特定の遺伝子上の切断が可能となってきた。ZFNとは、制限酵素であるFok Iのヌクレアーゼドメインを、Cys2-His2タイプのジンクフィンガーモチーフを持つ転写因子のDNA結合ドメインに結合させたキメラタンパク質である。目的のDNA配列に結合能の高いジンクフィンガー配列を配置することによって、目的のDNA配列特異的な切断が可能となる。
我々は、ZFNを高等植物、特にイネにおいて効率よく適用させ、遺伝子特異的なゲノム改変を行う為に、目的のDNA配列に対するZFNのデザインと、in vitro及びin vivoにおけるZFNのDNA切断能について確認する為のシステムを構築した。更には実際に植物ゲノム細胞の切断を行い、特定の内在性遺伝子における遺伝子改変を現在行っている。本発表ではこれらの結果について報告する。

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