This investigation was carried out to determine the effects of aflatoxin B₁ (AFB₁) on fetuses of mice and rats, and maternal tissues of rats. The pregnant ICR mice were injected intraperitoneal (ip.) at Day-13 of gestation with AFB₁ at 20 and 10 mg/kg BW (body weight). The fetuses from mice were examined at 12, 24 and 48 hours after inoculation (HAI). The pregnant Wistar rats were also injected ip. at Day-13 of gestation with AFB₁ at 20 mg/kg BW (sacrificed at 12 HAI), 5mg/kg BW (sacrificed at 24 HAI) and 2.5mg/kg BW (sacrificed at 48 HAI). Fetuses, placenta, and maternal liver, thymus and spleen were collected from rats for histopathology, the in situ detection of apoptotic cells (TUNEL method) and immunohistochemistry. Light microscopic study on fetuses of mice, and placenta and fetuses of rats detected no difference of cell death in AFB₁-treated group and in control group examined at different time points of study. On the contrary, liver, spleen and thymus of rats treated with AFB₁ at different doses of different time points evoked cell death where the lesions of spleen and liver were striking at 24 and 48 HAI, respectively. The lesions of liver were characterized by severe congestion, fatty change and multifocal/diffuse cell death; and at early time these hepatocytes underwent apoptotic type of cell death . The lesions of liver characterized by necrosis with slight apoptotic cells increased in severity with the advancement of time. The striking pyknotic cell death in thymus was evident at 48 HAI. These pyknotic cells showed positive staining with TUNEL method, the in situ detection of apoptotic cells. Immunohistochemistry detected activated caspase-3 in pyknotic cells of spleen, liver and thymus. However, the relation between AFB₁-induced apoptosis, necrosis and tumorigenesis in rats should be elucidated.

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【目的】いくつかの変異原物質において，着床前のマウスに投与すると胚致死および異常胎児が増加することが知られている。そこで今回，我々はラットに対して交尾成立から着床までの期間にアルキル化剤であるmethyl methanesulphonate (MMS) を単回投与し，胚・胎児発生への影響を検討するとともに，その感受時期についてもあわせて検索した。　【方法】交尾成立させたラットを投与日毎に妊娠0日（GD0）群，GD1群，GD2群，GD3群，GD4群，GD5群およびGD6群に各7～9例ずつ振り分け，妊娠0～6日のいずれかの午前にMMSの200 mg/kgを単回経口投与した。対照群は無処置動物とした。全動物について妊娠20日の午後に帝王切開を実施し，子宮内の胚・胎児の生死を判別するとともに，胎児体重および胎盤重量を測定した。また，生存胎児および胎盤について異常の有無を観察した。　【結果および考察】帝王切開の結果，着床率がGD0群で低値となった。また，着床後胚死亡率の高値がGD0群およびGD3～GD6群で認められた。外形異常はGD4 群で1児（2.0%，外脳）に，GD6群で2児（2.0%，小下顎または曲尾）に認められた。胎児体重の低値がGD5およびGD6群で認められ，GD6群では胎盤重量が低値となった。一方，胎盤重量の高値がGD0群で認められた。GD1およびGD2群においては，胚死亡および胎児・胎盤への影響がほとんど認められなかったことから，これらの時期は発生毒性に対してMMS投与による感受性が低いと考えられた。以上の結果から，ラットの着床までの期間において，MMSの暴露時期によって胚または母体の感受性は異なり，発現する発生毒性も異なる可能性が示唆された。

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To assess the effects of test substances on reproductive functions and embryo-fetal development in cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis), menstrual cycle and fetal/neonatal evaluation control data are particularly important. Menstrual cycles (146 female monkeys for a total of 907 cycles) were variable within and between females (average of all individual cycles: 30.5±7.7 days, average of mean value of each female: 30.9 ± 4.5 days).　Pregnancy ratio of 3-day mating session (for a total of 463 mating sessions) and the mean abortion/embryo-fetal death incidence (62 dams) were approximately 40% and 8%, respectively.　In teratology studies, the mean fetal weight on GD100 was 115 g. There were no external fetal abnormalities, a low incidence of visceral (absence of left thyroid, 2.4%) and skeletal abnormalities (hemi-vertebra or absence of the 12th rib, 5.6%), and a 12.6% incidence of skeletal variations (lumbar ribs). Peripheral lymphocyte subsets (flow cytometry) analysis data indicate that the levels of CD45, CD8, CD3, and CD4 were lower in the fetus (GD100). CD8, CD3 and CD4 in neonates are essentially equivalent to the mothers values by 6 months after birth. CD3 and CD4 were increased as compared to mothers levels in the neonate. CD3 was approximately 30% higher while CD4 was 80% higher in the neonate. Both CD3 and CD4 decreased after the neonatal stage and approached the mothers levels at 6 months.

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Flutamide (FLT)を子宮内・経乳汁暴露した出生仔への離乳後継続投与の有用性について検討することを目的とし、雌Crj: CD (SD) IGSラットに0.4、2、10 mg/kgのFLTを妊娠6から分娩後20日まで経口投与、得られた雄出生仔のうち各腹約半数に母動物と同用量のFLTを投与し、離乳後継続投与群、離乳後非投与群でみられた影響を比較した。包皮分離検査では、継続投与の10 mg/kg群で包皮分離は観察されず、0.4、2mg/kg群で分離日齢が遅延した。非投与群では10 mg/kg群で包皮分離が完了しなかったが、0.4、2 mg/kg群で異常はみられなかった。器官重量では、継続投与2 mg/kg以上の群で副生殖腺重量減少、10 mg/kg群で精巣重量減少、下垂体重量増加、非投与10 mg/kg群で精巣、副生殖腺重量減少がみられた。剖検では継続投与群、非投与群ともに2 mg/kg以上で外性器、内部生殖器の形態異常がみられた。ホルモン測定では継続投与10 mg/kg群でテストステロンの高値がみられ、非投与群では異常はみられなかった。継続投与群、非投与群の同用量群間における比較では、包皮分離日齢において0.4、2 mg/kg群で、器官重量では2 mg/kg以上の群で副生殖腺重量、10 mg/kg群で下垂体重量、ホルモン測定では10 mg/kg群でLH、テストステロン値に有意な差がみられた。以上の結果、子宮内・経乳汁暴露後の出生仔への離乳後継続投与は、内分泌かく乱作用が次世代へ及ぼす影響を詳細に検討するにあたって有用な方法であることが示唆された。一方、10 mg/kg群の雌出生仔でcleft phallusがみられ、FLTの子宮内・系乳汁曝露によって雌出生仔の外部生殖器に形態異常が誘導されることが明らかとなった。

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【目的】今回幼若動物における酵素誘導の影響についてのデータを収集するために，日齢の異なるラットを用いて，Phenobarbital(PB)によって肝代謝酵素を誘導したときの肝cytochrome P450（CYP），およびperoxisome脂質代謝酵素の変動について比較検討した。【方法】生後12日齢，26日齢，および7.5週齢のCrj:CD(SD)IGS雌雄ラットにそれぞれPB（80mg/kg）を4日間腹腔内投与した群と無処置群を設定した（12日齢：20 rats/sex/group，他：6 rats/sex/group）。各動物を安楽殺して肝重量を測定した後，Microsomeおよびperoxisomeを調製し，Ethoxyresorufin O-dealkylase（EROD），Testosterone 7 alpha-（T7A），6 beta-（T6B），16 alpha-（T16A），16 beta-（T16B），2 alpha-（T2A）hydroxylase，peroxisomal beta-oxidation(PBO)，Acyl-CoA oxidase(ACO)の酵素活性を測定した。【結果】PB投与群では，すべての日齢で無処置群と比較して約30％の相対肝重量の増加が認められた。7.5週齢PB群では，雄は無処置群と比較して，T16Bが約8倍，EROD・T6Bが約3倍，T7Aが約1.3倍誘導され，雌はT16Bが約12倍，T6B・T16Aが約6倍，EROD・T7Aが約2倍誘導され，雌雄で酵素活性値に差が認められた。これに対して， 12日齢PB群は，無処置群と比較して雌雄ともにT16Aが約20倍，EROD・T16Bが約13倍，T7A・T6Bが約5倍誘導され，26日齢PB群は，雌雄ともに無処置群と比較してT16A・T16Bが約15-25倍，T7A・T6Bが約4-5倍，ERODが約2倍誘導され，12日齢PB群および26日齢PB群では酵素活性値に雌雄の差が認められなかった（26日齢のT7Aを除く）。一方，ACOおよびPBOではいずれの日齢においてもPBによる誘導はみられなかった。【まとめ】以上より，幼若ラットではPBによって7.5週齢と同様にCYPの酵素誘導がおこり，かつ7.5週齢よりも誘導の影響が大きい可能性が示唆された。さらに7.5週齢でみられる性差が幼若ラットではほとんどないことが示された。

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我々は過去3,3',4,4',5-pentachlorobiphenyl (PCB126)胎生期暴露次世代の7,12-Dimethbenz[a]anthracene (DMBA)誘発乳腺発癌に与える影響に関して報告した。これまでの検討から、高用量PCB126胎生期暴露はDMBA誘発乳腺発癌を抑制させるのに対し、中用量PCB126胎生期暴露はDMBA誘発乳腺発癌を亢進さることを明らかにしたが、その機序は不明である。また、DMBAは生体内で代謝されることから発癌を進行させることから主たる代謝酵素であるCYP1の発現についてDMBA投与後2日まで過去報告した。今回は、DMBA投与後30日までのCYP1, AhRの発現について検討を行った。SD(slc)ラット胎齢13-19日までPCB126を7.5ug, 250ng, 2.5ng, 0g/kg/day経口投与を行った。出生後50日齢に各ラットにDMBA100mg/kg経口投与した後、6時間、12時間、1日、2日、5日、10日、20日、30日、後に剖検し肝臓でのCYP1, AhRの発現について検討を行った。7.5ug/kg群ではCYP1A1の発現延長が認められた。これに対し、250ng/kg群ではCYP1B1 の発現延長が認められた。DMBAは2段階の代謝を受ける第一段階の代謝はCYP1A1あるいは CYP1B1が進行させる。これに対し第二段階の代謝はCYP1B1のみが進行させることから、DMBAの発癌性の獲得にCYP1B1が重要であることが提唱されている。本検討では、7.5ug/kg群でCYP1A1の発現延長が認められたのに対し、発癌性の亢進を示した250ng/kg群ではCYP1B1、CYP1A1の発現延長が認められた。

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［背景と目的］一般に薬物は血漿タンパクに結合していない遊離型だけが組織間を移行し、薬効や毒性に関与する。したがって、血漿中での薬物の遊離型濃度の把握は非常に重要である。多くの薬物はアルブミンに結合しやすいが、塩基性薬物の中にはalpha-1 acid glycoprotein（AGP）に強く結合するものがある。AGPは容量が小さく感染症や炎症などにより血中濃度が増加することが知られている。よって、その変化がAGPに高親和性の薬物の動態に大きく影響する可能性がある。今回、塩基性薬物としてquinidine（QN）を選択し、数種の動物を用いてQNの血漿中動態と血漿中AGP濃度との関連を調べた。［方法］血漿中に既知の濃度のQNを添加し、限外濾過法により遊離型濃度をHPLCで測定した。結合型濃度は算出した。［結果と考察］Scatchard plotsの結果、どの動物種においても結合型濃度と遊離型に対する結合型の比の関係は2相性を示した。非線形最小二乗法により結合動態パラメーターを求め、血漿中QNの動態をシミュレーションした。その結果、QNの動態は種によって大きく異なることが示された。さらに、AGP濃度を変化させた場合、遊離型濃度の変化も動物種により異なることが示された。よって、AGPに親和性の高い薬物において、動物種間の薬効、毒性を比較する際、血漿中総濃度のみを考慮するとその評価を誤る可能性があることが考えられた。

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Recently we reported that simultaneous treatment of NIH 3T3 cells with the combination of phorbol myristate acetate (PMA) and hydrogen peroxide (H₂O₂) resulted in synergistic activation of Raf-1 kinase. In the present study, we have demonstrated that PP2 (4-amino-5-(4-chloro-phenyl)-7-(t-butyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidine), a potent and selective inhibitor of the Src-family tyrosine kinase, greatly potentiated the ability of PMA and/or H₂O₂ to activate Raf-1 kinase while it blocked the tyrosine phosphorylation of Raf-1. Unlike PMA/H₂O₂ treatment, which showed transient activation, PP2-mediated Raf-1 activation was sustained and continued to increase through 4 h of treatment. Transient transfection studies with a dominant-negative mutant of Ras (N19Ras) indicated that this PP2-induced activation of Raf-1 was Ras-independent. Moreover, PP2 showed no effect on platelet-derived growth factor (PDGF)-induced Raf-1 activation. Interestingly, mutation of the reported Raf-1 Src family tyrosine kinase phosphorylation site by conversion of tyrosines 340 and 341 to phenylalanine (YY340/341FF Raf) had limited effect on the ability of PP2 to induce significant stimulation of Raf-1 kinase activity. Taken together, our results suggest that a tyrosine phosphorylation event is involved in the negative feedback regulation of Raf-1. Inhibition of a Src family tyrosine kinase by PP2 appears to alleviate this tyrosine kinase-mediated inhibition of Raf-1 and allow activating modification(s) of Raf-1 to proceed. This PP2 effect resulted in significant and sustained Ras-independent activation of Raf-1 by PMA and H₂O₂.

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HHBrk1, human homology of maize Brick1 gene, was primarily identified to be an over-expressed novel gene in the α particles-transformed human bronchial epithelial cells in our laboratory. While maize Brike1 gene functions in promoting polarified cell division and cell morphogenesis in the maize leaf epidermis. HHBrk1 is predominantly expressed in the heart and skeletal muscle. The vector encoding GFP-hHBRK1 fusion protein was constructed and transfected the 95D lung cancer cells. GFP-hHBRK1 fusion protein was found to specifically recruited to the actomyosin ring and the tips of lamellipodia in cultured 95D cells, indicating that the gene product is a filament actin related protein and might be involved in actin filament assembly. To gain more information for elucidation the detail function of hHBRK1, the interacting protein of hHBRK1 was identified in heart tissues of mouse by GST pull-down assay and peptide mass fingerprint. The interaction between hHBRK1 and Ea isoform of cardiac troponin T (cTnT) was unveiled and further confirmed by coimmunoprecipitation and western blot analysis. Ea isoform is the result of alternative splicing in the N-terminal region of cTnT. These findings suggest that hHBRK1-cTnT interaction might function in the actin cytoskeletal organization

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ベニバナボロギク(Crassocephalum crepidioides)は民間薬として急性肝炎、発熱、浮腫に用いられており、抗突然変異誘発作用、抗酸化作用を有し、現在抗酸化成分としてイソクロロゲン酸aとcが分離されている。先に当教室ではベニバナボロギクがガラクトサミン(GalN)/リポポリサッカライド(LPS)誘導のラット肝障害を抑制することを明らかにした。そこで本研究では、LPS刺激によるマクロファージにおけるiNOS蛋白発現誘導を沖縄産薬草であるベニバナボロギクが抑制するか否かを検討した。研究方法は、マクロファージとしてBALB/c NIHマウスの腹水から樹立されたマクロファージ様細胞株、J774細胞を用いて行った。前培養では10%のウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を使用し、LPSおよび薬草添加時には0.5mMアルギニンをさらに加えて培養した。ベニバナボロギクは熱水抽出されたものを、イソクロロゲン酸はDMSOに溶解されたものを使用した。未刺激J774細胞をコントロール、細菌成分であるLPS(0.5μg/ml)で刺激した細胞を陽性コントロールとし、LPS刺激に加えてベニバナボロギク、イソクロロゲン酸(DMSO<0.5%)を添加した細胞の12時間と24時間後のiNOS(130kDa)蛋白発現量を8%のSDS-ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動後、Western blotを行って評価した。その結果、ベニバナボロギク(1mg/ml)、イソクロロゲン酸(200μM)が著明にiNOS蛋白発現を抑制した。このことからベニバナボロギクの生体内での炎症防御にiNOSが関与する可能性が示唆された。

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【目的】創薬初期の化合物選択において培養細胞を用いた細胞毒性試験は有効であるが，使用細胞株，試験法によって結果が異なることがある。今回我々は，探索段階における細胞毒性試験の実施を目的として，8種類の細胞株，ヒトおよびラット初代肝細胞を用いて4つのアッセイ法を実施し，感度，操作性，操作時間およびバラツキについて比較・検証したので報告する。【方法】由来の異なる8種類の細胞株（CHO，CHL，HepG2，ARLJ 301-3，ACHN，NRK-52E，Caco-2，IEC-6），ヒトおよびラット初代肝細胞を用いた。0.6-2.0×10⁴cells/wellで96穴マイクロプレートに播種し，24時間前培養を行った。11種類の化合物を添加して24時間暴露させ，細胞内ATP量，ミトコンドリア呼吸能（WST-1およびアラマーブルー法）およびDNA量（Hoechst 33342）を測定した。さらにこれらの化合物のIC₃₅値を算出し，細胞およびアッセイ法の比較を行った。【結果および考察】化合物の毒性の強さは細胞間で大きな差はなかったが，アミオダロンはヒトおよびラット初代肝細胞で，シクロスポリンはHepG2細胞で，ビンクリスチンはHepG2およびCaco-2細胞で感受性が弱かった。ヒト初代肝細胞は多くの化合物に対して感受性が強かった。測定法では，ATP測定法が最もバラツキが少なく，操作性，感度および操作時間の面でも優れていた。また，アラマーブルー法も感度良く検出できた。今回用いた11種類の化合物はin vivoでは肝臓や腎臓など特定の臓器に障害を示すが，in vitroでは細胞の由来による差は少なかった。これはin vivoでの毒性はADMEなどによる影響などが大きいが，in vitroでの毒性は細胞の増殖速度や接着能などの影響が大きいためと考えられる。

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Methamphetamine (METH), widely abused in Taiwan, is a long lasting derivative of d-amphetamine that has led to rapidly spreading health problems due to the high incidence of neurological and psychiatric complications associated with the consumption of this psychostimulant. Repeated exposure to recreational doses of METH produces persistent neurotoxicity to presynaptic monoamine terminals. However, the molecular and cellular mechanism underlying this process has remained unclear. In this study, we established a cell-culture model of METH-induced neuronal damage in human neuroblastoma SH-SY5Y cells. After exposure to 250 microg/ml of METH, we found the following intracellular alterations: (1) Mitochondrial membrane potential showed a 40% decreased after a 2hr treatment. (2) Intracellular mitochondrial mass showed a 50% increased after a 24hr treatment. (3) Cell cycle was arrested at G₀/G₁ phase after a 24hr treatment. (4) DNA fragmentation (sub-G₁) was significantly increased and cytoplasmic vacuoles as well as plasma membrane blebbing were observed after a 48 hr treatment. (5) Cell death was observed in a dose- and time-dependent manner. In addition, we found that pretreatment with 5 mM N-acetyl-cysteine (NAC) prevented the METH-induced cell death. However, pretreatment with 25 to 100 microM baicalein only prevented the cell death induced by the 250 microg/ml METH treatment for 24 hr. Baicalein could delay, but not completely prevent, the METH-induced neurotoxicity in the SH-SY5Y cells. Based on these observations, we suggest that the loss of mitochondrial membrane potential and cell death may play a critical role in the METH-induced neurotoxicity.

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生体分子機構に基礎を置いた分子毒性研究を進めるに当たり、そして、これを身の回りに存在する数万種の化学物質の毒性評価を効率化する方策として、我々は既知毒性物質を含む化学物質を対象としたトキシコゲノミクス・データベースの構築を進めている（*）。これにより、毒性発現メカニズムに支えられた、より正確、迅速かつ安価なリスク評価系の開発を目指している。
　このデータベースの構築に当たり、実験間の定量的比較を正確に行うなどの要件を満たす為に、Percellome手法（細胞1個あたりのmRNA絶対量を得る遺伝子発現解析手法）をAffymetrix GeneChipに適用することを出発点として開発した。現在は定量的RT-PCRと互換性のある高い精度を実現している他、CodeLink、Agilentのマイクロアレイへの移植が進んでいる。遺伝子欠失マウスの活用を見込んでマウスを主対象として実施中の本研究は３年計画の２年目に約50化合物のデータを収録し（H17/1/1現在）、予定とする100化合物を達成可能としている。また、異なる方式から得られたデータも容易に統合可能なPercellome手法が普及すれば、データベースの規模の加速的増大が期待される。
　本データベースは、毒性マーカー遺伝子（所謂フィンガープリント）の同定の他、毒性発現の分子機序を解明するために有用である。ここで得られる大規模な多変量データを効率よく分類（クラスタリング）するアルゴリズムを独自開発し、同一の発現制御下にある可能性の高い遺伝子クラスター（群）を多数抽出・解析している。より効率的なシグナルカスケード解析を行うことができる、遺伝子欠失マウスなどの遺伝子改変動物と野生型マウスとの比較研究にも着手している。本発表では本データベースと解析ストラテジーの概要を報告する。
　（*: 厚労科研費・H15-化学-002「化学物質リスク評価の基盤整備としてのトキシコゲノミクスに関する研究」）

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Aryl-hydrocarbon receptor (Ahr)はダイオキシン受容体としての性質を有し、その遺伝子欠失マウスの所見から、毒性学的に多彩な生体反応の引き金となることが確認されている。Ahrのリガンドとなる化合物には、2,3,7,8-TCDDなどの所謂ダイオキシン類の他、多環芳香族の3-methylcholanthrene(3-MC)や、生体由来のindigo/indirubin、βnaphthoflavoneなどが知られている。これらは、Ahrのリガンドでありながら毒性作用が異なって居り、これらのAhr依存度と分子毒性機序の差異を明らかにすることは毒性学的に非常に重要である。本発表では、我々の進める化学物質トキシコゲノミクス・プロジェクト（Percellome Project）の一環として実施した4種のAhr作動性化学物質について、投与によるマウス肝臓における遺伝子発現変動の初期像を比較解析し、その相違点と共通点を分子毒性学的に解明することを目的とする。
　12週齢雄のC57BL/6マウスに2,3,7,8-TCDD、2,3,7,8-TCDF、3-methylcholanthrene、或はIndigoを4-5用量（溶媒群及び公比√10、3-4段階）で単回強制経口投与し、その2、4、8、及び24時間後に肝臓を採取し、GeneChip Mouse Genome 430 2.0 Array（約45,000プローブセット）(Affymetrix Inc.)により、網羅的遺伝子発現解析を行った（１化合物に付き16~20群、各群３匹、計48~60測定）。標準化の手法に我々の開発した細胞一個あたりのRNA発現量を得る“Percellome”手法を使用し、化合物間の遺伝子発現比較をｍRNAコピー数により正確に実施した。
　Cyp1a1, Cyp1a2等、Ahrを介して発現が誘導される幾つかの既知遺伝子についても４物質すべてで誘導が確認されるものの、24時間まで遺伝子発現が持続する物と24時間以内に発現が終息する物など、これらの経時的用量的発現パターンには差異が見られる等の新知見が得られた
（本研究は厚労科研費・H15-化学-002「化学物質リスク評価の基盤整備としてのトキシコゲノミクスに関する研究」による）

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内分泌かく乱化学物質問題に於いて考慮すべき要素の一つに食物中（動物実験の場合は飼料中）の植物性エストロジェン（PE）がある。従来の毒性試験系はこの様な飼料活性を鋭敏に検出するものとはなっていないが、人での健康評価問題も含めて、それらの受容体原性影響の把握が重要となって来ている。我々は、分子毒性研究として化学物質トキシコジェノミクス・プロジェクト（Percellome project）を立ち上げ、分子メカニズムに支えられた、より正確、迅速、安価なリスク評価系の開発を推進している。ここでは、受容体原性毒性研究への適用例として、飼料中PEが、外来ホルモン活性化学物質の遺伝子発現変動に及ぼす影響を解析した結果を報告する。
　C57BL/6雌をCRF-1 (PE含有)、或はPhytoestorogen low diet（PLD:PE測定限界以下）にて飼育し、卵巣摘出後2週目に17β-estradiol （E₂）、bisphenol A（BPA）及びgenistein（GEN）を各々0.3microg/kg、70mg/kg、25mg/kg単回皮下投与し、投与後２及び24時間目に子宮を採取し、Percellome手法を適用した遺伝子発現プロファイルを得、飼料中PEの影響を解析した。
　遺伝子はその発現が飼料に影響されるものとされないものに大別された。前者はエストロジェン誘発遺伝子を含み、CRF-1で基礎発現値が高く、化合物投与での発現誘導幅がPLDで小さく、CRF-1では大きい傾向を示した。この結果はエストロジェンによる遺伝子発現変動がシグモイド曲線に従いPEがその底上げに働き、投与物質がその上に相加的に上乗せされた結果である可能性が示された。本研究は、化合物の生体作用を検討する際に飼料など背景となる状態の影響が無視出来ないことを遺伝子発現レベルで示した研究として注目される。
（本研究は厚労科研費・H13-生活-012及びH15-化学-002「化学物質リスク評価の基盤整備としてのトキシコゲノミクスに関する研究」による）

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　発生毒性学は、個体発生過程に於けるダイナミックな遺伝子発現調節の分子機構を基礎に、より正確なものに補強されることが分子発生研究から示されている。分子毒性研究の応用として、我々は、化学物質トキシコジェノミクス・プロジェクト（Percellome project）により、毒性発現分子メカニズムに支えられた、より正確、迅速、安価なリスク評価系の開発研究を推進している。ここでは、このPercellome projectの発生毒性への適用のモデル実験として、遺伝子欠損マウス胚を用いた解析例を報告し、この技術的妥当性を示す。
　モデルとしての当該遺伝子は、bHLH型転写因子MesP1およびMesP2遺伝子とした。両遺伝子は、発生初期の原腸陥入直後における中胚葉において一過性の発現を示す（胎生6.5-7.5 日）。このホモ欠失胚は、胚性中胚葉を欠き、原腸陥入部位には未分化中胚葉が蓄積するという表現型を示した上で、胎生10.5日に胎生致死となる。ホモ欠失と野生型のキメラ胚の解析から、これらの遺伝子が心臓中胚葉形成に必須な遺伝子であることも明らかにしてきた。経時変化ならびに機能面から、この遺伝子カスケードに注目し、胎生6.5日および7.5日の野生型ならびにホモ欠失胚の遺伝子発現を、GeneChip MOE430v2 (Affymetrix社)（約45,000プローブセット）を用いて網羅的に解析し、比較・検討した。
　ホモ欠失胚で発現が減少している遺伝子群として、心筋細胞あるいは血管内皮細胞の発生に関与する遺伝子群がリストアップされてきた。従って、発生毒性に向けたこの解析技術の妥当性を検証することが出来たものと考えられた。野生型胚全胚（胎生7.5、8.5、9.5日）の全胚遺伝子発現プロファイル・データベースを構築済みであり、現在、モデル催奇形性物質投与によるマウス胚を用いた遺伝子発現変動解析を検討中である。
（本研究は厚労科研費・H15-化学-002「化学物質リスク評価の基盤整備としてのトキシコゲノミクスに関する研究」による）

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製薬協基礎研究会では、2002年にトキシコゲノミクス（TG）およびファルマコゲノミクス（PG）の取り組みについて加盟企業へのアンケート調査を実施した。その結果、未導入の会社が多く、具体的成果があまり得られていない状況が確認された。その後、日本および欧米ではPGのガイダンスが公表間近となり、本格的な対応が必要となりつつある。また、前回の調査から2年が経過し、ゲノミクスを取り入れた具体的成果や課題がより明確になってきていると考え、再度、TG・PGへの取り組みを調査し、その結果について、2002年のものと対比し、その課題の抽出に資する事を目的とした。
アンケートは製薬協加盟80社を対象に実施（2005年1月6日-2月10日）し、TG、PGのそれぞれの有効回答数は共に63であった。
TG：現在TGは約40％（24社）の企業で導入されていた。TG技術は、創薬段階での薬物篩い分け、前臨床試験での毒性予測、ヒト副作用の予測、毒性メカニズム解析、バイオマーカーによる毒性評価、バイオマーカー確立、他剤との差別化に活用され、中でもほとんどの企業で毒性メカニズム解析は実施されていた。本調査ではTG技術の用途別に成功例、失敗例または課題について各社の意見をまとめた。さらに、前回の調査では問題点として「TG結果の意義付け」が圧倒的に多く、今回も約7割の意見は同様な結果であったが、残りの3割の意見は何らか形で結果の意義付けが見えてきたとの回答であった。
PG：薬物動態評価に何らかの形でPGを取り入れている企業は約45％（30社）であった（なお、酵素誘導評価においてレポーターアッセイ、RT-PCRを取り入れている企業も含めた）。薬物代謝酵素、トランスポーターの多型性の評価結果は臨床試験デザインに大きく影響することから、多型で層別した臨床試験を実施するために基礎が準備する試験データについて各社の意見をまとめた。

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【目的】我々は第31回学術年会において，GeneChip^®マイクロアレイ（RG U34Aアレイ，Affymetrix, Inc.）を用いた，肝臓グルタチオン欠乏を評価可能なプローブセットの選抜に関して報告した．本発表ではRAE230Aアレイ（Affymetrix, Inc）から同様のプローブセットを選抜し，両アレイのデータ解析結果を比較することを目的とした．【方法】L-buthionine (S,R)-sulfoximine（BSO），acetaminophen（APAP），butylated hydroxyanisole（BHA）をそれぞれ投与した雄性F344ラット肝臓に関して，RE230Aアレイを用いてマイクロアレイ解析を行い，mRNAレベルが肝臓グルタチオン含量に統計学的に有意に逆相関した遺伝子プローブ（グルタチオン欠乏評価プローブ）を選抜した．【結果および考察】RAE230Aアレイ版のグルタチオン欠乏評価プローブとして192個が選抜された．（RG U34Aアレイ版では69個．Biochem Pharmacol 68(7):1465-75）．主成分分析の結果，対照群，BSO群，APAP群，BHA群の各クラスターは明確に分離されたことから，RAE230Aアレイデータに関してもRG U34Aのデータ同様，マイクロアレイのデータから肝臓グルタチオン欠乏の評価が可能と考えられた．公共あるいは市販のトキシコゲノミクスデータベース充実化は近年急速に進んでいるものの，異なる型のアレイデータ混在が解析の障壁となっている．本試験では，アレイ間でデータが一致する遺伝子（メタロチオネインなど）と，一致しない遺伝子（CD14など）が混在した．こうしたデータの非整合性に対処するために，新旧アレイ間のデータ整合性を高めるプローブを選抜する方法を検討したので，併せて報告する予定である．

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【目的】現在の医薬品開発における毒性評価は、実験動物あるいはヒト由来培養細胞を用いて行われているが、ヒトでの毒性を予測するには不十分な点が多く、今後よりヒトに近い実験系の構築が望まれている。近年ヒトでの毒性を評価する手段の１つとして、DNAマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析（Toxicogenomics）が検討されている。そこで、本研究では材料としてプライマリーヒト肝細胞を用いて薬剤曝露時における網羅的な遺伝子発現解析を行い、そのデータを用いた肝毒性予測モデルの構築を目的とした。 【方法】接着型の凍結プライマリーヒト肝細胞に対し肝毒性を誘発する化合物を曝露し、1,4,24時間後の遺伝子発現量をマイクロアレイ（Affymetrix社製GeneChip® Human Genome U133A）を用いて測定した。肝毒性薬剤にはそれぞれ異なる肝毒性を誘発する化合物としてAcetaminophen （壊死）、chlorpromazine （胆汁うっ滞）, diclofenac（肝炎）、isoniazid （肝炎）、nitrosodimethylamine（遺伝子障害性発がん物質）、phenobarbital（非遺伝子障害性発がん物質）、 tetracycline （脂肪変性）を用いた。この結果得られた網羅的遺伝子発現データから肝毒性に関連する可能性の高い遺伝子を抽出し、それらの発現データを用いて肝毒予測モデルを構築した。モデル構築にはADMEWORKS/ModelBuilder（富士通九州システムエンジニアリング社）を使用した。【結果・考察】遺伝子発現データをパラメーターとしてモデル作成を行った結果、肝臓内における薬剤に対する応答反応を遺伝子発現レベルで鋭敏に捕え、極めて少数のパラメーターによる肝毒性予測モデルを構築できる可能性を示唆する結果を得ることができた。

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We treated cryopreserved human hepatocytes from three donors with a range of model hepatotoxic and non-hepatotoxic compounds and monitored their gene expression profiles using Affymetrix GeneChip technology. In order to create a “training list” with which to analyse unknown drug classes, a range of well studied compounds were chosen for their ability to elicit different pathological responses in the liver.Plated hepatocytes were treated with a single dose of acetaminophen (necrosis), chlorpromazine (cholestasis), diclofenac (hepatitis), gemfibrozil (positive control), isoniazid (hepatitis), nitrosodimethylamine (genotoxic carcinogen), phenobarbital (non-genotoxic carcinogen) and tetracycline (steatosis). Total RNA was isolated after 1, 4 and 24 h and used to synthesize biotin-labelled cRNA. Labelled cRNA from the three donors was pooled and hybridized to an Affymetrix HG U133A chip. Two replicates for each compound at each time point were performed and the expression values averaged. Changes in gene expression values compared to vehicle treated hepatocytes were used to identify genes capable of distinguishing the compounds.A second set of chemicals belonging to different drug classes (thiazolidinediones, anti-estrogens and HDAC-inhibitors) was tested in the same manner and the “training list” used to cluster all samples. Principal component analysis of the 24 h-treated samples showed distinct groupings according to chemical class.

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【緒言】トキシコゲノミクスプロジェクトは国立医薬品食品衛生研究所と製薬企業17社による共同研究であり，遺伝子発現データを用いた安全性予測システムの開発を目標としている．遺伝子発現実験において，RNAの品質はデータの精度に影響を与えることから，サンプル採取の際には迅速に保存する必要がある．しかし，毒性試験ではRNAサンプルの保存が最優先とは限らないため，時間経過によるRNAの分解が心配される．我々はRNA安定化試薬であるアンビオン社のRNAlater reagent（以下，RNAlater）に組織を保存するまでの時間とRNAの安定性に関しての検討を行った（検討1）．また，RNAlaterでの室温および4℃の保存期間についても検討した（検討2）．【方法】検討1：1匹のラットの肝臓から得た約10mgの組織片を氷上あるいは室温で10，30，60，120および240分放置した後，RNAlaterで1晩4℃保存した後，-80℃で凍結保存した．検討2：検討1と同様な組織片を摘出後10分以内にRNAlaterに浸して，4℃あるいは室温で１，3，8および15日保存した後に，-80℃で凍結保存した．各サンプルについてRNAをRNeasy mini columnで抽出し吸光度測定後，電気泳動およびβ-actinのreal-time PCRでRNAの品質の比較を行った．【結果および考察】検討1：室温で120分以上保存した際にβ-actinの発現量が減少したが，氷上保存では変化はなかった．検討2：RNAlaterに漬けて室温で保存した場合は，β-actinの発現量がわずかに減少したが，4℃では変化はなかった．以上より，肝組織から安定してRNAを抽出する場合は，組織の取り扱いを氷上で，凍結前のRNAlater保存は4℃で行うことが望ましいと考えられた．

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【緒言】トキシコゲノミクスプロジェクトは国立医薬品食品衛生研究所と製薬企業17社による共同研究であり，遺伝子発現データを用いた安全性予測システムの開発を目標としている．遺伝子発現実験において，RNAの品質はデータの精度に影響を与えることから，RNAサンプルの保存条件は重要である．最近，アンビオン社から，RNA安定化試薬（RNAlater reagent，以下RNAlater）が発売され，多くの研究室で使用されるようになった．本研究ではRNAlaterを使用した保存法と従来の保存法（組織を凍結後，冷凍庫あるいは液体窒素で保存）を比較し，組織保存法の違いがRNAの品質に及ぼす影響について検討した．【方法】1匹のラットの肝臓から得た約20mgの組織片をRNAlater，液体窒素，-80℃あるいは-20℃で保存した．なお，RNAlaterについては組織片をRNAlaterの入ったチューブに入れ4℃で1晩保存した後，3つの方法（-80℃，-20℃，RNAlaterを除去した後に-80℃）で保存した．各条件で7日，1，3，6および12ヶ月保存した後，RNAをRNeasy mini columnで抽出し，吸光度測定後，電気泳動およびβ-actinのreal-time PCRでRNAの品質の比較を行った．【結果および考察】RNAlaterを用いた保存法は，他の方法と比較してRNAを最も安定して保存することができた．また，β-actinのreal-time PCRにより，RNAの電気泳動における28S/18Sのパターン比較では検出できないRNA量の差を検出することができた．以上の結果から，RNAlaterを用いた保存法は，液体窒素や超低温冷凍庫を使わずにRNAを安定化したまま組織を保存することができ，遺伝子発現実験に有用であると考えられた．

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【緒言】トキシコゲノミクスプロジェクト（TGP）は国立医薬品食品衛生研究所と製薬企業17社によって2002年に開始されたプロジェクトである。TGPでは約150化合物について、ラットin vivo、ラット初代培養肝細胞およびヒト初代培養肝細胞の一連のセットで曝露試験を実施し，遺伝子発現及び毒性学的データを蓄積している。我々はそのデータを基にした安全性予測システムの開発を目指している。本発表では、エチオニン暴露後の遺伝子発現変化をラット初代培養肝細胞およびヒト初代培養肝細胞の試験系で比較した。【方法】ラット初代肝細胞は、6週齢の雄性SDラットからコラゲナーゼ還流法により分離した。ヒト初代肝細胞はTissue Transformation Technologies社から購入した。エチオニンを最終濃度0.4、2および10mMになるように培地に添加し、2、8および24時間後に細胞を回収して解析に用いた。網羅的遺伝子発現解析には、ラットはAffymetrix Rat 230 2.0マイクロアレイを、ヒトはU133 Plus 2.0マイクロアレイを用いた。ラットおよびヒトでの比較は、ヒトで得られた結果をラットオルソログに変換して行った。【結果および考察】ヒト初代培養肝細胞とラット初代培養肝細胞で共通して変動が見られた遺伝子数は、ヒト初代培養肝細胞で変動が見られた遺伝子の約2割であった。共通して変動した遺伝子のうちCbp/p300-interacting transactivator,　with Glu/Asp-rich carboxy-terminal domain,2 (Cited2)などは、ラットin vivoでも同様な変動が見られ、またTGPで評価済みの化合物の中でも特異的に変動していたことから、エチオニンの作用に密接に関連しているものと考えられた。

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トキシコゲノミクスプロジェクト（TGP）は国立医薬品食品衛生研究所と製薬企業17社によって2002年に開始されたプロジェクトである．TGPでは約150化合物について，ラットin vivo，ラット初代培養肝細胞およびヒト初代培養肝細胞の一連のセットで曝露試験を実施し，遺伝子発現及び毒性学的データを蓄積している．我々はそのデータを基にした安全性予測システムの開発を目指している．in vivo試験で化合物の安全性を予測する際，投与後の吸収，分布，代謝および排泄の4ステップからなる体内動態を把握することは重要である．近年，化合物投与後における体内動態の各段階でトランスポーターの関与が注目を集めており，P糖タンパク質やMRPファミリーをはじめとする多種多様なトランスポーターが同定されてきた．またトランスポーター遺伝子群の発現は化合物投与によって変化し，薬物動態に影響を与えることも報告されていることから，これらの発現変動を調べることは，化合物の安全性を予測する上で有用な情報となる．我々は，現在までにデータ生成が完了している化合物の中から，トランスポーターの基質，InducerもしくはInhibitorとして作用することが知られている化合物を中心に15化合物に着目し，それらの化合物を反復投与したラットの肝組織を用いて，real-time PCRにより代表的なトランスポーター遺伝子の発現変動を調べた．またラット初代肝細胞を用いたin vitro試験においても同様の評価を行い，ラットin vivoおよびin vitroにおけるトランスポーター遺伝子群の発現変動について比較検討したので報告する．

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【緒言】トキシコゲノミクスプロジェクトは国立医薬品食品衛生研究所と製薬企業17社による共同研究であり，遺伝子発現データを用いた安全性予測システムの開発を目標としている．遺伝子発現実験において，RNAの品質はデータの精度に影響を与えることから，RNAサンプルの保存条件は重要である．我々はRNA抽出にキアゲン社のRNeasy kitを採用しており，その構成試薬であるBuffer RLT lysis buffer（以下RLT）を用いて肝組織および培養細胞の溶解を行っている．この保存方法はRNA抽出に使用した残りのサンプルをRLT溶解液の状態で保存できるため，再実験や貴重なサンプルの保存に有用である．本研究では，RLTに溶解した肝組織を，液体窒素，-80℃あるいは-20℃で保存した後，サンプル中のRNAの安定性を調べることにより，保存条件の違いがRNAの品質に及ぼす影響について検討を行った．【方法】1匹のラットから得た肝組織片10 mgにつき100μLのRLTを添加し溶解した後，組織溶解液を100μLずつ分注し，3つの方法（液体窒素，-80℃，-20℃）で保存した．各条件で3日，7日，1，3，6および12ヵ月保存した後，RNAをRNeasy mini columnで抽出し吸光度測定後，電気泳動およびβ-actinのreal-time PCRでRNAの品質の比較を行った．【結果および考察】12ヵ月間の保存期間中，液体窒素，-80℃および-20℃の保存条件で，RNAの28S/18Sのパターンおよびβ-actinの遺伝子発現量に大きな差はなかった．これらの結果から，RLT組織溶解液でRNAを安定化したまま保存できるだけでなく，RNA安定化試薬：RNAlater reagent（アンビオン）による保存が不向きな培養肝細胞の保存にもRLTが応用可能であると考えられた．

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【緒言】トキシコゲノミクスプロジェクト（TGP）は国立医薬品食品衛生研究所と製薬企業17社によって2002年に開始されたプロジェクトである。TGPでは約150化合物について、ラットin vivo、ラット初代培養肝細胞およびヒト初代培養肝細胞の一連のセットで曝露試験を実施し，遺伝子発現及び毒性学的データを蓄積している。我々はそのデータを基にした安全性予測システムの開発を目指している。本研究では基礎的検討として、ラット腎臓を乳頭、髄質、皮質に分離して遺伝子発現解析を行い、遺伝子発現プロファイルを部位間で比較した。【方法】6週齢雄性SDラットから摘出した腎臓を、乳頭、髄質および皮質に分離し、それぞれGeneChip Rat Genome 230 2.0 Array (Affymetrix) にて遺伝子発現を網羅的に解析した。【結果および考察】腎機能（尿生成、有害物の排出、ホメオスタシス、およびレニン、プロスタグランジン、エリスロポエチンの産生・分泌など）と関連が深い遺伝子に着目すると、乳頭、髄質および皮質間で発現量が異なる遺伝子が多数確認された。例えば、尿素輸送に関連するsolute carrier family 14 member 2（Slc14a2）遺伝子は、皮質＜髄質＜乳頭で発現量が高く、グルコース再吸収と関連するNa+ dependent glucose transporter 1（Naglt1)遺伝子は、乳頭＜髄質＜皮質で発現量が高かった。腎臓の各部位における遺伝子発現を網羅的に解析した本研究結果は、腎機能の生化学的・生理学的heterogeneityを研究する一助となる。更に毒性学的には、化合物による腎臓の障害部位と、各部位の遺伝子発現プロファイルを組合せて解析することで、より高度な毒性メカニズム解析が可能となる。

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［背景］近年、様々な電気機器の発達により、中間周波数帯の電磁界の利用が増加しており健康影響に関する関心が高まりつつある。しかし、中間周波電磁界（300Hz～10MHz）の生物影響については、ほとんど研究されていない。［目的］in vitro試験が可能な中間周波磁界曝露装置を開発し、微生物復帰変異試験により、2kHz、20kHz、60kHzの中間周波磁界の変異原性について検討する。［方法］in vitro試験用の中間周波磁界曝露装置を開発した。本装置は、2kHz、20kHzおよび60kHzの正弦波磁界を、それぞれ最高0.91mTrms（ICNIRP国際ガイドラインの146倍）、1.1mTrms（同176倍）および0.11mTrms（同18倍）で曝露できる。コイル内に磁場を遮蔽しないように塩ビ性のウォータージャケット式インキュベーターを配置した。磁界曝露空間は、20 x 20 x 20cmで、磁界の均一性は、±2.5%以内に制御できた。この装置を用い、６種類の試験菌株（サルモネラ菌４菌株(TA1535、TA1537、TA98、TA100)および大腸菌２菌株(WP2 uvrA、WP2 uvrA/pKM)）に対し、2kHzで910μT、20kHzでは、270μTおよび1.1mT、60kHzでは110μTの磁界を、それぞれ48時間曝露した。各試験は、対照群および曝露群それぞれ６枚ずつのプレートを用い、３回以上行った。［結果］t-検定で復帰変異コロニー数を評価したところ、いずれの菌株でも再現性のある有意な復帰変異コロニー数の変化は見られなかった。また、各試験結果の平均値を用いたプール解析でも有意な差は見られなかったことから、本研究で検討した高磁束密度の中間周波磁界には、変異原性がないことが明らかとなった。

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【目的】医薬品候補化合物の開発初期段階における染色体異常(CA)誘発性の効率的な評価方法として、in vitro小核(MN)試験法の有用性が注目されている。本研究では自社低分子化合物のうち弱度から中等度のCA陽性化合物に焦点を当てMNのデータ特性を調べた。
【方法】陽性対照9物質、あるいは自社低分子8化合物(弱度から中等度のCA陽性化合物、構造異常5-30％前後)を対象として、CHL細胞を用いるMN試験法により、1) MNおよびCAの最大異常頻度・用量反応の比較、2) MNおよびCA判定結果の一致率、3) MN試験におけるサイトカラシンBの有用性を調べた。
【結果】1) 陽性対照物質の最大異常頻度はMNおよびCA間で高い相関性を示したが、異常頻度はMNで低くCAの約1/2であった。一方、自社化合物の最大異常頻度はMNで低くCAとの間に相関性は認められなかったが、MN頻度は低いながらも陰性対照と比較して高値を示した。また、MNおよびCAは同様の用量反応を示した。2) MNおよびCA判定結果の一致率は、陽性対照物質で高かった(88％)。一方、自社化合物の一致率は低かったが(54％)、MN試験の最高用量として過度の細胞毒性用量(陰性対照の相対値20％未満)を除いて解析すると一致率の向上が認められた(67％)。3) サイトカラシンBの検討において、陽性対照物質では非添加系と比較して添加系のMN頻度が高値を示した。一方、自社化合物では中等度CA陽性化合物に陽性対照物質と同様の傾向が認められたが、弱度CA陽性化合物に明確な差はなかった。
【結語】自社低分子化合物のうち弱度から中等度のCA陽性化合物に焦点を当てMNのデータ特性を調べた結果、陽性対照物質とは異なる傾向が散見された。以上のようなデータ特性を把握した上で、医薬品候補化合物の開発初期段階に効率のよいMN試験系を用いることは有用と考えられた。

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【目的】Ames試験は医薬品開発における標準的な試験法として汎用されているが，創薬初期には化合物の合成量に限りがあるため実施が制約される．これに対し，Ames試験を小型簡略化したMiniscreen Assayは，Ames試験と同じ測定原理ながらAmes試験より少ない化合物量で実施可能である．今回Miniscreen Assayの検出感度を検討するため，Ames試験で陽性となった自社化合物（22化合物）について，サルモネラ菌TA98およびTA100株を用いてMiniscreen Assayを実施し，Ames試験の結果と比較した．【方法】12 wellプレート内に最少グルコース寒天を固化させ，その上に緩衝液またはS9mixを100µl，化合物溶液を20µl，および5 %菌液が入った軟寒天500µlを順次重層し，37℃で2日間培養して復帰突然変異コロニー数を計数した．【結果および考察】Ames試験の直接法あるいは代謝活性化法いずれかの試験条件下で，溶媒対照群に対し復帰突然変異コロニー数をTA98株で5倍，あるいはTA100株で3倍を超えて増加させたAmes強陽性化合物は，Miniscreen Assayにおいても同一条件下でコロニー数を増加させた．一方，これらAmes強陽性化合物でもコロニー数の増加を示さなかった条件では，Miniscreen Assayにおいても増加はなかった．また，コロニー数の増加が3倍未満のAmes弱陽性化合物は，いずれの条件においてもMiniscreen Assay でコロニー数を増加させることはなかった．これらの結果から，Miniscreen Assayは創薬の初期段階でAmes試験の陰性化合物を陽性と判定することなく，Ames試験の強陽性化合物を確実に検出できる簡易法として利用可能と考えられた．

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目的
植物の根や果実などを原料とする生薬には、抗酸化作用や免疫増強作用など有効な物質が多く含まれている。しかし、生薬剤の効果のみを考え飲んだとしても不十分の効果か、全く違う効果が起きる危険性が高まる可能性があるためこれらの有害情報管理や毒性情報が要求されている。本研究はThe National Toxicology Program (USNTP)および医薬品などの毒性試験基準(KFDA)に従い生薬の安全性評価資料確保および危害性評価について検討した。

材料と方法
生薬材料は、Arisaema amurense Maxim、Myristica fragrans Houttuyn、Acanthopanax divaricatus var. albeofructus、Zizyphus jujuba MillerおよびPeriploca sepium Bgeを熱湯抽出後凍結乾燥した粉末を使用した。試験方法は復帰突然変異試験、染色体異常試験およびマウスを用いる小核試験を使用した。

結果と考察
復帰突然変異試験では、全ての被験物質群の復帰変異コロニー数は代謝活性化の有無に関わらず、用量依存性ならびに陰性対照群の2倍以上の増加が認められなかった。染色体異常試験では、 全ての被験物質群の培養系列において、構造異常あるいは数的異常(倍数体)を有する細胞の出現頻度は陰性対照群と同程度であり、染色体異常誘発性を有さないと判定された。マウス骨髄細胞を用いた小核試験の全ての被験物質群での小核誘発頻度は陰性対照群と比較して2000mg/kgの濃度群で有意な差が認められなかった。また、被験物質投与群の正染性赤血球（NCE）に対する多染性赤血球（PCE）の比率は陰性対照群と同程度であった。本研究で得られた 遺伝毒性評価の結果は今後、生薬の様々な毒性試験とヒトへの健康影響を把握する基礎資料として活用できると考えられる。

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CB6F1-TgrasH2（rasH2)マウスはヒト発がん物質に高い感受性を示し短期がん原性試験に有用だが、同腹仔であるCB6F1-nonTg（nonTg)マウスと外観上区別できず、生産段階で片側耳介がマーキングされてしまうという欠点がある。そこでICタグの応用を試み、その安全性について検討した。【方法】ICタグ（IT-MOUSE, 3.2x13.7mmの円柱形。0.24ｇ）は4週齢時のマウス背部皮下に埋植した。rasH2および同腹のnonTgマウス雌雄各15匹に、7週齢時より週1回電磁波を曝露（データ読み取り）し、かつアセトン（100μL）または皮膚発がんプロモーターのTPA（phorbol 12-myristate 13-acetate, 2.5μg）を週3回、本試験系の標準投与期間（26週間）剃毛背部皮膚に塗布した。タグ埋植部と全身の病理学的変化を、MNU群（N-methyl-N-nitrosourea, 75mg/kg腹腔内単回投与。20週目に剖検）も含め検討した。【結果】タグ内のデータは全飼育期間を通じて読み取れ、個体識別が可能だった。対照群を含む各群全例でタグ周囲の被膜形成、多数例で被膜周囲の軽度線維化が観察されたが、いずれも異物に対する生体防御反応でありタグ周囲での腫瘍発現は認められなかった。肺腺腫などの自然発生腫瘍についても背景データの範疇であり、体重や一般状態への影響もなかった。rasH2マウスのTPA群では背部皮膚の乳頭腫や角化棘細胞腫が認められ、MNU群では前胃乳頭腫や悪性リンパ腫が高頻度で認められたが、いずれもタグ未使用時と同頻度だった。【結論】rasH2マウスの短期がん原性試験系ではマウスの背部皮下へのICタグ埋植に起因する増殖性変化は認められないことが明らかになり、種々のデータ管理に応用可能と考えられた。

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【目的】ヒトプロト型c-Ha-ras遺伝子を導入したrasH2マウスは、発がん物質に対して高い感受性を示すが、その発がん増強機序は十分明確にされていない。私たちは過去に、前胃および肺における誘発腫瘍の遺伝子発現解析を行い、腫瘍組織における導入遺伝子の発現上昇と、前胃扁平上皮癌ではマウス内在性ras遺伝子の発現上昇が認められることを報告した。今回は、7,12-dimethylbenz[a]anthracene (DMBA)により誘発した前胃腫瘍について、Rasシグナル関連因子の発現を中心に遺伝子発現解析を行った。【方法】前胃腫瘍を誘発するため、8週齢、雄のrasH2マウスにDMBA 50mg/kgを単回腹腔内投与した。DMBA投与後6週に前胃の病理組織学的検索を行い、無処置対照群の正常前胃組織とDMBA投与群の正常前胃組織あるいは誘発された前胃腫瘍を用いて、Agilent社マウス遺伝子解析用DNAマイクロアレイによる遺伝子発現解析を実施した。導入遺伝子およびRas関連遺伝子のmRNA発現はRT-PCR法により確認した。【結果】DMBA投与群では、前胃扁平上皮癌が73％（11/15）発生した。マイクロアレイ解析では、無処置群およびDMBA投与群の正常前胃組織とDMBA誘発扁平上皮癌とで、遺伝子発現パターンが区別される傾向を示した。RT-PCR法では、導入遺伝子およびマウス内在性Ha-ras、N-ras遺伝子の発現は腫瘍組織において有意に増加した。さらに、腫瘍組織ではjunB、c-myc、c-fos、cyclinD1、cyclinG1の発現上昇も認められた。【考察】以上の結果から、rasH2マウスの前胃腫瘍では、導入遺伝子と共にマウス内在性ras遺伝子の発現上昇が腫瘍形成に関与する可能性が示唆された。マイクロアレイ解析については現在検討中である。

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【目的】Hexachlorobenzene (HCB)は農薬、防かび剤および工業生産物などの原料として使用されてきたが、現在ではほとんどの国では使用されていない。しかし、HCBは自然環境中では分解されにくく生物濃縮される性質を有することから、重要な環境汚染物質とされている。HCBは実験動物において肝細胞腫瘍を誘発させることが知られており、また、HCBは他の非遺伝毒性発がん性を有する農薬と同様に、中期肝発がん性試験法においてプロモーション作用を示すことが報告されている。それゆえ、HCBの発がん性の程度について検索することは重要であり、今回、中期肝発がん性試験法を用いて用量依存的検討を行った。
【方法】6週齢の雄性F344ラットを用い、diethylnitrosamine(DEN) 200 mg/kg,bwを単回投与し、その2週間後にHCBを0、0.002、0.01、0.04、0.15、0.6、1.6、3.0、8.0、15.0、40.0および75.0 ppmの濃度で飼料中に混じて6週間経口投与した。いずれの群も実験3週目に2/3肝部分切除を行い、実験期間8週間で屠殺剖検し、肝の前がん病変であるglutathione S-transferase(GST-P)陽性細胞巣の定量的解析を行った。
【結果】肝臓重量では、15 ppm以上の投与群において絶対重量の、8 ppm以上の投与群において相対重量の有意な高値を認めた。GST-P陽性細胞巣の定量値は、いずれの投与群においても対照群と比較して個数および面積ともに統計学的に有意な差を認めなかったが、最高用量の75 ppm投与群においては個数および面積ともに高値傾向を認めた。
【結論】HCBは雄ラット肝臓に対して発がんプロモーション作用を有し、その作用量は75 ppm付近であることが示唆された。

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We evaluated gingival toxicities induced by chronic exposure of female Harlan Sprague-Dawley rats to dioxin and dioxin-like compounds (DLCs) and compared them to similarly induced oral lesions reported in the literature. This investigation represents part of an ongoing initiative of the National Toxicology Program to determine the relative potency of chronic toxicity and carcinogenicity of polychlorinated dioxins, furans, and biphenyls. For 2 years, animals were administered by gavage 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD); 3,3’,4,4’,5-pentachlorobiphenyl (PCB126); 2,3,4,7,8-pentachlorodibenzofuran (PeCDF); 2,2’,4,4’,5,5’-hexachlorobiphenyl (PCB153); a tertiary mixture of TCDD, PCB126, and PeCDF; a binary mixture of PCB126 and 153; or a binary mixture of PCB126 and 2,3’,4,4’,5-pentachlorobiphenyl (PCB118); control animals received corn oil-acetone vehicle (99:1) alone. A full complement of tissues, including the palate with teeth, was examined microscopically. In the groups treated with TCDD and the mixtures of TCDD, PCB126, and PeCDF; PCB126 and 153; and PCB126 and 118, the incidences of gingival squamous hyperplasia increased significantly. In the groups treated with TCDD, PCB126, and the mixture of PCB126 and 153, squamous cell carcinoma (SCC) in the oral cavity increased significantly. This investigation constitutes the first report documenting that chronic administration of dioxin-like PCBs can induce gingival SCC in rats. These results indicate that dioxin and DLCs target the gingiva of the oral cavity, in particular, the junctional epithelium of molars.

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【目的】シクロヘキセンは特殊溶剤、シクロヘキセンオキサイド他各種有機合成原料、染料の中間体などに用いられており、変異原性を示す物質であるが、発がん性を含む長期毒性試験の報告はない。我々はシクロヘキセンの長期毒性を明らかにする目的で吸入暴露により2年間の試験を実施した。
【方法】F344ラットとBDF₁マウスの雌雄、各群50匹にシクロへキセン（和光試薬1級）をラットは雌雄とも600、1200、2400 ppm、マウスは雌雄とも75、150、300 ppmの濃度で1日6時間、1週5日間、2年間全身暴露した。一般状態の観察、体重、摂餌量の測定、血液学検査、血液生化学検査、尿検査、剖検、臓器重量測定及び病理組織学検査を行った。
【結果及び考察】ラットでは、対照群と比べ生存率、一般状態及び摂餌量に差異を認めなかったが、2400 ppm群の体重は雌雄とも全投与期間を通じ対照群に比べて低値であった。腫瘍性病変は、雄に肝細胞腺腫と肝細胞癌を合わせた発生の僅かな増加が認められた。また、雄の肝臓では前腫瘍性病変である好酸性小増殖巣の発生増加が2400 ppm群、肝海綿状変性の発生増加が1200 ppm以上の群に認められた。雌に腫瘍の発生増加は認められなかった。その他、雄の腎臓（慢性腎症）、甲状腺（巣状濾胞細胞増生）及び雌雄の脳（小脳の顆粒細胞の変性）に病変の増加がみられた。
マウスでは、対照群と比べ生存率、一般状態及び摂餌量に差異を認めなかった。体重は、300 ppm群の雌雄で投与期間中にやや低値の週もみられたが、最終体重は対照群との間に差を認めなかった。また、腫瘍性病変及び非腫瘍性病変とも暴露による影響は認められなかった。
本試験は労働省（現厚生労働省）の委託により実施した。

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【目的】p -ニトロアニソールは染料の中間体などに用いられており、変異原性を示す物質であるが、発がん性を含む長期毒性試験の報告はない。我々はp -ニトロアニソールの長期毒性を明らかにする目的で混餌経口投与による2年間の試験を実施した。
【方法】F344ラットとBDF₁マウスの雌雄、各群50匹にp -ニトロアニソール（和光試薬1級）をラットは雌雄とも2000、4000、8000 ppm、マウスは雌雄とも、5000、10000、20000 ppmの濃度に混合した粉末飼料を2年間自由摂取させた。一般状態の観察、体重、摂餌量の測定、血液学検査、血液生化学検査、尿検査、剖検、臓器重量測定及び病理組織学検査を行った。
【結果及び考察】ラットでは、血液学検査で雌雄とも貧血、血液生化学検査で腎障害を示唆する結果が得られた。病理組織学検査では、雄に肝細胞腺腫の発生増加が認められ、肝臓に前腫瘍性病変である好塩基性小増殖巣と海綿状変性の増加がみられた。雌に子宮腺癌の発生増加が認められ、他臓器への転移もみられた。
マウスでは、血液学検査で雄に貧血が認められた。病理組織学検査では、雄に肝芽腫及び肝細胞癌の発生増加、雌に肝芽腫、肝細胞癌及び肝細胞腺腫の発生増加が認められた。前腫瘍性病変として、肝臓では雌雄ともに好酸性小増殖巣が僅かに増加し、肝細胞の小葉中心性の肥大がみられた。また雄に肝細胞の小葉中心性の核異型もみられた。以上のように、p -ニトロアニソールはラットでは雄に肝臓、雌に子宮の腫瘍、マウスでは、雌雄に肝臓の腫瘍を発生させることが明らかとなった。
本試験は労働省（現厚生労働省）の委託により実施した。

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〔目的〕強エストロジェン作用物質であるエチニルエストラジオール(EE)と弱エストロジェン作用物質であるノニルフェノール(NP)を、卵巣摘出ラットに常法(皮下：反復投与)とミニポンプ(皮下埋没：連続投与)で投与し、投与方法による子宮肥大及び膣反応の感受性を比較した。〔方法〕動物は投与開始14日間前に卵巣摘出したラットを供試した。投与時週齢は9週齢とし、1群あたり8ないし10匹を使用した。投与用量はEE　1μg/kg/day、NP　100mg/kg/dayとし、EEは3日間、NPは7日間投与した。投与終了時には剖検し、子宮重量を測定した。子宮及び膣については10%中性緩衝ホルマリンにて固定後、HE染色し組織病理検査に供試した。検査は子宮及び膣の粘膜上皮の高さについて、画像処理装置(IPAP：住化テクノス)を使用し測定した。〔結果〕子宮重量：EE投与群では両投与方法ともに対照群と比較して有意に増加し、投与方法により差は認められなかった。NP投与群では両投与方法ともに有意に増加したが、常法の方がミニポンプに比べ有意に増加した。子宮/膣粘膜上皮の高さ：EE投与群では両投与方法ともに対照群と比較して有意に増加し、投与方法による差は認められなかった。NP投与群では両投与方法ともに対照群と比較して有意に増加したが、常法の方がミニポンプに比べ有意に増加した。〔考察及び結論〕投与方法によりEEでは子宮及び膣に対する感受性に差は認められなかったが、NPにおいては感受性に差が認められた。従って、常法による投与の方がミニポンプ投与に比べ子宮肥大及び膣反応の感度が高いことが示唆され、弱エストロジェン作用物質の検出には連続投与よりも反復投与の方が適していると推察した。

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　身体依存の形成には薬物の持続的な暴露が必要であることから，身体依存性試験における薬物投与の方法としては混餌法が一般的に用いられている．しかし，一般毒性試験および安全性薬理試験で一般的に用いられる強制経口投与により身体依存性の評価が可能であれば，それらの試験の間でデータを共有できるという点で大変有用であると考えられる．そこで，ラットにおける強制経口投与による身体依存性の形成について，陽性対照物質として汎用されているジアゼパムを用いて検討した．また同時に，F344系およびSD系ラット間での比較も行った．（方法）ジアゼパムを1週間毎の漸増法により1日2回あるいは3回の投与頻度で4週間反復強制経口投与した（投与量：200→400→600→800 mg/kg/day）．投与期間終了後，経時的に症状観察および体重測定を行い，退薬症候について評価した．（結果）いずれの系統のラットにおいても，刺激に対する反応性の亢進や筋緊張などの退薬症状が認められ，F344系においては低頻度ながら震戦，痙攣なども認められた．また体重については，退薬2日をピークとする顕著な減少が認められ，以降回復傾向を示した．なお，このときの体重減少率は，F344系では1日2回投与群で11.3％，1日3回投与群で12.4％，SD系ではそれぞれ11.2％および11.3％であり，1日2回投与と3回投与で差異は認められなかった．（結論）これらの変化は，いずれも退薬症候の典型とされるものであることから，ラットにジアゼパムを強制経口投与することにより身体依存性が形成されたものと判断された．以上より，ラットにおける強制経口投与による身体依存性の評価が可能であると考えられた．

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【目的】卵巣摘出（卵摘）ラットは、骨粗鬆症をはじめとする閉経後の病態モデルとして繁用されている。一方、閉経後の女性では、エストロゲン減少に起因した過剰摂食により肥満（体脂肪の増加）を生じることがよく知られている。本研究では、卵摘ラットにおける肥満および卵巣摘出に伴う変化を調べ、本ラットのヒト閉経後肥満モデルとしての特性を検討した。【材料および方法】9週令で卵摘および偽処置したCrj:CD(SD)IGSラットの性周期、摂餌量、体重およびBMI（body mass index）を測定した。また、卵摘後3および7週間後に血中インスリン、レプチンおよびエストラジオール濃度、脂肪重量を測定した。さらに血液および血液生化学的検査と器官重量測定を行った。【結果】卵摘ラットでは、卵巣摘出後3日以降に性周期が消失した。卵摘ラットでは偽処置ラットに比べて、実験期間を通して高い体重、BMI、摂餌量を示した。また、卵摘ラットの処置後7週間までの体重増加率は、偽処置ラットの約2倍であった。卵摘ラットでは偽処置ラットに比べて、血中レプチンおよび各種コレステロール、白色脂肪（鼠径部皮下、腸間膜）および褐色脂肪（頸背部皮下）の重量が高値であった。インスリンおよび血糖には明らかな差はみられなかった。この他、卵摘ラットでは、血中ALAT、アルカリフォスファターゼおよび尿素窒素の高値、血中総蛋白、アルブミンおよびA/G比の低値、胸腺重量の高値が認められた。なお、卵摘ラットでは、血中エストラオジオールはいずれも測定限界以下であり、病理学的検査で子宮および膣の萎縮性変化がみられた。【まとめ】本検討の結果から、閉経後の肥満と類似した変化（血中エストロゲンの減少，摂餌量，体重およびBMIの増加）がみられ，卵摘ラットがヒト閉経後の肥満モデルとして優れた特性を持つことが示された。なお，卵摘後16週間まで飼育して検査および測定を行う予定である。

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【目的】我々は，第31回本学会においてヒト用に開発された血液分析装置XT-2000i (シスメックス社)の動物血への有用性及び問題点について報告し，動物用血液分析装置としてXT-2000iVを開発し，2004年9月に上市した．本装置は，基本性能である動物種毎の白血球自動分画に加えて，ユーザーによる手動解析ゲートの設定が可能である．この手動解析機能を用いることで，血液以外に腹水，気管支肺胞洗浄液等の各種血液細胞浮遊試料中の細胞計測・分類が可能である．今回，我々は，動物における骨髄有核細胞の計測及び骨髄細胞分類への適用を試み，基礎データを収集したので報告する．
【方法】XT-2000iVの骨髄細胞に対する測定原理は，白血球測定系と同じ半導体レーザを用いたフローサイトメトリー法を適用し，各種細胞を計測及び分類する．
SD系ラットの大腿骨より骨髄を採取後，重量を測定し，骨髄細胞を非働化FBSに浮遊させた後，孔径0.1 mmナイロンメッシュを用いて，ろ過した．さらに，測定に適した濃度に希釈後，XT-2000iVのマニュアルモードで有核細胞数を測定し，希釈直線性及び同時再現性について検討した．また，同時にADVIA120での測定及び目視法による有核細胞数を測定し比較した．さらに，XT-2000iVの手動解析機能を用いた分類と骨髄塗抹標本の目視分類を比較した．なお，ビーグル及びカニクイザルについても同様に検討し，報告する予定である．
【まとめ】XT-2000iVを用いたラットの骨髄有核細胞数の計測は可能と判断した．比較対照法との相関，希釈直線性，再現性については検討中であり，良好な結果が得られるものと期待する．また，骨髄細胞分類の粗分類であれば，可能と推察する．今回の検討結果をもとに，骨髄細胞の自動分類機能を搭載した装置の開発に繋げたい．

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尿中アルブミンは糸球体基底膜の損傷による血清蛋白質の漏出に伴って増加し，腎糸球体の炎症，アミロイド腎，糖尿病性糸球体腎症などの指標のひとつとして考えられている．今回，イヌアルブミンに対する特異的なウサギ抗体を作製し，尿蛋白定性試験紙では検出不能な微量の尿中アルブミンを測定できるエンザイムイムノアッセイ法を確立した．まず，イヌ血清から精製したアルブミンをウサギに皮下投与して抗イヌアルブミン血清を作製し，硫安分画法および陰イオン交換クロマトグラフィでIgG画分（抗イヌアルブミン抗体）を精製した．また，トレーサーとしてイヌアルブミンに過ヨウ素酸法でHRPを標識した．抗イヌアルブミン抗体およびHRP標識アルブミンを用いて競合法にて測定範囲31-2000 ng/mLの尿中のイヌアルブミン定量法を確立した．確立した測定系は以下に記する定量性能を示した．標準曲線用標準液（0, 31, 63, 125, 250, 500, 1000及び2000 ng/mL）の3日間の日差再現性（各濃度 n=15）の吸光度の相対変動係数（%CV）は2.6-6.1%であった．また，尿検体（3濃度）の3日間の日差再現性（各濃度 n=15）の吸光度の%CVは2.8-4.2%，アルブミン濃度換算値の%CVは3.3-6.7%であった．また，抗イヌアルブミン抗体はラット，ウシ及びヒトのアルブミンに対して交差反応性を示さなかった．以上の結果から，本測定法は優れた定量性能を有すると判断された．次に，この測定系を用いて背景データを採取した．ビーグル犬雄6ヵ月齢（n=30以上），雄7ヵ月齢（n=40以上）及び雌6ヵ月齢（n=20以上）から尿を採取し，アルブミン及びクレアチニン濃度を測定した．

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近年，薬物の安全性評価において内分泌器官に対する影響の有無を評価しておくことが一般的になってきている．各種実験動物のうちラットについてはホルモン測定試薬の入手が比較的容易であり，背景データも蓄積されてきている．しかし，イヌの各種ホルモンの背景データについてはまだ不充分な状況である．
その理由として：
1. イヌのホルモン標準品や測定試薬が入手困難であり，一方，入手可能なヒト用試薬の抗体は種特異性の点からイヌのホルモンに対する反応性が低く使用できない場合が多いこと．
2. 人畜共通のステロイドホルモンについても，ヒトとイヌでは血中レベルが異なり，充分な感度で測定できない項目が少なくないこと．
などが挙げられる．
我々は入手可能なイヌ専用測定試薬を用いてイヌ血中（血清あるいは血漿）の下垂体ホルモン濃度に関する背景データを採取することを目的として，市販のradioimmunoassay (RIA) の測定試薬を用いてバリデーション（定量性能の検証）および血中のホルモン濃度を測定した．また，人畜共通のステロイドホルモンについても，ヒト用の測定試薬を用いて，測定条件の最適化を検討し，イヌの血中のホルモン濃度を測定した．
まず，発情周期のホルモン濃度変化を捉えるために，雌性イヌの発情期を含む約1ヵ月間，週3回の頻度で採血し，血清のluteinizing hormone (LH)，follicle-stimulating hormone (FSH)，17β-estradiol (E₂) およびprogesteroneを可能な限り測定した．
また，日周のホルモン濃度変化を調べるために，雄性イヌから9am，11am，1pm，3pm，5pm，7pmおよび11pmに採血し，血漿中thyroid-stimulating hormone (TSH)，thyroxine (T₄)，triiodothyronine (T₃)，testosterone，5α-dihydrotestosterone (DHT)，aldosteroneおよびcortisol濃度を測定した．

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The use of nanotechnology in consumer and industrial applications will likely have a profound impact on the quality and utility of a number of commercial products from a variety of industrial sectors. Nanomaterials exhibit unique physical/chemical properties and impart enhancements to engineered materials, including better magnetic properties, improved electrical activity, and increased optical properties. In addition, these materials are much more reactive than their bulk material counterparts as a result of their higher surface area. Consequently, the use of nanotechnology has the potential to facilitate substantial improvements in several critical societal functions such as energy generation and distribution, food processing, and building construction. Nanomaterials are already being used in a variety of commercial products, including computer components, textiles, cosmetics, glass technology, and photovoltaic systems. Given the impending widespread use of nanotechnology, a systematic approach needs to be developed for evaluating the risk to human health and the environment from exposure to nanomaterials. Some of the uncertainties associated with exposure to nanomaterials include the extent to which these materials interact with cellular organelles and the biological impact of those interactions, and the long-term health effects from acute and chronic exposure. There is also very little known about the environmental implications of the use of nanomaterials. Accordingly, the ILSI Health and Environmental Sciences Institute (HESI) has formed a subcommittee to improve the science associated with developing toxicological and safety evaluations for engineered nanomaterials and to improve the fundamental understanding of the behavior of these materials in biological systems and the environment. The broad goal of the effort is to develop a systematic approach to conducting a comprehensive toxicological and safety evaluation for nanomaterials. The specific project areas that form the basis of the subcommittee's activities, and that are the focus of this poster presentation, include nanomaterial characterization, toxicity, solubility, and life-cycle analysis.

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背景　近年，創薬初期でのminiaturizeされたげっ歯類のin vivo毒性試験が展開されてきている。我々は，in vivo Mini-tox studyを探索研究早期のin vivo毒性スクリーニング試験として立ち上げ，毒性情報の乏しい新規化合物の多面的安全性評価を進めている（第31回日本トキシコロジー学会）。今回，一連のバリデーション試験のうち，多臓器変化を示した非定型的抗精神薬Xの試験結果を示す。
材料および方法　動物：頚静脈カニュレーション(JVC)施術済みのCrj:CD(SD)IGSラット（8週齢，雄）を溶媒対照群，低用量群（L），高用量群（H：Lx10 mg/kg）の各群に3例づつ振り分け，化合物Xを単回経口投与し，投与翌日にネンブタール麻酔下で放血，安楽殺し，剖検した。検査項目：体重（毎日），機能観察総合評価法(FOB；投与前，投与後0.5，4hr)，自発運動測定Motor Activity (MA；投与前，投与後1，4hr)，心拍数・血圧測定（HR，BP with BP Monitor MK-200；投与前，投与後1，4hr），薬物血中濃度測定（TK；0.5，2，4，24hr），尿検査（投与後6-20hr），血液・血液生化学的検査（24hr），剖検，臓器重量および病理組織学的検査を行った。
結果および考察　試験において死亡例は認められなかったが，行動異常，散瞳，体温低下，自発運動抑制，循環器変化，白血球減少，肝機能系逸脱酵素上昇，血糖値上昇，胃粘膜障害等が観察された。これらの結果は臨床で危惧されている非定型的抗精神薬の変化（J. Clin. Psychiatry, 59, suppl. 12: 17-22, 1998）と一致し，単回投与試験でも検出力を上げることにより毒性予測性が高まることが期待された。

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（目的）10％中性緩衝ホルマリン液で1日，7日および2週間固定したラットの肝臓からパラフィンブロックを作製し，RT-PCRでmRNAの増幅が得られるRNAを抽出するための条件を検討した。（材料と方法）雄性IGSラットの肝臓を採取して一部を10％中性緩衝ホルマリン液にて固定し，1日後，7日後および2週間後に，常法にしたがってパラフィン包埋した。その後10μmに薄切し，Optimum FFPE RNA Isolation Kitを用いて切片2枚からRNAを抽出した。それとは別に，凍結保存した肝臓からTrizolを用いてRNAを抽出した。得られたRNAの1μgを逆転写し，内部標準遺伝子であるGAPDH，β-actinおよび酵素CYP3A1についてABI PRISM 7000を用いてリアルタイムPCRを実施した。（結果）Kit標準のRNA抽出プロトコル（脱パラフィン→37℃ 3時間でproteinase K処理→フィルターに吸着→洗浄→溶出→DNase I処理）では，ホルマリン液での固定時間として24時間以内が推奨されており，本検討のような長時間の固定標本では良好なRNAは得られなかった。そこで，proteinase Kの処理温度と時間を変更（温度：45または60℃，時間：3，8，16または24時間）し，最適な抽出条件を調べた。その結果，ホルマリン1日固定のブロックでは60℃ 8時間，7日および2週間固定のブロックでは60℃ 16時間のproteinase K処理条件でmRNAが最も高率に検出された。mRNAの定量値は，ホルマリン固定時間が1日→7日→2週間と長くなるほど低下し，凍結標本との比較でそれぞれ7-17％，2-5％，1-2％であった。しかし，内部標準遺伝子との比率（GAPDHとCYP3A1，β-actinとCYP3A1の比）に，固定時間の延長による影響はみられなかった。（結論）ホルマリン固定時間の延長により経時的なmRNA定量値の低下が認められたが，各遺伝子の定量値の比率は保たれていたことから，適切な抽出条件では2週間固定後のパラフィンブロックでもmRNA発現量を調べることが可能であると考えられた。

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ラットの性周期は膣の粘膜組織の観察によって発情前期(P)，発情期(Ｅ)，発情後期(M1，M2)，休止期(D)の5つのステージに分類される．動物試験では，性周期の変化を利用して，各種検査のスケジュールを決定するための指標としたり，性周期の回帰性を利用して排卵や交尾の時期を推測している．また，性周期の変化に応じて卵巣，子宮，膣などの生殖器は特有の変化を示し，これらの変化には種々の性ホルモンが関与することが知られている．これらの知見を裏付ける実験として，雌ラットのそれぞれの性周期に合わせて採取した血液から5項目のホルモン濃度を測定した．動物は8週齢のCrj:CD(SD)IGSを144匹用い，13日の馴化を行った．馴化5日目から13日までの9日間に膣垢を採取し，性周期が正常に回帰している事を確認した．馴化後，10週齢で目的の性周期を示した動物から全採血（時点屠殺）した．採血直前に性周期を確認したのち，ペントバルビタール麻酔下で腹大静脈から全採血し，血漿（EDTA-2K処理）を採取した．得られた血漿から，プロラクチン，プロゲステロン，エストラジオール，LH，FSHの5項目のホルモン濃度を測定した．採血時点は，性周期が回帰する4日間のうちに2～4時間の間隔で計22時点を設定し，1時点あたりの動物数は6匹とした（6匹×22時点＝132匹）．
＜採血期間中の性周期の変動と採血時点＞発情前期(P)を示した日を第1日目として起算した場合，採血期間4日間の性周期は，第1日目：(D)→(P)，第2日目：(Ｅ)→(M1)，第3日目(M1)→(M2)，4日目：(D)を示した．採血時点は，第1日目：0，3，6，10，14，18，20，22時，第2日目：0，2，6，10，18，22時，第3日目：10，18，22時，第4日目：6，10，14，18，21時の計22時点とした．

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【目的】薬物誘導性フォスフォリピドーシス（PL）は, リン脂質がライソソームに蓄積し細胞内封入体（ラメラボディー）を形成する現象であり, ライソソームの腫大や他のオルガネラの障害を引き起こし, 細胞死にまで至ることがあることから毒性学的に重要な所見である。従来,PLの検出法は動物に薬物を反復投与し, 臓器の電顕標本にてラメラボディーを確認していたが, 少量の多検体を短時間で評価する手法としては不向きである。そこで本研究では, 培養細胞を用い, 蛍光標識リン脂質（NBD-PC）の取り込み量から, PLの感度および精度のよい迅速な評価方法を確立したので報告する。【方法】CHO細胞などの動物種, 由来組織の異なる７種の初代培養細胞あるいは細胞株を96穴プレート上で24時間, 37℃にて培養後, NBD-PCおよび数種のPL惹起物質を添加してさらに24時間培養した。細胞を洗浄後, 蛍光プレートリーダー（Ex/Em:480/540）でNBD-PCの細胞への取り込み量を測定した。さらに, ヘキスト33342を添加して, 蛍光プレートリーダー（Ex/Em:360/460）で細胞のDNA量を測定した。また, CHO細胞におけるNBD-PCの取り込み量と電子顕微鏡像の所見を比較した。【結果・考察】初代培養細胞と細胞株の間では, 細胞株の方がPLの検出感度が高い傾向があった。動物種間及び由来組織間では, PLの惹起に大きな差は認められなかったが, 感度の点でCHO細胞及びCHL細胞が最も優れていた。また, 細胞数の指標としたDNA量でNBD-PCの取り込み量を補正したところ, 精度・再現性の良好な結果が得られた。さらに, CHO細胞を用いたPLの程度は, 電子顕微鏡像で得られた所見と相関した。以上, 我々はDNA量から細胞毒性の程度を数値化して補正することにより, 96ウェルフォーマットでPLを感度・精度よく迅速に評価できる系を確立した。

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【目的】非拘束ラットの呼吸機能に及ぼす自発運動の影響を評価するため、中枢性呼吸亢進作用を有するnikethamideおよび麻酔薬であるpentobarbitalを雄ラットに投与し、呼吸機能パラメータ（呼吸数、1回換気量、分時換気量）と自発運動量の関連を検討した。【方法】雄ラット（Crj:CD(SD)IGS系、6～7週齢）にnikethamide（50 mg/kg, i.v.）、pentobarbital（50 mg/kg, i.p.）、生理食塩液（i.v., 対照）を投与し、投与直後より90分間、非拘束プレチスモチャンバーに収容して、差圧トランスデューサー（TPF100、InfoDisp）およびアンプ（AMP100、InfoDisp）により呼吸数、1回換気量ならびに分時換気量を測定した。また、チャンバーを運動量測定装置スキャネット（MV-10、メルクエスト）内に設置することで、自発運動量を同時に測定した。【結果】生理食塩液を投与した対照群の自発運動量は、投与直後に高値を示したが、約20分後まで徐々に低下し、その後安定した。呼吸数、分時換気量は、自発運動量と同様の経時変化を示し、正の相関（相関係数：ともに約0.8）を認めたが、1回換気量は観察期間を通してほぼ一定であった。nikethamide投与群の自発運動量は対照群とほぼ同様の推移を示したが、呼吸機能パラメータは対照群より高値を示し、自発運動量に依存しない呼吸機能亢進が確認された。pentobarbital投与群では自発運動はほぼ消失し、各呼吸機能パラメータも対照群より低値を示した。さらに、自発運動を亢進する薬物について検討し、報告する予定である。

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サルの行動におよぼす薬物の影響をより詳細に観察するため，薬物投与下で摂餌行動における指先の微細運動機能を観察した。また，同時に粗大運動機能および数種反射機能の項目を含む一般状態観察ならびに自発運動量測定を行った。
［方法］3頭のアカゲザルに0.5％CMCまたはジアゼパムを単回胃内投与した。投与後1時間に飼料を特殊給餌器に入れて与え，飼料を取り終えるまでの時間 (摂餌時間) を測定した。特殊給餌器は金網製の箱型であり，サルが金網を通して左右上肢の指先で餌ペレットを底部から上部に運び上げ，開口部から取り出すことが可能な構造とした。また，一般状態観察では，ケージ内の状態 (姿勢，外観，排泄物等)，観察者への反応性 (攻撃行動，怯え表情)，粗大運動 (動作緩慢，運動失調) などのほか，モンキーチェアーに保定し，各種反射反応，瞳孔径，筋緊張等を投与後1，2，4および6時間に観察した。さらに，赤外線センサーによる自発運動量測定を投与後24時間まで連続的に実施した。
［結果］0.5％CMC投与時と比較して，ジアゼパム1 mg/kgでは全ての項目について著明な変化はみられなかった。4 mg/kgでは，3頭中1頭でケージ内の状態，観察者への反応，粗大運動ならびに自発運動量の各項目で，また，他の2頭では粗大運動のみにおいてそれぞれ軽度ないし中等度の中枢抑制性の変化がとらえられた。モンキーチェアー保定による観察では全ての動物において変化はみられなかった。これに対し，投与直前の2日間と比較した摂餌時間の割合を0.5％CMCと比べると，4 mg/kg では1.3倍，1.5倍および2倍と全頭で延長しており，微細運動機能の障害が認められた。
［考察］演者らの考案した特殊給餌器により，サルにおいて，摂餌行動における指先の微細運動機能におよぼすジアゼパムの影響をとらえられることが明らかとなった。

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癌細胞が増大するためには，癌組織へ向かう血管新生が極めて重要であることが広く知られている．近年，血管新生を阻害することにより癌の増殖を抑制するという戦略が考えられるようになり，血管新生阻害剤に関する研究は世界的に活発に行われている．前立腺癌は男性ホルモン活性に依存し，その活性をブロックすることで進行を抑えられるためホルモン療法が導入されている．しかし，治療を継続するうちにホルモン不応性となって再燃する例があり，その治療法として化学療法が行われている．しかし，患者が高齢でもあり骨髄抑制などの副作用が問題となりやすいことから，新規治療薬として血管新生阻害剤に対する期待が高まっている．そこで，我々はヒトホルモン抵抗性前立腺癌細胞PC-3に対する各種血管新生阻害剤の効果を，代表的な血管新生解析in vivoモデルであるマウス背部皮下法(dorsal air sac assay)及び担癌ヌードマウスを用いて検討した．本学会では，試験結果及び今後の方向性について報告する．

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