【目的】体細胞核移植技術を応用した遺伝子組換え家畜作出法の確立を目的として，乳汁中に有用生理活性物質を分泌するシバヤギの作出技術の開発を進めてきた。その結果，遺伝子組換えシバヤギの作出に成功したので報告する。【方法】シバヤギ胎子由来線維芽細胞にPGK puro 遺伝子を連結したセレノプロテインP発現遺伝子断片（β-Cas-SelP/PGKpuro：ウシβカゼインプロモーターとヒトセレノプロテインP遺伝子を連結）をエレクトロポーレーションにより導入した。ついで，遺伝子導入細胞を，ピューロマイシン添加（1μg/ml）培地で選択培養し，クローン化した。増殖・形態・染色体数を指標として5株を選び，体細胞核移植に使用した。体細胞移植方法および未受精卵子の採卵方法は我々の既報（Ohkoshi et al., 2002）に準じた。すなわち，レシピエント卵細胞質には過剰卵胞発育誘起処理後，腹腔内視鏡下で卵胞吸引法により得られた体内成熟卵子から第２減数分裂中期染色体を除去したものを使用した。ドナー細胞は，除核未受精卵細胞質へ電気的に融合し，ついでシクロヘキシミド添加培地で培養し活性化を誘起した。核移植卵は，IVD-101液で低酸素条件下で8日間体外培養した。得られた胚盤胞は，発情を同期化した受胚雌子宮へ外科的に移植した。【結果】遺伝子導入細胞をドナー細胞として体細胞核移植を行ったところ，8∼30%が胚盤胞へ発生した。各細胞株あたり2∼6頭の受胚雌子宮へ胚移植した。産子が得られた#1細胞株では，核移植卵の12%（7/59）が胚盤胞へ発生し，4個を2頭の受胚雌へ移植したところ両方とも妊娠が認められた。このうち1頭が，147日目に分娩兆候を示し，三つ子を自然分娩した。第1，2子（生時体重1.15kg，1.05kg）は生後3時間以内に死亡したが，第3子（生時体重1.25kg）は成育中である。PCRの結果，これらの産子は導入遺伝子を有していることが判明した。

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【目的】肝臓特異的な核転写因子であるHNF(Hepatocyte Nuclear Factor)-1αは膵臓の発生に関与することが知られている。その遺伝子の変異は, 若年性成人発症型糖尿病(MODY)を引き起こすことが知られている。我々はブタを用いた糖尿病モデルの確立を最終目的とし, ブタ・インスリン(INS)プロモーター下でヒト変異型HNF1α遺伝子を発現するベクターを構築した。本研究ではトランスジェニック(tg)マウスを作製し, 糖尿病発症の有無, 及び病態を評価した。
【方法】ヒトCMVエンハンサー, ブタINSプロモーター, ヒト変異型HNF1α, SV40ポリAシグナル配列を連結したベクターを構築し, 前核注入法によりトランスジェニックマウスを作製した。得られた産仔はPCR及びサザンブロット解析により導入遺伝子の確認を行った。血糖値及び体重の測定は3～8週齢で行った。導入遺伝子の発現はRT-PCRにより確認し, さらに膵臓の組織化学的分析を行った。
【結果】合計69匹の産仔のうち6匹のtgマウスが得られた。そのうち1匹(#9-2)が高血糖, 体重減少を示し糖尿病を発症した。他2匹が体重減少を呈し2～3週齢で死亡した。他の3匹は病態を発症しなかった。#9-2は4週齢で対照群と比べ約5倍の高血糖値を示し, 8週齢では体重が対照群に比べ約40%減少した。この個体では導入遺伝子の発現が膵臓, 肝臓など7臓器で確認された。また, 膵臓の組織化学的分析ではINS分泌細胞(β細胞)を含むランゲルハンス島の減少, その周辺の腺房細胞の萎縮・壊死が観察され, #9-2の高血糖はb細胞減少によるINS分泌障害によるものと示唆された。以上の結果よりブタINSプロモーター下でヒト変異型HNF1α遺伝子を発現するベクターによる糖尿病発症が確認された。この結果は糖尿病治療法を評価する糖尿病モデルブタ作製のための重要な知見を提供すると思われる。

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【目的】DNA付着精子の顕微授精（ICSI）によって前核注入（PN）法と同等の効率でトランスジェニック（TG）個体作出が可能であることが報告されている。ICSI法ではMII期卵に外来遺伝子を導入する点がPN法と大きく異なる。このような特徴から、ICSI法では導入遺伝子の組み込みが、PN胚に比して胚発生のより早い時期に起こる可能性がある。その場合、ICSI法で作製された遺伝子導入胚は、導入遺伝子陽性割球と陰性割球が混在する、いわゆるモザイク胚になりにくいとの仮説が成り立つ。この仮説をICSI法によるマウス胚へのGFP遺伝子の導入によって検証することを本研究の目的とした。【方法】ICSI法はPerry ら1999に従い行った。CZB液で凍結融解した精子2～5×10⁵個⁄10µlを25ngのCAG-EGFP（3.0kb）と5分間共培養した後、ICSIに用いた。前核注入には10ng⁄µlのDNAを用いた。ICSI法および前核注入法で作成した胚を桑実期–初期胚盤胞期まで培養し、発生率およびGFP発現率を比較した。両区の蛍光陽性桑実胚をプロナーゼ処理して透明帯を消失させ、その後10µM EDTA添加PBS（-）を用いて個々の割球に分離し、各割球の蛍光を観察した。【結果】ICSI法とPN法により作製した胚の発生率およびGFP発現率は、それぞれ61.5%（59⁄96）対90.6%（116⁄121）,（P<0.01）および47.9%（46⁄96）対36.7%（47⁄121）であった。ICSI法で得られた蛍光陽性胚の中で、モザイク胚の占める割合は25.0%（5⁄20）であり、PN法78.9%（15⁄19，P<0.01）に比べて有意に低かった。またICSI法で得られた蛍光陽性胚では、その大半の割球が蛍光陽性を示したのに対し（81.0%,124⁄153） 、PN法では有意に低く56.6%（168⁄297,P<0.01）にとどまった。以上から、ICSI法による遺伝子導入では、モザイク胚が生じにくい事が示された。同時にICSI法により作製された蛍光陽性桑実胚では、高い割合の構成割球が導入遺伝子陽性となることが認められた。

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【目的】我々は顕微授精（ICSI）法によって作出されたマウス遺伝子導入胚では，前核注入（PN）法に比べてより高い割合の構成割球に導入遺伝子の発現が認められることを見出した（河野ら，本大会）。本研究では，ブタにおいても同様の現象が見られるかどうかを検証した。【方法】ICSI法：NIM液を用いて凍結融解したブタ精子（2∼5×10⁵個/10µl）を室温にて2.5ng/µlのDNA（CAG-EGFP；3kb）と5分間共培養した後，ICSIに用いた。あらかじめ電気的活性化刺激（直流150V/mm，100µsec）を加えた体外成熟卵に，ICSIを行った。PN法：体外成熟•体外受精由来の前核期卵を顕微注入に用いた。体外受精には，PGM-tac培地（Yoshioka et al. BOR 2003）および凍結精巣上体精子を使用した。精子濃度を5×10⁶個⁄mlに調整したPGM-tacドロップ（100µl）に，15∼20個の成熟卵を投入した。20hr媒精後，前核期胚を回収し，前核の一方に10ng/µlのDNAを数pl顕微注入した。両方法により作出した胚を桑実期胚まで体外培養した後，プロナーゼ処理により透明帯を消失させた。さらにその胚を100µM EDTA添加PBS（−）で10分間処理することにより個々の割球に分離し，蛍光顕微鏡下で割球ごとのGFPの発現状況を観察した。【結果】GFP発現陽性胚の中で，GFP蛍光陽性割球と陰性割球とが混在する胚（モザイク胚）の割合は，ICSI法では38.5%（15/39）であり，PN法（91.7%，11/12）に比べて有意（p<0.01）に低かった。また、大半（81%以上）の割球が蛍光陽性を示す胚の割合は，ICSI法で得られた陽性胚全体の8割以上（82.1%，32/39）に達したのに対し，PN法では有意（p<0.01）に低く8.3%（1/12）にとどまった。以上の結果からブタにおいても，ICSI法で作製された遺伝子導入胚はPN法よりもモザイク胚の出現頻度が低いことが示された。同時に，ICSI法で遺伝子導入された胚においては，より高い割合の構成割球がGFP陽性となる傾向が認められた。

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【目的】日本短角種は放牧適性に優れる東北地域の特定品種である。胚移植を活用した本品種の改良増殖のため，生体内卵子吸引(ovum pick up: OPU)-体外胚生産(in vitro production: IVP)による胚生産性の適応性を調べるとともに，効率的なOPU-IVPのための日本短角種での要因を調べた。
【方法】日本短角種および黒毛和種の経産牛を各４頭供試した。週１回の頻度でOPUを反復実施し，OPU時の卵胞数および採取卵母細胞の数と品質，および，その後の胚発生率を調べた。得られたOPUならびにIVP成績を両品種で比較した。
【結果】日本短角種はOPU時の卵胞数が有意(P<0.01)に少なく，その結果，採取卵母細胞数と胚発生数は有意(P<0.01)に少なかった。しかしながら，OPU時の卵胞数に対する採取卵母細胞の比率は黒毛和種と同等であり，さらに，採取卵母細胞中のA,Bランク比率は有意(P<0.05)に高く，発生率は黒毛和種と同等以上であった。OPUを反復した場合，日本短角種のA,Bランク卵母細胞比率は初回が2回目以降より有意(P<0.05)に低かったが，それ以降は黒毛和種と同等に安定して採取が可能であった。日本短角種でのOPU-IVPによる胚の生産効率は全平均で1.6±0.2/週/頭であり，この結果は年間の試算では，過排卵誘起処置による胚生産成績を大きく上回った。なお，日本短角種のIVP成績では，培養する卵母細胞数が4個以下の場合，胚盤胞期胚の発生率が有意(P<0.05)に低下した。このような個体は全体の35.5%を占め，この比率は黒毛和種の約3倍であった。さらに，凍結精液の違いは胚発生成績に有意(P<0.05)な影響を及ぼしていた。
以上のことから，OPU-IVPは日本短角種で胚を生産するための有効な手法であることが明らかとなった。また，より効率的な胚生産のためには，採取卵母細胞数の多い個体の選抜ならびにIVPに利用する凍結精液の検査が重要であることが示された。

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【目的】異種間移植は大型哺乳動物の原始卵胞内の卵子（原始卵胞卵子）に胚発生能を付与する手法として期待されているが，未だに胚盤胞への到達例はない。そこで本研究では，ブタ卵巣を移植したマウスに性腺刺激ホルモンを投与し卵胞発育を促進することによって，原始卵胞卵子に胚発生能を付与できるか否かを検討した。【方法】原始卵胞から構成される生後20日齢のブタ卵巣皮質を細切し，20個前後の細切片を卵巣摘出ヌードマウスの腎皮膜下に移植した(Kaneko et al. BOR 2003)。膣開口後60日前後に，マウスに妊馬絨毛性性腺刺激ホルモン(eCG)の腹空内投与，またはブタFSHを充填した浸透圧ポンプ(Alzet)の皮下留置を行った。移植卵巣および末梢血を，eCG投与２日（eCG-2）または３日後（eCG-3），FSH投与７日間(FSH-7)または14日間後（FSH-14）に採取した。さらにLHサージの発現を抑制する目的で，FSH処理開始７日後に抗エストラジオール血清を投与し，処理開始14日後に移植卵巣を採取した(FSH-14AS)。【結果】ホルモン処理群，特にFSH-14AS群では胞状卵胞の発育が顕著であったが，FSH-14群では胞状卵胞の多くが血腫となった。マウスの血中総インヒビン濃度はホルモン処理によって上昇し，特にFSH-14AS群で高値を示した。直径115µm以上の卵子のマウス１匹あたりの採取数は，eCG-3群(68±11，n=14)，FSH-7群(60±11，n=12)およびFSH-14AS群(49±9，n=8)において，性腺刺激ホルモンを投与しなかった対照群(18±5，n=9)に比較して明らかな増加を示した。体外成熟後，上記３処理群(eCG-3; 13±3，FSH-7; 21±4およびFSH-14AS; 16±5)では対照群(4±1)に比較して多数の卵子が成熟した。さらに100個前後の成熟卵子を体外受精し７日間の体外培養の結果，eCG-3，FSH-7およびFSH-14AS群においてそれぞれ１卵子ずつ胚盤胞への発生が観察された。以上の結果から，マウスに適切なホルモン処理を施すことによって，移植したブタ原始卵胞卵子に胚発生能を付与できる可能性が示された（科研費No.17380170）。

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【目的】ブタ胚の耐凍性は，分割初期で低く，拡大胚盤胞期で高くなるが，それには脂肪顆粒の量が関係していることが示唆されている。我々は，第97回大会において，ブタ単為発生胚を用い，脂肪顆粒が減少する拡大胚盤胞期の胚で水透過性や耐凍剤透過性が向上することを明らかにした。この膜透過性の向上も耐凍性の向上に関与している可能性がある。本研究では，体外受精胚においても同様の膜透過性の向上が見られるかどうか調べた。【方法】未経産ブタの卵胞から卵丘卵母細胞複合体を採取し，48時間培養して成熟したものを卵子とした。そして，凍結-融解した精巣上体精子と体外受精させて胚（桑実胚，胚盤胞および拡大胚盤胞）を作製した。卵子および胚を，25°Cの高張なSucrose添加PB1液あるいはグリセロール添加PB1液に浸し，経時的な相対的体積変化から水透過係数（µm/min/atm）とグリセロール透過係数（×10^-3 cm/min）を算出した。【結果】体外受精桑実胚の水透過係数（0.83±0.16）は卵子の値（0.97±0.59）と同様に低く，胚盤胞で有意に上昇し（1.84±0.98），さらに拡大胚盤胞で高くなった（3.98±2.96）。グリセロール透過係数も，桑実胚（0.057±0.047）では卵子の値（0.017±0.0053）と同様に低かったが，胚盤胞で高くなり（0.24±0.16），拡大胚盤胞では著しく高くなった（1.04±0.58）。以上の結果から，体外受精胚は，単為発生胚と同様に拡大胚盤胞期で水透過性や耐凍剤透過性が大きく上昇することが判った。また，拡大胚盤胞期での耐凍性の向上には脂肪顆粒の減少だけでなく，膜透過性の向上も関与している可能性が受精胚でも示唆された。

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【目的】卵子の体外成熟 (IVM) 技術は、卵子の細胞化学的研究や核置換実験に必須の技術である。しかし、マウスのcumulus-free IVMの効率は極めて悪く、IVM液への血清の添加やMII染色体置換などで対処しているのが現状である。そこで、この原因の追及と技術改善を目的としてIVM卵子を細胞化学的に解析した。さらに改良IVM法を一次精母細胞の顕微授精へ応用した。【方法】IVMには、αMEM，TYHおよびこれらの1:1混合液 (TaM) にBSAを添加 (serum-free) した培地を用いた。卵丘細胞を除いた後にIVMした卵子におけるミトコンドリアの分布，MPF活性，染色体および細胞骨格系の分布の観察・解析を行い、IVM後の発生も観察した。一次精母細胞の顕微授精は、MI卵への注入法で行い、TaMで成熟させた後、MII置換なしで活性化処理を施した。【結果および考察】体外成熟率は、αMEMよりもTYHの方が有意 (P<0.05) に高かったが、単為発生または体外受精後の発生は逆であった。MPF活性は、TYH由来卵においてαMEM由来卵およびin vivo成熟卵よりも有意 (P<0.05) に高かった。ミトコンドリアの分布は、TYH由来卵は凝集型、αMEM由来卵は散在型の特徴を持っていた。一方TaM由来卵は、これらのパラメーターでαMEMとTYHの中間的特性を示し、特にミトコンドリアの分布は、in vivo由来卵と類似していた。このTaMを用いた系では、GV卵当たり23.8%の産仔が得られ、他の2区よりも高率であった。一次精母細胞の顕微授精を行ったところ、MII置換なしで初めて2匹 (1.1%) の産仔が得られた。しかしMII期において既報と同様に娘染色体の早期分離 (PSCS) が観察されており、この動態はIVM条件の改良では改善されないことが示唆された。以上の通り、培養液の改良でserum-free, cumulus-free IVM卵子の質を有意に向上させることができた。一次精母細胞の顕微授精のPSCSの原因は現在検討中である。

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【目的】マウスの雄性生殖細胞の凍結保存技術は近年増加し続ける遺伝子改変マウスの系統維持として用いられるなど，有効かつ必須の技術である。しかし操作における手際のよさやコツ等の技術的要因が結果を左右して，誰でも簡便に行うことの出来る技術とは言えないのが現状である。今回我々は凍結・融解のための前準備や特殊な技術を必要としない，すなわち技術レベルや施設を問わずに実施できる雄性生殖細胞保存法の確立を試みた。【方法】ICRおよびC57BL/6 雄マウスより精巣と精巣上体を摘出し，そのまま組織ごと凍結チューブに入れ以下の凍結方法を試みた。A: 凍結チューブを凍結用コンテナへ納めてから -80˚Cディープフリーザー中で凍結（約-1˚C/分で冷却），B: Aの後液体窒素で保存，C: コンテナなしでディープフリーザー凍結，D: 液体窒素に直接投入し凍結。それぞれ１週間から7ヶ月間保存を行った。融解は凍結チューブを室温水に漬けることにより行った。常法に従い精子・精巣細胞を分離してマウス未受精卵へ顕微注入を行い，胚の体外発生および胚移植後の産子への発生を検討した。また海外において同方法で凍結したサンプルをドライアイス便で空輸したのちに顕微授精を行って産子が得られるかについても検討した。【結果】精巣上体精子，精巣精子，円形精子細胞ともにほぼ全ての試験区で産子が得られた。しかし精巣上体精子を用いた顕微授精では着床しないレシピエントが多く見られ，産子率も低い結果となった。そこで精子浮遊用培養液をNIM (nucleus isolation medium)に変えたところ産子率の改善が見られた。またドライアイス便で空輸したサンプル由来の精巣精子・伸長精子細胞からも産子獲得に成功した。本法により，凍結保存技術や液体窒素等がない施設でも受精能を保持した状態での凍結保存が可能であることが明らかになった。またドライアイスによる輸送が可能であり，ドライシッパーおよび煩雑な手続きが不要な簡便輸送を可能にする技術であることが明らかになった。

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【目的】卵子および受精卵の保存は，ガラス化保存法の改良により様々な動物種およびステージで可能となった．しかしガラス化法では，細胞内氷晶形成を抑えるために高濃度の耐凍剤が用いられるため，その耐凍剤の毒性を低く抑える必要がある．そこで本研究では，耐凍剤毒性を低減させるために，ガラス化液の平衡処理を4˚Cで行い，その影響について検討したので報告する．【方法】ICR系雌マウスよりhCG投与44時間後に2細胞期胚を採取し実験に供した．ガラス化液は，20%FCS含有D-PBS 液に10%EG+10%DMSO+0.6M Sucroseを添加したEDS液を使用した。ガラス化は第96回日本繁殖生物学会大会にて報告したプルランフィルム法により行った。（実験1）室温にてEDS液へ20秒，40秒，2分間浸漬した後にガラス化し，浸漬時間の影響を比較した。（実験2）室温にて20%FCS含有D-PBS 液に0.6M Sucroseを添加した液に浸漬した後，4˚Cの同液に胚を移し，さらに4˚Cの条件下でEDS液に0分，15分，30分，45分，1時間浸漬した。浸漬した胚はガラス化せずに加温洗浄して，浸漬温度と時間の影響を調べた。（実験3）4˚CでEDS液に1時間浸漬した後にガラス化し，融解後の胚盤胞への発生率および胚の細胞数を調べた。【結果】（実験1）融解後の発生率は，非ガラス化対照区，20秒区，40秒区，2分間区でそれぞれ98%，98%，93%，77%と2分間浸漬した場合に有意に低下した。（実験2）4˚CのEDS液に0分から60分間まで浸漬した胚の発生率は93%以上で，浸漬時間の影響は認められなかった。（実験3）非ガラス化対照区とEDS液に1時間浸漬した後にガラス化した区の発生率は，それぞれ95%および92%であった。発生した胚の細胞数も両区で差は認められなかった。以上，低温でガラス化平衡することにより，耐凍剤毒性を低く抑えることができることが明らかとなった。

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The present study was conducted to examine the meiotic competence and DNA damage of immature porcine oocytes following cryoprotectant exposure and vitrification. In the first experiment, porcine oocytes were collected from slaughtered ovaries and then exposed to four cryoprotectants [40% ethylene glycol (40%EG), 20% EG and 20% glycerol (20%EG/GLY), 20% EG and 20% propylene glycol (20%EG/PG), and 20% EG and 20% dimethyl sulfoxide (20%EG/DMSO)] for 1 min before in vitro maturation (IVM). In the second experiment, the porcine oocytes were vitrified with 40%EG, 20%EG/GLY, 20%EG/PG or 20%EG/DMSO before IVM. After cryoprotectant exposure or vitrification, the oocytes were cultured in the maturation medium for 44 h. As a control, the oocytes were cultured for 44 h without the treatments of cryoprotectant exposure and vitrification.The meiotic status and DNA fragmentation of the oocytes were examined using a combined technique for simultaneous nuclear staining and TUNEL by a modification of the procedures used by Otoi et.al.(1999). As a cryoprotectant, 20%EG/GLY was superior to 20%EG/PG and 20%EG/DMSO, with respect to the maturation to metaphase II (MII) and DNA fragmentation of oocytes. When the oocytes were vitrified and cultured, much less oocytes (5% to 9%) reached MII, irrespective of the kind of cryoprotectants. The percentages of DNA fragmentation in the oocytes with cryoprotectant exposure and vitrification were significantly lower than those of control fresh oocytes. These results indicate that the meiotic competence of porcine oocytes is damaged by the cryoprotectant exposure, and the competence of vitrified oocytes is not improved by the kind of cryoprotectants.

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【目的】未成熟ブタ卵毋細胞を凍結保存すると，融解後の生存性が著しく低下する。その原因の一つは，凍結保存時に不可欠である凍結保護剤の化学的な毒性作用であると考えられている。本実験では，４種の凍結保護剤を様々な時間で未成熟なブタ卵毋細胞に平衡させることが，ATP量に及ぼす影響について検討した。【方法】と殺場由来ブタ卵巣から卵丘細胞が１層以上付着する卵毋細胞（COs）を吸引・採取し，エチレン・グリコール（EG），プロピレン・グリコール（PG），ジメチルスルフォキシド（DMSO）及びグリセロール（G）を，それぞれ1.5 Mになるように室温下で添加した。平衡時間は，5，15及び30分間に設定した。その後凍結保護剤を添加しない39°C溶液内で5分間静置し，それぞれの区の凍結保護剤を除去した。これら平衡過程並びに除去した区のATP量を，ルシフェリン・ルシフェラーゼ法により測定した。また比較のため，卵丘細胞を剥離する卵毋細胞（DOs）も作製し，同様に処理を行った。なお30分間平衡させ除去処理した各区COsの一部は，修正NCSU37液で体外成熟（42-46時間，5%CO₂，95%空気，39°C）させた。【結果】30分間平衡させ除去処理したCOsを成熟培養する場合，排卵状態にあるM-II期までの到達割合は，G区のみが対照区に比べて有意（P<0.05）低下した。しかし，他の区ではほぼ同様な値が得られた。一方DMSOやPGで処理をしたCOsやDOsのATP量は，いずれの時間で平衡させても，あるいは除去しても，対照区とほぼ同様な高い値を示した。しかしGを30分間平衡させ除去処理したCOsや，GやEGを5，15及び30分間それぞれ平衡させた除去区DOsでは，対照区に対して有意（P<0.05）に低いATP量を示した。以上の結果から，除去後にEGは卵毋細胞のみの，Gは卵毋細胞のみならず卵丘細胞のATP量を，低下させることが明らかになった。よって未成熟なブタ卵毋細胞に対する凍結保護剤は，DMSOとPGが適していると推察された。

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【目的】魚類卵子は、未だ凍結保存が不可能である。その原因は、卵子の体積が非常に大きく、水や耐凍剤の細胞内外への速やかな透過が困難なためと考えられる。メダカでは、成熟卵子や胚と比べて未成熟卵子の膜透過性が高いことを我々は明らかにした。本研究では、ゼブラフィッシュの成熟卵子と未成熟卵子の水および耐凍剤に対する透過特性を調べ、どちらが凍結保存に適するかを調べた。【材料及び方法】未成熟卵子は成熟雌ゼブラフィッシュの卵巣から回収した。成熟卵子は産卵直前の雌の腹部を指で圧迫して回収した。いずれの卵子も、25℃の75% Leibovitz’s L-15 medium(LM液、239 mOsm/kg)中で平衡化させた。《実験 1》卵子を水で希釈したLM液(102, 161, 191 mOsm/kg)あるいはSucrose 添加75% LM液(400, 800, 1200 mOsm/kg) に25℃で60 分間浸して平衡化し、その相対的体積から卵子の固形分含量を算定した。また25℃のSucrose 添加75% LM液(400, 800 mOsm/kg)中での相対的体積の経時的変化から水透過性を調べた。《実験 2》卵子を25℃の8% エチレングリコール、10% グリセロール、10% プロピレングリコールあるいは9.5% DMSOを添加した75% LM液に60 分間浸し、相対的体積の経時的変化から耐凍剤透過性を調べた。【結果】固形分含量は、未成熟卵子(65%)の方が成熟卵子(74%)よりも少なかった。水透過係数は、未成熟卵子が成熟卵子と比べて4倍以上高かった。また、未成熟卵子ではいずれの耐凍剤も透過したが、成熟卵子では耐凍剤はほとんど透過せず、透過係数の算出が困難であった。これらの結果から、ゼブラフィッシュ卵子においても、未成熟卵子の方が成熟卵子より水および耐凍剤に対する透過性が高く、凍結保存に適していると考えられる。

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The first successful cryopreservation of teleost embryos was reported in the Japanese flounder (Chen and Tian, 2005). To develop optimum protocols for cryopreservation of flounder embryos, we examined the toxicity of cryoprotectants to embryos, their water-and cryoprotectant-permeability, and survival of cryopreserved embryos. To examine the toxicity of the cryoprotectants (DMSO, ethylene glycol (EG), methanol (MeOH) and propylene glycol (PG)), embryos at the blastula, gastrula, tail bud and pre-hatch stages were exposed to cryoprotectant solutions at 15°C and their survival was assessed by their ability to hatch. To determine the permeability, embryos were exposed to solutions with a cryoprotectant or sucrose at 25°C, and relative volume changes were examined. MeOH and PG were less toxic than DMSO and EG to embryos at all the stages. Of the four stages, embryos at the tail bud stage showed the highest hatching rate after exposure to MeOH and PG. When embryos were suspended in cryoprotectant or sucrose solutions, they showed minimal volume change, suggesting low water- and cryoprotectant-permeability. When embryos were cryopreserved with vitrification solutions (FVS1 and FVS3) containing MeOH and PG (13% + 20% and 18% + 27%, respectively), embryos at all stages examined became opaque during cooling, indicating intracellular ice formation during cooling. The low-membrane permeability of Japanese flounder embryos might make them difficult to be cryopreserved. Although Chen and Tian reported successful cryopreservation of flounder embryos using FVS1 and FVS3, our study failed to repeat their results.

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【目的】ウシ体外受精7日目胚盤胞を切断して得られた少量のサンプルからDNAを抽出後，primer extension preamplification(PEP)-PCR法でゲノム全領域DNAを増幅し，次に，特異的DNAを増幅して性別と赤血球膜蛋白異常症(バンド3欠損症)との診断が可能であることを報告した(日本畜産学会, 2004)。今回は，性別と腎尿細管形成不全症(CL-16欠損症)の診断を行い，バンド3欠損症との3項目診断の可能性についても検討した。【方法】CL-16欠損症をヘテロで保因する雄牛の精液と卵巣由来卵子(フリー)とを体外受精した高品質の7日目胚盤胞を試験に供した。切断刃で胚の 1/5から 1/3切断し，サンプルを洗浄後，10µl水中のサンプルを95°C，5分間熱処理してDNAを抽出した，15 merランダムプライマー(OPERON)を用いたPEP-PCR法(繁殖生物学会，2003)によりDNAを増幅した。性をXYセレクター(伊藤ハム)で判定し，並行して，Hiranoら (2000) の検査法でCL-16欠損症の保因の有無を診断した。サンプリング胚をゲル・ローディング・チップガラス化保存法(Tominaga and Hamada, 2001)を用いて8日間超低温保存した1個のOPU由来胚を受胚牛に移植した。バンド３欠損症についてはヘテロで保因するウシの精液あるいは卵子を用い，遺伝子型検査法(Inaba et al. 1996)で診断した。【結果】2種類の診断が82個の胚の内80個(97.6％)の胚で可能であり，CL-16欠損症のヘテロ保因:フリーの比率及び雄:雌の比率はともに39:41であり，ほぼ1:1であった。雌でCL-16欠損症フリーと診断した胚の移植により，判定どおりの子牛が誕生した。また，バンド3欠損症との3項目診断も可能であった。以上のことから，PEP-PCR法の応用により，多項目のDNA情報が判明した胚を利用できることが明らかになった。

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[Objectives] The ng/fg parthenogenetic embryos harboring the 13-kb H19 deletion in ng allele successfully developed to term. However, the majority of the parthenotes exhibit severe growth retardation and die either just before or soon after recovery. The imprinted Igf2 and Dlk1 genes are thought to play important role for the extended development and survival. To explore a reason for the developmental retardation and the lethality in the parthenotes, we focused on hematopoiesis and assessed the expression of Igf2 and Dlk1, known as major regulator for hematopoietic stem cell differention and hematopoisis. [Methods] The ng/fg parthenotes were reconstructed by serial nuclear transfer. Total RNAs were extracted from the liver of E12.5 parthenotes ng(wt) /fg(wt) and ng (H19D13) /fg(wt) and controls. The cDNA was used for the quantitative gene expression analysis by real-time PCR. Liver cells of ng(wt) /fg(wt) and ng(H19D13) /fg(wt) parthenotes and controls at E12.5 were incubated with anti-Ter119 and anti-c-Kit, and followed by using FACS analysis. [Result] The expression of Igf2 in liver was repressed in ng(wt) /fg(wt) parthenotes, and decreased in ng(H19D13) /fg(wt) parthenotes at E15.5. The Dlk1 was repressed in the liver of both types of parthenotes. Further, the flow cytometry analysis of the liver cells at E12.5 showed that the immature erythroid cells were evidently increased in ng(wt) /fg(wt) parthenotes, but the more mature erythroid cells were decreased in ng(wt) /fg(wt) parthenogenetic liver. [Conclusion] The present results show that the retardation of liver development and hematopoietic stem cell differentiation in parthenotes could be involved in parthenogenetic lethality.

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[目的] 我々は以前、CAG promoter + loxP/EGFP-CAT/loxP-lacZ（=CETZ-17）transgeneを用いた緑発光からlacZ発現へ切り替わる系（CETZ-17系）の開発を報告し、それがマウス初期胚（Sato et al., J Reprod Dev 45, 411-417, 1999; Mol Reprod Dev 56, 34-44, 2000）や胎仔皮膚（Sato et al., Mol Reprod Dev 69,　268-277, 2004）の細胞系譜解析、妊娠母体から胎盤を経由した胎仔への遺伝子導入系の開発（Kikuchi et al., Gene Therapy 9, 1529-1541, 2002）に応用出来ることを示して来た。しかし、この系では、lacZ活性を組織化学的に解析するため、個体・組織を固定せねばならないという問題があった。今回、2種の発光遺伝子を用い、生きたまま遺伝子発現の切り替わりが出来る系（CRTEIL系）を開発した。[方法] tester transgeneとして、CAG promoter + loxP/HcRed1-CAT/loxP-EGFP-IRES-luc（=CRTEIL）を構築した。このtransgeneを細胞に導入すると、HcRed1由来の赤発光を示すが、下流のEGFP由来の緑発光やホタルluciferase（=luc）は発現しない。しかし、その細胞にCre遺伝子発現ベクターを導入すると、Cre酵素によりloxPで挟まれたHcRed1-CAT部分が除去され、下流側のEGFPやlucが発現するようになる（赤から緑発光の切り替え）。特にこの系では、EGFPで遺伝子発現の定性的判定、luciferaseで定量的判定が下せる利点がある。[結果・考察] NIH3T3細胞にpCRTEIL, pCRTEIL + pCAG/NCre等を遺伝子導入し、1日後に発光を観察すると、予想通り、pCRTEILのみの導入では、赤発光は見られたが、緑発光は検出されず、pCRTEIL + pCAG/NCreのco-transfectionでは、赤発光を示す細胞は、緑発光も示し、また、赤発光が減退し、緑発光が際だつ例も見られた。同じことが、in vivo electroporation法による輸卵管への遺伝子導入方法（Sato, Mol Reprod Dev, in press）を用いても観察された。目下、CRTEIL transgenic miceを作製している。その結果の報告と本系を用いた様々な可能性を披露したい。

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【目的】岩手地鶏(天然記念物)は,飼養羽数の減少によって近親交配が進み,近交退化による絶滅の危機にある。 近年,ニワトリの精子や卵子の前駆細胞である始原生殖細胞（PGC）を他品種の鳥類初期胚に移植し,生殖系キメラを作出して遺伝資源を保存する試みが行われている。一方,我々はマウスPGCをマウスあるいはラット血清で培養すると,PGCが生殖隆起(GR)から飛び出して増殖することを報告している。　そこで本研究では,岩手地鶏のGR由来PGC(gPGC)をニワトリ血清で培養し,gPGCの形態変化を観察することを目的とした。　【方法】 孵卵5.5～6日目の種卵から胚を取り出し,GRを分離した。4wellプレートに1羽づつのGRを入れ,無血清DMEM,FCS,CSおよびニワトリヒナ血清を10%添加したDMEMで1,3,5,7,14日間それぞれ培養した。各々の時間で培養組織をSEMで観察するとともに,PASおよび抗SSEA-1モノクロナール抗体による染色を行った。また,凍結・融解によるgPGCへの影響も検討した。　【結果】 ニワトリヒナ血清で培養したgPGCは,無血清DMEM,FCSおよびCSに比較し顕著にGRからの飛び出しが多く,マウスPGCをげっ歯類血清で培養した時と同じ現象が観察された。培養１日目のgPGCは微絨毛を持っていなかったが,培養が進むにつれて細胞表面の微絨毛は増え,糸状仮足のようなものも見られるようになり,接着力は強くなっていることが SEMにより観察された。また,培養７日目以降では 膜の様な構造物で覆われた コロニー様細胞集団も観察された。14日までの培養gPGCは,PASおよび抗SSEA-1モノクロナール抗体に反応した。したがって,培養によりgPGCの性質は変化しないことが示唆された。さらに,凍結したgPGCは,融解してもその形態に変化が見られなかった。融解後3日間培養したgPGCは生存しており,PASと抗SSEA-1モノクロナール抗体に反応し,凍結保存が可能であることが示唆された。

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【目的】一酸化窒素（NO）は生体では寿命が極めて短いものの，その機能は多岐にわたっており，生体内で非常に重要な役割を演じていることが明らかとなっている。しかしながら，卵子の成熟過程におけるNOの機能については不明な点が多く残されている。本研究では，体外成熟過程におけるNOの機能について明らかにすることを目的に、ブタ卵丘-卵子複合体(COCs)の生成するNOの測定，卵子および卵丘細胞におけるNOSの発現およびその活性を調べた。【方法】屠場由来の卵巣よりCOCsを吸引採取し，卵丘細胞が緊密に付着し，細胞質が均一なものを実験に供した。培養培地は，TCM199にhCG(10IU/ml)およびBSA（4mg/ml）を添加したものを用いた。培養開始後0h，20h，28hおよび44hにCOCsを新たな培地に移し，さらに3h培養を行い，それぞれの培養時間に生成されたNO量を酸化窒素分析システムによって測定して経時的な変化を調べた。NOSの発現は，卵子と卵丘細胞を分離し，それぞれ総RNAを抽出してRT-PCR法によりeNOSおよびiNOSの発現を調べた。NOSの活性は，培養0h，44hに卵子を裸化してNADPH diaphorase染色を行い，顕微鏡下で観察した。【結果】COCsによるNO生成を測定した結果，培養0hで高いNO生成量を示したが，それ以降は減少する傾向を示し，44hでは有意に減少した(p<0.05)。RT-PCRの結果，卵子はeNOSを発現していたが，iNOSの発現は認められなかった。一方，卵丘細胞ではeNOSおよびiNOSの両方の発現が認められた。NADPH diaphorase染色では，成熟に伴い卵子のNOSの活性が低下することが示された。以上の結果から，卵子で生成されるNOはeNOSに由来し，卵丘細胞ではeNOSおよびiNOSに由来することが明らかとなった。またNOの産生が減数分裂の進行に伴い，特に卵核胞期以降に減少することから，NOが卵核胞期での分裂停止に関与している可能性が示唆された。

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【目的】ブタ体外成熟用培養液(修正NCSU培養液)には、通常10%程度のブタ卵胞液(pFF)が含まれる。ところが、pFFの採取・調整には手間がかかりロット差が生じたり、pFF自体に感染源が含まれる危惧がある。そこで、細胞培養用として市販されているウシ胎仔血清(FBS)を添加して体外胚生産を行ったところ、胚盤胞が作出可能で移植により仔豚が生まれることを報告した(第101回日本畜産学会)。本報告では、FBS添加NCSU-37液が成熟と受精に及ぼす影響について検討した。【方法】FBS4製品(以下、ロット)について10%添加NCSU-37液を調整し、卵丘細胞-卵子複合体の成熟培養を行い、卵丘細胞の膨潤と核成熟の進展を調べた。1ロットについては、成熟培養後に卵丘細胞の存否の下で体外受精を行い精子侵入状態について検討した。なお、対照区としてpFFを用いた。【結果】卵丘細胞が膨潤した複合体の割合は、pFF(74%)に比べてFBSでは4ロットすべてで有意に低下した(P<0.05, 15-41%)。卵核胞崩壊はpFFとFBSの各ロットで差がなかった(76-96%)ものの、成熟率はpFF区(73%)に比べてFBSでは4ロットすべてで有意に低下した(P<0.05, 26-41%)。体外受精の結果、成熟卵子への単精子侵入率はpFF(23%)に比べてFBSで有意に低下した(P<0.05, 5%)。また、FBS添加では、卵丘細胞を除去して受精してもその率に差が認められなかった(6%)。FBSの添加は卵丘細胞の膨潤と核成熟を低下させるが、卵丘細胞の状態が精子侵入に影響を及ぼさないこと、さらに正常な受精卵が得られることが確認された。

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【目的】第二減数分裂中期 (MII期) での減数分裂の停止には細胞周期停止因子 (CSF) の高い活性が必須で，MAP kinase系 (Mos/MEK/MAPK) および成熟促進因子 (MPF; p34^cdc2 kinase+cyclin B) が重要な役割を持つことが知られている．われわれは自発的に減数分裂を再開するラットMII卵子ではp34^cdc2 kinase活性が低下すること，そして除核卵子ではその活性がさらに低下することを報告した (Ito et al., Reproduction, 2005)．このことから核およびその周辺部はCSF活性の維持に必要であると考えられ，本研究では除核した卵子のMAP kinase系およびMPF活性について検討した．【方法】(実験1) SD系雌ラットの排卵卵子を除核あるいは除核と同容量の細胞質を除去し，操作完了直後および1時間培養後のp34^cdc2 kinase活性を比較した．さらにtotal cdc2およびcyclin Bをウェスタンブロット解析した．(実験2) 排卵卵子を除核後1時間まで培養し，p-MEK，p-MAPKの検出を行った．さらにプロテアソーム阻害剤のMG132および脱リン酸化抑制剤のオカダ酸 (OA) で処理した除核卵子のcyclin B，p-MAPKも測定した．【結果】(実験1) 操作完了直後では，細胞質除去区，除核区ともp34^cdc2 kinase活性に変化は認められなかったが，除核区ではその後1時間で有意に低下した．またこの区ではcyclin Bも有意に減少し，total cdc2もわずかに減少した．(実験2) 未処理区のp-MEKおよびp-MAPKは培養1時間後まで変化しなかったが，除核区では両方の急激な減少が認められた．さらに除核卵子をOA処理した時，p-MAPKは増加し，MG132とOAの両処理ではcyclin Bとp-MAPKの両方が増加した．以上のことから，ラットMII卵子の核とその周辺部にはcyclin Bの分解とMEKの脱リン酸化の両方を抑制する因子が存在し，その働きによりCSF活性は高く維持されMII期で減数分裂を停止していると考えられた．

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【目的】スナネズミは，癲癇や脳障害などの疾患モデル動物として有用な実験動物である。しかし，スナネズミ初期胚の培養に関しては，卵管細胞と共培養することによって，1-cellから胚盤胞までの培養が成功しているが，既知培養液のみでの培養は成功していない。そこで本研究では，多くの動物種で胚の発生を促進するアミノ酸に着目し，スナネズミ初期胚の体外培養用既知培養液を作出することを目的として，卵管細胞との共培養下における各発生段階でのアミノ酸消費量の測定，および培養液へのアミノ酸添加が胚発生に及ぼす影響を調べた。【方法】1）修正TCM199(10%ウシ胎児血清＋ピルビン酸＋乳酸添加)を用いてスナネズミ卵管細胞を培養し，卵管細胞がモノレイヤーを形成した後，スナネズミ2-cell胚と共培養した。共培養後，培養液を回収し，液体クロマトグラフィーを用いてアミノ酸濃度を測定した。2）修正M16培養液(EDTA 100μM添加，リン酸無添加，NaCl 99.0mM，グルコース2.0mM)に0.2mg/mlグルタミン，グルタミン酸，グリシンのいずれか1つを添加し，スナネズミ2-cell胚を培養し発生率を調べた。【結果】共培養の結果，グルタミン酸，アスパラギン酸，セリンにおいて，8-cell期に比べ16-cell期で有意な消費量の増加がみられた。また，修正M16にグルタミンを添加すると4-cellおよび8-cellへの発生率が有意に高まったが，グルタミン酸およびグリシン添加区では発生率が有意に低くなった。これらのことから，グルタミン酸は8-cell以降に消費され，スナネズミ8-cell期に起こるcell blockに関与している可能性が示唆された。

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【目的】生体成分を含まない単純合成化学培地によるブタ成熟培養系の確立を目的として，合成高分子物質の成熟と発生に及ぼす影響，ならびに成熟培地中に存在するアミノ酸の発生に及ぼす影響について検討した。【方法】直径4-6mmの卵胞から採取した卵母細胞!)卵丘細胞!)顆粒膜細胞複合体（OCGCs）と卵胞膜を10% FBS，4.0 mg/ml BSA，または3.0 mg/ml PVAを添加したｍSOF，ｍSOFのみ(無添加区)，および10% FBSを添加したｍTCM199で42時間成熟培養後，成熟率を調べた。また，卵丘の膨潤化を検討するために，アクチンフィラメントの分布様式，OCGCsにおけるアポトーシスを調べた。また，電気刺激活性化後，サイトカラシンB処理を行って単為発生2倍体を作り，PZM-3を用いて168時間培養した。さらに，PVA添加mSOFに必須アミノ酸および非必須アミノ酸を添加した培地で成熟させた卵母細胞を活性化し，発生率ならびに胚盤胞の細胞数を調べた。成熟および胚培養は，すべて38.5˚C，５％CO₂，湿潤条件で行った。【結果】成熟培養後，いずれの実験区でも90%以上の卵子がMIIに達し，有意差は認められなかった。FBS添加区において，卵丘の膨潤化がもっとも充実し，卵子周囲に残存するF-actinの分布がもっとも少なく，アポトーシスを示す卵丘細胞数も少なかった。活性化96時間，および168時間後における桑実胚ならびに胚盤胞の割合は，FBS添加区において有意に高かったが，他の実験区間では有意差が認められなかった。また，FBS添加区の発生率は必須と非必須アミノ酸添加区よりも高かったが，胚盤胞の細胞数には有意差が認められなかった。以上の結果から，血清および高分子物質を含まない単純塩類合成培地で成熟させたブタ卵母細胞は，活性化後，胚盤胞まで発生することが明らかになった。

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[Introduction] The first mitotic cleavage plane correlates with the sperm entry position fertilization cone, or the second polar body (2pb) (Gardner et al., 1997; Karolina et al., 2002). Recently, Hiiragi et al. (2004) have shown that the first mitotic cleavage plane of the mouse egg is not predetermined but is rather defined by the topology of the two apposing pronuclei. [Methods] Mouse zygotes were produced by ICSI using oocytes and sperm from B6D2F1 mice. First, sperm heads were injected into oocytes at different positions at angles to the line of the metaphase II site and the center of egg (45° to 180°). Then male and female pronuclear position were observed 2 h interval until the early 2-cell embryo. Second, in order to examine the effects of the microtubule network on the migration of male and female pronuclei, eggs 2 h after ICSI were treated with 0.02 μg/ml demecolcine or 5 μg/ml cytochalasin B. Then the positions of male and female pronuclei were examined at 12 or 16 h after ICSI. Finally, the positions of the spindle, male and female chromosomes to the 2pb during the first cleavage were observed. [Results] The female pronucleus was always located in the space side of the 2pb and this tie is caused by a tie-microtubule cluster between the 2pb and female pronucleus. The male pronucleus migrated to the center of zygote and usually made angles 90 to 135° to the line of the female nucleus and the 2pb. Additionally, the final position of the male pronucleus was independent of the sperm injection site. In conclusions: The first mitotic cleavage plane of the mouse zygote is defined by the tie of the female pronucleus and the 2pb through a tie-microtubule cluster.

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【目的】ニワトリ放卵直後（stage X）の受精卵からはES様細胞が樹立されたことから、この時期の胚盤葉の細胞には未分化細胞が存在すると考えられている。一方、ヒトやマウスなどではES細胞由来の胚様体を介して初期発生の分化を制御することで細胞分化のメカニズムを探る手段として利用されたり、再生医療のための基礎的研究がなされたりしている。本研究では、未分化細胞を含むstage Xの胚盤葉細胞から初代培養系において胚様体類似の凝集体を作成して、その特性解析、および分化能の評価を行った。【方法】Stage Xの胚盤葉細胞を採取後、LIF、KSR存在下で培養することにより細胞凝集体を形成させた。細胞凝集体の特性解析として、未分化細胞マーカーであるSSEA-1の免疫染色およびアルカリフォスファターゼ活性について検討した。また半定量RT-PCRを用いて凝集体における生殖細胞マーカーであるvasa遺伝子の発現を周囲の細胞と比較した。この細胞群が胚様体に類似していること、レチノイン酸レセプターを発現することから、凝集体をトリプシンで分散・播種し、レチノイン酸を添加して、神経細胞のマーカーであるSox3の発現をRT-PCRにより調べた。【結果】胚盤葉由来の細胞凝集体ではSSEA-1に陽性を示し、アルカリフォスファターゼ活性についても高い活性を示した。レチノイン酸で刺激した細胞では神経細胞マーカーのSox3の発現がRT-PCRにより確認された。一方、vasa遺伝子の発現については凝集体では周囲の細胞に比べると高い発現が確認されたものの、継代後はレチノイン酸の添加の有無に関わらず消失することが認められた。以上の結果より胚盤葉由来の細胞凝集体では、ヒトやマウスにおけるES細胞由来の胚様体と形態的に類似しており、未分化マーカーに陽性であることが確認された。さらにその胚様体の組織分化を分化誘導因子等により制御できることも明らかになり、初期発生における細胞分化のモデルになる可能性が示唆された。

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【目的】哺乳動物における“最初の細胞分化”は，後期8細胞期から桑実期にかけて開始する栄養芽細胞と内部細胞塊への分化である。しかし，“最初の細胞分化”を制御する分子機構は未だ一部しか解明されていない。私達はそれらを制御する遺伝子を同定するために，桑実期前後において発現量が変動する遺伝子のサブトラクションcDNAライブラリーを構築した。そして、このライブラリーのスクリーニングにより同定した新規ホメオティック遺伝子群の全長cDNAのクローニングと，マウス初期胚およびマウス胚性癌細胞における発現解析を行った。【方法】SSH法により，4-8細胞期から桑実期にかけて発現量が増加するcDNAライブラリーを構築した。得られたcDNA断片のうち，転写調節因子様cDNA断片を選定し，RACE法により全長cDNAをクローニングした。さらに，初期胚の各発生段階，および胚性癌細胞株(F9，P19)における発現パターンをRT-PCR法により検討した。【結果】サブトラクションcDNAライブラリーより，機能が不明な新規ホメオティック遺伝子B606を同定した。B606 cDNAの塩基配列情報とRACE法により，B606遺伝子およびB606遺伝子と構造的に深く関連するホメオティック遺伝子AとBの全長cDNAをクローニングすることに成功した。初期胚におけるこれらの遺伝子の発現パターンについて検討したところ，いずれも4-8細胞期から桑実期にかけて発現量が上昇することが判明した。そこで，Egam-1ファミリー遺伝子群(Expressing gene at morula stage)として，Egam-1(遺伝子A)，Egam-1N(遺伝子B)，Egam-1C(B606)と命名した。初期胚における発現パターンに相反し，胚性癌細胞の未分化状態または分化誘導時におけるEgam-1ファミリーの発現パターンはそれぞれ特徴を有していた。

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【目的】マウス初期胚は，受精後2.5～3日の8細胞期から桑実期にかけて，胎児になる細胞系列と胎盤になる細胞系列に分化し始める。この段階は哺乳動物における最初の細胞分化であると考えられるが，その詳細な分子機構は未だ解明されていない。我々は，マウス初期胚において発現量が変動する遺伝子を探索し，4-8細胞期から桑実期にかけて発現が増加する新規ホメオティック遺伝子 Egam-1 ファミリーを同定した。本研究では，Egam-1 ファミリーの機能を推定するために，マウスの発生段階(胎児・胚体外組織)及び成体組織におけるEgam-1 ファミリーの発現解析を行った。【方法】マウス初期胚及び成体組織からtotal RNAを抽出後，cDNAを合成し，PCR法及びreal-time PCR法によりEgam-1 ファミリーの発現パターンを解析した。また，大腸菌によりGST融合Egam-1N及びEgam-1Cタンパク質を生産し，ウサギに免疫してポリクローナル抗血清を作製した。この抗血清を用いて，マウス受胎産物におけるEgam-1 ファミリータンパク質の発現についてwestern blot法により検討した。【結果】real-time PCR法により，Egam-1，Egam-1N及びEgam-1C mRNAは受精後2～4日目のマウス初期胚において高発現していることが判明した。受精後10～18日目にかけて，Egam-1N mRNAは胎児にのみ発現していたが，発生の進行に伴い発現量が減少した。Egam-1C mRNAは胎児及び胚体外組織に発現しており，胎児では発生の進行に伴い発現量が減少したのに対し，胚体外組織では逆に発現量が増加した。Egam-1 mRNAは5～18日目にかけて発現がみられなかったが，成体の目において高発現していた。mRNAの発現解析の結果に一致して，マウス受胎産物においてEgam-1N及びEgam-1Cタンパク質が検出された。Egam-1 ファミリーはホメオティック遺伝子であること，その発現は特徴的なパターンを示すことから，これらの発現部位において標的遺伝子の転写調節を行い，発現部位の細胞分化を制御している可能性が考えられる。

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【目的】マウスにおける“最初の細胞分化”は，受精後3日目の桑実胚で開始するが，その分子機構は殆ど解明されていない。我々は，“最初の細胞分化”に関連すると推定される遺伝子群を探索し，機能不明の新規ホメオティック遺伝子Egam-1 ファミリー（Egam-1， Egam-1N，Egam-1C）を同定した。本研究では，マウスES細胞におけるEgam-1 ファミリーの強制発現により，未分化状態維持及び細胞分化への関与について検討した。【方法】まず，ES細胞におけるEgam-1 ファミリーの発現解析を行った。未分化細胞または分化誘導細胞（LIF非添加培養（-LIF）またはレチノイン酸添加培養（+RA））からtotal RNAを回収し，RT-PCR法によりEgam-1 ファミリーの発現解析を行った。次に，Egam-1 ファミリーがES細胞の未分化状態を維持する可能性，及び細胞分化を誘導する可能性を検討するために，Egam-1ファミリー発現ベクターをES細胞へ遺伝子導入後，分化誘導（-LIFまたは+RA）し，細胞コロニーの形態変化を検討した。【結果】ES細胞におけるEgam-1 ファミリーの発現解析：Egam-1は未分化状態及び-LIFでは発現が検出されず，+RAにより発現が明確に誘導された。Egam-1Nは未分化状態及び+RAで発現が検出され，-LIFにより大きく発現が低下した。一方，Egam-1Cは未分化状態及び-LIFで同程度の発現を示し，+RAにより発現が上昇した。ES細胞におけるEgam-1 ファミリーの強制発現：Egam-1は，未分化状態維持培養にも関わらずES細胞の分化を誘導した。一方，Egam-1Nは-LIF及び+RAのどちらにおいてもES細胞の未分化状態を維持した。しかしEgam-1Cでは，ES細胞の明確な形態変化は見られなかった。以上の結果から，Egam-1はES細胞の細胞分化，Egam-1Nは未分化状態維持に関与している可能性が示された。Egam-1Cの機能は不明だが，構造上の関連性より，Egam-1またはEgam-1Nの機能発現に影響を及ぼしている可能性が考えられる。

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個体発生や細胞分化の過程において,ダイナミックな構造変換を遂げるクロマチンは,多岐にわたるエピジェネティックな不均等性(epigenetic asymmetry)を獲得する。最近になって，ヒストンテイルの修飾に基づくエピジェネティックな不均等性の構築プロセスが明らかとなりつつあり，DNAメチル化に依存性の低い,いわば「祖先型」の制御機構が存在する可能性を示唆している。初期発生過程において確立されるエピジェネティックな不均等性は,調和のとれた多彩な細胞活動に必須であり,エピジェノタイプ構築プロセスや体細胞クローンの定型的な胎盤異常を考える上でも大変興味深い。遺伝因子と表現されるジェノタイプは，均一であることが生命の維持に必須であるが，一方で，細胞核に付与された後成的な特性であるエピジェノタイプは，不均等性を生み出すことにより，多彩な生命活動を可能とする。従来の遺伝医学ではみられなかった捉え方ではあるものの，遺伝因子（ジェノタイプ）と環境因子に加え，エピジェノタイプを加味することにより，より包括的に生命現象を説明できる可能性がある。ゲノムインプリンティングに代表されるエピジェネティクスの基礎から，エピジェネティックな不均等性がどのように生命活動に関わっているのかについても考察したい。

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【目的】ウシ二次卵胞をガラス化保存するための最適な条件を調べることを目的とし，保存液，融解液および希釈液へのスクロース(Suc)添加濃度，保存液での処理時間と温度の影響を検討した。【方法】と畜場で得たウシの卵巣の皮質から直径150-200 µmの二次卵胞を切り出した。卵胞を9つのグループに分け，7.5%エチレングリコール(EG)，7.5%ジメチルスルフォキシド(DMSO)および20%仔ウシ血清を含む修正199(平衡液)に室温で15分間浸漬し，次いで15%EG，15%DMSOおよび20%仔ウシ血清と 0，0.25あるいは0.5 M Sucを含む修正199(保存液)で，室温で1分間，室温で30分間，あるいは4˚Cで30分間処理したのち，クライオトップ上に並べて液体窒素に投入し，ガラス化保存した。0.5 M Sucを含む保存液でガラス化した卵胞の融解には，1 M Sucを含む融解液(38.5˚C)を用い，融解後0.5 M Sucを含む希釈液に5分間浸した。Suc無添加保存液でガラス化した卵胞にはSuc無添加の融解液と希釈液を，また0.25 M Suc添加保存液では，0.5 M Sucを含む融解液と0.25 M Sucを含む希釈液を用いた。卵胞を洗浄後，卵胞および卵母細胞の正常性を組織学的に調べた。【結果】ガラス化処理前，70%以上の二次卵胞は正常であった。Sucの濃度にかかわらず，室温あるいは4˚Cで 30分間処理した区では，ガラス化-融解後，正常な卵胞はほとんどみられなかった。一方，室温で1分間処理した卵胞のうち0.25および0.5 M Suc添加区では80%以上の卵母細胞は正常な形態を示したが，約40%の卵胞では顆粒膜細胞間に大きな間隙が認められた。Sucを含まない保存液を用いて室温で1分間処理した卵胞では，顆粒膜細胞の形態は比較的良好に保たれたが，約半数の卵母細胞の核は萎縮しており，細胞質の希薄化も認められた。以上の結果より，Sucを含む溶液を用いたガラス化保存では卵母細胞の正常性が保たれ，一方，Sucを使用しないガラス化保存では顆粒膜細胞の正常性が保たれることが示された。

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【目的】げっ歯類を除く多くの哺乳動物種では受精時に精子によって持ち込まれた中心体から星状体ができ、そこから発達したチューブリン繊維網が雌雄両前核を卵子の中央に移動させる。本実験ではヒト精子中心体の機能解析に利用されるウシ卵子への異種顕微授精系において、南極海棲クロミンククジラの精子がもつ微小管形成中心 (MTOC) としての能力を評価した。
【方法】-20℃で保存しておいたクジラ精子およびウシ精子を融解し、5 mM DTTで5～20分間処理した後、体外成熟ウシ卵子に顕微注入した。ICSI 4～6時間目に微小管安定化バッファーとメタノールで卵子を固定し、免疫蛍光染色によってα-チューブリンを、DAPIによって核を染色して精子星状体の形成卵率を求めた。またクジラ精子注入卵の一部は7%エタノール (5分) と2 mM 6-DMAP (4時間) の併用処理により活性化誘起し、ICSI 4時間目に星状体形成卵率とチューブリン繊維網の対卵子径比を調べた。
【結果】クジラ精子から星状体が形成された卵子の割合は34% (10/29) で、ウシ精子由来の星状体形成卵率 (38%, 9/24) と同等だった。星状体形成卵のうち注入精子により活性化が起こっていたのはウシでは5例 (56%) だったのに対しクジラでは2例のみ (20%) だった。活性化処理を補足した場合、精子星状体形成卵率の増加 (38%, 11/29。対照区は27%, 6/22) はわずかだったが、チューブリン繊維網のサイズは0.09から0.55に改善された。以上、クジラ精子では中心体を起点として星状体ができ、そこからのチューブリン繊維網の成長には卵細胞質環境が影響することが示唆された。

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【目的】本研究は2種類のBSA（Fraction-V及びFatty acid free）がブタ精子の運動性と先体反応に及ぼす影響について調べた。哺乳類の精子のリン脂質には多くの脂肪酸が含まれている。 ブタ精子中の脂肪酸の減少は、精子の運動性の低下に係わっている。さらに、精子の先体反応にも影響を及ぼしていると考えられる。そこで本研究では、Fraction-VもしくはFatty acid free BSAをブタ精子に添加して、精子の運動性及び先体反応について比較検討した。また、精子の代謝活性への影響を調べた。【方法】Fraction-VもしくはFatty acid free BSAを添加したmTALPを培養液とし、各培養液に精子を加えて遠心分離し、 洗浄した後、 swim-up し、精子を前培養した。処理した精子は6時間培養し、運動性を1時間毎に観察した。Triple-stainingを用いて精子を染色・観察し先体反応率を調べた。また、¹⁴C-glucoseを用いて、精子への取り込みと酸化について調べた。取り込みと酸化の測定はscintillation　counterで行なった。５％PCAを用いて精子を洗浄した後、Glucoseの取り込み量を測定した。精子によるCの酸化を調べるために、NaOHでCO₂をトラップ後、scintillation cocktailに混合して測定した。【結果】 ブタ精子の運動性と先体反応、ならびにglucoseの取り込みと酸化は Fraction-V　BSA添加区で有意に高まった。これらのことから脂肪酸がglucoseの代謝を高め、精子の運動性及び先体反応に影響を及ぼしていることが判った。

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【目的】雄ウシの低繁殖性は多大な経済的損失を与えるだけでなく，系統維持を脅かす深刻な要因である。本研究では雄ウシの低繁殖性の原因を解明する目的で，人工授精による受胎試験等での成績が不良であった個体（低繁殖能力雄ウシ）から採取し作製した凍結精子の運動性，鞭毛運動の制御に関与するPKAの活性，およびキャパシテーション・先体反応の進行状態を調べた。【方法】8頭の低繁殖能力ウシおよび4頭の正常繁殖能力ウシ（対照区）由来の凍結精子を融解，洗浄した後CaCl₂含有または不含のBO-Hepes液に再浮遊した。次いで洗浄後の精子における運動性を顕微鏡下で観察するとともに，CTC染色法に従ってキャパシテーション・先体反応の進行状態を判定した。さらにPKA活性を調べる目的で，精子浮遊液にcBiMPS（細胞透過性cAMPアナログ）を添加して38.5°Cで3時間インキュベートし，精子内のセリン/スレオニンリン酸化PKA基質タンパク質をSDS-PAGE・ウエスタンブロッティング法により検出し，検出像をデンシトメーターで解析した。【結果】洗浄後の精子での前進運動率は，正常繁殖能力の対照区と比較して4頭の低繁殖能力ウシで有意に低かった。cAMPアナログ処理後の精子リン酸化PKA基質タンパク質の相対検出量については，前進運動率の低かった低繁殖能力ウシで対照区より低い値を示した。一方CaCl₂不含の培養液を用いた実験において，CTC染色法で得られた結果より，4頭の低繁殖能力ウシではキャパシテーション過程にある精子の割合が対照区よりも有意に高かった。またそれらのウシでは，培養液にCaCl₂を加えたところ，対照区よりも未キャパシテーション精子率が有意に低く，先体反応精子率が有意に高い値であった。以上の結果より， PKAの低活性による低前進運動性および時期尚早なキャパシテーション・先体反応の進行が雄ウシの低繁殖性の一因であると推定される。

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【目的】精原細胞に関する研究はこれまでマウスを中心になされ，現在までに様々ことが明らかにされてきた。しかし，マウス以外の動物種，特にブタでの精原細胞に関する研究は，精子形成の分化ステージに特異的なマーカーが無い為にあまり研究がなされていない。そこで，本研究ではブタの精原細胞や精母細胞など精子形成を担う細胞に特異的なモノクローナル抗体の作出を試みたので報告する。【方法】未成熟ブタの精巣をコラゲナーゼ液中にて分散させ細胞懸濁液を得た。得られた細胞をBALB/c系雌マウスの腹腔に5回免疫し，最終免疫の4日後に脾臓を採取し，マウスミエローマ細胞と融合した。HAT選択培地中で増殖した細胞を，成熟ブタ精巣の組織切片を用いてスクリーニングし，ハイブリドーマ細胞を限界希釈法によりクローニングした。さらに，抗体産生ハイブリドーマを腹腔に投与して腹水を採取した。得られた抗体は，成熟ブタと生後１０日齢の未成熟ブタ精巣，胎齢２８日のブタ生殖隆起，成熟ラット及び生後１日齢のラット精巣，成熟ハムスター精巣との交差反応をそれぞれ調べた。【結果】成熟ブタの精原細胞の核に特異的に交差する２種類のモノクローナル抗体KZM-2a，KZM-2bが得られた。KZM-2a抗体は成熟ブタの精原細胞の核を特異的に認識し、さらに未成熟ブタ精巣だけでなく胎齢２８日のブタ生殖隆起でも陽性であった。また，成熟ラット，成熟ハムスター精巣の精原細胞にも陽性であったが、未成熟ラット精巣では陰性であった。KZM-2b抗体は成熟ブタの精原細胞だけでなく精母細胞の核も認識した。しかし，未成熟ブタ精巣及び胎齢２８日のブタ生殖隆起では陰性であった。また，成熟ラット，成熟ハムスター精巣では精原細胞と精母細胞の核に陽性であったが、未成熟ラット精巣では陰性であった。以上、本研究よりブタの精原細胞及び精母細胞の核を特異的に認識する２種類の抗体が得られた。

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【目的】哺乳動物の精子形成は精細管内で進行するが，その過程は多数のホルモンや細胞間相互作用により複雑な調節を受けている。卵胞刺激ホルモン（FSH）は精細管内のセルトリ細胞や生殖細胞に作用し，精子形成において重要な働きをする。げっ歯類におけるFSH作用の発現はFSHレセプターの発現レベルが深く関与しているため，精上皮周期のステージ特異的なFSHの作用はその濃度の変化よりも，FSHレセプターの発現レベルの変化によって調節されることが報告されている。また，これまでFSHレセプターの局在はセルトリ細胞上に限定されてきたが，近年，生殖細胞にも存在する可能性が示された。そこで本研究ではヤギ雄性生殖細胞の分化とＦＳＨレセプターの発現との相互作用を検索することを目的に，ヤギ精巣を組織化学的，分子生物学的に解析した。【材料および方法】精巣は0.5－6および24ヶ月齢の日本ザーネン種雄ヤギから摘出した。精巣組織は直ちに液体窒素で凍結保存，またはブアン固定後パラフィン包埋し，8μmの切片を作成した。組織切片はPAS染色し，光学顕微鏡で各分化段階の生殖細胞数を計測した。精巣total RNAは凍結保存組織から定法に従い，抽出した。FSHレセプター遺伝子発現の変化は半定量RT-PCRにより調べた。【結果】0.5，1，1.5ヶ月齢の精細管では胚芽細胞およびA型精原細胞，2ヶ月齢ではザイゴテン期精母細胞，3ヶ月齢ではパキテン期精母細胞が確認された。4ヶ月齢以降の精細管では精子が確認された。1.5ヶ月齢から3ヶ月齢，および3ヶ月齢から4ヶ月齢の精細管の比較において生殖細胞数が著しく増加した。半定量RT-PCRの結果から有意ではないが，月齢の異なる精細管の比較において，FSHレセプター遺伝子発現レベルに違いが認められた。このことから，ヤギ雄性生殖細胞の増殖および分化とFSHレセプター遺伝子の発現レベルとの間の相互作用の存在が示唆された。

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We previously demonstrated the specific distribution of a calcium-dependent phospholipids binding protein, annexin 5, in the testis. As we found that annexin 5 was involved in gonadotropin secretion in the pituitary gonadotropes, it is hypothesized to be involved in some testicular function. To examine this possibility, in the present study, we studied first the effect of hemicastration and unilateral cryptorchidism on annexin 5 content and distribution in the testis. Effects of hCG, GnRH and testosterone on annexin 5 expression were also evaluated. Hemicastration increased annexin 5 content of the remaining testis after 24h. It was thought that this increase was induced by enhanced gonadotropin secretion after castration, because hCG (50 IU/head) augmented testicular content of annexin5 within 24h. It seemed that the interstitium was expanded with the augmentation of annexin 5 expression after hCG treatment. On the other hand, unilateral cryptorchidism also increased the annexin 5 expression of the cryptorchid testis during four weeks observation. Annexin 5 in the cryptorchid testis concentrated to intra-seminiferous tubules but not in the interstitium. The increase of testicular annexin 5 content seen after hemicastration and cryptochidism is thought to be induced by diverse mechanisms and in different cell species. Intratesticular administration of GnRH analog and subcutaneous testosterone injection both increased annexin 5 expression. These present data reveal multiple stimuli give changes in annexin 5 content in various cell species of the testis. Pituitary luteinizing hormone is suggested to augment annexin 5 synthesis in the interstitial cells.

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【目的】F-spondinは当初，胎子の中枢神経系の発育に関与する糖蛋白質として発見され，in vitroで神経軸索の成長作用を持つことが明らかにされた。しかし近年，F-spondinは卵巣で大量に生産され，血管平滑筋の増殖作用をもつことも判明した。本研究では，卵巣と発生的に相同な精巣においてもF-spondinが生産されるか，また精巣の発達にともないF-spondinの生産が変化するかを明らかにすることを目的とした。【方法】生後１，４，16および40週齢のヨーロッパ種の雄ブタから精巣を採取した。精巣はトリスバッファー（pH 7.5）で５倍希釈し，ホモジナイズして試料とした。試料中のF-spondinは，ヘパリンセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー，DEAEイオン交換クロマトグラフィー，およびRESOURCEカラムを用いた逆相クロマトグラフィーで分離した。分画中のF-spondinは，SDS-PAGE後の蛋白染色とF-spondinに対するペプチド抗体を用いたWestern blottingを用いて検出した。【結果】F-spondinはアフィニティークロマトグラフィーでは0.75M NaClで，イオン交換クロマトグラフィーでは0.2M NaClで溶出された。逆相クロマトグラフィーの溶出分画を蛋白染色およびWestern blottingを用いて解析した結果，F-spondinは40％アセトニトリルで溶出された。精巣から単離されたF-sponidnの分子量は110 kDaであり，ウシ卵巣から単離された蛋白質（95 kDa）に比較してやや大きいことが明らかとなった。一方F-spondinは，１および４週齢では精巣中から多量に単離されたが，16週齢では減少し，40週齢の精巣からは単離不能であった。以上の結果から，精巣は卵巣と同様にF-sponidinを生産すること，およびその生産は精巣の発育にともない変化することが推察された。

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【目的】リラキシンは，子宮の組織改変作用のほか，多岐にわたる組織で作用が注目されている多機能性ホルモンである。しかし，反芻家畜ではリラキシンの存在は不明瞭で，その代替としてリラキシン関連タンパク（RLF）が機能的なリラキシンとして発現していることが示唆されている。最近，LGR7とLGR8と呼ばれる２種類のリラキシン受容体がヒトで発見され，とくにRLFはLGR8のみを受容体とすることが判明している。本研究では，反芻家畜のパイロットアニマルとしてヤギを用い，精巣におけるRLFとその受容体LGR8の発現と局在を転写および翻訳レベルで調べ，RLFのリガンド-レセプターの存在について検討した。【方法】ヤギ精巣は成熟（繁殖季節）および未成熟ザーネン種より採取し，直ちに液体窒素で凍結した。まず，精巣におけるRLFとLGR8の発現を調べるため，全RNA抽出後，RT-PCRを行うと共に，塩基配列を決定した。加えて，成熟および未成熟間における転写レベルでの発現解析を半定量RT-PCRで調べた。次に，RLFとLGR8の遺伝子発現細胞を同定するため，DIG標識cRNAプローブを作製し凍結切片を用いてin situハイブリダイゼーションを行った。さらに，RLFおよびLGR8のペプチド抗体を用いた免疫染色を施した。【結果】ヤギ精巣のRT-PCRより，RLFとその受容体LGR8のDNA断片の増幅が認められた。即ち，RLFについては本研究室で明らかにした妊娠ヤギ卵巣RLF全塩基長と一致する部分配列が，一方LGR8についてはヒトLGR8と相同性のある部分配列が増幅されていた。加えて，成熟と未成熟精巣間でこれら遺伝子の発現を半定量RT-PCR解析した結果，RLFとLGR8の遺伝子発現は成熟精巣で増大していることが分かった。次に，in situハイブリダイゼーションの結果から，RLFとその受容体LGR8の遺伝子発現はいずれもライディッヒ細胞で見出すことができた。さらに，免疫染色の結果も同様の所見を得た。以上，ヤギ精巣においてリラキシン関連タンパクRLFのリガンド-レセプターの存在が示唆された。

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【目的】ヒツジやヤギでは雄由来の匂いが季節外の排卵を誘起する雄効果という現象が知られている。一般に匂いの情報は嗅上皮－主嗅球を含む主嗅覚系、あるいは鋤鼻器－副嗅球を含む鋤鼻系の何れかを介して扁桃体などの高次中枢へと伝達される。齧歯類では多くのフェロモン効果が鋤鼻系で処理されているが、反芻獣の雄効果についてはフェロモンの受容部位は定かではない。シバヤギの視床下部からはGnRHのパルス状分泌を制御する周期的な神経活動（MUAボレー）が記録されるが、雄フェロモンはこの活動を刺激する。この反応を指標とし、鋤鼻器へのフェロモン取り込みの遮断が及ぼす影響をみることで、ヤギにおける雄効果フェロモンの受容部位を検討した。【方法】卵巣摘除し視床下部へ電極を留置した成熟雌シバヤギを供試した。雄シバヤギの頭頸部から採取した被毛を呈示カップにセットし、雌の吻部に保持することでフェロモン呈示とした。ヤギの鋤鼻器は、鼻腔と口腔を繋ぐ切歯管の中ほどに開口している。注射麻酔下で左右両側の切歯管にステンレス針（外径1.2mm、長さ25mm）を挿入して閉塞し、開口部を塞ぐことで鋤鼻器を機能的に遮断した。覚醒後フェロモン呈示を行い、MUAボレー誘起までの潜時を計測した。また別の個体を用いて片側のみ切歯管を閉塞し、両側の鼻腔内に染色液を滴下したあと屠殺、鋤鼻器を採材し、染色液の取り込みを比較した。【結果】無処置群では適切なタイミングでフェロモン呈示すると直後にMUAボレーが誘起された。同様に切歯管を閉塞した状態でも、雄ヤギ被毛呈示の直後1分以内にMUAボレーが誘起された。また切歯管の閉塞は鋤鼻器への染色液の取り込みを阻害していた。【総括】切歯管の閉塞によりフェロモンの鋤鼻器への取り込みは抑制されると考えられたが、この鋤鼻器の機能的遮断はフェロモン効果を阻害しなかった。齧歯類とは異なり、ヤギの雄効果を引き起こすフェロモンは嗅上皮で受容され、その情報は主嗅覚系を介して視床下部へと伝達されている可能性が示唆された。

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【目的】ブタの下垂体後葉中にはPRFが存在するが、その物質が何であるかは分かっていない。本研究では、ブタ下垂体後葉をペプチド抽出分画（ペプチド分画）とその他の分画（非ペプチド分画：主に蛋白質）に分けin vitroでプロラクチン(PRL)放出活性を調べた。また、後葉中にはオキシトシン（OT）とバソプレッシン（VP）が含まれるのでOTとVPのPRL放出活性も同様に調べた。
【方法】ブタ下垂体後葉中のペプチド分画はMoriらの方法に従い、酢酸を用いて調製した。6ヶ月齢の去勢豚から得た培養ブタ下垂体前葉細胞にペプチド分画（0.0125～0.2 eq/ml,1eq=1頭分の下垂体後葉抽出物）、非ペプチド分画（0.01～1.0 mg/ml）、OT及びVP（10^-11 M～10^-7M）をそれぞれ培養下垂体前葉細胞に添加し、2時間培養した後、培養液中に放出されるPRL濃度をEIAにより測定した。
【結果】ペプチド分画添加時のPRL濃度は、0.2 eq/ml濃度添加時において対照区に比べ有意に高い値を示した（P<0.05）。また、非ペプチド分画添加においてもPRLの放出が見られ、0.25、0.5及び1.0 mg/ml濃度で対照区に比べ有意に高い値を示した（P<0.05）。一方、OT、VPでは有意なPRL放出は見られなかった。本研究の結果はPRFはペプチドの他、ペプチド以外の物質である可能性を示唆する。またOTとVPはブタではPRL放出に関係しないことも示す。

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【目的】ラジオイムノアッセイ(RIA)による下垂体前葉ホルモンの測定は、アイソトープを使うため種々の制約がある。そこで本研究では、アイソトープを使わないEIAによる家畜の下垂体前葉ホルモン濃度の測定方法について検討した。
【方法】本研究では培養液中のブタのプロラクチン(PRL)と成長ホルモン(GH)濃度のEIAによる測定法について検討した。ブタのPRLとGHをビオチンで標識し、透析膜を利用してビオチン標識したPRLとGHを回収した。第二抗体をコーティングした96ウェルプレートに標準ホルモンと第一抗体を添加し一晩４°Cでインキュベーションした。次にペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを加えた後、過酸化水素とオルトフェニレンジアミンの入った基質液で30分間反応させた。硫酸で反応を停止させたのち、各ウェルの吸光度(495nm)を測定した。
【結果】本システムでのEIA に適したビオチン標識PRLとGHの希釈倍率はそれぞれ6,000倍および30,000倍であった。 PRL とGHはそれぞれ0.16～40ng/mlと0.31～40ng/mlの範囲で良好な標準曲線が描けた。PRL とGHの標準曲線はそれぞれ培養液とブタ血清との間で良好な平行関係が見られた。培養液からのPRLとGHの平均回収率はそれぞれ133%および104%であった。EIAと RIAで測定した培養液中のPRLとGH濃度にはそれぞれ正の相関関係が認められた。本研究の結果は、培養液中のブタのPRLとGH 濃度は本研究で確立したEIA により測定できることを示している。

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【目的】脂肪細胞から分泌されるレプチンはLHやGH分泌を刺激することが報告されている。しかし，反芻家畜の場合，血中レプチン濃度の測定が難しいため，その分泌形態はよく分かっていない。そこで本研究は，RIAによる反芻家畜の血中レプチン濃度の測定系を確立し，ウシにおける血中レプチン濃度の日内変動を明らかにしようとした。
【方法】(１)RIAによるレプチンの測定系について：ウサギにヒツジレプチンを免疫して抗血清を作製した。得られた抗血清はアフィニティカラムを用いて精製，濃縮した。ヒツジレプチンのヨード化とRIAのプロトコールは，Blacheらの方法に従った。精製した抗体の希釈倍率，ウシ血清と標準曲線との平行性，血清からのレプチンの回収率を調べた。(２)血中レプチン濃度の日内変動について： 3.5～6ヶ月齢の雄子ウシ計7頭を用いて，12:00から翌日12:00までの24時間，15分間隔で採血を行った。血漿中レプチン濃度は確立したRIA系により測定した。
【結果】(１)精製した抗体は500∼1000倍でRIAに使用できた。段階希釈したウシ血清は標準曲線と平行した。ウシ血清からのレプチンの回収率は平均120%であった。(２)ウシの血中レプチン濃度は不規則なパルス状分泌形態を示した。レプチンの分泌様式は，午後の方が午前より血中レプチン濃度が高いもの（3頭），朝方にレプチン濃度が高まるもの（3頭），一日中ほぼ同じ濃度を維持するもの（1頭）の3形態に区別できた。以上の結果から，本研究で確立したRIAによりウシの血中レプチン濃度は不規則なパルス状分泌を示すことが明らかになった。

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【目的】ホルモン情報伝達を利用して、受容体結合、2nd-メッセンジャー生成、タンパク質リン酸化、および遺伝子発現量などがホルモン情報として定量化されている。さらに、生細胞においてホルモン情報が転写因子レベルで視覚的に計測できるならば、広範囲の応用が期待される。本研究では、顆粒層細胞においてcAMP制御領域活性（CREB）リズムのリアルタイム計測システムを確立し、さらにCREB活性に及ぼす卵子由来因子の影響について解析した。【方法】CRE制御領域を含むオリゴヌクレオチド（正鎖：AAAAAATGACGTCACCCCCC，逆鎖：GGGGGGTGACGTCATTTTTT）を作製し、３回タンデムに連結、5’側に制限酵素部位を付けて、pGL3-promoterベクター（Luc遺伝子を連結）に構築、細胞導入用のLucレポーターベクターを作製した。顆粒層細胞はブタ卵胞（直径3-6 mm）から単離し、２日間培養、CRE制御領域を含むベクターを導入した。培地交換を行いホルモン等（FSH, LH, forskolin, IGF-I, EGF, bFGF, TGFb2, TNFa）を添加して、クロノスで48 h CREB活性を連続的に計測した。また、顆粒層細胞と卵核胞期卵子と18 h共培養して同様にホルモン等による変化についても計測した。【結果】CREB活性の変化は３相に分かれ（急激な応答、減衰、不応）、顆粒層細胞におけるCREB活性を誘導する成長因子は、IGF-Iのみで他の因子は影響しなかった。FSH、LH、forskolinはCREB活性を急激に増加させたが、TGFb2、TNFaはそのCREB活性を30%減少させた。卵核胞期卵子との共培養では、CREB活性は明らかな減少を示した。したがって、顆粒層細胞のCREはFSH、LHが作用する制御配列である他に、この配列に影響する卵子由来の因子の存在が推測された。この計測システムは、新規の方法として転写レベルで未同定因子のシグナリング推定など広範な応用が期待できる。

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【目的】筋芽細胞の増殖・分化を調節する因子であるミオスタチン（GDF-8）の発現は、ニワトリ初期胚の体節形成に伴って筋節部で認められ、その発現は孵化後も継続する。しかし、筋肉形成に至る分子機構は明らかではない。哺乳動物ではGDF-8遺伝子欠損により筋肉肥大が報告されていることから、本研究では、増殖・分化能を有すニワトリ胚由来筋芽細胞の培養系を確立し、二本鎖RNA（siRNAs）を用いたRNA干渉によりGDF-8の機能を解析するとともに、それにより発現が変化する遺伝子を検索した。【方法】パ-コ-ル密度勾配法によりニワトリ12日胚の胸筋から筋芽細胞を分離し、この培養細胞にGDF-8-mRNAを標的とするsiRNAsをリポフェクション法により導入した。GDF-8、p21、MyoD、Myogeninの発現量はRT-PCRで測定し、活性測定は転写因子Smadが結合する配列（CAGA box：AGCCAGACA）をベクター（pGL3）に組み込み、細胞に導入してクロノスで連続的に（72 h）計測することにより行った。さらにsiRNAs導入により発現が変化する遺伝子をDifferential Display（DD）法で検索した。【結果】胚胸筋から分離した細胞は、筋芽細胞特有の増殖・分化の変化を示した。siRNAsを導入した筋芽細胞では、導入24 h後にGDF-8の発現、活性に明らかな減少が見られ、GDF-8の発現により誘導されるp21の発現も72 h後に減少した。siRNAsを導入した筋芽細胞では細胞融合率に影響が見られたが、細胞増殖には変化はなかった。さらに、DD法の結果から、発現量が変化した複数の遺伝子が見つかった。【結論】筋芽細胞においてsiRNAs を用いたRNA干渉によりGDF-8の発現、活性が抑制され、それに付随してp21などの発現が変化した。また、GDF-8は他の遺伝子の発現の変化を伴って筋芽細胞の増殖・分化に関わることが示唆された。

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【目的】リラキシンはペプチドホルモンの一種であり、分娩時の恥骨間靱帯の伸長や産道拡大などの働きを持つ。その一方で、脳や雄性生殖器にも受容体が存在することが報告されており、多機能なホルモンであることが分かっている。スナネズミは、癲癇や脳虚血等の疾患モデル動物として有用な実験動物であるが、近年LHやFSHの配列が決定されたところであり、生理学分野における研究の歴史は浅い。そこで本研究では、スナネズミにおけるリラキシン研究の導入とするべく、スナネズミのリラキシン塩基配列を決定し、既に配列の分かっているマウス・ブタ・ヒトなどを対照とし、塩基・アミノ酸配列の比較を行った。【方法】妊娠15,19,23日目のメススナネズミから卵巣・胎盤・子宮・脳を採取し、LN₂で急速に凍結した。サンプルからISOGENを用いてTotal RNAを抽出した。RT-PCRを行いFirst strand cDNAを作成した。ハムスターリラキシンから構築したプライマーを元にPCRを行った。cDNAのプールの評価のために、G3PDHプライマーを用いた。PCR産物はアガロースゲル電気泳動を行い、目的のバンドからPCR産物の抽出を行ったのちシークエンスを行い、配列決定をした。【結果】全ての実験区に於いて、First strand cDNAがもたらされたが、そのうち、メススナネズミの卵巣由来のcDNAからリラキシンのB-chainを含む塩基配列が増幅され、この塩基配列を決定することが出来た。また、この塩基配列及びそれから推定されたアミノ酸配列は特にハムスターのものと高い相同性を示した。

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[Objective] The aim of this study was to clarify whether the route of administration is critical factor for evaluating the effects of environmental estrogens in birds. [Methods] Immature 3-week-old male quail were treated with a single intraperitoneal (i.p.) injection of estrogenic chemicals dissolved in corn oil, and mRNA levels of ZP1, VTG-II, and apoVLDL were measured in the liver on 1, 2, 3, and 4 days after injection. Mature female quail were received i.p. injection of estrogenic chemicals daily for ten consecutive days. Fertile eggs were collected and incubated for 8, 10, 12, 14, and 16 days. Total RNA was reverse-transcribed with oligo (dT) primers, and cDNA was subjected to real-time PCR. [Results] Transcription of ZP1, VTG-II, and apoVLDL genes were highly specific for mature females, and no significant expression was observed in liver of untreated males. The mRNA levels of ZP1, VTG-II, and apoVLDL increased one day after injection of ethinyl estradiol (EE) or diethylstilbestrol (DES), but not of nonylphenol, bisphenol A, genistein, or coumestrol. ApoVLDL was the most sensitive gene for evaluating the estrogenic effects in the liver of Japanese quail. Expressions of estrogen-sensitive genes were enhanced in the liver of male embryos after maternal exposure to EE, but not to DES. These results provided an additional insight into the relationship between the route of administration and the effects of estrogenic compounds in birds.

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【目的】早期妊娠因子（EPF）は、母体の胎児に対する免疫攻撃を抑制し、妊娠の成立に重要な働きをする物質と考えられている。主として母体の血中より検出され、当研究室では血清由来のものを特に超早期妊娠因子（Super-EPF）、それ以外の材料より検出される物質をEPF様物質と呼んで区別している。本研究では、効率の良い精製法の確立を目的とし、その工程により得られた精製物を用いて２D SDS-PAGEによるウシ超早期妊娠因子の解析を行なった。【方法】ウシ血清を３５％飽和および４０％飽和の硫酸アンモニウムにより塩析し、上清、沈澱の各分画をロゼット抑制試験（RITest）に適用し活性を調べた。その後、活性のあった分画を CM sepharoce Fast Flowによる陽イオン交換クロマトグラフィーに適用した。さらに、RITestにより活性のあった分画をSDS-PAGE、2D SDS-PAGEおよびイムノブロッティングに適用し、ウシ超早期妊娠因子の解析を試みた。【結果】最終的な活性分画の総タンパク量は33.5ODで、回収率は6.26％であった。この結果は以前の精製法よりも若干少ないものだった。しかし、その後の解析によって、これまでの精製法では検出できなかったSuper-EPFと思われる新たなタンパクスポットが確認された。したがって、この新しい精製法はEPF の精製にとって有効な方法と考えられる。精製物のSDS-PAGEによる解析では、20および50KDa付近に抗ウシSuper-EPFポリクローナル抗体と特異的に反応するバンドが確認され、さらに、２D SDS-PAGEの後にイムノブロッティングで解析した結果、20および25KDa付近に抗ウシSuper-EPFポリクローナル抗体と特異的に反応する３つのスポットが観察された。これら３つのスポットはSuper-EPFの重要な候補と思われ、この３つのスポットについてTOF-MSを用いて現在解析中である。

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【目的】スンクスは周年繁殖の交尾排卵型動物であるが，その生理作用機構や内分泌制御機構において独特な特徴を有している。妊娠中のプロジェステロン分泌に関しても，妊娠初期から中期では低レベルを保つ血中プロジェステロン濃度が後期に急激に上昇すること，少数例ではあるが，妊娠の初期段階に卵巣除去を行っても妊娠維持が可能であることが報告されているなど極めて特異な性質を示す。しかしながらこの特異的な現象のメカニズムは未だ解明されていない。そこで本研究ではプロジェステロン産生組織と分泌についての検討を行った。【方法】妊娠スンクスの卵巣，胎盤，副腎を妊娠0，5，10，15，20，25，30日で採取し，４％PFAで48時間浸漬固定後，常法に従い5μmのパラフィン切片を作製し，P450scc（cytochrome P450 side chain cleavage），P450arom（aromatase cytochrome P450）の各組織での局在の推移を免疫組織化学的手法を用いて調べた。【結果】P450scc発現は妊娠５日目に初めて認められ，卵巣・胎盤ともに妊娠20，25日で最大となった。卵巣では黄体，胎盤では特定の細胞群においてのみ局在がみられた。P450arom発現も妊娠5日目に初めて認められ，徐々に増加していく傾向にあった。胎盤でのP450sccとP450aromの局在は一致していた。卵巣では胎盤よりも強い陽性反応が認められた。しかしながら妊娠8日目に卵巣除去を施したものでも妊娠が維持された。またどちらの酵素においても，副腎においては妊娠していないものとの優位な差は見られなかった。これらのことよりスンクスでは卵巣だけでなく胎盤にも妊娠時におけるプロジェステロン分泌能が備わっていると考えられる。

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【目的】我々はウシ子宮内膜に機能的な glucocorticoid receptor (GR) α の存在することを見出し，glucocorticoid (G) が子宮内膜間質細胞における prostaglandin (PG) F2α の基礎分泌および腫瘍壊死因子 (TNFα) 刺激下の PGF2α 分泌を抑制することを示した。本研究ではウシ子宮内膜における G の生理的役割の詳細を明らかにする目的で，発情周期を通じた 11β–hydroxysteroid dehydrogenases (11HSDs) mRNA 発現量の変化について検討した。G の作用は 11HSDs により局所的に調節される事が知られている。さらに，G の PGF2α 抑制作用が genomic な作用であるかどうかを明らかにするために G の作用におよぼす RU486 (GR antagonist) の影響を併せて検討した。【方法】1) 発情周期各期の子宮内膜組織における 11HSDs mRNA 発現量を半定量的 RT-PCR により調べた。2) 子宮内膜組織から間質細胞を単離し，コンフルエントに達するまで培養した後，培養液を交換すると同時に RU486 (10 µM)，cortisol (Cr; hydrocortisone 100 nM) または TNFα (0.06 nM) を単独または組み合わせて添加した。24 時間後，培養上清中の PGF2α 濃度を EIA により測定するとともに，プレート毎の DNA 量を測定した。【結果】1) 11HSDs mRNA 発現は発情周期を通じて認められ，11HSD1 mRNA 発現量は中期と後期に低く，卵胞期から排卵にかけて高かったが，11HSD2 mRNA については発情周期を通じて発現量に有意な変化は認められなかった。2) RU486 は間質細胞における Cr の PGF2α 分泌抑制作用を阻害し，また，TNFα の PGF2α 合成刺激作用を抑制する Cr の作用を阻害する傾向が示された。以上より，ウシ子宮内膜において，排卵時 および退行期に高い 11HSD1 mRNA 発現が不活性型 G を活性型 G に転換することにより，排卵時および黄体退行時の PG 分泌を抑制する可能性が考えられる。また，G の PG 抑制作用は genomic な作用である可能性が示された。

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【目的】我々はこれまでに、単為発生胚を同時移植することにより１個のブタ受精胚を産子にまで発生させることが可能であることを報告した（日本畜産学会第104回大会）。本研究では単為発生胚の移植がレシピエントブタに及ぼす影響を明らかにするため、レシピエントブタのステロイドホルモン動態と生殖器官の形態的変化を調べた。【材料と方法】単為発生胚は未成熟ブタの卵巣より採取した未成熟卵母細胞を体外で成熟培養し、電気刺激により活性化した後、0.3%BSA添加PZMで110時間培養して作製した。受精胚は未成熟ブタにeCGおよびhCGを処理し、人工授精96時間後に回収した。これらの胚を発情同期化したレシピエントブタに移植し、糞中のProgesterone、 Estrone Sulfate(E₁S)の濃度と子宮、卵管、卵巣などの生殖器官の肉眼、組織学的形態変化を調べた。【結果】単為発生胚を移植したレシピエントブタの糞中Progesterone値は妊娠ブタと同様に発情後10日までに上昇し、その後高い値を維持した。一方、E₁Sの分泌は認められたが、個体により異なり、一定のパターンを示さなかった。胎齢25日の単為発生胚は生存しているものの、受精胎子に比べて小さく、胎盤の形成は不十分であった。胎齢40日以降では生存胎子は認められないが、胎子の遺残物は子宮の中に残り、子宮粘膜固有層の水腫様変化は妊娠ブタに比較して顕著であった。黄体組織は妊娠ブタのものと差がなかった。【結論】単為発生胚は妊娠30日ころまでに死滅するが、遺残物は子宮内に留まり、黄体は機能を維持し、レシピエントブタは妊娠様の状態を継続することが明らかとなった。

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