ジベレリン（GA）のイネにおけるシグナル伝達は、GA受容体であるGID1 とGA反応の抑制因子であるDELLAタンパク質（イネにおいてはSLR1）がGA依存的に結合することにより、SLR1の分解がF-box タンパク質GID2を介して起こり、GA反応が誘導されることが知られている。今回、SLR1の分解に至る分子機構をより詳細に理解するため3因子間の相互作用について解析した。
SLR1とGID2の相互作用はGA, GID1に依存し、さらに両者の相互作用に必要なそれぞれの領域をアラニンスキャニング法により酵母内で解析したところ、SLR1のC末側に存在するGRASドメインおよびGID2のGGF/LSLドメインが必須であることが明らかとなった。同様にしてSLR1とGID1の結合に必要なSLR1側の領域を解析したところ、GID1とGA依存的に結合することが知られているSLR1のDELLA/TVHYNPドメイン以外にもSLR1はGRAS ドメインを介してGID1と相互作用することが示された。我々の結果は、GA存在下でDELLA/TVHYNPドメインがGID1と結合するとGRASドメインがGID1と結合可能となり、この結合がGID2のGGF/LSLを介したSLR1の認識に不可欠であることを示唆している。本研究の一部は、文科省「ターゲットタンパク研究プログラム」の支援をうけて実施された。

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イネSLR1は、ジベレリン（GA）シグナル伝達の抑制因子として機能する。GAが受容体GID1に結合すると、GID2（Fボックスタンパク質）を介したSLR1の分解がおこり、その結果、GAシグナルの脱抑制が起きる。従って、受容体が壊れた変異体 (gid1) や、生合成変異体においては、強い矮性を示す個体ほどSLR1が蓄積する。一方、gid2変異体においては、gid1や生合成変異体に比較して多量のSLR1が蓄積しているにも関わらず、矮性度は弱い。今回、gid2変異体のこのような性質について詳細な検討を行ったので報告する。
gid2変異体において、遺伝的にGID1受容体を欠損させた場合や内性GA量を減らした場合、SLR1の蓄積量は減少し、矮性は強くなった。逆に、GA添加やGID1過剰発現体では、SLR1量が増加し、矮性度は減少した。このことは、gid2変異体には、GAとGID1に依存しSLR1の分解を必要としないGAシグナルが存在することを意味する。gid2変異体におけるGAシグナルの存在は、3つのGA応答遺伝子（GA-20酸化酵素遺伝子、GID1, SLR1）の、変異体における発現解析からも支持され、SLR1のGAによる正の制御が変異体におけるSLR1タンパク質の異常蓄積の原因であると結論した。本研究の一部は、文科省「ターゲットタンパク研究プログラム」の支援を受けた。

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ジベレリン（GA）は植物の生長や発達に関わる重要な植物ホルモンの一種である。GA応答はDELLAタンパク質と呼ばれる転写因子によって制御されており、細胞がGAシグナルを受容するとDELLAは速やかに分解され、GA応答遺伝子群の発現が変動する。DELLAの分解にはE3ユビキチンリガーゼSCF^SLY1が関わっており、DELLAはSCF^SLY1に認識、ユビキチン化され、プロテアソームによって分解される。最近発見されたGA受容体GID1はGA依存的にDELLAのN末端部位と結合し、DELLAとSCF^SLY1の相互作用を促進することが判明している。本研究ではGID1のGA依存的なDELLAタンパク質認識機構を構造レベルで解明するためにGA-GID1-DELLA複合体のX線結晶構造解析を行った。GA₃およびGA₄を用いた2種類のGA-GID1-DELLA複合体はそれぞれ1.8Åの分解能で決定され、両者の構造はほぼ同じであった。GA分子はGID1コアドメインにあるポケットに結合しており、GID1で高く保存されたN末端部位がGA結合ポケットを覆っていた。DELLAは保存されたDELLAおよびVHYNPモチーフがGID1との相互作用に関わっており、主にGID1のN末端部位と結合していた。この結果はGA受容によるGID1N末端部位の構造変化がGID1のDELLA認識に重要であることを示唆している。

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植物ホルモン・ジベレリン (GA) は発芽・伸長成長・開花時期を制御することが知られている。GA信号伝達において、植物固有のGRAS family に属するDELLAタンパク質は、核内で主要な抑制因子として機能し下流の信号伝達を抑制しているが、GAの添加にともない速やかに分解される。GAレセプター、SCF複合体の発見によりDELLAタンパク質の分解までの経路が明らかとなった。我々は、下流の信号伝達経路を明らかにする為、DELLAタンパク質（GAI,RGA）と相互作用する転写因子GAF1を単離した。GAF1過剰発現体は、開花時期の促進、胚軸の伸長、葉の展開といった表現型を示した。酵母、植物を用いたモデル実験において、GAF1は、塩基配列特異的な結合能を有する転写因子であり、GAF1単独では、それほど強い転写活性化能を示さず、GAIと相互作用することにより強い転写活性化能を有することを示した。また、BiFC解析により、植物細胞内においてGAF1とGAIの相互作用は、GA量依存的なGAIタンパク質の分解により、消失することがあきらかとなった。以上より、GAF1は、GA内生量の変化にともないGAF1複合体の構成を変えることによって、その転写活性化能を調節する可能性が示唆された。これらのモデル実験をもとに、GAF1の標的遺伝子の探索を行っている。

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ジベレリン（GA）は高等植物の発芽、茎部伸長、花芽形成などを制御する植物ホルモンである。RSGはタバコのbZIP型転写因子で、GA内生量調節に関与する。ドミナントネガティブ型のRSGを発現させた植物ではGA内生量が低下し、GA生合成酵素遺伝子NtGA20ox1（Ntc12）のフィードバック制御が阻害される。NtGA20ox1のプロモーター領域にはRSGの結合配列が存在する。GA内生量が低下すると、RSGはNtGA20ox1のプロモーターにin vivoにおいて結合することがクロマチン免疫沈降法により示された。RSGの機能制御にはカルシウム依存性タンパク質キナーゼや14-3-3が関与することを明らかにしてきたが、GA信号伝達において中心的な役割を果たすDELLAタンパク質との関連は不明であった。本研究ではシロイヌナズナのオルソログAtRSGによるGA生合成酵素遺伝子の転写調節の解析を目的とした。パーティクルガンを用いたトランジェントアッセイにより、GA 20-酸化酵素遺伝子（AtGA20ox1)の転写を活性化することが明らかになった。AtRSGが他のGA生合成酵素遺伝子の転写調節にも関与するかを、トランジェントアッセイにより調べた。また、GA信号伝達において核内で抑制因子として機能するDELLAタンパク質とAtRSGによるGA生合成酵素遺伝子群の転写制御の関連について解析した。

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ストリゴラクトンは、さまざまな植物の根から分泌され、根寄生雑草の種子発芽刺激物質として、また宿主植物に無機栄養を供給するアーバスキュラー菌根菌（AM菌）の菌糸分岐促進物質として作用する化合物である。最近、我々は、イネおよびシロイヌナズナの分枝過剰突然変異体を用いて、ストリゴラクトンが植物の分枝を抑制することを明らかにした。しかしながら、根圏シグナル物質であるストリゴラクトンがなぜ植物の分枝を抑制するのかよく分かっていない。ストリゴラクトンの生産量は無機栄養、特にリン酸が欠乏すると増加することが知られている。これは、AM菌を活性化させるための宿主植物の生存戦略であると考えられている。一方、貧栄養環境下で分枝を増やすことは植物にとってコストがかかる。したがって、ストリゴラクトンは、貧栄養環境において、AM菌の活性化と同時にその情報を地上部へ伝達して分枝を抑制し、無機栄養の利用を効率化させる役割を担っていると考えられる。そこで、貧栄養環境下のイネにおけるストリゴラクトンの生産量と分枝の頻度との関係を調査した。リン酸濃度の低下に伴うストリゴラクトン内生量の増加と、分枝抑制に相関が認められた。また、野生型の分枝が抑制される低リン酸環境においても、ストリゴラクトン欠損変異体の分枝は抑制されなかった。これは、ストリゴラクトンが栄養飢餓応答における植物の分枝制御に関与していることを示唆している。

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根から分泌されるストリゴラクトン(SL)は、根寄生植物の発芽およびアーバスキュラー菌根菌の菌糸分岐を誘導する宿主認識シグナルである。今回は、根分け法を用いてリン(P)がSLの生産・分泌に与える影響を検討した。ソルガムは播種から5日間は水道水で、その後5日間は1/2但野田中培地（160 μM P）で培養後に、低リン条件（8 μM P）に移行した。10日間馴化後に根を2等分して、片方の根は引き続き8 μM Pで培養し、もう片方の根は160 μM P培地で培養した。等分した両方の根を8 μM Pで培養した場合を対照区とした。24時間後に培養液を回収してSLの分泌量および根の含量を調べた。同じ個体の根を半分に分けて、一方を160 μM Pの培地で、他方を8 μM P培地で培養した場合、それぞれのSL分泌量に差は認められなかったが、両方の根を8 μM Pで培養した対照区の分泌量と比較すると大きく減少した。地下部のSL含量は、分泌量と同じ傾向であった。地下部のP含量は培地によって変動しなかったが、地上部のP含量は、片方の根を160 μM Pの培地で培養した場合に対照区に比べて増加した。以上のように、SLの生産・分泌はシステミックに制御されており、地上部のP濃度の上昇によって抑制されることが示唆された。

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シアノバクテリアSynechococcus elongatus PCC 7942において，多くの遺伝子の発現は24時間周期の概日リズムを示す。この遺伝子発現リズムはKaiA, KaiB, KaiCという3つの時計タンパク質が構成する化学振動子の出力として生み出される。現在までに，遺伝子発現リズムに異常の見られる様々な突然変異体が単離され，それらの原因遺伝子の機能解析が進んでいる。その中でも，sasA, rpaA, labAという3つの遺伝子は化学振動子が生み出す時間情報を遺伝子発現へ伝達する重要な出力系遺伝子である。化学振動子の時間情報は二成分制御系のセンサーキナーゼであるSasAとそのレスポンスレギュレーターであるRpaAを介した転写活性化経路と、LabAを介したKaiC量依存的転写抑制経路の2つの経路が時計遺伝子kaiBCのリズミックな転写調節に働くことが知られていた。しかし，labA/sasA二重破壊変異体においても、低振幅ながらkaiBC概日リズムがはっきりと確認できた。このことから，LabAとSasA以外の因子を介した転写出力経路の存在が示唆されていた。我々は新たな概日転写出力経路の同定に成功したので、本会で報告する。

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ルシフェラーゼレポーターは、プロモーター活性の概日リズムを測定する手段として多くの生物種で使われている。そこで私たちは、ルシフェラーゼレポーターを使って単細胞緑藻クラミドモナスの時計遺伝子のプロモーター活性をレポートする生物発光株の作製を試みた。
時計遺伝子ROC15およびROC75のプロモーター領域にコドンを最適化したホタルルシフェラーゼのコード配列を連結し、クラミドモナスの核ゲノムに遺伝子移入した。ROC15とROC75のmRNA量の概日リズムの位相は約8時間ずれているので、生物発光の位相も同じように8時間ずれると予想された。ところが驚くべきことに、ROC15レポーター株とROC75レポーター株の生物発光リズムは同じ位相で振動した。用いた時計遺伝子のプロモーター領域はルシフェラーゼレポーターの発現リズムに反映されていないのだろうか？ROC15およびROC75レポーター株のルシフェラーゼmRNA量の概日リズムを調べたところ、生物発光とは異なり明らかに8時間のリズム位相のずれが認められた。したがって、少なくともmRNAの蓄積の段階まではROC15、ROC75遺伝子の概日リズムを反映していることが解った。この結果からクラミドモナスでは,転写後にルシフェラーゼレポーターの生物発光リズムを調節する機構があることが示唆された。

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植物の概日時計の分子機構は、主にシロイヌナズナ、イネおよびウキクサといった被子植物を中心に研究されてきた。その一方で、シダ植物やコケ植物といった比較的原始的な種では、時計機構の解析はほとんど進んでいない。その為、植物における時計機構の多様性と進化はほとんどわかっていない。そこで我々は、基部陸上植物に属するコケ植物の一種ヒメツリガネゴケを用いて時計機構の解析を行ってきた。このコケのゲノムは、CCA1/LHYやPRR遺伝子群など、シロイヌナズナの時計遺伝子のホモログをかなりの数保有している。この発表では、コケのCCA1ホモログ遺伝子（PpCCA1aとPpCCA1b）について、機能解析を含め最近の解析結果を報告する。

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One core group of clock components in Arabidopsis that controls the pace of the central oscillator is comprised of five PRR proteins whose biochemical function in the clock remains unclear. The PRRs are related to Response Regulators (RRs) of His-Asp phospho-relay signal transduction systems. We have identified and characterized genes encoding PRR homologs from Physcomitrella (Designated as PpPRR1, PpPRR2, PpPRR3 and PpPRR4).
It should be noted that the Arabidopsis PRRs lack phospho-accepting aspartate
(D) residue.Instead, each pesudo-receiver has a glutamate (E) residue at this particular position. Interestingly, Physcomitrella PRR does not show this property, instead all PpPRRs retain the aspartate (D) at the potential phosphorylation site.
Expression of PpPRRs under DD, LL and LD conditions shows circadian, arrhythmic and diurnal pattern respectively. These data have allowed us to interpret how plant PRRs evolved during evolution.

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日周期（昼夜）や光周期（季節）などの環境変化に依存して生育する植物にとって、概日時計は重要な生体機能の一つである。最近になり、シロイヌナズナにおける研究から植物概日時計に関する理解が大きく進展した。その結果、高等植物は動物とは異なる固有の時計機構を進化させてきたことが明らかになった。現在では、シロイヌナズナ概日時計の振動機構に関して数理モデルが提唱され広く引用されている。そのモデルでは、CCA1/LHY-TOC1(core loop)ループに加えて、CCA1/LHY-PRR9/PRR7ループ(morning loop)と、Y-TOC1ループ(evening loop)の3つのフィードバックループが互いに相互作用することで機能していると考えられている。未同定のY遺伝子の候補としてはGIやPRR5が挙げられている。このモデルを検証する目的も含めて、我々は以前、morning loopが欠損したprr9 prr7二重変異体やコアループを失ったcca1 lhy toc1三重変異体を解析した。本研究では、evening loopが欠損したと考えられるgi toc1やgi prr5二重変異体、及び、morning loopとevening loopの両方の機能を欠損していると考えられるprr9 prr7 toc1三重変異体を解析した。それらの結果に基づいて、現在の時計モデルに関して考察したい。

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概日時計は植物の24時間周期の様々な生理活性リズムの生成に関与していることが知られている。概日時計が1日の明暗や温度サイクルに同調して機能することは、環境に応答した概日リズムの生成にとって重要である。ここ10年の間に、シロイヌナズナの時計関連因子が数多く同定されてきたが、同調性に関わる因子に関してはよくわかっていない。我々はTIMMING OF CAB2 EXPRESSION 1 (TOC1/PRR1)を含む疑似レスポンスレギュレーター（PRR）ファミリーの構成因子が、概日時計中心振動体として時計機構に密接に関わっていることを明らかにしてきた。本研究では、時計遺伝子CCA1, LHY, PRR9, PRR7, PRR5, TOC1遺伝子の多重変異体を用いて、明暗サイクル条件下での概日リズムに関して解析を行った。その結果、cca1-1, lhy1-1, toc1-2の3重変異体は、自由継続リズムに関しては消失するが、明暗サイクル条件下においては明瞭な概日リズムが観察された一方、prr9-10、prr7-11、prr5-11、toc1-2の四重変異体は、自由継続リズムだけでなく明暗や温度サイクル条件下においても概日リズムが消失していた。このことから、PRR9、PRR7、PRR5、TOC1は、概日時計が環境要因に応答して同調するために必要な要素であることが明らかになった。

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植物に見られる多くの現象が日周性（昼夜）や光周性（季節）に依存した周期性を示し、これらの機構に概日時計が関与している。特に光周性花成を説明する時計依存性モデルは有名である。また最近、シロイヌナズナ芽生えの胚軸伸長が日周変動を示すことが報告された。今回我々は、胚軸伸長が日周性だけでなく光周性制御も受けていることを見出し、この現象に概日時計が関与していることを報告する。
胚軸伸長が日長に単純に比例しているのではなく、ある閾値を超えた短日条件でのみ顕著に伸長が促進される現象を見出した。そこで、各種の時計変異体を駆使することで、短日条件の計測が時計に依存していることを示唆する結果を提示する。また、その分子機構を理解するために胚軸伸長促進因子（PIF4/5転写因子）の発現様式を各種変異体に関して検討した。その結果、明け方前におけるPIF4/5の高発現が胚軸伸長に重要であり、そのためにはPIF4/5の転写リズムと短日条件の符合（PIF4/5-Coincidence）が重要であるとこが示唆された。この機構は、光周性花成におけるCONSTANSの転写リズムと長日条件の符合（CO-Coincidence）モデルと類似している。これらから、シロイヌナズナの光周性胚軸伸長（成長）制御を説明する新規な時計依存性Coincidenceモデルを提案する。

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PSEUDO RESPONSE REGULATOR (PRR) 遺伝子群はシロイヌナズナの生物時計の機能に関わる。その中でもPRR9, PRR7, PRR5は重要であり、その三重機能欠損株prr9 prr7 prr5 (d975)は時計遺伝子の転写レベルの概日リズムが消失する。PRR9, PRR7, PRR5によるゲノムワイドな転写レベルの概日リズムの制御を見いだすため、我々は昼から夕(ZT8, ZT10, ZT12)においてd975のDNAアレイ解析 (Affymetrix ATH-1 GeneChip) を行った。野生型では’昼遺伝子’の発現は、夕方に向けて減少し、一方’夜遺伝子’の発現は増加した。d975ではそれら遺伝子の発現はほとんど一定であった。またd975では’昼遺伝子’の発現が野生株に比べて脱抑制されており、逆に’夜遺伝子’の発現が抑制されていた。つまりPRR9, PRR7, PRR5は’昼遺伝子’の抑制と’夜遺伝子’の誘導に関わる事が示唆された。d975で発現上昇していた遺伝子群は、低温ストレス誘導を受ける遺伝子群と有意な相関があり、さらにd975は低温ストレスに耐性を持つ事が分かった。これらの結果はPRR9, PRR7, PRR5が時計機構として、低温ストレス誘導性遺伝子群な間接的な制御に関わる事を示唆している。

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概日時計の適切な制御には、転写レベルでのリズム制御のみならず、タンパク質の分解や安定化を始めとした翻訳後修飾が非常に重要な役割を担うことが近年解明されつつある。シロイヌナズナの概日時計制御に関わるPSEUDO RESPONSE REGULATOR (PRR)ファミリーメンバー5つのうち、PRR1/TOC1(TIMING OF CAB EXPRESSION 1) とPRR5がE3ユビキチンリガーゼSCF^ZTLによる分解のターゲットとしてプロテアソーム経路により分解される。我々は、PRRファミリータンパク質がリン酸化を受け、そのレベルが概日振動を示すことを見出した。リン酸化レベルの高いTOC1とPRR5は、F-boxタンパクZTL(ZEITLUPE)とより強く相互作用を示す。また、TOC1とPRR3はin vivoで相互作用し、この相互作用には両タンパク質のリン酸化が必須であることが示された。また、PRR3と相互作用したTOC1はZTLと相互作用できず、これによりZTLによる分解を免れて安定化する可能性が示唆された。このように、TOC1, PRR3, PRR5のリズミックなリン酸化とそれによる相互作用の変化によりタンパク質の安定性が制御され、これが概日時計機構において重要である可能性を見出した。

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シロイヌナズナのトライコームは葉の表皮細胞から分化した単一の細胞からなる毛状構造体であり、細胞運命を決定するメカニズムの解明や、その転写制御ネットワークの研究に用いられてきた。二つの転写因子GL3とGL1は、トライコーム形成に必要とされることがわかっている。我々はGL3とGL1を中心とした転写制御ネットワークを明らかにすべく、二つの異なるアプローチによるゲノムワイドな解析を行った。一つは、マイクロアレイ解析による発現変化の調査である。我々は変異体に加えて、グルココルチコイド受容体を利用した機能誘導による計時的マイクロアレイ解析も行い、その結果少なくとも約500遺伝子がGL3およびGL1によって発現が制御されることがわかった。二つ目のアプローチでは、GL3およびGL1の標的遺伝子群を得るためにChIP-chip解析を行った。シロイヌナズナ全ゲノムをカバーしたタイリングアレイを用い、GL3およびGL1の標的遺伝子としてそれぞれ約700、約500遺伝子、共通の標的遺伝子は約20遺伝子にのぼった。それらはMYC1,SIAMESE,RBR1などトライコーム形成過程で関与が示唆されていたものも含まれていた。これら二つの異なるアプローチと共発現データを用いたクラスター解析をもとに、GL3とGL1を中心とした転写制御ネットワークを明らかにすることに成功した。

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アラビドプシスの EDM2 は、抵抗性遺伝子を介した耐病性獲得と、正常な発生に必要な因子である。EDM2 は、転写やエピジェネティック制御に関する因子に共通する特徴を持つが、これまでに知られているどんな転写制御因子にも属さない。私達は WNK タイプのタンパク質リン酸化酵素（WTK）が核内において EDM2 と相互作用し、EDM2 をリン酸化することを見出した。wtk 変異体では、耐病性の低下は見られないが、edm2 変異体様の発生異常を示す。このことから、EDM2 の機能は WTK により部分的に制御されていると考えられる。更に、EDM2 はクロマチン構造に影響を与え、複数の耐病性や発生制御に関与するタンパク質をコードする遺伝子の発現を制御していると思われる。私達は現在、EDM2 相互作用因子として同定した、いくつかのクロマチン構造変化に関連するタンパク質の in vivo での機能を明らかにすることにより、EDM2 を含んだ転写制御複合体の役割を理解し、その複合体がどのように耐病性や発生過程に必要な遺伝子群の発現を制御するのかを明らかにしようとしている。また、私達は耐病性と発生過程の制御の関連性にも興味を持ち、研究を進めている。

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ICE1は低温シグナル伝達系において最上流に位置する転写因子で、低温によるICE1の活性化がDREB1A/CBF3の発現誘導に重要である。しかし、低温によるICE1 の活性化に関する分子機構については明らかになっていない。これまでに、K393残基におけるICE1のSUMO化が低温シグナルの調節に重要であることを明らかにした。SUMO化はリン酸化により制御されているという報告があることから、本研究ではICE1のK393残基周辺のセリン・スレオニン残基がICE1の活性化に果たす役割を検討した。まず、K393残基周辺の6箇所のセリン・スレオニン残基をアラニン残基に置換したICE1の転写活性化能を測定した。その結果、6箇所のうち1つのセリン残基をアラニン残基に置換するとICE1の転写活性化能が野生型より上昇することが分かった。この置換体をシロイヌナズナで過剰発現させると、野生型ICE1過剰発現体より凍結耐性が向上した。本発表ではICE1の転写活性化機構についても考察する。

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ヒストンN末端の化学修飾に依存したクロマチン構造の変化は, 遺伝子の転写制御に関与している. 我々はこれまでに, シロイヌナズナの乾燥ストレス誘導性遺伝子領域において, 遺伝子発現とヒストン修飾の蓄積に相関があることを報告した¹⁾.
我々は, 植物におけるクロマチン動態変化を介した転写制御機構についてより詳細に調べるため, 乾燥-再吸水過程におけるストレス誘導性遺伝子領域の発現および抑制制御とヒストン修飾変化との関連について解析を進めている. まず, 乾燥-再吸水処理を施したシロイヌナズナ植物体を用いてタイリングアレイ解析を行い, 乾燥-再吸水過程において特徴的な発現パターンを示す遺伝子群の抽出を行った. これら遺伝子群のプロモーターおよびコーディング領域上における, 幾つかのヒストンメチル化およびアセチル化修飾について, 経時的な（無処理, 乾燥処理4時間, および乾燥処理4時間からの再吸水処理1-5時間）ヒストン修飾状態の変動を, クロマチン免疫沈降法を用いて検出した. 本発表では, ヒストンH3およびH4の修飾変化を中心に, ストレス誘導性遺伝子の発現および抑制制御とその領域におけるクロマチン状態の変化について議論したい.
¹⁾ Kim et al. (2008) Plant Cell Physiol.: 49: 1580-1588.

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タンパク質因子の生体内での機能解析のためには、その相互作用因子を知ることが重要である。現在、酵母を用いた2-hybrid systemがそれらの検出に広く用いられているが、転写因子はそれ自体で転写活性能を有するものが多く、そのため酵母系での検出が難しいと認識されている。そこで我々は、EAR転写抑制ドメイン(SRDX)のtransrepression作用を検出することでタンパク質間相互作用を確認出来る新たな系を開発した。我々は、任意のタンパク質因子にSRDXを融合させたキメラタンパク質を任意の転写因子と共発現させた場合、その因子が転写因子と相互作用する場合にはそのタンパク複合体は転写抑制複合体として働き、下流遺伝子の発現を抑制することを見出した。これまでにヘテロダイマーを形成することが報告されているヒトFOSおよびJUN転写因子、並びにMADS転写因子であるPIおよびAP3において、一方の転写因子にSRDXを融合してtransient assayを行った。その結果、明瞭なレポーター活性の抑制としてタンパク質－タンパク質相互作用を確認することができた。さらに、DNA結合ドメインを持たないWD40タンパクである、TTG1に関して、transient およびstableの両系で実験を行ったので、その結果も合わせて報告し、タンパク質間相互作用検出系における本システムの可能性を考察する。

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TFIIB とその相同蛋白質である BRF は、それぞれ RNA ポリメラーゼ II と RNA ポリメラーゼ III の転写開始に不可欠な基本転写因子である。しかし、菌類や動物を用いたこれまでの研究により、RNA ポリメラーゼ I（Pol I）に対応するTFIIB 型の転写因子は存在しない事が明らかになっている。最近、植物のゲノム解析や他の研究により、植物が TFIIB や BRF と異なる、第3の TFIIB 型転写因子 pBrp を持つ事が明らかにされたが、その機能についてはこれまで不明であった。
本研究では、モデル植物である単細胞性紅藻 Cyanidioschyzon merolae （シゾン）を主に用い、pBrp の機能解析を行った。その結果、pBrp が Pol I に特異的な TFIIB 型転写因子であり、リボソーム DNA (rDNA) の転写に正に関わる事が明らかになった。更に、シロイヌナズナにおいても、pBrp が rDNA の転写に関わる証拠を得た。これらの事から、pBrp は植物において一般に、 Pol I と共に rDNA の転写に関わる基本転写因子であると結論付けた [1]。これらの結果を元に、TFIIB 型転写因子の進化過程について考察する。
[1] Imamura et al., (2008) EMBO J 27: 2317-2327

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オオムギは根からクエン酸を分泌してアルミニウムを無毒化する機構を持っており、このクエン酸分泌に関与する遺伝子(HvAACT1)は最近我々によって同定された（Furukawa et al., 2007）。この遺伝子はアルミニウムによって発現が誘導されず、耐性品種は常に高発現をしており、HvAACT1タンパク質は根の表皮細胞に局在している。本研究ではHvAACT1の発現制御機構を明らかにするために、アルミニウム耐性の異なる品種を用いて3’-UTR及び5’-UTR の配列比較を行った。RACEを行った結果、3’-UTRにおいて品種間で配列の差が見られたが、アルミニウム耐性との関連が認められなかった。一方、5’-UTRを調べたところ、感受性品種はORFの上流約6kbpに転写開始点があり、3種類のスプライシングパターンを示した。耐性品種の場合、この転写開始点から始まるRNAは5種類のスプライシングパターンを持ち、これらの配列中には感受性品種に存在しない配列が含まれていた。耐性品種のゲノム解析により、この配列はORFの4.6kbp上流に挿入された約1kbpの特異的な配列に由来していることがわかった。また、耐性品種は特異配列上に複数の転写開始点が存在していた。これらの結果から特異配列がHvAACT1の耐性品種における高発現に関わっている可能性があり、現在プロモーター活性の測定などを行っている。

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三価鉄のキレーターであるムギネ酸類とその前駆体であるニコチアナミンは、植物体内の鉄の移行に関わっている。鉄の吸収・移行に関わる遺伝子の多くが、上流に鉄欠乏応答性シスエレメントIDE1、IDE2を持つ。本研究では、IDE2に特異的に結合する新規NAC型転写因子IDEF2を、yeast one-hybrid法によりイネから単離した(Ogo et al., JBC 2008)。IDEF2はIDE2の一部をコア配列として認識し、この配列はこれまで報告されたNAC型転写因子の結合配列とは異なった。興味深いことに、IDEF2はこのコア配列とは全く異なるCaMV35Sプロモーターの一部にも結合し、複数の結合配列を持つという性質を示した。IDEF2は根、茎葉ともに恒常的に発現していた。RNAi法とCRES-T法によりIDEF2の機能を抑制したイネは、鉄の体内分配に異常をきたした。RNAiイネでは、鉄の体内輸送に関わる鉄―ニコチアナミントランスポーター遺伝子OsYSL2を含むいくつかの鉄欠乏誘導性遺伝子の発現が抑制されていた。IDEF2がOsYSL2の上流に存在するIDEF2結合コア配列に結合することをin vitroで確認した。これらの結果から、IDEF2はIDE2と相互作用することにより遺伝子の発現を制御し、植物の鉄ホメオスタシスに重要な役割を果たしていることがわかった。

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遺伝子の発現は、転写因子がプロモーター領域のシスエレメントに特異的に結合することによって制御されている。従って遺伝子の発現制御を理解するためには、プロモーター中のシスエレメントを特定することが重要となる。そこで我々は、マイクロアレイ解析の結果を利用してin silicoでプロモーター配列中からシスエレメントを予測する、新規シスエレメント予測プログラム MAMA (Microarray Associated Motif Analysis program) を開発した。鉄欠乏イネの根を用いて行った44Kマイクロアレイ上の全ての遺伝子のプロモーターから、MAMAにより8塩基長内で鉄欠乏により誘導される遺伝子発現を付与する可能性の高いシスエレメントの候補を予測した。その結果、鉄欠乏応答を制御する転写因子IDEF1の結合コア配列CATGCを含む配列が2、4、5番目に、植物体内の鉄の分配に関与する転写因子IDEF2の結合コア配列CA(A/C)G(T/C)(T/C/A)(T/C/A)を含む配列が12番目に、鉄欠乏誘導性転写因子OsIRO2の結合コア配列CACGTGGの類似配列が10番目に予測された。これらの配列は、既存のシス予測プログラムでは予測されないか、あるいは大量の出力の中に埋もれていたものである。MAMAが機能的シスエレメントを予測するプログラムとして有効であることが示された。

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高CO₂環境に対する光合成生物の分子応答機構は緊急に解明すべき重要課題である．単細胞緑藻Chlamydomonas reinhardtii は，高CO₂条件において，ペリプラズム局在性の分子質量43 kDaのタンパク質（H43）遺伝子の転写を誘導する．本研究では，H43遺伝子発現制御機構を明らかにするため，高CO₂応答性シスエレメントの探索を試みた．まず，H43遺伝子の完全長cDNAを取得し，翻訳開始点の-68 bp上流に転写開始点を見い出した．その後，様々な長さのH43遺伝子上流配列を順次欠失させ，レポーター遺伝子aryl-sulfatase2に接続した系列を作製し，これを細胞に導入した．アリルスルファターゼ活性を指標としたスクリーニングにより，H43遺伝子の上流に，少なくとも2つの高CO₂誘導性シスエレメントがあることが見いだされた．それらは転写開始点から-151～-176 bpと， -657～-687 bp上流に位置していた．興味深いことに，後者の配列は，Volvox carteriのゲノム配列中に存在する3つのH43遺伝子ホモログの上流からも発見された．これは，H43遺伝子の発現制御機構が，種を超えて保存されている可能性を示唆するものである．

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Dof転写因子は植物特異的な転写因子であり、被子植物では様々な植物固有の生理機能への関与が示されている。植物機能の高度化とDof転写因子の機能の多様化の関係を調べるために、緑藻のクラミドモナスとコケ植物のヒメツリガネゴケのDof遺伝子の検索を行ったところ、クラミドモナスには1個（CrDof）、ヒメツリガネゴケには19個のDof遺伝子（PpDof1-19）が存在することがわかった。一方、紅藻のシアニディオシゾンと珪藻の1種Thalassiosira pseudonanaのゲノム上にはDof遺伝子が見つからなかった。このことからDof遺伝子の起源は緑藻と陸上植物の共通祖先に遡ると推定された。また、Dof遺伝子はCrDof、PpDof1-6及び被子植物のDof遺伝子を含むグループA、PpDof7-17遺伝子のみから成るグループB、PpDof18、19及び被子植物のDof遺伝子が属するグループCに分けられた。PpDof1-6のcDNAの塩基配列を決定したところ、これらは系統樹上でPpDof1と2、PpDof3と4、PpDof5と6の3つの組に分かれて独立したクレードを形成した。そこで、各遺伝子の一重変異体と、組をなす2つの遺伝子を破壊した二重変異体の作出を行った。その結果、PpDof1とPpDof2の二重変異体は野生型とは異なる生長の様子を示した。現在、更に詳細な表現型解析を行っている。

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染色体の高次構造は染色体の複製や組換え、近傍遺伝子の転写など、核内で行われる様々な事象に影響を及ぼしている。ハツカダイコンのグルタミン合成酵素をコードするGln1;1遺伝子は、ハツカダイコンゲノム上では非常にA/Tに富む領域に埋め込まれる形で存在しており、こうした構造がプロモーターの正常な発現制御に不可欠であることが形質転換シロイヌナズナを用いた研究から明らかになっている（第42回大会）。その後、Gln1;1遺伝子のプロモーターアッセイを継続して行ってきた結果、上記のA/Tリッチな構造領域がシロイヌナズナゲノム中に挿入されると、高い確率で形質転換体の形態異常を引き起こすことが示された。観察された異常は、茎頂分裂組織の消失や形態異常、分枝様式の異常、花や葉、茎の形態異常など多岐にわたっていたものの、いずれも細胞分裂の制御の攪乱が疑われた。また、異常の重篤度は挿入された構造領域のコピー数には相関を示さず、ゲノム上の挿入位置が形態異常の発生に関係する可能性が示唆された。こうした結果に基づき、現在はGln1;1遺伝子を含むA/Tリッチな領域が、シロイヌナズナのゲノム上にある何らかの機能領域近くに挿入された場合に、その働きと干渉を起こすことにより植物の形態異常を引き起こすのではないかと仮説を立て、研究を進めている。

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近年、植物のオルガネラRNAの部位特異的な切断、スプライシング、RNA編集や翻訳の制御にPPRタンパク質が関わっていることが明らかになってきた。PPRタンパク質はRNA結合能をもつPPRモチーフと機能未知の多様な保存配列モチーフをもつことが知られている。保存配列モチーフのひとつであるDYWドメインをもつPPRタンパク質がRNA編集酵素であろうという仮説が2007年にSaloneらによって提唱された。そこで我々はこの仮説を検証するため、先ずヒメツリガネゴケのミトコンドリアのRNA編集部位を調べ、11ヶ所のRNA編集部位を同定した。次にDYWドメインをもつPpPPR_71をコードする遺伝子を破壊した変異株を作製し、RNA編集への影響を調べた。その結果、この株ではミトコンドリアccmF mRNAのccmF-2部位のRNA編集が起こらないことを明らかにした。さらにPpPPR_71がccmF-2部位を含むRNAと特異的に結合することを、ゲルシフトアッセイにより明らかにした。これらの結果はPpPPR_71がccmF-2部位の認識因子であることを強く示唆している。DYWドメインがRNA編集酵素であるかどうかを調べるため、ミトコンドリアin vitro RNA編集系（Takenakaら, 2003年）に準じてPpPPR_71のRNA編集活性を調べたので、その結果も合わせて報告する。

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PPRタンパク質は、35アミノ酸からなるPPRモチーフを反復して持つタンパク質で、葉緑体およびミトコンドリアの遺伝子発現に関与する。高等植物オルガネラにおいてRNA編集は、RNA上のCをUへと変換するものであり、大規模に行われている。我々は、葉緑体のRNA編集にPPRタンパク質がトランス因子として働くことを明らかにした。しかしながら、編集反応を行う触媒因子の実体は未だ不明である。近年、いくつかのPPRタンパク質が持つDYWモチーフが、編集酵素の実体ではないかという仮説が提唱された。しかしながら、DYWモチーフを持つCRR2を欠損している変異株は、葉緑体RNA編集ではなくRNA切断に異常を示す。この矛盾も含めてDYWモチーフを持つPPRタンパク質（DYWサブクラス）の機能を明らかにするために、DYWサブクラスを欠損するcrr22、crr28変異株の解析を行った。その結果、crr22、crr28は特定の葉緑体RNA編集能を欠損していることが明らかになった。しかしながら、in vivoでCRR2のDYWモチーフは必須であるが、CRR22とCRR28のDYWモチーフは不要だった。また、CRR22とCRR28のDYWモチーフはCRR2のDYWモチーフと機能的に相補できないことがわかった。本発表では、得られた結果を基に、葉緑体におけるDYWサブクラスとRNA編集の進化的関係を議論したい。

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高等植物色素体ゲノムはT7ファージ型RNAポリメラーゼNEPと細菌型RNAポリメラーゼPEPによって転写される。色素体コードのaccDとrpo遺伝子群はNEPに絶対依存的に転写される。一方、光合成系遺伝子は主にPEPによって転写される。遺伝子発現は一義的には転写レベルで規定されるが、色素体内で、RNAのエディッティング・トリミング・スプライシングといった転写後調節が、機能性RNAや活性型タンパク質の適切かつ十分な発現に重要である場合が多い。ATTED-IIデータベースを利用し、シロイヌナズナの主要なNEPであるRPOTpの発現様式ともっとも高い相関性を示す遺伝子を検索したところ、PPRタンパク質をコードする遺伝子がみつかり、PPRTpと名づけた。pprTp変異株は強いアルビノ表現型を示し、地上部の形態形成の異常も観察された。この変異株ではrpo遺伝子群のRNAエディッティングは正常に起こっていたが、accD遺伝子のRNAエディッティングが起こらなくなっていることが明らかになった。またそのほかの色素体遺伝子やタンパク質の発現への影響も様々であった。これらのデータからaccD mRNAのRNAエディッティングを介したPPRTpの生理・分子機能について議論する。

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NEPは色素体で機能する2つのヘテロ転写系の内のひとつでT7ファージ型RNAポリメラーゼである。シロイヌナズナは核にコードされたRPOTmp (RPOT;2)と RPOTp (RPOT;3) の2つのNEPをもっている。このうちRPOTmpはおそらく葉緑体とミトコンドリアの両方に局在することや、根の発達やrrn16のプロモーターの一つを活性化しているらしいことが示されている。しかしその機能の分子レベルでの詳細にはまだ不明な点が多い。我々はRPOTmpの直接的あるいは間接的機能として、tRNAやリボソームを含む翻訳装置の発現に着目している。本研究では、rpoTmp欠損変異株について (1) 核コード、色素体コード両方の色素体翻訳システム遺伝子のノザン解析やQPCR解析、(2) 精製葉緑体によるポリソーム解析、(3) 強光や葉緑体機能に影響する各種試薬に対するストレス応答、(4) 色素体DNA含量の定量、を行った。これらの結果から、RPOTmpnoの色素体翻訳システム発現への関与について議論する。

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葉緑体の起源は原始シアノバクテリアによる細胞内共生であると考えられており、共生に由来する独自のゲノムとその遺伝子発現システムを継承している。しかしながら、共生当初の自律性はその後の長い年月を経る中で徐々に失われ、それに代わって様々な制御系は細胞核による支配を強く受けるようになった。本研究で用いた単細胞紅藻Cyanidioschyzon merolae（シゾン）はそのゲノム構造や転写制御システムに多くの原始的な特徴が見られ、高等植物と比較してより自律的な遺伝子発現制御がなされているものと予想される。我々は、単離葉緑体を用いたRun-on転写系とクロマチン免疫沈降法（ChIP法）を展開し、光に自律応答した一群の光合成遺伝子の転写制御には、シゾンに唯一残されているヒスチジンキナーゼ（HIK）と葉緑体ゲノムにコードされているレスポンスレギュレーターの1つであるYcf27から構成される二成分制御系が関与することを明らかにした。また、光合成電子伝達阻害剤を用いた解析の結果、この転写制御にはプラストキノンの酸化還元状態に依存したレドックス制御は関与しない可能性が示唆された。HIKの構造的進化に関する知見も踏まえ、シゾン葉緑体における光に応答した転写制御のメカニズムについて考察する。

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プラスチドDNA （ptDNA）の複製はプラスチドの半自律的な自己増殖に必須であるが、その機構はほとんど明らかにされていない。本研究では陸上植物の間で高度に保存された遺伝子構成のptDNAをもつ苔類ゼニゴケ培養細胞を材料に、ptDNAの複製様式とシス配列の解析を行った。ゼニゴケ培養細胞は増殖が旺盛であるとともにプラスチド形質転換が可能であり、網羅的な複製中間体の解析に適している。アガロースゲル二次元電気泳動法により複製中間体の形状をptDNA全領域について解析したところ、バブル型の複製中間体は検出されなかった。これはptDNA上には定位置で恒常的に機能している複製起点が存在しないことを示唆した。また、逆位反復配列（IR）と小単一コピー（SSC）領域の境界において、rRNAオペロンの転写方向とは逆向きにIR内へ進行してきた複製フォークの蓄積と、それに伴う相同組換え中間体を見出した。複製フォークが蓄積している領域を薬剤耐性遺伝子で置換した組換え型ptDNAでは、複製フォークの蓄積とそれに伴う相同組換え中間体が消失した。これは、この領域に複製フォークの障壁もしくは相同組換え部位として機能するシス配列が存在することを示唆している。この複製フォーク障壁が相同組換えを介したptDNAの複製制御や、rRNAオペロンの転写装置と複製装置の衝突防止に機能する可能性について議論する。

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これまで私達は葉緑体ストロマ成分の一部が小胞RCBとして葉緑体から切り離されオートファジーにより液胞に輸送分解されることを明らかにした。オートファジーは炭素や窒素飢餓時に特に誘導されると考えられている。RCBは老化段階の葉でより多く形成されるが、栄養環境との関係は分かっていない。本研究では切離した老化葉において栄養環境がRCB形成に及ぼす影響を解析した。RCBは切離葉を暗所下、飢餓条件でコンカナマイシンAを加えインキュベートすることで液胞に蓄積する。インキュベート時にスクロースを含むMS培地成分を添加するとRCB形成は著しく抑制された。詳細に解析すると、その抑制を引き起こす主成分はスクロースであった。またインキュベート時に光を照射することでもRCB形成は抑制されたが、DCMUの添加でその抑制は起こらなかった。葉の糖含量を調べると、可溶性糖、デンプンが光照射下では共に蓄積しており、暗所下では共に減少していた。以上の結果から葉の糖含量がRCB形成を制御する一つの要因になっていることが示唆された。次にインキュベート環境がRCBを含むオートファゴソーム全体の形成に及ぼす影響を解析した。その結果、光照射はRCB形成を抑制するが、葉緑体以外の成分を含む他のオートファゴソーム形成は抑制しないことが分かった。この結果はRCB形成を特異的に制御するオートファジー機構が存在することを示唆している。

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葉の老化過程において、葉緑体タンパク質は主要なリサイクル窒素源として分解され、新規合成器官へと転流される。その際、葉緑体そのもののサイズが縮小し、さらに数が減少していくことが知られている。オートファジーは細胞質やオルガネラのバルクな分解系として知られるが、その葉緑体分解への関与を遺伝学的に示した報告はなかった。最近、私たちは葉緑体由来の小胞RCBが、オートファジーによって液胞へ輸送されることを明らかにした。本研究では、オートファジーによる葉緑体の分解経路についてさらに詳細に解析した。
野生体とオートファジー欠損変異体シロイヌナズナを用い、短期間で明確に葉緑体分解を解析するための一老化モデルとして、個別に暗処理した葉で誘導される老化において、暗処理葉の葉緑体数、サイズの計測を行った。その結果、5日間の処理中、野生体では葉緑体数とサイズが処理前より有意に減少したのに対し、オートファジー変異体では、葉緑体数の減少はなく、サイズも処理後一日目以降一定となった。さらに、野生体の液胞には、多数のRCBが検出されると同時に、葉緑体そのものの局在が生葉の細胞中で直接的に確認された。以上の結果は、葉緑体が小胞RCBとして「部分的に」また、「丸ごと」オートファジーにより液胞へ輸送、分解される2つの経路が存在することを示した。

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フィトクロムは植物の主要な光受容体の1つである。フィトクロムを介する光シグナル伝達経路を解明するため、本研究では苔類ゼニゴケを用いた。ゼニゴケは基部陸上植物であり、アグロバクテリウムを介した形質転換系が確立されている。これまでにゼニゴケフィトクロム遺伝子（MpPHY）を単離し、Mpphyが一分子種しか存在しないこと、光可逆性を備えたフィトクロム分子であること、さらにMpphyのTyr²⁴¹残基をHis残基に置換したMpphyY241Hが光可逆性を失うことを示した。今回、MpphyY241H発現株およびRNAiによるMpphyノックダウン株を用いて赤色光応答表現型の探索を行うことで、Mpphyのin vivoでの機能解析を行った。野生株において胞子発芽後の伸長生長阻害および細胞分裂促進、仮根の形成、葉状体切断面における再生が赤色光に依存し、その効果が遠赤色光により打ち消されることを見出した。一方、MpPHYY241H全長をCaMV35Sプロモーターで発現させた株は、暗黒下でも仮根を形成し、葉状体を再生した。Mpphyノックダウン株は野生株とは異なり、遠赤色光非依存的に生殖生長相に移行した。このように、苔類ゼニゴケがフィトクロムを介する明確な光応答を有することから、赤色光信号伝達解明のモデルとして有効であることが期待される。

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bHLH型の転写因子であるPHYTOCHROME INTERACTING FACTOR 3 (PIF3) は、phytochrome B(phyB)の活性型特異的に相互作用する。本研究では、この相互作用に必要なphyB分子内の領域を特定するために、phyBのN末端領域内の変異を解析した。
まず、PIF3との相互作用を低下させるようなphyBのN末端領域内の変異をYeast Two Hybridシステムの変法によりスクリーニングした。このスクリーニングで得られた変異と、我々が以前に単離した、シロイヌナズナの赤色光応答を低下させるような変異を合わせた、15個の変異がPIF3との相互作用を低下させる事を確認した。これらの分光学的特性への影響を調べたところ、これら15個の変異は1）分光学的特性に異常がみられる変異（11個）、2）分光学的特性に異常がみられないにも関わらずPIF3との相互作用を低下させる変異（4個）、の二つに分類された。この内、後者はPIF3との相互作用に直接的に関わると考えられる。
既に結晶構造が明らかにされているBphPとphyBの配列を比較すると、2）に分類される4個の変異のうち3個が、PASドメインとGAFドメインの間の結び目構造の表面に見つかった。この事から、これら3個の変異が見つかったアミノ酸残基がPIF3との相互作用に直接的に関わっている事が示唆された。

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植物の芽生えは、重力と光を認識して生長方向を決定する。興味深いことに、芽生えは青色光に対して強い光屈性を示すが赤色光には重力屈性阻害を示す。光屈性は主にフォトトロピン (phot1, phot2)により制御され、重力屈性阻害はフィトクロム (主にphyA, phyB)により制御される。
PKS1はphyA、Bの相互作用因子として単離されたタンパク質である。これまでに我々は、シロイヌナズナPKSは4つの分子種（PKS1-4）が存在し、pks変異体は低青色光の光屈性に異常を示すこと、さらにPKS1はphot1と相互作用することを明らかにした。本研究で我々はpks変異体の屈性反応ついて詳細に解析を行った。まず野生型の芽生えの生長方向を90度転換させ、赤色光の重力屈性への影響を観察した。その結果、芽生えの赤色光に対する反応は、重力屈性の阻害ではなく別の応答によって重力屈性阻害のように観察されることが分かった。そしてPKS1とPKS4はこの未知応答に重要であることが分かった。次にphot1pksとphyApksの変異体を用いてphot1依存の光屈性を調べた結果、PKS1、PKS4は主にphot1依存の経路で重要であることが分かった。phyAは青色光によっても活性化されることから、PKS1とPKS4は低青色光条件下でphyA、phot1依存の両屈性反応経路に関与することが示唆された。

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トウモロコシ幼葉鞘などの光屈性の光量反応曲線の解析によって、パルス照射によって誘導される1次光屈性と2次光屈性、および照射時間に依存して反応が増大する時間依存光屈性（全て正の光屈性）が同定されている(Iino, 1990)。本研究では、イネ幼葉鞘を用いて光量反応曲線を解析し、フォトトロピン信号伝達系との関係を調べた。イネ幼葉鞘の光屈性はトウモロコシ幼葉鞘などに比較すると弱いため、パルス照射による光屈性の解析が困難であった(Neumann and Iino, 1997)。今回、重力屈性が低下したlazy1突然変異体(Yoshihara and Iino, 2007)を用いることによって、パルス照射による反応を含めた光量反応曲線の解析を達成した。その結果、1次光屈性、2次光屈性、時間依存光屈性がトウモロコシ同様に誘導されることが明らかになった。更に、1次光屈性よりも低光量のパルスで誘導される光屈性を新たに同定した。lazy1突然変異体とcpt1突然変異体(Haga et al., 2005)などを交配して作出した2重突然変異体を用いることによって、光量反応曲線で分離される反応は全てフォトトロピン信号伝達系に依存することが明らかになった。この結果から、光屈性の光量反応曲線に見られる多相性は、複数の光受容体の関与ではなく、フォトトロピン信号伝達系の複雑性を反映していることが示された。

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フォトトロピン（phot）は青色光受容体の一つで、光屈性、葉緑体定位、気孔の開口などの光情報受容を担っている。シロイヌナズナは、phot1とphot2の二種類のホモログを持っており、phot1は弱光から中高強光域、phot2は強光域の光センサーとして働く。phot分子は、N末側にFMN（フラビンモノヌクレオチド）を1分子非共有的に結合するLOVドメインを二つ（LOV1、LOV2）とC末側にSer/Thrキナーゼドメインを持ち、光により活性制御されるタンパク質キナーゼの機能を持つと考えられている。キナーゼ活性の光制御においてはLOV2ドメインが主要な役割を果たすことが示されている。これまでのLOVドメイン光反応の研究から、FMNの光反応およびタンパク質部分の構造変化に重要と考えられるアミノ酸が幾つか報告されている。本研究ではそれらの中で、分子動力学計算から発色団FMNのリン酸基との相互作用が重要であると考えられるArgのLysへの置換、FTIRから光反応は起こるがその後の二次構造変化が起こらなくなることが報告されているGlnのLeuへの置換、の二つの変異をシロイヌナズナphot2のLOV1あるいは LOV2の一方、またはLOV1とLOV2両方に導入した変異体を作出し、これら変異体の光屈性、葉緑体逃避運動を調べ、LOV2ドメインへの変異導入がこれらの反応に影響を及ぼすという結果を得た。

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葉緑体の細胞内の配置は、光環境に応じて変化することが知られている。葉緑体は、細胞内で、弱光に集まり強光から逃げる。これらは、それぞれ集合および逃避反応と呼ばれ、光合成の効率化や葉緑体のダメージの軽減に重要であると報告されている。我々の研究室では、シロイヌナズナ変異体の大規模探索によって、葉緑体光定位運動に関わる遺伝子を明らかにしてきた。本研究では、2つの新規変異体web1とweb2およびその原因遺伝子について報告する。web1とweb2は、逃避反応に異常がある変異体として単離された。その後の解析により、web1とweb2は葉緑体の運動速度が遅い変異体とわかった。マップベースクローニングによって、coiled-coil領域をコードしたWEB1およびWEB2遺伝子が原因遺伝子として同定された。WEB1とWEB2は、組織特異的発現パターンおよびコードされたcoiled-coil領域の頻出パターンが酷似していた。酵母2ハイブリッド法によってWEB1とWEB2が結合することもわかった。GFP融合タンパク質を用いた解析では、WEB1は主に細胞膜付近に局在し、わずかに細胞質にも局在した。WEB2は細胞質のみに局在した。BiFC解析によって、両者の結合が細胞質で確認された。以上の結果から、細胞質に局在するWEB1-WEB2複合体が葉緑体の運動速度を制御すると示唆された。

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植物ホルモンであるアブシジン酸（ABA）は、青色光による気孔開口を阻害することで速やかに気孔を閉鎖させ、乾燥ストレス下における植物体からの水分の損失を防いでいる。しかしながら、ABAが気孔開口を阻害する詳しい機構については不明である。本研究では、ABAのセカンドメッセンジャーであるホスファチジン酸（PA）による青色光情報伝達の阻害について報告する。ソラマメ表皮および孔辺細胞プロトプラストにPAを添加すると、青色光に応答した気孔開口および気孔開口の駆動力となるH⁺放出が阻害された。PAの生成阻害剤である1-ブタノールをあらかじめ添加しておくと、ABAによる青色光に応答した気孔開口とH⁺放出の阻害が部分的に回復した。さらに、PAは青色光受容体フォトトロピンの自己リン酸化には影響を与えず、細胞膜H⁺-ATPaseのリン酸化を阻害したことから、PAはフォトトロピンとH⁺-ATPaseをつなぐ情報伝達を阻害することが考えられた。そこで、PAが青色光情報伝達のポジティブレギュレーターであるプロテインホスファターゼ1（PP1）に与える影響について調べたところ、PAはPP1と結合しそのホスファターゼ活性を低下させることが分かった。以上の結果から、ABAはPAを介して青色光情報伝達を阻害すること、またPP1がABAによる開口阻害の標的因子となる可能性が示唆された。

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青色光受容体フォトトロピンは、光屈性、葉緑体光定位運動、気孔開口、葉の横伸展等の光受容体として機能することが知られている。青色光による気孔開口において、孔辺細胞で発現するフォトトロピンに受容された光シグナルは、最終的に細胞膜H⁺-ATPaseを活性化することにより、気孔開口の駆動力を形成することがわかっているが、フォトトロピンから細胞膜H⁺-ATPaseに至る細胞内シグナル伝達については、不明の部分が多い。
本研究では、EMS処理したフォトトロピン2重変異体を用いて、葉の横伸展と気孔開度を指標にスクリーニングを行い、気孔が顕著に開口している抑制変異体の単離を行った。単離した変異体のうち、scs1（suppressor for closed stomata phenotype in phot1 phot2）と名付けた変異体は、明暗条件下で常に気孔が開口していたが、アブシジン酸に対しては感受性が見られた。また、孔辺細胞プロトプラストにおける細胞膜H⁺-ATPaseのリン酸化状態及び活性を調べた結果、この変異体のH⁺-ATPaseは常に活性化された状態であった。マッピングにより原因遺伝子の同定進めた結果、scs1変異体の原因遺伝子は、花成制御に関わることが知られているELF3であることが明らかとなった。現在、ELF3の孔辺細胞における働きについて解析を進めている。

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Synechococcus elongatus PCC 7942 株のグリコーゲン生合成代謝変異株を用いたこれまでの解析から、貯蔵多糖の蓄積が塩ストレスや酸化ストレス環境下での生育に重要であることが明らかとなった。本研究ではホスホリラーゼ（glgP）および α-1,4-グルカン転移酵素（malQ）変異株を新たに作製し、既に報告した枝切り酵素（glgX）変異株と併せ、多糖代謝能に関して解析を行った。
野生株粗抽出液において検出される GlgP、MalQ の活性は、各変異株でそれぞれ特異的に消失していた。またアミロペクチンを含む非変性ゲル電気泳動活性染色法におけるバンドパターンの差異に基づいて GlgP、MalQ に対応するバンドを特定することができた。
野生株において細胞あたりのグリコーゲン含量は一定値を維持しており、明暗周期（12 h/12 h）の暗期ではグリコーゲンの分解はほとんど認められなかった。これに対し、連続暗下、塩ストレス条件（0.2 M NaCl）下ではグリコーゲンの分解が顕著に促進された。そして同条件下において、glgP、glgX、malQ 変異株ではグリコーゲン分解活性が著しく低下していることが見出された。以上の結果から、シアノバクテリアの貯蔵多糖分解代謝において GlgP、GlgX、MalQ が重要な役割を担っていることが強く示唆された。

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The cyanobacterial genomes contain two homologues of the groEL gene, groEL1 and groEL2. The groEL1 gene forms an operon with groES whereas groEL2 is not accompanied by groES. Plant chloroplasts also possess two types of Cpn60 which are GroEL homologues, known to form a hetero-oligomeric assembly. The present study is being conducted to unveil whether the cyanobacterial GroELs can also show a hetero-oligomeric assembly. Native polyacrylamide gel electrophoresis showed that in Synechococcus elongatus PCC 7942, unlike in E. coli, GroEL1 and GroEL2 do not form a tetradecamer.. In vitro the cyanobacterial GroEL1 formed smaller oligomers such as a heptamer, while GroEL2 formed only a trimer. To investigate hetero-oligomeric interaction, a pull-down assay was conducted using Thermosynechococcus elongatus His-GroEL1 and S.vulcanus GroEL1 or GroEL2. The His-GroEL1 formed a hetero-oligomer with the GroEL2. The distinct in vitro properties of the cyanobacterial oligomers implicate physiological significance which may be required under environmental stress.

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Non-coding RNA (以下ncRNA)はさまざまな遺伝子発現調節を行っている。大腸菌では網羅的解析により80以上のncRNAが同定されているが、光合成を行う原核生物ではあまり解析が進んでいない。多くのncRNA遺伝子が遺伝子間領域に存在することから、新規のncRNAを探索することを目的として4種の淡水性ラン藻ゲノムの遺伝子間領域の相同性検索を行った。その結果、3カ所の相同性の高い領域を見い出した。1つはguaBとtrxA遺伝子間領域に存在するRNA遺伝子yfr1で、yfr1欠損株は多くのストレスに過敏になることを報告した(Nakamura et al. PCP 2007)。本発表では2カ所の領域syc0182の下流とsyc0894の下流について報告する。前者の領域には120ntの低分子RNAが検出された。後者の領域は50Sリボソームタンパク質をコードするrplKAJLオペロンの下流であり、65ntの安定なRNAが発現している。高い相同性を示したSynechocystis PCC 6803のsll0185とslr0199の遺伝子間領域にも65ntのRNAが発現していることを確認した。2つのRNAのコアな相同配列を利用し両ラン藻ゲノムを再検索すると複数の候補が得られ、ncRNAの遺伝子ファミリーを形成していると考えられる。さらに詳しい発現解析を行ったので報告する。

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ラン藻には、光合成細菌・化学合成細菌のcbbオペロン転写因子CbbRのホモログが複数存在する。Synechococcus elongatus strain PCC7942のCbbRホモログの1つであるCmpRは、高親和性ABC型HCO₃^-トランスポーターBCT1をコードするcmpABCDオペロンの低CO₂条件に応答した誘導に関与し、そのcmpA上流領域中の発現制御領域への結合は2-ホスホグリコール酸（2-PG）により促進される。2-PGは低CO₂条件で細胞内濃度が上昇すると考えられる分子である。一方で、高親和性CO₂取り込み機構NDH-I₃をコードするndhF3D3chpY（ndhF3オペロン）に対しては、CmpRは高CO₂条件における抑制因子として働くことがマイクロアレイ解析の結果から推定された。ndhF3の上流にはCbbRホモログに特徴的な結合認識配列が存在しなかったが、ゲルシフト解析によりCmpRがndhF3の転写開始点付近に結合することが示された。ndhF3転写開始点付近へのCmpRの結合は2-PGを必要としなかったが、2-PGを添加すると、より上流側に新たなCmpR結合サイトが現れた。これらの結果より、ndhF3オペロンの低CO₂応答機構として、2-PGを介したCmpRの結合部位の切り替えによる転写制御機構の存在が推定された。

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psaABは光化学系I反応中心をコードする重要な遺伝子であり、シアノバクテリアの環境応答における主要な調節対象のひとつである。既に我々はSynechocystis sp. PCC 6803においてRrf2型転写因子Slr0846がpsaAB遺伝子の発現に関わることを報告している。一方、強光応答に関わるOmpR型レスポンスレギュレーターRpaB (Ycf27, Rre26)もまたpsaAB遺伝子のプロモーター領域へ結合することが明らかとなってきた。一方、RpaBと高い相同性をもつRpaA (Ycf27, Rre31)もまた光化学系への影響が示唆されてきたが、直接的な制御の標的となる遺伝子はみつかっていなかった。本研究では大腸菌から発現・精製したHis-RpaAを用い、psaABのプロモーター領域に対するゲルシフトアッセイおよびDNaseI フットプリントアッセイを試みた。その結果、psaAB遺伝子の上流の3ヶ所のRpaB結合領域のうち1ヶ所に比較的高い親和性で結合することがわかった。しかし、His-RpaBと比較するとDNAに対する結合は弱い。これらのことからRpaAはRpaBと似て非なる配列を認識し、転写調節に関与している可能性がある。現在、破壊株および過剰発現株を作製し、in vivoにおいてpsaAB遺伝子の転写に及ぼす影響を調べている。

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シアノバクテリアの3つの時計タンパク質KaiA、KaiB、KaiCとATPにより、概日時計再構成系が構築された。これは時間を発振するメカニズムがタンパク質の生化学的性質により説明可能であることを意味する。概日時計は、24時間周期で振動すること、温度が変化しても周期は変化しないという温度補償性など固有の特徴をもつ。KaiCのATPase活性は温度非依存的であり概日時計の温度補償性の基盤となる。さらにKaiC周期変異タンパク質を用いたATPase活性の解析により、ATPase活性が概日時計の速度を決めていることが明らかになった。今回、非リン酸化模倣変異体であるKaiC-AA(S431A/T432A)のATPase活性が野生型よりも高く、特にKaiA存在下においては野生型の約20倍に上昇することを見出した。さらに興味深いことに、KaiA存在下においてこの活性は一般的な酵素活性と同様に温度依存性を示すことが明らかになった。KaiCは各プロトマーの境界にATPが結合することで六量体を形成し、またリン酸化部位は結合したATP近傍に位置することが結晶構造解析より明らかになっている。そのため、ATP加水分解反応は構造変化やリン酸化と深く結びついていることが推察される。野生型およびKaiC-AAの構造変化解析と併せ概日時計の性質の基盤となるメカニズムを考察する。

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