胎盤は、胎生に必要なシグナルと栄養の供給を行う胚外組織である。ラットは、胚盤胞細胞の子宮内への浸潤、血管の著しい再構築により特徴づけられる血絨毛性胎盤を形成するが、その形成様式には系統間の違いが明確に見られる。Holtzman-Sprague Dawley、Fischer 344およびDahl SS (DSS)はよく発達したjunctional zoneや胚盤胞細胞の広範な浸潤を伴う胎盤を形成するが、Brown Norway (BN) ラットの胎盤形成はより限定的である。胎盤形成の系統特異性は、その構造的特徴あるいは遺伝子の発現特性により定量化する事ができる。本研究では、これら定量的な特質を用いて染色体置換近交系ラットを解析し、胎盤形成の制御における遺伝的機構の解明を試みた。染色体置換ラット系統は、BN由来の染色体をDSSに移入することにより作出されており、我々はこれら２１の染色体置換系統（２０の常染色体とX染色体）と、親系統DSSおよびBNについて解析した。雌ラットは同系統の雄と交配後、妊娠１８日にその胎盤形成部位が組織的および生　化学的解析に供された。染色体置換ラット系統間において、産子数、胎盤および胎児重量の違いは見られなかった。親系統の遺伝子発現プロファイリングの結果、junctional zone (JZ)におけるPLP-Lの発現が系統特異的である事が示された。そこで、染色体置換系統間のJZにおけるPLP-L発現プロファイリングを検証した。その結果、BN由来の１７番染色体がDSSに移入されたDSS-BN17におけるPLP-Lの発現量は、DSSと異なりBNにより近い事が明らかとなった。さらに、DSS-BN17におけるPLP-L　mRNAの発現局在はBNに見られるそれと同様であった。これらの結果から、我々は胎盤形成における制御情報として１７番染色体を同定したが、今後はDSS-BN17からの遺伝子置換系統の作出、さらには胎盤形成を制御する遺伝子座の同定が期待される。

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【目的】近年、遺伝子発現検出技術の向上により妊娠初期のウシ末梢血白血球（PBL）における特異分子の検出が可能となってきている。その遺伝子発現を指標に妊娠状態に関連する分子を特定する試みがなされているが、未だ不明の部分が多く特異分子の特定には至っていない。生体内での各白血球画分の機能は様々であり、遺伝子発現レベルでも異なる特徴を有していると考えられる。本研究では、ウシPBLにおいて妊娠に関連する遺伝子発現の主体を担っている画分を突き止めるため、各白血球画分における遺伝子発現動態を検証した。【方法】黒毛和種牛を用い、人工授精日を妊娠0日（D0）としてD0、7、14、21に頚静脈より採血した。比重遠心により分離したバフィーコート部分より白血球を採取、溶血処理したものを解析試料とした。セルソーターを用い、死細胞を除くすべての細胞（all）、顆粒球（G）、単球（M）、リンパ球（L）を分取し、RNAを抽出した。ISG15、Mx1、Mx2、OAS-1についてリアルタイムRT-PCRを行い、各画分における遺伝子発現量の変化を調べた。また血漿プロジェステロン濃度を時間分解蛍光法により確認した。対象として、発情周期を通じて同様に採血したものを解析した。【結果】ウシの白血球は、フローサイトメトリーにおけるスキャッター解析により、G、M、L画分の分取が可能であった。画分中の4遺伝子すべてについて、発情周期を通して発現量の有意な変化が見られなかったが、妊娠初期にはD0と比較して有意な増加が認められた。また、all、M、LにおいてはD21以降に初めて有意差が認められ、GではD14から有意な変化を認めた。Gでの遺伝子発現はD7以降において他の3画分と比較して高かった。これらのことから、妊娠初期のウシPBLにおいて発現が増加すると報告されている遺伝子の発現の主体を担っているのは顆粒球であると考えられる。それ故、妊娠初期ウシ末梢血中の顆粒球における遺伝子発現の変動は妊娠に関連して発現する特異分子の状態を反映すると推察された。

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【目的】排卵様式を知ることは、その種の繁殖生理を正確に理解する上でも、また希少種の飼育下繁殖計画を進める上でも重要である。例えば、イエネコは交尾排卵動物であるが、個体によっては飼育環境等により稀に自然排卵することが報告されている。野生ネコ科動物も同様であると考えられているが、報告例が少なく不明な点が多い。排卵調査には、定期的に超音波等で卵巣検査を行うか、頻回採血からLHサージを捉える方法があるが、これらの方法を野生種に適用するのはほぼ不可能である。そこで本研究では、糞中の卵巣ステロイドホルモン代謝物の動態と性行動の観察から排卵状況を間接的に調査した。また、本法の妊娠判定への有用性についても検討した。【方法】動物園飼育下のトラ18頭（アムール、ベンガル、スマトラの各亜種含む）から糞を週1～3回採取し、凍結乾燥後にステロイドホルモン代謝物をメタノールにて抽出後、卵胞活動の指標としてエストラジオール-17β（E）またはアンドロステンジオン（AD）、黄体活動の指標としてプロゲステロン（P）含量を酵素免疫測定法により定量した。また、内2頭で採血を行い、血中P濃度を測定した。【結果】血中と糞中の各P動態を比較した結果、類似した変動傾向が確認でき、両値間に高い正の相関（r＝0.95，n＝61）が認められた。発情期中に雄からの乗駕や交尾行動がみられた個体では、その翌日には発情兆候が消失しP値が上昇した。非妊娠時のP上昇期間は46.6 ±1.6日間（34例）であったのに対し、妊娠した場合には、妊娠期間である104.3日間（4例）高値が維持された。一方、交尾がみられなかった場合や単独飼育個体のP値は、ほぼ基底を維持し（稀に上昇あり）、EまたはAD、発情兆候に約1ヶ月の周期性が認められた。以上のことから，1）トラは稀に自然排卵が起こるが、通常交尾排卵型で、2）排卵を伴う約2ヶ月と排卵を伴わない約1ヶ月の2種類の発情周期があり、3）最終交尾から約40～50日後に、糞中P含量が高値を維持していることを指標に妊娠を判定できることが示された。

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【目的】ツシマヤマネコは国内で最も絶滅のおそれの高い哺乳類の一種であり、現在4施設で飼育下繁殖の取り組みが行われている。そこで本種の繁殖生理の解明を目的として、糞中の性ステロイドホルモン代謝物の測定による非侵襲的な内分泌動態のモニタリングを行った。さらにその測定法の有効性を検討するため、糞中の性ステロイドホルモン代謝物の定性分析を行った。【方法】福岡市動物園で飼育されていた雌のツシマヤマネコ1頭を対象として、2004～2006年の交尾期および妊娠期を含む時期に糞を採取した。糞は凍結乾燥後に80％メタノールで性ステロイドホルモン代謝物を抽出し、エストラジオール-17β（E₂）およびプロジェステロン（P₄）抗体を用いた酵素免疫測定法によりそれぞれの代謝物を定量した。また、代謝物を明らかにするため、E₂含量の高い期間および妊娠期間中の糞をメタノール抽出してSep-Pak C18カートリッジを用いて精製し、E₂およびP₄代謝物の分離を逆相HPLCにより行った。回収したフラクション中のE₂およびP₄代謝物の免疫反応性のピークを、E₂代謝物2種およびP₄代謝物6種の標準物質の溶出時間と比較した。【結果】糞中E₂代謝物含量は、交尾前に明確な上昇を示し、糞中P₄代謝物含量は、交尾日以降顕著な上昇を示した。糞中E₂代謝物の定性分析の結果、E₂およびエストロン（E₁）の溶出位置と一致する明確なピークが認められた。妊娠期の糞中にはP₄はわずかで、5α-pregnane-3α-ol-20-one、5α-pregnane-3β-ol-20-oneおよび5α-pregnane-3α、20-dioneの溶出位置と一致する明確なピークが認められた。以上の結果から、ツシマヤマネコの糞を用いた卵胞活動のモニタリングにはE₂またはE₁の測定が、また排卵や妊娠のモニタリングには5α系プレグナンに高い交叉性をもつ抗体を用いた測定が有効であることが示された。

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Cysteine is considered to promote MPN formation in pigs through synthesis of oocyte GSH which has an important role in providing cells with a redox state to avoid toxic effects of oxidative damage. However, such previous investigations were carried out under high oxygen tension (20% O₂). In this study, we evaluated the effects of cysteine concentrations in IVM medium under low oxygen tension (5% O₂) on their intercellular content of GSH after IVM, their subsequent status after IVF and embryonic development ability. COCs were collected and cultured in IVM medium supplemented with 0 (C), 0.05, 0.1, 0.2 or 0.6 mM cysteine for 44-46 h, fertilized in vitro and subsequently cultured for 6 days. GSH content of IVM oocytes exposed to 0, 0.05, 0.1, 0.2 or 0.6 mM cysteine increased significantly (P<0.05) as the concentration of cysteine increased (12.2, 14.0, 15.1, 16.4, and 16.4 pmol/oocyte, respectively). However, the rates of oocyte maturation, sperm penetration, MPN formation, monospermy, cleavage, and blastocyst formation on Day 6 were not different among the groups. Moreover, the cell numbers of blastomeres in blastocysts were uniform among the groups. These results indicate that supplementation of 0.05-0.6 mM cysteine during IVM under 5% O₂ tension significantly increased intracellular GSH contents of IVM oocytes; however, it had no promoting effects on nuclear maturation, fertilization and MPN formation and subsequent embryonic development to the blastocyst stage. Therefore, O₂ tension during IVM of oocytes is suggested to play an important role in IVP of porcine embryos.
Supported by JSPS-VAST 2005-2007 project and Monbukagakusho scholarships.

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【目的】卵細胞質内精子注入法 (ICSI) がほぼ完成しているマウスでは、凍結乾燥 (FD) 精子の冷蔵保存が実用可能なレベルにある。ウシFD精子のICSIも試みられているが、大型家畜では凍結融解 (FT) 精子を用いた通常のICSIによる胚盤胞作製効率に改善の余地が残されている。本研究ではまず、FT-ICSIにおける成熟卵子の高速遠心処理、精子のDTT処理、およびICSI後に補填する活性化処理が胚盤胞作製効率に及ぼす影響を調べた (実験1)。続いて乾燥行程の異なるFD精子をICSIし、胚盤胞の作製を試みた (実験2)。【方法と結果】体外成熟・裸化卵子へのICSIにはピエゾマニピュレーターを用い、低酸素下での発生培養はmSOFaa液中で8日間行った。(実験1) 高速遠心によって細胞質脂肪顆粒を偏在させた体外成熟卵子をFT-ICSIに用いても、胚盤胞発生率 (15%) に非遠心区の値 (16%) と差は認められなかった。また、DTT処理FT精子をICSIしたときの胚盤胞発生率 (14%) も無処理区の値 (11%) から有意に改善されなかった。一方、ICSI直後の胚にイオノマイシン処理によって活性化補填し、さらにエタノール、CHX、6-DMAPのいずれかで併用処理したが、イオノマイシン (5 µM、5分) とエタノール (7%、5分) を4時間間隔で併用した場合に30%の胚盤胞発生率が得られた。この割合はIVFでの同成績 (40%) と有意差なく、この改善は第二極体放出から初期分割を速やかに起こした卵子の増加によった。(実験2) ウシFD精子は、ラット精子で1年間の冷蔵保存に有効だった2段階法 (0.37 hPaで14時間1次乾燥後、0.001 hPaで3時間2次乾燥)、あるいは2次乾燥行程を省いた1段階法のいずれかによって調製した。4°Cで1～7日間保存後にICSIに供し、活性化補填はイオノマイシン・エタノール併用処理とした。FT-ICSI、FD-ICSI (2段階法)、FD-ICSI (1段階法) の各区で第二極体放出卵率に差はなかった (71～74%) が、卵割率はFD区で約4割減となった (各68、37、43%)。さらにFD-ICSI区の胚盤胞発生率は1～2%とFT-ICSI区の21%よりも著しく低く、ウシ精子用に凍結乾燥条件を見直す必要が生じた。

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【目的】これまでの研究でドジョウ(Misgurnus anguillicaudatus)を実験材料とした胞胚細胞の核移植を行ない、得られた個体が外部形態的に通常受精個体と差異が無く、生殖能力を有していることを明らかにした。次に培養体細胞の核移植による個体作出を行うため、通常培養、並びに血清飢餓培養を行った体細胞の核移植を行なったが、体節期以降の個体は得られなかった。本研究では、更なる発生段階の個体作出を目的として、メダガで良好な結果が得られている低温処理卵への培養体細胞の核移植を試みた。【方法】ドジョウ成魚の尾鰭から採取した体細胞を培養し、ドナーとした。培養にはFBSを10％添加し、カナマイシンを50mg/l の濃度で加えたD-MEMを用いた。コンフルエントまで培養し、トリプシンで解離したものをドナー細胞とした。レシピエントは、ドジョウの未受精卵を大型シャーレの曝気水中に撒き、5分間の接水後0℃の水槽にて40分間低温処理を行なった。その後トリプシンにより卵膜除去し、除核せずにレシピエント卵とした。これらを用いて核移植を行ない、卵の生残率、得られた胚や仔魚の倍数性、ゲノムの由来の分析を行なった。【結果】核移植を行った837卵のうち、201 (24.0%) が卵割し、97 (11.6%) が胞胚期、43 (5.1%) が囊胚期、6 (0.7%) が体節期、3 (0.4%) が孵化期に達し、1個体が5日齢仔魚まで生存した。倍数性の判別を体節期2個体と、5日齢1個体について行なったところ、2個体が4倍体、1個体が2倍体であった。マイクロサテライト多型分析を用いて囊胚期、体節期の胚および仔魚のゲノムの由来を調べた結果、13個体がドナーとレシピエントの両方に由来し、4個体がドナーのみに由来、1個体がレシピエントのみに由来していた。倍数性とゲノムの由来の両方が判別できた個体のうち、2倍体1個体はドナーのみのゲノムに由来し、4倍体2個体はいずれもドナーとレシピエント両方のゲノムに由来していた。

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【目的】体細胞核移植（SCNT）において、体細胞核のリプログラミングに係わるエピジェネティクス制御の分子基盤についてはいまだ十分に解明されていない。近年、細胞核を構成するタンパク質が細胞核やクロマチンの機能構造を動的に制御し、遺伝子発現制御の構造基盤を形成する可能性が示されている。その中でも、アクチン関連タンパク質(actin-related protein : Arp)は、クロマチンの機能構造やダイナミクスに関与するクロマチンリモデリング複合体に広く含まれている。そこで本研究では、受精卵および体細胞核移植由来卵子（SCNT卵子）において、クロマチンリモデリング複合体の1つであるSWR1複合体に着目し、その構成因子であるArp6、Arp4およびSWR1の局在について免疫組織化学的解析を行った。【方法】体細胞核移植はWakayamaらの方法に従い行った。レシピエント卵子はB6D2F1マウスより、ドナー細胞に用いた卵丘細胞はB6C3F1マウスより回収した。体外受精はToyodaらの方法に従い、B6C3F1マウスを用いて行った。卵子の免疫組織化学染色は、受精卵は媒精後、SCNT卵子は細胞注入後、5、7、9時間にて行った。本実験は近畿大学動物実験規定に準じて行った。【結果・考察】Arp6は、受精卵、SCNT卵子ともに核全体でドット状の局在が見られ、特に受精卵の雄性前核に強い局在がみられた。Arp4は、受精卵とSCNT卵子いずれも核全体に分布し、特に核小体辺縁部でやや多く局在する傾向がみられた。SWR1は、特に受精卵の雄性前核の核小体辺縁部で強く均一な分布がみられたが、SCNT卵子では核小体辺縁部での局在が少なく不均一であった。またDAPIによる染色から、受精卵に比べSCNT卵子では核小体辺縁部でのヘテロクロマチン構造が不均一であることが示された。これらの結果から、細胞核の機能構造やクロマチンリモデリング複合体の形成異常が、SCNT卵子での核のリプログラミングに影響している可能性が示唆された。

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【目的】体細胞核移植(SCNT)由来クローンラットの作出例は、胎子繊維芽細胞をドナー細胞として用いた報告１例にとどまっている。これまで演者らは、ラットSCNT卵をプロテアソーム阻害剤(MG132)添加培地で長時間培養すると紡錘体に異常が起こり、卵割率が低下すること(第101回日本繁殖生物学会)、また、マウスなどのSCNT卵で発生能向上が報告されているTrichostatin Aを用いても、ラットSCNT卵の体外発生能を向上させないことを報告してきた(第49回日本哺乳動物卵子学会)。これらの実験では、いずれも採取直後の卵丘細胞をドナー細胞として用いた。本実験では、核移植卵をMG132に感作しない新しい実験系を確立し、また、ドナー細胞として培養細胞を用いることが、ラットSCNT卵の体外発生能に及ぼす影響について検討した。【方法】SD系ラット(3-5w)に過剰排卵処理を施し、hCG投与後15時間目に第2減数分裂中期卵(MII期卵)を得た。核移植は、ピエゾドライブを用いた直接注入法により行った。ドナー細胞には、採取直後の卵丘細胞・卵胞上皮細胞、また、培養した卵丘細胞・卵胞上皮細胞、尻尾由来の繊維芽細胞、腎臓由来の細胞を用い、培養細胞については血清飢餓培養した後にドナー細胞として使用した。MG132は、採卵および除核時のみ培地に添加した。核移植卵は、ストロンチウムおよびサイトカラシンB添加KSOMを用いて6時間処理することにより活性化付与した。【結果】用いた細胞種にかかわらず、前核形成率は高かった(2前核、81-98%)。また、2細胞期への発生率は尻尾由来の繊維芽細胞を用いた場合に低かったが(68%)、他の細胞を用いた場合では、いずれも高かった(82-91%)。4細胞期以降への発生率は、同じ由来の細胞であっても、培養することで向上する傾向があり、培養した細胞を用いた場合では、胚盤胞への発生も確認することができた(4-8細胞期：9-10 vs 21-26%、胚盤胞：0 vs 2%)。本実験の結果から、核移植卵をMG132に感作させないこと、ならびに、ドナー細胞を培養することがラットSCNT卵の体外発生能向上に有効である可能性が示唆された。

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【目的】マウス体細胞核移植（SCNT）胚は、比較的高率に胚盤胞に発生するが、産子への発生能は低い。これまで演者らは、着床後におけるSCNT胚の発生能を向上させるため、免疫抑制剤であるCsA（第23回日本生殖免疫学会）や、hCG（第50回日本哺卵学会）を受胚雌マウスに投与することで、10.5日齢の胎子形成率が向上することを報告してきた。しかしながら、得られた産子率に改善はみられなかった。そこで本研究では、hCG投与により向上した胎子を産子へと発生維持させることを目的に、妊娠維持に必須なホルモンであるProgesteroneを着床期以降に投与することで、マウスSCNT胚の発生能が改善するか否かについて検討した。【方法】既報に従い、採卵時に得られた卵丘細胞をドナー細胞核とし、直接注入法により核移植を行った（BOR,74,1083,2006）。培養後90時間目に得られた胚盤胞を、偽妊娠1.0日齢のICR系偽妊娠雌マウスの卵管へ移植した。胚移植後、偽妊娠3.5 - 6.5日目までは、24時間間隔で10IUのhCGを連続投与し（第50回日本哺卵学会）、7.5- 17.5 日目までは、1.0mg/kgまたは1.0mg/mouseのProgesteroneを24時間間隔で連続投与した。ついで、18.5日目に開腹検査を行い、産子発生能について検討した。なお、hCGまたはProgesteroneの媒体である、生理食塩水あるいはゴマ油を、実験区と同様のスケジュールで投与した区を対照区とした。【結果】核移植後、50～53％のSCNT胚が胚盤胞へ発生した。受胚雌へ移植後、18.5日目の開腹検査では、いずれの投与区においても着床率に差はみられなかった（31～40%）。産子生産率において、対照区では産子が得られなかったのに対し、1mg/kg濃度のProgesteroneを投与した区では、生存産子を得ることができた（0 vs 2%）。同様に、1mg/mouse濃度でProgesteroneを投与した区においても、生存産子が得られたのはProgesterone投与区のみであった（0 vs 2%）。本実験の結果から、hCG投与とProgesterone投与を併用することで、SCNT胚の産子生産率が若干向上する傾向がみられた。

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【目的】生殖細胞は遺伝情報を次世代へ伝えることができる唯一の細胞であり、潜在的に全能性を有することが知られていることから、体細胞とは異なる生殖細胞特異的なエピジェネティック制御やシグナル伝達が存在している。近年、これらの事象の重要な因子として生殖細胞特異的に発現する遺伝子が同定されてきているが、詳細な分子機構はいまだ不明な点が多い。我々は、これまで成体マウスにおいて生殖腺特異的に発現する新規遺伝子GSE (gonad specific expression gene)を同定している (Zhang M et al., 2002 ；Mizuno S et al., 2006)。しかし、この遺伝子が胎子期の生殖細胞において発現しているかは不明であった。本実験では、GSE が生殖細胞の形成に関与しているかどうかを検討することを目的に、生殖細胞形成時期である胎生4.5日(E4.5)～2週齢の胎子及び幼若マウスにおけるGSEの発現解析を行った。【方法】E4.5胚は体外受精により得たものを使用し、E5.5～E18.5の胎子は8～10週齢ICR系マウスの交配により得られた妊娠マウスから胎子及び幼若マウスを得た。E4.5からE11.5胚及び胎子は個体全体を、E12.5以降の胎子及び幼若マウスについては生殖巣のみをそれぞれRNA抽出及びタンパク質抽出し、RT-PCR及びウエスタンブロット解析に用いた。これらの胚、胎子及び組織はそれぞれ3個体分採取した。In situ hybridizationでは、それぞれの個体をBouin固定液により固定、定法に従って厚さ5μmの切片を作製し、DIG標識によりGSEの局在を調べた。【結果】RT-PCR及びウエスタンブロット解析からGSEはE7.5の胎子から発現し、E12.5から卵巣及び精巣で発現していることが示された。また、E7.5～E12.5の胎子におけるGSEの局在は、始原生殖細胞に認められた。マウスにおいて生殖細胞はE7.25から出現することが知られている(Ginsburg et al., 1990)。このことから、胎子期の生殖細胞におけるGSEの発現開始は生殖細胞発生時期からであり、その発生過程において何らかの機能を有する可能性が示唆された。

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【目的】マウス胚性幹細胞(ES細胞)、及び胚体外内胚葉細胞(XEN細胞)は胚盤胞より樹立され、原始内胚葉系列細胞に分化誘導することができる。しかし、XEN細胞が示す原始内胚葉系列細胞への分化能について、ES細胞と定量的に比較した報告はない。そこで、分化誘導したES及びXEN細胞における原始内胚葉系列マーカー遺伝子発現量を比較し、XEN細胞が原始内胚葉のモデル細胞として適しているか検討した。なお、原始内胚葉系列細胞への効率的な分化誘導方法を検討するために、XEN細胞の分化誘導方法として既に報告されている接着培養法に加え、浮遊培養法も試みた。 【方法】ES細胞は、接着及び浮遊培養法を用いてレチノイン酸による分化誘導を3及び5日間行った。XEN細胞は、接着及び浮遊培養法を用いてマウス胎仔線維芽細胞培養上清非添加培養による分化誘導を6及び10日間行った。Gata4、Gata6(原始内胚葉マーカー)、aFP(近位内胚葉マーカー)、tPA(遠位内胚葉マーカー)発現量をReal-time PCR法により定量し、発現量を比較した。 【結果及び考察】浮遊培養により分化誘導したES細胞では、接着培養と比較してGata4発現量は59倍、Gata6、aFP、tPA発現量は9～18倍高かった。すなわち、接着培養と比較して、浮遊培養では更に原始内胚葉への分化が促進された。一方、浮遊培養により分化誘導したES細胞と比較して、未分化XEN細胞におけるGata4発現量は3倍、Gata6発現量は6倍高かった。同様な比較において、浮遊培養又は接着培養により分化誘導したXEN細胞におけるaFP発現量は、それぞれ10倍、2倍高かった。さらに同様な比較をした場合、XEN細胞におけるtPA発現量は、浮遊及び接着培養ともに約8倍高かった。以上の結果より、ES細胞に比較してXEN細胞は近位・遠位内胚葉への分化能が高いこと、およびXEN細胞においても、浮遊培養ではより近位・遠位内胚葉への分化が促進されることが示唆された。すなわち、XEN細胞は原始内胚葉系列のモデル細胞として適していることが定量的に示された。

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【目的】我々は、孵化稚魚の腹腔内に移植された精原細胞が、宿主生殖腺へ移動・生着した後に、そこで機能的な配偶子へ分化することを明らかにしている。精原細胞のこれらの特性を利用した移植技法を、種苗生産へ応用できれば、親魚養成が困難な大型魚種の種苗を、飼育が容易な魚種に生産させる代理親魚養殖も可能になると期待される。さらに移植に用いる精原細胞を、培養下で増殖させる技術が確立されれば、移植を介して、シャーレ内の細胞から魚類種苗を生産できると考えられる。そこで本研究では、精原細胞の培養下での生存、分裂を促す有効な添加因子の探索を行った。【方法】生殖細胞が特異的にGFPで標識されたvasa-Gfp 遺伝子導入ニジマスの未成熟個体の精巣より、高純度でA型精原細胞を含む細胞集団を調整した。有効な添加因子を同定するために、得られた細胞を、栄養性因子やペプチド性因子などを異なる濃度で単一添加した培養液中で培養し、培養14日目における各区の生存精原細胞数を調査・比較した。続いて、同定した有効因子が、精原細胞の生存、分裂、および宿主生殖腺への生着能に与える影響を調査するために、培養14日目において、TUNEL アッセイ、BrdU アッセイ、および、孵化稚魚腹腔への移植実験を行った。【結果】スクリーニングの結果、アデノシン、またはサケ血清を含む培養液を用いた場合に、培養14日目の生存精原細胞数が、対照区と比較して、2倍程度増加することを見出した。またTUNELアッセイ、およびBrdUアッセイの結果、アデノシンは培養下の精原細胞のアポトーシスを抑制し、サケ血清はその分裂を促すことが示唆された。さらに、サケ血清を添加した場合に限り精原細胞の宿主生殖腺への生着能が改善されることを明らかにした。以上の結果より、本研究で同定したアデノシン、サケ血清は、代理親魚養殖を目指した精原細胞の培養系に有効な因子であることが示唆された。

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【目的】葉緑体は植物や藻類にみられる細胞内小器官だが、その起源はシアノバクテリアの一種と考えられており、１０数億年前に真核生物に１度だけ細胞内共生（１次共生）して葉緑体になったといわれている。本実験では、シアノバクテリアをマウス卵に注入することで人為的に一次共生を再現し、共生の条件検討および胚発生に与える影響を調べた。【方法】まず、注入用培地の検討を行うため、シアノバクテリア（Synechocystis sp. PCC 6803）を10％PVP-H-CZB、H-CZB、NIMに懸濁後、1個、5-10個、20個、それ以上(～100個)をB6D2F1マウスの未受精卵に注入し、生存率、単為発生後の発生率および注入数の影響を調べた。次に注入先の環境の影響を調べるために、未受精卵、単為発生胚（1nあるいは2n）、および受精卵へ注入し、同様な観察を行った。受精卵については細胞質内だけでなく前核内への注入も試みた。注入後に胚盤胞期まで発生した胚は培養を継続し、シアノバクテリアを細胞内にもつES細胞の樹立を試みた。【結果】シアノバクテリアはマニュピュレーターで卵子内へ注入可能であり、またクロロフィルの自家蛍光により染色なしで存在を観察できた。注入用培地の違い、および受容する胚の違いによる胚発生への影響は見られなかった。しかし注入数に関係なく胚の中でシアノバクテリアの増殖は見られず、50個以上のシアノバクテリアを注入した胚の多くは発生が阻害された。さらに、胚盤胞期でシアノバクテリアの存在が確認された胚からES細胞の樹立を試みたが、細胞内にシアノバクテリアの存在が確認できたものの、ここでもやはり増殖は見られなかった。また、発生過程でのシアノバクテリアの細胞質内分布はランダムで、細胞分裂に伴って各娘細胞へ伝わっているのが観察された。今後培養温度や、培養中に光合成可能な光を当てるなどさらなる改良を加えることで卵子内のシアノバクテリアを増殖させることができれば、葉緑体マウスの作出も可能になるかもしれない。

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【背景】ユキヒョウは単独性の季節多発情型交尾排卵動物であるにもかかわらず、国内の飼育下個体群は主に施設面での制約のため雌雄を通年で同居させている場合が多い。このような本来の生態とは異なる状態で飼育すると、繁殖を含めた様々な生理面に悪感作が生じると考えられるが、これを科学的に証明した報告は少ない。そこで本研究では、飼育方法の違いが雌の繁殖に及ぼす影響を内分泌学的側面から詳細に検討した。【方法】妊娠歴のある2頭の雌AとBおよび妊娠歴のない雌Cをそれぞれ2007年4月から1年間および2006年6月から3年間にわたって供試した。前2者は雄と通年別居飼育を行い、本種においてエストラジオール-17β（E2）と正の相関関係にある発情行動（Kinoshitaら, 2009）が見られた日にのみ雄と同居させた。Cについては研究1年目は雄と通年同居飼育を行い、2年目は発情行動が見られてから雄との同居を始め、3年目は再度通年で同居飼育を行った。研究期間中週2～7回の頻度で新鮮糞を採取し、その中に排泄されたE2およびコルチゾールの含量をKinoshitaら(2009)の方法に準じてEIA法で測定した。【結果】通年同居飼育を行わなかった場合の年間糞中E2濃度の変動幅は、雌A、BおよびCがそれぞれ0.13～5.44、0.11～12.03および0.19～13.05μg/gであり、Aは1月からBとCは10月から上昇し始め、3頭ともで上昇期間中に交尾行動が確認された。一方、通年同居飼育を行ったCのE2濃度は、初年度が0.11～6.45で、3年目が0.07～4.44μg/gであり、ともに通年同居飼育を行わなかった2年目よりも低く明確な上昇も見られず、常に雄が居たにもかかわらず両年とも交尾行動はなかった。またCにおいて、通年同居を行った年の糞中コルチゾール濃度は0.26～11.20μg/gの範囲で変動し、通年同居飼育を行わなかった年の0.05～6.58μg/gに比べて有意に高い値を示した。以上の結果から、ユキヒョウでは本来の生態に反する通年同居飼育を行うと個体にストレスが掛り、繁殖能力も低下する可能性が高く、種の保存を目的とした飼育下個体群管理には別居飼育が有用であると考えられた。

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【目的】近年注目されているキスペプチンの性腺刺激ホルモン放出作用は、ウシではまだ十分検討されていない。本研究は春機発動期前及び分娩後の黒毛和種雌ウシにKisspeptin-10(Kp10)を投与して、この二種の生殖生理環境差が黄体形成ホルモン(LH)放出反応に及ぼす影響を明らかにしようとした。
【方法】春機発動期前のウシには5～6ヵ月齢の黒毛和種雌子ウシ4頭を供試した。分娩後のウシには分娩後75～160日(離乳後1～92日)を経過し、PRIDを7日間挿入したあとの黒毛和種雌ウシ8頭を供試した。Kp10 (5µg/kg b.w.)は頸静脈内に投与した。また分娩後のウシ3頭はGnRH(100µg)を筋注した。採血は投与前及び投与後に頸静脈カテーテルから経時的に行い、血漿中LH濃度の変化を比較した。
【結果】(1) 春機発動期前の雌子ウシ4頭にKp10を投与した結果、全頭で血中LH濃度は急激に上昇した。投与後の頂値は投与前の値に比べ120%高い値を示した。 (2) 分娩後の雌ウシ5頭にKp10を投与した結果、離乳1日目の1頭では反応が見られなかった。またLHが上昇した4頭も雌子ウシに比べ反応が弱く、投与後の頂値は投与前の値の45%の上昇に過ぎなかった。(3) 分娩後のウシ3頭にGnRHを筋注した結果、Kp10投与牛と同様に離乳1日目の1頭では反応が見られなかった。しかし、他の2頭では、投与後の頂値は投与前の値に比べ480%まで上昇した。
【結論】本研究の結果は、分娩後のウシのKp10に対するLH放出反応は弱いこと、しかし下垂体はGnRHに対する強い反応性を持っていることを示す。また離乳直後のウシの視床下部-下垂体系の性腺刺激ホルモン放出機構は低下していることを示唆する。

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性腺刺激ホルモン放出ホルモン (GnRH) のパルス状分泌は視床下部-下垂体-性腺軸の活性維持に重要であるが、そのパルス発生機構は未だ解明されていない。キスペプチンは、GnRH/黄体形成ホルモン（LH）分泌を強く促進するペプチドで、ラットにおいてパルス発生機構が存在すると考えられてきた視床下部弓状核に細胞体が局在する。本研究では弓状核にあるキスペプチンニューロンがGnRH/LHのパルス発生に重要な役割を果たしているとの仮説のもと、弓状核を高周波により破壊し、LHパルスへの影響について検討した。卵巣除去した成熟雌ラットの弓状核全域を高周波により破壊し、LHパルスを検出するための頻回採血を行った。この破壊により正中隆起のGnRHニューロン終末が損傷を受けたかどうかを確かめるため、キスペプチンの活性型部分ペプチド（Kp-10）を破壊後に静脈内投与し、LH分泌を調べた。キスペプチンの細胞体が破壊されているかを確かめるため、実験終了後、側脳室にコルヒチンを投与し、２日後還流固定し、キスペプチンを免疫染色した。その結果、キスペプチンの細胞体が密集する弓状核後方が破壊されている個体ではLHパルスが抑制されていることが明らかとなった。しかしながらキスペプチンの一部の細胞体や線維が存在する弓状核前方が破壊されている個体でもLHパルスの抑制がみられた。Kp-10の静脈内投与により、全ての個体でLHの放出が確認された。以上の結果より、弓状核にあるキスペプチンニューロンがGnRH/LHのパルス状分泌に重要な役割を果たしていることが示唆された。本研究は生研センター「新技術・新分野創出のための基礎研究推進事業」の一部として実施した。

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【目的】ドーパミンの誘導体、Salsolinol (SAL)は新しいプロラクチン(PRL)放出因子である。しかし、その分泌特性や機構については明らかでない。一方、反芻家畜のPRL分泌は、日長により変化する。本研究は、日長とSALによるPRL分泌との関係を知るための実験系を確立するために、ヤギを人工照明下で飼養し、SAL、TRH、ドーパミン拮抗薬(スルピリド)を投与して自然環境飼育下のヤギのPRL分泌反応と比較した。
【方法】本実験では、室温を20℃に設定し、成熟雌シバヤギを８時間明、１６時間暗の人工照明下で飼養した（短日条件）。これらのヤギの頸静脈内にカテーテルを留置し、SAL(5 mg/kg b.w.)、TRH (1µg/kg b.w.)、スルピリド(0.1 mg/kg b.w.) をそれぞれ投与して血中のPRL濃度の変化を調べた。一方、７月に自然環境下で飼養しているヤギ（長日条件）にSAL、TRH、スルピリドを投与し血中PRL濃度を測定して、両群における血中PRL濃度の変化を比較した。
【結果】(1) 短日条件の人工照明下で飼養したヤギにおいて、SAL、TRH、スルピリドの投与は血中PRL濃度を有意に上昇させた（P<0.05）。PRL放出量にはSAL、TRH、スルピリドによる差は見られなかった。(2) 長日条件の自然環境下で飼養したヤギにおいて、SAL、TRH、スルピリドは血中PRL濃度を有意に上昇させた（P<0.05）。また短日条件下のヤギと同様にPRL放出量にはSAL、TRH、スルピリドによる差は見られなかった。しかし長日条件下で飼養されたヤギではSAL、TRH、スルピリド投与によるPRL放出量は短日条件下のヤギに比べ有意に多かった（P<0.05）。
【結論】本研究の結果は、SAL は他のPRL放出刺激物質と同様に短日及び長日条件下でPRLを放出させること、またその放出反応は長日期で高まることを示す。人工照明下における本実験系の有効性が確認されたので、現在照明時間を変えてPRLの分泌反応を検討している。
本研究は平成21年度科学研究費補助金(21380169)で行われた。

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【目的】我々は、ドーパミンの誘導体、Salsolinol (SAL)は成熟雌ヤギや子ウシのプロラクチン(PRL)を放出させること報告している。本研究は、これらの動物と生殖生理状態が著しく異なる雄ヤギや分娩後の雌ウシにおいても、SALがPRLを放出させるかどうかを明らかにするため、雄ヤギと分娩後の雌ウシにSALを投与しPRL放出反応を調べた。またSALによるPRL分泌機構の一端を探るために、雄ヤギを使い、ドーパミンアゴニストやL-ドーパを投与する実験も行った。
【方法】実験は５月に行った。成熟雄ヤギ及び分娩後86～116日(離乳後14～42日)を経過した黒毛和種雌ウシの頸静脈内にSAL(5 mg/kg b.w.)を投与した。また雄ヤギにブロモクリプチン（ドーパミンアゴニスト）製剤やL-ドーパ製剤を筋注したのち、SALを投与した。SAL投与後2時間頸静脈カテーテルから経時的に採血を行い、血漿中PRL濃度の変化を調べた。
【結果】(1)SALを静脈内に投与すると、雄ヤギ及び雌ウシとも血中PRL濃度は急激に上昇した。 (2) SAL投与前に、雄ヤギにブロモクリプチンを投与するとSAL投与によるPRL放出反応は抑制された。しかしL-ドーパを投与してもSALによるPRL放出反応には変化が見られなかった。
【結論】本研究の結果は、SALは成熟雄ヤギや分娩後の雌ウシでもPRLを放出させること、またSALによるPRL放出はドーパミンアゴニストにより抑制されることを示す。
本研究は平成21年度科学研究費補助金(21380169)で行われた。

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The aims of the present study were to clarify the effect of Kisspeptin-10 (Kp10: a shorter variant of kisspeptin retaining full biological activity) on the secretion of growth hormone (GH) from cultured bovine anterior pituitary (AP) cells, and evaluate the role of sexual steroids and Kp10 on the secretion of GH in vitro. The AP cells which were prepared from 8 to 11-month-old castrated calves were incubated for 12 h with estradiol (10nM), or progesterone (10nM), or testosterone (10nM), or vehicle only (control), and followed by a 2-h incubation period with Kp10. The amounts of GH released in media after a 2-h incubation period were measured by a time-resolved fluoroimmunoassay. Kp10 (1µM, 10µM) significantly stimulated the secretion of GH from the AP cells regardless of steroids treatments (P<0.05), and estradiol, progesterone, and testosterone showed no effect on enhancement of GH secretion in response to Kp10. The GH-releasing response to growth hormone- releasing hormone (GHRH, 10nM) was significantly greater than that of Kp10 (P<0.05). The present results suggest that Kp10 directly stimulates the release of GH from somatotrophic cells, and sexual steroids don't enhance the sensitivity of somatotrophic cells to Kp10. Furthermore, they suggest that the GH-releasing effect of the Kp10 is less potent than that of GHRH.

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【目的】弓状核に存在するキスペプチンニューロンは、パルス状性腺刺激ホルモン放出ホルモン（GnRH）分泌を制御していると考えられている。我々は、シバヤギ弓状核キスペプチンニューロン近傍に電極を留置し、黄体形成ホルモン（LH）のパルス状分泌と同期する一過性の多ニューロン発火活動上昇（MUAボレー）を記録する手法を既に確立している。げっ歯類やヒツジを用いた研究から、弓状核キスペプチンニューロンにはNeurokinin B (NKB)が共発現していることが示されているが、その生理機能は全く不明である。そこで本研究では、NKBの弓状核キスペプチンニューロン神経活動に対する作用を解析した。【方法】実験には卵巣除去雌シバヤギを用いた。シバヤギ弓状核キスペプチンニューロンにおけるNKBの発現を調べるため、免疫組織化学染色およびin situ hybridizationを行った。また、シバヤギ弓状核キスペプチンニューロン局在部位に記録電極の留置を、側脳室カニューレを外科的に留置した。対照あるいはNKB（0.2, 2nmol）を脳室内に投与し、その前後における神経活動を記録解析した。【結果】形態学的手法により、シバヤギ弓状核において、NKBはほとんど全てのキスペプチンニューロンに発現していることが明らかとなった。また、NKBの脳室内投与は、投与直後に１～数回のMUAボレーを引き起こす作用を持つことが明らかとなった。【考察】NKBは、弓状核キスペプチンニューロンを活性化させることにより、GnRH/LHの周期的な放出を引き起こす役割を持つと考えられた。弓状核キスペプチンニューロンに共発現し、その活動を抑制するDynorphyin A (Dyn)の作用を考え合わせると（大蔵ら、2009年日本繁殖生物学会大会）、NKBとDynが協調して弓状核キスペプチンニューロンの神経活動を制御することが示唆された。
本研究は生研センター「新技術・新分野創出のための基礎研究推進事業」の一部として実施した。

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我々は以前、新生仔期の性ステロイド感作により前腹側室周囲核(AVPV)のキスペプチンニューロン、 および性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)/黄体形成ホルモン(LH)サージ発生機構が脱雌性化することを報告した。そこで本研究は、この新生仔期の性ステロイドによる制御がキスペプチン特異的であるかを検討することを目的とした。出生直後の雄ラットに精巣除去した群(Neo Cast)、生後5日の雌にestradiol-benzoate(EB)を投与し、成熟後に卵巣除去した群(Neo EB)、成熟後に性腺除去した雌雄ラット(Ad OVXおよびAd Cast群)を設け、各群の半数の動物には成熟後に高濃度エストロジェンを処置した。AVPVに存在し、GnRH/LHサージへの関与が考えられるγアミノ酪酸、グルタミン酸、ニューロテンシン、ガラニンおよびドーパミンニューロンに着目し、これらの遺伝子発現あるいはそのマーカータンパク遺伝子発現を半定量的RT-PCRにより解析した。高濃度エストロジェン処理下でNeo CastとAd OVX群ではAd Cast群に比して有意に高いKiss1の発現を示した。一方、他の神経ペプチドあるいはマーカータンパクの遺伝子であるGad65/67、vGlut2、Nts、Gal、およびTh遺伝子の発現は、成熟後のエストロジェン処置の有無に関わらず全群で確認され、新生仔期の性ステロイド環境による明瞭な効果は認められなかった。これらの結果により、新生仔期の性ステロイド感作がAVPVのKiss1発現を特異的に抑制することによりGnRH/LHサージ発生機構を脱雌性化することが示唆された。本研究は生研センター基盤研究推進事業により支援されている。

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【目的】キスペプチンは、Kiss1遺伝子によりコードされ、生殖機能を第一義的に制御する神経ペプチドである。我々は以前、新生仔期ラットへの出生日から生後10日までのエストラジオールベンゾエイト（EB）の連続投与が、成熟後の雌雄ラット脳内におけるキスペプチン発現を著しく抑制し、性腺機能を低下させることを報告した。本研究は、各種エストロジェン受容体（ER）ノックアウト（KO）マウスを用い、発達脳へのエストロジェン作用を仲介するERの同定を目的とした。【方法】ERαKO、ERβKO、および野生型（WT）のC57BL/6系統雌マウスを用いた。出生1、3、5、7、および9日目にEBを投与した群、あるいは落花生油（oil）を投与した群をそれぞれの遺伝子型のマウスで設けた。10～22週齢に達した動物に卵巣除去を施し、その1週間後に動物の脳を灌流固定した。凍結脳切片を作成し、弓状核（ARC）におけるKiss1 mRNA発現をin situ hybridizationにより検出し、その発現細胞数を得た。【結果および考察】WT、ERαKOおよびERβKO マウスのoil投与群におけるKiss1 mRNA発現細胞数はともに高い値を示した。WTおよびERβKOマウスのEB投与群におけるKiss1 mRNA細胞数はWTマウスのoil投与群と比べて著しく減少した。一方、ERαKOマウスのEB投与群では多数のKiss1 mRNA発現細胞数が認められ、WTマウスのoil投与群と比べて著しい違いは認められなかった。以上の結果から、マウスにおいても、新生仔期のエストロジェンがキスペプチン発現を抑制すること、およびエストロジェンはERβではなく、主にERαを介してキスペプチンニューロンに作用し、生涯にわたってキスペプチンの発現を抑制することが示唆された。本研究は生研センター「新技術・新分野創出のための基礎研究推進事業」の一部として実施した。

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【目的】弓状核キスペプチンニューロンは、パルス状性腺刺激ホルモン放出ホルモン（GnRH）分泌を制御すると考えられている。我々は、シバヤギ弓状核キスペプチンニューロン近傍に電極を留置し、黄体形成ホルモンのパルス状分泌と同期する一過性の多ニューロン発火活動上昇（MUAボレー）を記録する手法を既に確立している。Dynorphin A（Dyn）は、弓状核キスペプチンニューロンに発現しているが、その生理的機能は明らかとなっていない。本研究では、GnRH分泌制御機構におけるDynの役割を明らかにすることを目的とした。【方法】実験には卵巣除去雌シバヤギを用いた。弓状核キスペプチンニューロンにおけるDynの発現を調べるため、免疫組織化学染色およびin situ hybridizationを行った。弓状核キスペプチンニューロン局在部位に記録電極を、また側脳室カニューレを外科的に留置した。対照あるいはDyn（0.2, 2nmol）を脳室内に投与し、その前後における神経活動を解析した。さらに、Dyn受容体であるkappa opioid receptor (KOR) antagonist（nor-BNI）の脳室内持続投与（60 nmol/h, 2h）が、神経活動におよぼす影響を解析した。【結果】シバヤギ弓状核において、Dynはほぼ全てのキスペプチンニューロンに発現していることが明らかとなった。Dyn/キスペプチン陽性線維は、Dyn/キスペプチンニューロンの細胞体近傍に存在していた。また、Dynの脳室内投与によりMUAボレーの頻度が減少し、nor-BNI持続投与によりMUAボレー頻度が増加することが明らかとなった。【考察】弓状核キスペプチンニューロン間におけるDyn/KORシグナル伝達が、オートフィードバック作用を介してキスペプチンニューロン自身の活動を制御することが示唆された。弓状核キスペプチンニューロンに対して抑制作用をもつDynが、刺激作用をもつNKB（若林ら、2009年日本繁殖生物学会大会）と協調し、キスペプチンニューロンの周期的な神経活動を制御すると考えられた。本研究は生研センター「新技術・新分野創出のための基礎研究推進事業」の一部として実施した。

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【目的】脳における性腺刺激ホルモン放出ホルモン（GnRH）神経細胞の分布や、黄体形成ホルモン（LH）ならびに卵胞刺激ホルモン（FSH）を介した排卵制御機構については、これまで多くの動物で報告されているが、交尾排卵動物における詳細な報告は未だ少ない。そこで本研究では交尾排卵動物であるスンクス（Suncus murinus）を用い、GnRH神経細胞と線維の詳細な局在部位を免疫組織化学的に明らかにし、LH及びFSH遺伝子を同定することを目的とした。【方法】供試動物にはKAT系統雌スンクスを用いた。4％パラフォルムアルデヒドにて灌流固定した脳を採取し、25μmの凍結切片を作成した後、抗GnRH抗体（LRH13）を用いて免疫組織化学によりGnRH神経細胞及び線維の分布を解析した。また、スンクスの下垂体を採取しRNAを抽出後、RACE法によりLHおよびFSH遺伝子の同定を行った。【結果および考察】スンクスの脳においてGnRH陽性細胞は終神経節、対角帯垂直肢、内側中隔、視索前野吻側部の正中から内側部に局在していた。GnRH免疫陽性線維は線条体、辺縁系皮質領野、対角帯垂直肢、内側中隔、終板器官、正中隆起、前腹側室周囲核において比較的多く、帯状回、弓状核、手綱核、内側扁桃体においても少数の陽性線維が確認された。GnRH神経細胞及び線維の分布はこれまで報告されている他の哺乳動物の分布とほぼ一致していた。またスンクスのLH遺伝子は435bp、FSH遺伝子は366bpのコーディング領域を持ち、ヒト、マウスのアミノ酸配列とそれぞれ、LH遺伝子61.8、71.5％、FSH遺伝子70.6、67.2％の相同性を示した。これらのことよりGnRHの分布様式やLH、FSH遺伝子の推定アミノ酸配列は交尾排卵動物のスンクスにおいても高く保存されているものと推察された。本研究は生研センター基盤研究推進事業によりサポートされています。

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We demonstrated that LPA is synthesized in endometrium and there is higher LPA concentration and mRNA expression for LPA1 in bovine endometrium during pregnancy than estrous cycle. Thus LPA may contribute to early pregnancy establishment. In in vivo study we investigated LPA effect on conception rate, P4 and PG secretion in heifers. Animals were inseminated 72 h after second PGF2α injection. From Day 15 to 18 after insemination, heifers were treated intravaginally with: saline (control), LPA (1 mg) or VPC32183 (1 mg; n = 8 for each group). Blood samples were collected on the following days after insemination: 0, 6, 12, 15, 16, 17, 18, 21 and 30. Pregnancy was confirmed by USG and per rectum examination on days 30 and 49. LPA administration resulted in increase in P4 and PGE2 concentrations compared to saline and VPC32183 - treated heifers (P<0.05). In saline and LPA-treated groups 6 out of 8 heifers were pregnant, whereas conception rate in VPC32183 – treated heifers was 37% (P<0.05). In in vitro study we examined the effects of LPA on PG secretion and PGES and PGFS mRNA expressions in stromal and epithelial cells of bovine endometrium on Days 16-18 of pregnancy and estrous cycle. LPA increased PGE2 production and PGES mRNA expression in stromal cells at estrous cycle and pregnancy (P<0.05). The overall results indicate that LPA serves as luteotropic factor during early pregnancy stimulating P4 and PGE2 secretion through activation of PGES mRNA transcript expression in stromal cells. Moreover, at pregnancy establishment, endogenous LPA protects CL and embryo development.

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【目的】ヒラメの遺伝的雌は、性分化時期の高水温(27℃)飼育により、アロマターゼ(エストロゲン合成酵素)遺伝子の発現が抑制されて雄へと性分化することが知られている。しかしながら、高水温によりアロマターゼ遺伝子の発現が抑制される機構は不明である。一方、当研究室では、糖質コルチコイドの一種であるコルチゾルが雄への性転換を誘導できることを見出している。そこで本研究では、ヒラメの温度依存性性決定にコルチゾルがどのように関与しているのかを明らかにすることを目的とした。 【方法】EIAによりヒラメ性分化時期のコルチゾル量を測定し、生殖腺器官培養系を用いてコルチゾル投与による性分化関連遺伝子の発現変化をRT-PCRにより解析した。また、HEK293細胞を用いたレポーターアッセイにより、コルチゾルが及ぼすアロマターゼ遺伝子の転写制御への影響を調べ、ゲルシフトアッセイを用いてコルチゾル受容体GRとアロマターゼ遺伝子のプロモーター領域との結合性を解析した。さらに、in vivoにおけるその結合性を明らかにするため、ChIPアッセイを用いて解析した。 【結果】コルチゾル量は高水温飼育により上昇することが分かり、生殖腺器官培養の結果、コルチゾルは雌特異的マーカー(アロマターゼ, foxl2)の発現を抑制し、雄特異的マーカー(mis)の発現を誘導することが明らかとなった。また、アロマターゼ遺伝子のプロモーター領域にはGRが直接結合するコンセンサス配列は確認されなかったが、レポーターアッセイ及びゲルシフトアッセイの結果、コルチゾルはGRを介してこのプロモーター領域内のCREに直接結合し、アロマターゼ遺伝子の転写活性を抑制している可能性が示唆された。さらにChIPアッセイの結果、高水温飼育個体においてのみ、GRがこのCREに結合していることが確認された。 【考察】これらの結果から、ヒラメの遺伝的雌において、高水温により上昇したコルチゾルが、GRを介してアロマターゼ遺伝子の発現を直接抑制し、雄化を誘導している可能性が示唆された。

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【目的】キスペプチン(メタスチン)は、視床下部においてGnRH分泌制御に重要な役割を担う神経ペプチドである。全長キスペプチンのうちC末端側10個のアミノ酸配列(Kp-10）が生理活性を示し、末梢投与でも性腺刺激ホルモン分泌効果が得られることから、ウシでの繁殖制御技術への応用が期待される。本研究では、ホルスタイン種成熟雌ウシの静脈内または筋肉内にKp-10を投与し、血中黄体形成ホルモン(LH）および卵胞刺激ホルモン(FSH)濃度に及ぼす影響について検討した。【方法】乾乳期のホルスタイン種経産牛3頭を供試し、CIDRを用いた発情誘起処置による発情開始後9～16日に試験を行った。採血は頚静脈に留置したカテーテルを通じて10分間隔で12時間または8時間行った。静脈内投与試験では、採血開始から8時間後に、ウシ型Kp-10(0.02または0.2 nmol/kg)または対照として生理食塩水を留置カテーテルから投与した。筋肉内投与試験では、採血開始から4時間後に、ウシ型Kp-10(0.2 nmol/kg)または対照として生理食塩水を臀部筋肉内に投与した。血漿中LHおよびFSH濃度はRIAにより測定した。【結果】0.2 nmol/kgのKp-10静脈内投与により、血中LH濃度の上昇がみられた。この時のKp-10投与後1時間における血中LH濃度のarea under the curveは投与前1時間と比べて有意な増加が認められた。0.02 nmol/kgのKp-10静脈内投与では、血中LH濃度に変化はなかった。一方、0.2 nmol/kgのKp-10筋肉内投与では、LHの分泌動態に明瞭な変化はなかった。また、Kp-10の静脈内および筋肉内投与による血中FSH濃度に変化はなかった。以上より、キスペプチンが乾乳期ホルスタイン種経産牛においてもLH分泌を刺激することが確認され、新たな繁殖刺激剤として応用できる可能性が示された。本研究は生研センター「新技術・新分野創出のための基礎研究推進事業」の一部として実施した。

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目的：プロラクチン(PRL)は、主に脳下垂体前葉で合成・分泌されるペプチドホルモンである。妊娠・授乳期に濃度が上昇し、乳腺上皮細胞の分化・分裂促進、乳汁分泌の開始などに関与している。一方で、翻訳後修飾を受けた異型PRLも数多く報告されており、機能も様々である。我々は翻訳後にプロテアーゼ切断により生成するN末端16kDa PRL（16kDa PRL）に注目した。16kDa PRLは上皮細胞において抗血管新生、アポトーシス仲介性の血管退行を促進していることが報告されており、乳腺においてもこれを機能させることで、乳癌の浸潤・転移の抑制、治療につながることが期待されている。本研究は乳癌治療の基礎研究を目的に、16kDa PRLの生成過程と正常乳腺退行への関与を検討した。
方法：組換えマウスPRLを用いて、約16kDaに切断するプロテアーゼとその切断部位を解析し、さらにマウス乳腺中の16kDa PRLとプロテアーゼの量、局在部位、mRNAの量的変化を観察した。また、アポトーシス細胞と16kDa PRLの関連を検討した。
結果：組換えマウスPRLはCathepsin D（CD）によりN末端から約16kDaの部分で切断された。マウス乳腺中のCDは同時期の16kDa PRLの量的変化と一致し、両者は離乳後2日以降では乳腺細胞内に共局在した。退行期乳腺上皮細胞でPRL およびCD mRNAの発現が見られた。乳腺上皮アポトーシス細胞は離乳後2日以降に増加し、16kDa PRLの局在とアポトーシス陽性細胞は離乳後3日以降に一致していた。
考察：以上のことから、乳腺退行期には下垂体および乳腺上皮細胞で合成されたPRLがCDにより切断され、切断された16kDa PRLは乳腺上皮細胞の分化・増殖を阻害することで乳腺退行の進行に関与していると推測される。

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【目的】栄養は性腺機能を制御する因子の1つである。本研究ではマウス下垂体の性腺刺激ホルモン産生細胞 (ゴナドトロフ) が性腺機能を制御するエネルギーセンサーとして血糖値を感知すると仮説提唱して実験を行った。本研究の目的は、グルコースの拮抗利用阻害剤である2-deoxy-D-glucose (2DG) によりゴナドトロフの性腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体 (GnRH-R) や性腺刺激ホルモン mRNA発現量が低下するかin vitroで検討することにある。【方法】 実験には8週齢のICR雄マウスとゴナドトロフ株化細胞LβT2を用いた。下垂体とLβT2でエネルギーセンシングに重要なAMP活性化プロテインキナーゼ (AMPK)、グルコキナーゼ (GK)、グルコース輸送担体2 (GLUT2)、GLUT4等のmＲＮＡが発現しているかRT-PCR法で測定した。また、LβT2を5mMの2DG に24時間暴露した後、GnRH-R、黄体形成ホルモンβ鎖 (LHβ)、卵胞刺激ホルモンβ鎖 (FSHβ) mRNA発現量の変化をreal-time PCR法で測定した。さらに、エネルギーセンサーとして知られるAMPKのリン酸化をwestern blot法で観察した。【結果】下垂体とLβT2にはAMPK、GK、GLUT2、GLUT4等のmRNAが発現していた。また、2DG曝露によりLβT2でAMPKのリン酸化が誘起され、GnRH-RとFSHβ mRNA発現量が低下した。しかし、AMPK活性剤であるAICARを投与した実験では、GnRH-RとFSHβ mRNA発現量の低下は観察できなかった。以上より、マウス下垂体にはグルコースを含めたエネルギー基質の感知メカニズムが存在すること、また、グルコース利用性の低下はゴナドトロフでGnRH-RとFSHβ mRNA発現量を低下させるが、そのメカニズムにAMPKのリン酸化は関与しないことが示唆された。

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【目的】マウス下垂体の性腺刺激ホルモン産生細胞（ゴナドトロフ）には長鎖脂肪酸受容体G protein-coupled receptor 120 (GPR120)が局在している。これまでに我々は、血中遊離脂肪酸が上昇する絶食時にマウス下垂体のGpr120 mRNA発現量が増加すること、パルミチン酸曝露によりゴナドトロフ株化細胞LβT2でGpr120 mRNA発現量が増加し、GnRH receptor (GnRH-R) mRNA発現量が減少することを報告している（第101回 日本繁殖生物学会）。本研究では、高脂肪食給餌が下垂体のGpr120、GnRH-R、LHβ、FSHβ mRNA発現量に与える影響を検討した。 【方法】実験には12週齢のICR雄マウスを用いた。飼料に含まれる脂質：炭水化物：タンパク質のエネルギー比率は、10：70：20（コントロール食）と60：20： 20（高脂肪食）だった。１ヶ月間、自由摂食下で飼育した後、下垂体のGpr120、GnRH-R、LHβ、FSHβ mRNA発現量をReal-time PCR法で測定した。 【結果】1ヶ月間の給餌により高脂肪食群とコントロール群の体重はそれぞれ52.2 ± 3.4 gと42.2 ± 0.8 gになった。高脂肪食群ではコントロール群に比べて下垂体のGpr120、GnRH-R、FSHβ mRNA発現量が統計的有意に増加した。また、LHβ mRNA発現量もコントロール群に比べて増加する傾向があった。以上の結果から、血中遊離脂肪酸が増加する生理的条件下では、ゴナドトロフのGpr120 mRNA発現量が増加すること、高脂肪食給餌が性腺刺激ホルモン、特にFSHの合成を促進することが示唆された。現在、高脂肪食給餌がマウスの血中LHとFSHのパルス状分泌に影響を与えるか検討している。

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【背景、目的】我々はこれまでに、転写調節因子PRX2を下垂体に存在する転写因子として初めてクローニングした（JRD印刷中）。その後、ラット下垂体を用いて下垂体の形成過程におけるPRX2の発現細胞を解析し、PRX2は幹細胞マーカーであるSOX2と下垂体特異的転写因子PROP1の陽性細胞に発現し、下垂体形成過程から出生後下垂体にかけて未分化な細胞に発現することを報告した（第101回日本繁殖生物学会大会）。以上の結果からPRX2は、ホルモン産生細胞の供給源となる未分化細胞において何らかの役割を発揮していると考えられた。一方、下垂体形成過程でのPRX2陽性細胞には、SOX2やPROP1と共存する細胞だけでなく、SOX2やPROP1に陰性なPRX2単独に陽性な細胞が存在することも示され、PRX2陽性細胞は複数種が存在することが明らかになった。本研究では、この複数種のPRX2細胞を免疫組織化学の手法によりさらに解析した。 【方法】各日齢のラット胎仔を4%PFAで固定し、凍結切片を作製した。各転写因子に対する抗体を1次抗体とし、蛍光標識2次抗体を用いた2重蛍光免疫組織化学を行った。 【結果】PRX2陽性細胞はE15.5で初めて確認された。その場所はE11,5にすでに発現しているSOX2とE11.5に発現を開始するPROP1に陽性な細胞が多数存在する、下垂体ラトケ遺残腔に接するmarginal cell layerの細胞で確認された。一方、下垂体周辺に存在し、SOX2、PROP1に陰性な間葉細胞においてもPRX2は発現していることが確認された。さらにこのPRX2陽性間葉細胞は、下垂体形成過程を通して下垂体前葉内に侵入する様子が観察された。この結果からPRX2は、下垂体前葉の原基となるラトケ嚢由来の細胞に由来するものと、下垂体前葉内に進入する間葉細胞に由来する、2種の異なる細胞において発現していることが示された。今後、この間葉細胞の役割と、これらの細胞におけるPRX2の機能について解析を進める予定である。

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今回報告するLHX2は、すでに下垂体腫瘍由来のαT3-1細胞において、糖タンパク質ホルモンα鎖遺伝子（Cga）の転写因子として同定されている。最近、我々は、ブタFSHβ鎖遺伝子（Fshβ）上流域（-852/-746：Fd2と呼ぶ）に対する結合因子として、初めてLhx2cDNAをクローン化した。今回これまでに進めてきた、LHX2の作用機序の解析結果を報告する。 実験は、組換え体LHX2を用いてFSHβ転写開始点上流約2kbまでの結合部位を、ゲルシフトアッセイおよびDNaseIフットプリンティングにより解析した。また、分泌型アルカリフォスファターゼをレポーターとして、LHX2および種々の下垂体の転写因子の発現ベクターを組み合わせて、ゴナドトロフ系譜の株化細胞LβT2とハムスター卵巣由来の株化細胞CHOにおけるFshβに対する作用を解析した。さらに、ブタ下垂体での発現の推移を調べた。 その結果、１）LHX2の結合部位として、酵母のOne-Hybrid Systemによるクローニングの際に用いたブタFd2領域（-852/-746）を含めた７ヶ所の結合部位（–1915/–1899, –1799/–1768, –1441/–1422, –1156/–1145, −836/−827, −818/−810, −808/−798）が同定された。２）Fshβ転写開始点上流域に対して、LHX2はCHOで促進効果を示すものの、LβT2細胞では抑制効果を示した。３）一方、ブタFd2領域のみに対しては促進効果を示した。４）Lhx2mRNA量は、雌雄ブタ胎仔下垂体40日頃より徐々に増加し、出生後に倍近くまで増加して230日齢で出生直前のレベルに低下していた。 以上のことから、LHX2はFSHβに対し主として抑制効果を示し、下垂体の発達期に機能する因子と考えられる。また、LHX2はCgaに対しても転写抑制効果を示すことから、LHX2はFSH合成に対して負の働きを示すと考えられる。

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横浜市繁殖センターでは、エンザイムイムノアッセイ（EIA）を用いて、ブラジルバク(Tapirus terrestris)雌個体の血中プロゲステロン（P4）の測定を行い発情周期の把握を行ってきた。今回、さらに正確な発情周期の把握と生殖生理メカニズムの解明を目的として、LH測定系の作成と性能検討を行った。
同じ奇蹄目であるウマのLH抗体とLH標準物をNational Hormone & Peptide Program Harbor-UCLA Medical Centerより購入し、まずPeroxidase Labeling　Kit-NH2（同仁科学研究所）を使用しLH標準物をペルオキシダーゼ（HRP）で標識しLH-HRPを作成した。さらに、LH抗体とLH-HRPの最適濃度決定試験を経て、標準曲線の作成と希釈試験を行い測定系の評価を実施した。その後、血中P4濃度の変動との比較検討を試みた。対象個体は16歳の雌で、採血の頻度は概ね週1回から3回のペースであった。
濃度決定試験の結果、LH抗体20万倍とLH-HRP100万倍の組み合わせで最適となり、標準曲線は0.97ng/ml～500ng/mlの範囲で良好な曲線を得られた。希釈試験ではホルモンを含むサンプルの測定値と標準曲線の間に概ね平行性が確認された。
血中LHの動態は、発情周期を示すP4の測定値が基底値まで低下した時期の数回において、68ng/mlから140ng/ml、81ng/mlから222ng/ml、54ng/mlから189ng/mlへの上昇を示したが、上昇はP4の低下時に必ず確認される結果とはならなかった。
P4の低下時にLH上昇の確認が数例であった理由は、採血間隔が、3日から10日程度空いていたためピークをつかめなかったものと思われた。確認できたLHの上昇はP4の周期と連動していたことから、作成した測定系はある程度ブラジルバクのLH測定に有効であることが示唆された。

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【目的】性腺刺激ホルモン投与によるマウスの排卵誘起においては排卵効率に大きな系統差が見られ、発生工学を広範な系統へ適用する上で障害となっている。そこで本研究では誘起排卵効率の系統差の原因究明とその克服法の開発を目指している。最初のアプローチとしてホルモン投与の反応性の違いが卵胞刺激ホルモン受容体（FSHR）や黄体化ホルモン受容体（LHR）の量的・質的差異に基づくかを検証した。【方法】マウス12系統（129x1、A/J、AKR/N、BALB/cCr、C3H/HeJ、C57BL/6J、CBA/N、DBA/1J，DBA/2Cr、NZB/N、NZW/N、SJL/J）の精巣cDNAと、GenBankより得たFSHR（NM_013523.2）およびLHR（NM_013582）の配列情報を基に設計したプライマーを用いてコーディング領域をPCRにより増幅し、産物のcDNA配列を求め、両受容体のアミノ酸配列を得た。6系統（A/J、DBA/1J、DBA/2Cr、C3H/HeJ、C57BL/6Cr、BDF1）の4週齢雌マウスの卵巣cDNA（FSHR測定にはホルモン未処理卵巣を、LHR測定にはPMSG投与後48時間後の卵巣を使用）にてTaqManプローブを用いた定量PCRを行い、GAPDH mRNAを内部標準としてmRNA量の比較を両受容体について行った。また、蛍光抗体を利用した定量Western Blot解析によりGAPDHを内部標準としてFSHR蛋白量を比較した。【結果】マウス12系統間でcDNA配列に差異が見られたものの、両受容体ともアミノ酸配列には差異はなく、6系統間で卵巣におけるFSHR mRNA、LHR mRNAおよびFSHR蛋白質の量に有意差はなかった。【考察】排卵誘起効率の系統差は単純な受容体の質的・量的差異によるものではないことが明らかとなった。今後はLHRの蛋白量測定を実施すると共に受容体結合後のシグナル系の系統差について調べる予定である。

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【目的】哺乳動物の卵巣において、卵胞発育および排卵の過程では好中球等の白血球が関与することが知られている。卵胞発育過程における卵胞液中のインターロイキン8(IL-8)の濃度は、他の発育卵胞と比べ前排卵卵胞で最も高くなる。このIL-8は、排卵する卵胞への白血球の誘導だけでなく卵胞を構成する細胞の機能に関与していることが考えられる。しかし、IL-8がウシ顆粒層細胞のステロイド合成に関与するか否かについては不明である。そこで本研究では、培養ウシ顆粒層細胞を用いて、エストラジオール(E2)およびプロジェステロン(P4)産生に及ぼすIL-8の影響について検証した。【方法】実験1：食肉処理場由来ウシ卵巣を用いて、卵胞直径、卵胞液中E2およびP4濃度比などを基準にして卵胞を発育段階別に3つに区分した（小卵胞、高E2卵胞および前排卵卵胞）。各卵胞から顆粒層細胞を採取し、RNA抽出後、cDNAを作製し、IL-8受容体であるCXCR1およびCXCR2のmRNAの発現解析を行った。実験2：ウシ大卵胞（直径10-15mm）から顆粒層細胞を採取し、1ng/ml FSH、10nM A4および2.5ng/ml IL-8を処理し、48時間培養した。採取した培地は、E2測定に用いた。また、2.5ng/ml IL-8および2.5ng/ml LHを処理し、48時間培養した。採取した培地は、P4測定に用いた。【結果】実験1:において、CXCR1のmRNA発現量は小卵胞に比べ高E2卵胞および前排卵卵胞で有意に高くなった。CXCR2のmRNA発現量は、卵胞の発育段階による有意な変化は認められなかった。実験2:において、IL-8はFSH刺激の有無に関わらず、E2産生を抑制した。P4産生において、IL-8単独処理はP4産生を阻害したが、LHとの複合処理ではP4産生を促進した。以上の結果から、IL-8受容体のうち、CXCR1が卵胞発育過程に積極的に関与している可能性があること、またIL-8はウシ顆粒層細胞の黄体化への初期開始に関与する可能性のあることが示唆された。

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【目的】キスペプチンはGPR54の内因性リガンドとしてヒト胎盤から同定されたKiss1遺伝子にコードされるペプチドで、視床下部での性腺刺激ホルモン放出ホルモン（GnRH）分泌調節において重要な役割を果たしていることが、近年報告されつつある。性腺においてもKiss1遺伝子が発現することが報告されているが、その機能は未だ解明されていない。我々はこれまでにブタ卵巣においてキスペプチンが原始、一次、二次卵胞、卵胞腔が完全に形成されるまでの三次卵胞（初期三次卵胞）の顆粒層細胞に発現していることを報告している（第101回日本繁殖生物学会）。本研究では卵巣におけるキスペプチンの生理作用を明らかにすることを目的に、ブタ顆粒層細胞におけるkiss1ならびにGpr54 mRNA発現を検討した。【方法】16μmのブタ卵巣未固定凍結切片を作成し、マイクロダイセクションシステムにより二次卵胞、初期三次卵胞、三次卵胞の顆粒層細胞を採取した。採取した組織からRNAを抽出しKiss1、Gpr54、Fshr mRNA発現をRT-PCRにより検討した。【結果および考察】Kiss1 mRNAは二次卵胞および卵胞腔が形成されはじめた初期三次卵胞の顆粒層細胞で発現が見られ、三次卵胞の顆粒層細胞では発現が消失していた。一方Gpr54 mRNAはいずれの顆粒層細胞にも発現は見られなかったが、卵胞膜細胞において発現がみられた。卵胞発達の指標となるFshr mRNAは二次卵胞では発現がみられず、初期三次卵胞、三次卵胞の顆粒層細胞にのみ見られた。これらのことよりブタ顆粒層細胞におけるKiss1遺伝子発現はキスペプチン発現と一致し、初期三次卵胞までの顆粒層細胞でキスペプチンが産生されていることが示唆された。また卵胞膜細胞にGpr54遺伝子が発現していたことより、顆粒層細胞で産生されたキスペプチンは卵胞膜にパラクリン作用し、卵胞発育に関与している可能性が示唆された。本研究は生研センター基盤研究推進事業によりサポートされています。

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【目的】ウシ黄体は活発な血管新生やプロジェステロン(P)合成を伴って形成される。成熟した黄体は50%以上の血管内皮細胞(EC)と30%程度の黄体細胞(LC)から成り、血管が密に存在している。しかし、妊娠不成立時には子宮からのプロスタグランジンF_2α(PG)の刺激で血管機構が崩壊し、P分泌が減少して黄体は退行する。このように黄体の形成から退行までには厳密な血管調節機構が存在する。本研究では、黄体の主要な血管新生促進因子である血管内皮増殖因子(VEGF)の作用に抑制的に働く血管新生抑制因子Vasohibin(Vh)に着目し、ウシ黄体でのVEGF-Vhシステムの存在とその調節機構を調べた。【方法】実験1 : 食肉処理場由来の黄体を初期（day2-5）、中期(day8-10)、後期(day13-15)、退行期(day17-19)に分類し、黄体組織を採取した。実験2 : magnetic beadsを用いて初期黄体からECを単離し、残った細胞をLC分画とした。ECにVEGF(1,10,20,50,100 ng/ml)を添加し、24時間後に細胞を回収した。実験3 : 初期黄体(day4)または中期黄体(day10-12)を持つウシにPGまたは生理食塩水を投与し、1時間後に卵巣を除去し、黄体組織を採取した。実験4 : 初期黄体または中期黄体から単離したEC、LCにPG(10^-6M)を添加し、2時間後に細胞を回収した。各遺伝子発現はreal-time PCR法を、各タンパク質発現はウエスタンブロット法を用いて測定した。【結果】実験1 :黄体期初期、中期、後期に比べ退行期においてVEGF、Vhのタンパク質発現が低かった。実験2 : 50ng/mlのVEGF添加によりVh mRNA発現が上昇した。実験3 : 初期黄体においてPG投与後1時間でVEGF、Vh mRNA発現が上昇したが、中期黄体ではどちらも減少した。実験4 : 初期黄体から単離したEC、LCでPG によりVEGF mRNA発現が刺激され、Vh mRNA発現はLCでのみ刺激された。中期黄体から単離したLCではPGによりVEGF mRNA発現のみ刺激された。以上からVEGF-Vhシステムがウシ黄体に存在し、初期黄体と中期黄体ではVEGF-VhシステムのPGに対する反応性に違いがあるということが示された。

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【目的】腫瘍壊死因子 (TNF) はウシ黄体のプロスタグランジン合成を促進し、Fasやinterferonとの共同作用により細胞死を誘起するなど、黄体機能調節に深く関与することが知られている。本研究では、ウシ黄体におけるTNFの産生細胞と標的細胞を明らかにする目的で、TNFとその受容体 (TNF-RI・TNF-RII) の局在を調べ、発情周期にともなう発現量の変化を検討した。【方法】１）黄体期初期 (排卵後 2-4 日)、中期 (8-12 日)、後期 (14-16 日) ならびに退行期 (19-21 日) にあるウシから黄体を採取し、TNF、TNF-RIおよびTNF-RII遺伝子とタンパクの局在について、 in situ hybridization法と免疫組織化学染色により検討した。２）発情周期にともなうウシ黄体組織中のTNF、TNF-RIおよびTNF-RII遺伝子発現の変化を定量的PCR法により検討した。【結果】１）黄体におけるTNF遺伝子発現は免疫細胞だけでなく、大型黄体細胞や小型黄体細胞でも認められたが、血管内皮細胞には顕著な発現は認められなかった。同様にTNFタンパク発現も発情周期を通じて大型・小型黄体細胞に認められた。また、TNF-RIとTNF-RIIの遺伝子ならびにタンパク発現は、大型黄体細胞や小型黄体細胞だけでなく血管内皮細胞でも認められた。２）黄体組織中のTNF遺伝子発現は黄体退行期において、他の周期と比較して有意に高かった (P<0.01)。一方、TNF-RI遺伝子発現に発情周期にともなう有意な変化は見られなかったが、TNF-RII遺伝子発現は黄体退行期において他の周期と比較して有意に高いことが明らかとなった (P<0.01)。以上の結果ならびに我々の過去の報告から、ウシ黄体においてTNFが免疫細胞だけでなく、大型・小型黄体細胞でも産生されることが明らかとなり、黄体細胞や血管内皮細胞に存在するTNF-RIおよびTNF-RIIを介して黄体機能を調節することが示された。またTNFとTNF-RII遺伝子発現が黄体退行期に高かったことから、この時期にTNF-RIIを介した黄体機能調節機構の存在する可能性が示された。

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ラットの性周期黄体は、発情休止期2日目（D2）の夕方にアポトーシスを開始する。これまでに我々は、D2 17時の黄体でゴナドトロピン放出ホルモン（GnRH）、およびGnRHシグナルのバイオマーカーであるアネキシン5（AX5）の遺伝子発現が増加すること、GnRHの拮抗阻害薬であるセトロレリックスを卵巣に局所投与すると、黄体のアポトーシスが抑制されることを明らかにした。これらの結果は、黄体局所で作用するGnRHシグナルが黄体のアポトーシス開始に関与することを示唆している。実際にアポトーシスが起きるには、細胞内に発現するアポトーシス関連因子のどれかを介して、GnRHのシグナルが実行因子に伝えられる必要がある。そこで本研究では、黄体中のGnRHの標的細胞をAX5を指標にして調べるとともに、アポトーシス促進因子であるBaxと抑制因子であるBcl-2のGnRHシグナルに対する関与について検討した。まず、D2 17時の卵巣を採取し、蛍光二重免疫染色を行ったところ、GnRHおよびAX5陽性細胞は、黄体中の近似した箇所に、斑状に分布していた。これらの陽性細胞には、GnRHを細胞質に、AX5を核膜付近に発現する黄体細胞と、AX5のみを細胞質に発現する黄体細胞の2種類が存在した。次に、D2 10時の黄体を採取し、40% O₂ 5%CO₂条件下で器官培養を行った。10^-7 MのGnRH類縁体（コンセラール）、もしくは同濃度のセトロレリックスを添加した培養液中で6時間培養したのち、黄体中のAX5、Bax、Bcl-2の発現量をウェスタンブロッティング法にて解析した。対照群に比べて、コンセラール添加群ではAX5、Baxの発現増加とBcl-2の発現低下が観察された。一方、セトロレリックス添加群では、AX5、Baxの発現低下とBcl-2の発現増加が観察された。以上の結果より、ラット性周期黄体に時期特異的に発現するGnRHはオートクリン・パラクリンによって黄体細胞に作用し、Baxの発現増加とBcl-2の発現低下を介してアポトーシスを誘導することが示唆された。

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【目的】Insulin-like factor 3 (INSL3) は、Insulin-like hormone family に属しており、主に性腺から分泌されるペプチドホルモンである。ウシにおいても黄体ならびに卵胞内膜細胞で INSL3 mRNA が非常に高く発現することが報告されている。さらにINSL3欠損マウスの卵胞閉鎖および黄体退行が早まることから、INSL3は卵胞および黄体の維持に重要な役割を果たす可能性が考えられている。しかしウシ黄体におけるINSL3 receptorであるRXFP2の塩基配列および発現は明らかにされておらず、その作用の詳細も不明である。本研究ではウシ黄体において、INSL3 が黄体内局所調節因子として働く可能性を調べるためにウシ黄体におけるRXFP2 遺伝子の塩基配列の同定および発現、発情周期を通じた黄体における RXFP2 mRNA およびタンパク発現量の変化を調べた。【方法】1) ウシ黄体組織における RXFP2 mRNA 発現をRT-PCRにより検討した後、増幅したPCR 産物の塩基配列をシークエンシングにより調べた。2) 発情周期を通じたウシ黄体組織におけるRXFP2 mRNAおよびタンパク発現量の変化をRT-PCR およびWestern blot法により調べた。【結果および考察】1) RT-PCRにより得られた500 bp付近のバンドの塩基配列を決定したところ、ウマおよびヒトRXFP2遺伝子の塩基配列とそれぞれ 90.8%、87.1%、アミノ酸配列は85.4%、83.3%の相同性を示した。2)RXFP2 mRNA発現は、黄体期中期および退行期において、初期および形成期と比較して有意に高かった。またRXFP2タンパク発現量は形成期黄体で最も高く、黄体の成熟そして退行にかけて低くなる傾向が見られ、初期および形成期黄体の発現量は後期および退行期黄体と比較して有意に高かった。本研究ではウシにおけるRXFP2遺伝子の塩基配列を決定し、ウシ黄体においてRXFP2が発情周期を通して発現することが示された。RXFP2発現がウシ黄体形成時に最も高かったことから、INSL3 は黄体形成における機能調節に局所調節因子として作用している可能性が示された。

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本研究では、それぞれ黄体相中期および後期である偽妊娠6日目(PSP6)とPSP9の幼若ラットに、外生的PGF_2α（PGF、30μg/head）で黄体退行を誘起した時のGroup IVA(GIVA) およびVIA(GVIA) phospholipase A2(PLA2)並びにcyclooxygenase(COX)-1,-2の阻害薬の卵巣嚢内局所投与の効果を検討した。PGF投与直前に両側卵巣嚢内に溶媒（20%DMSO加生理食塩水）を投与した対照群の血漿Progesterone（P4)濃度は、PSP6では投与12時間後に投与前レベルの33％にまで低下したが、24時間後には73%にまで回復した。一方PSP9では6時間後には43％にまで低下し、以後24時間まで低下し続けた。黄体のステロイド産生細胞と血管内皮細胞のアポトーシスをTUNEL法で検討したところ、PSP6の投与前ではTUNEL陽性割合がそれぞれ1、5％であり、24時間後には27、30％に増加した。一方PSP9では投与前がそれぞれ10、11％であり、24時間後には26、46％であった。PSP6のGIVA PLA2阻害薬(AACOCF3)投与群とGVIA PLA2阻害薬(BEL)投与群の両方で、12時間後のP4濃度が対照群と比べ有意に高く、24時間後のステロイド産生細胞のTUNEL反応陽性率は有意に低かった。一方PSP9では、P4濃度に対する両阻害薬の有意な効果は見られなかった。しかし、PGF投与後に分離した黄体をin vitroにおいて溶媒あるいは上記阻害薬を添加して培養したところ、対照群と比べ両阻害薬群におけるステロイド産生細胞のTUNEL反応陽性率は、有意では無いものの低い傾向にあった。次にCOX-2阻害薬(NS398)投与群についても検討したところ、PSP6でのP4分泌の低下とアポトーシスの出現に対し、上記PLA2阻害薬と同様な阻害効果が見られた。一方COX-1阻害薬(SC560)投与群では有意な効果が見られなかった。PSP9では、両阻害薬群でのP4分泌とアポトーシスの出現に対する効果は見られなかった。以上の本研究成績から、PGF誘導性の黄体退行では、黄体内で活性化されるGIVA PLA2/GVIA PLA2/COX-2が、P4分泌の低下と主としてステロイド産生細胞のアポトーシスを仲介していることが示唆された。

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膜タンパク質はシグナル伝達や物質の取り込み、細胞内小胞輸送など多様な細胞機能に関与する。本研究では、精子機能や分化に関わる未知の膜タンパク質遺伝子を同定し、その機能を探ることを目指した。まず、NCBIの遺伝子発現データベースと膜貫通領域予想プログラムを用いたin silicoスクリーニングにより、マウスの精巣発育に伴い発現が上昇する機能未知遺伝子を23個選び出した。野生型およびW/W ^v マウス精巣のcDNAを用いRT-PCRを行ったところ、19遺伝子が野生型のみで発現が認められたことから、これらは生殖細胞特異的遺伝子であることが示唆された。同様に、本遺伝子群は精巣特異的に発現し、生後20～25日齢以降の精巣で発現が上昇することを明らかした。次に、この遺伝子群の中からCD47と相同性を持つ遺伝子（CD47L）に着目して解析を進めた。CD47は好中球やマクロファージにある受容体SIRPαに結合し、その食作用を抑制することなどが報告されている。CD47L遺伝子の全長クローニングを行ったところ、CD47との相同性はアミノ酸レベルで約50％であった。また、CD47L遺伝子は、精巣においてスプライシングにより膜貫通領域が異なる３つのアイソフォームが発現していることを見出した。次に、CD47Lの受容体について解析した。SIRPα及びそのファミリーでオーファン受容体であるSIRPβをCOS７細胞に発現させ、CD47Lの結合アッセイを行ったところSIRPαにのみ結合した。また、その親和性はCD47のそれと顕著な差は認められなかった。なお、CD47は多様な細胞種で発現していることが知られているが、ウエスタンブロッティングにより精子には発現していないことが判明した。以上より、精子上にあるCD47Lタンパク質がSIRPαを刺激することにより、マクロファージ等によって自身が貪食されるのを抑制する機能を有している可能性が考えられる。

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【目的】地球温暖化の進行によるとみられる平均気温の上昇は、わが国でも各地で認められている。それに伴い、種雄牛においては、古くから知られているが、有効な解決策がまだみいだされていない夏季不妊の緩和策あるいは適応策を構築していく必要がある。本研究では、この高温障害に伴い発生する種雄牛の生態現象を明らかにするための手段として、赤外線サーモグラフィー装置による陰嚢表面温度の測定を取り上げた。【方法】畜草研で繋養中の種雄牛４頭（黒毛和種３頭およびホルスタイン種１頭）を供試し、赤外線サーモグラフィー装置(TH9100WR 、NECアビオ)を用いた陰嚢表面温度の測定条件を検討した。【結果】種雄牛の陰嚢表面温度を赤外線サーモグラフィー装置で測定するためには、首をスタンチョンに固定して、しっぽをロープなどで保定したうえで、高さが60～80cmの三脚にこの装置をのせ、後方約1mの距離から温度を測定すればよいことがわかった。牛の陰嚢表面には毛がほとんど生えていないので、測定部位を剃毛する必要はなかった。この方式により、５～25℃の環境温度下で陰嚢表面温度を測定した結果、陰嚢中心部分の表面温度は、28～32℃であった。ただし、特に陰嚢の先端部において、表面が糞尿などで湿っている場合、冬季には、その表面温度が16℃程度まで低下することがあった。今後、陰嚢表面温度を赤外線サーモグラフィー装置で継続的に測定していくことで、その温度と夏季における精液性状の悪化との関連性を検討していく予定である。

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ブタやウシの卵子は卵胞の発育と共に成長し、その直径が大きくなることが知られている。ブタでは体外成熟時間が長く、この期間中に卵子の大きさがどのように変化するのか、成熟条件や卵胞の由来がこれにどう影響するのかについては明らかにされていない。本研究は、卵子の直径に卵胞の由来および体外成熟条件が及ぼす影響について検討した。方法、ブタ卵子をNCSU37培地を用いて44時間培養し、24時間と44時間における卵子の直径をキーエンスＢＺ8000を用いて計測した。またその時の核相についても観察した。実験1、直径、2mm以下、2-5mm、および5mm以上の卵胞由来卵子間の比較を行った。実験2、培養期間前半の卵子の成長が大きかったことから培養前半にcAMP添加、非添加区を設け比較した。実験3、成熟後PB放出の有無による差を比較した。実験4、TCM199とNCSU37間の比較を行った。実験5、NCSU37を用いてアミノ酸添加、非添加間の比較を行った。結果、卵子は体外成熟中に成長し小卵胞由来卵子においてその成長が著しかった。GV期の長さが異なるcAMP添加と非添加区の間では差が見られなかった。培養後極体放出の有無は卵子のサイズに影響しなかった。さらにNCSU37はTCM199に比べて有意に卵子が大きくなること、またアミノ酸の添加は、卵子の成長を有意に促すことが示された。これらのことから卵子は、体外成熟中にもその直径が大きくなり、成熟培地やアミノ酸の添加がこの成長に影響することが示され、卵子の大きさの変化が成熟条件の適否を調べる指標となる可能性が示された。

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【目的】小卵胞（SF）由来卵母細胞は中卵胞（MF）由来の卵より成熟率が低いことが知られている。また、SF由来の卵丘細胞卵母細胞塊（COCs）はIVM開始時に有している卵丘細胞数がMF由来のものより少ないことが示されている。そこで、本研究では、卵丘細胞の由来および量が卵成熟率におよぼす影響について検討した。【方法】屠場由来ブタ卵巣の直径1-2mmおよび3-6mmの表層卵胞からCOCsを採取し、それぞれSF区およびMF区とした。COCsは無血清成熟培地(修正POM)中で既法(前半20時間のみGn・dbcAMP添加)に従い合計44時間体外成熟培養した。18G針でSF由来およびMF由来COCsの卵母細胞をつぶして細胞質を除去し、SF由来COCsに対してMF由来卵丘細胞塊（C-MF）は1/2の量を、SF由来卵丘細胞塊（C-SF）は等量加えて共培養した（それぞれSF+C-MF区、SF+C-SF区）。【結果】SF+CMF区の成熟率（77.6±5.0％）はSF区（56.0±4.8％）より高く、MF区（86.2±5.1％）と同程度まで改善されたが、SF+C-SF区（70.5±3.4％）では顕著な改善が見られなかった。小卵胞と中卵胞では卵丘細胞の機能が異なり、それが成熟率に影響を与える可能性が示唆された。

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The objectives of this research were to examine the time-related changes in PKA activity and to elucidate its role in the meiotic resumption of pig oocytes. Cumulus-oocyte complexes (COCs) and denuded oocytes (DOs) were obtained from ovaries of prepubertal gilts and then cultured for the meiotic maturation. Immediately before and after culture for 3-27 hr, the COCs, oocytes from COCs and DOs were subjected to analyses of nuclear stage, PKA activity and serine/threonine phosphorylation state of possible PKA substrate proteins. During the culture, PKA activity showed a similar increasing change around 3 to 12 hr of culture in COCs and oocytes from COCs, but remained low and constant in DOs. Also, serine/threonine phosphorylated proteins were present throughout the culture course in COCs and oocytes and started to increase around the time of meiotic resumption of DOs and oocytes from COCs (18 and 24 hr, respectively). However, suppression of PKA activity by a PKA inhibitor H89 led to the inhibition of meiotic resumption and/or incompletion of the meiotic maturation in oocytes from COCs and DOs. Meanwhile, addition of a protein synthesis inhibitor cycloheximide and a cell-permeable cAMP analog dbcAMP increased the PKA activity in COCs and oocytes and resulted in the inhibition of meiotic resumption. These results suggest that PKA must remain active but below a threshold in order to complete the meiotic resumption in pig oocytes.

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【背景・目的】卵子成熟培地の検討には多数の卵子が必要であるため、卵子の得にくい霊長類では詳細な培地の検討はなされていない。マーモセットは霊長類の中では珍しく多産であり、近年、卵巣刺激法の確立により一度に多数の卵子を得ることができるようになった。そこで我々は、様々な動物種の成熟培地を参考に基礎培養液やサプリメントを検討し、成熟培地の至適条件を決定してきた(第101回日本繁殖生物学会大会発表)。本実験ではブタ卵子成熟培養法を参考に、マーモセット卵子成熟培地へのブタ卵胞液(pFF)添加の影響を調べた。 【材料・方法】12匹の成熟雌マーモセットより卵巣を摘出し、注射針を用いて卵胞を裂き未成熟(GV期)卵子を採取した。得られた卵子を個体毎に2等分し、Waymouth培地(5% FBS、1% ITS、100IU/ml FSH、10ng/ml EGF、1µg/ml Estradiol、0.5mM Na-pyruvate、10mM Sodium lactate、4mM Hypotaurineおよび1mM Glutamine添加)、および10%pFF添加Waymouth培地で体外成熟を行なった。その後、第一減数分裂中期(MI期)および第二減数分裂中期(MII期)への成熟率を比較した。また、得られたMII期卵子は体外受精させ、胚盤胞期までの発生を観察した。有意差検定はχ二乗検定を用いた。 【結果・考察】Waymouth培地で培養した286個のGV期卵子のうち、104個(36.4%)がMI期まで、71個(24.8%)がMII期まで成熟した。一方、10%pFF添加Waymouth培地で培養した291個のGV期卵子は、141個(48.5%)がMI期まで、105個(36.1%)がMII期まで成熟し、両ステージへの成熟率ともpFF添加培地で有意に高い結果となった(P<0.01)。体外受精後の発生成績は、培養液の違いによる差は認められなかった。以上より、マーモセット卵子体外成熟培養にブタ卵胞液の添加が有効であることが示された。

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【目的】MPF活性はCdc2タンパク質のリン酸化修飾によって変動し、161番スレオニン（T161）のリン酸化がMPFを活性化する。一般にCdc2の T161はCdk7、Cyclin H、MAT1からなるCdk活性化キナーゼ（CAK）によってリン酸化されることが知られている。哺乳類において、体細胞分裂ではCAK活性は細胞周期を通して恒常的に高いレベルを維持しているとされているが、卵成熟におけるT161リン酸化状態の変化やその制御については明らかではない。そこで、哺乳類卵成熟過程のMPF活性変動に対するCAKによる制御の詳細を明らかにすることを目指し、本研究では、ブタのCAKをクローニングし卵成熟過程における関与について検討した。【方法】屠場由来ブタ卵巣より未成熟卵を回収し、体外成熟培養を行った。Western Blot法によって成熟過程におけるCdc2のT161リン酸化状態を調べた。ブタのCAKを構成するCdk7、Cyclin H、MAT1の遺伝子をクローニングするために、ヒト、マウスcDNA配列を元にブタESTを検索し、GV期卵のmRNAを鋳型としたRT-PCRを行った。得られたPCR産物の配列を決定し他種と比較した。Cdk7のアンチセンス（as）RNAをGV期卵の細胞質内に顕微注入し、核成熟およびCdc2 T161リン酸化状態について調べた。【結果】卵成熟過程にけるCdc2のT161リン酸化は、GV期卵では極めて低く24、48時間に高かった。ブタ卵において、ヒト、マウスと94%以上の高い相同性を示すCdk7、Cyclin H、MAT1が存在した。卵成熟過程を通してこれらの転写産物が存在することが明らかとなり、ブタ卵成熟過程においてCAKとして機能していることが予想された。Cdk7に対するasRNAを注入したところ、成熟培養48時間において、Cdc2の T161リン酸化はわずかに低下し、成熟率が低下した。以上の結果から、ブタ卵成熟過程において、CAKがCdc2のT161リン酸化を介して卵成熟へ関与している可能性が示唆された。

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【目的】本研究は、ホルモン無添加完全合成培地において、PKC活性化剤として知られるphorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)が卵母細胞の体外成熟に及ぼす影響を検討した。 【方法】卵巣表層の直径3∼6mmの卵胞から採取した卵丘細胞-卵母細胞塊を、PMAを様々な濃度 (0, 10, 100, 1000 nM)添加した完全合成培地（mPOM）中で20時間培養後、PMA不含の同液中で24時間培養し、核相を観察した。培養前半20時間の1 mM dibutyryl cAMPとの組合せについても同様に検討した。 【結果】GVBD率は、PMA無添加区(38.0%)と比較してPMA添加区で高く(10 nM, 70.1%; 100 nM, 75.8%; 1000 nM, 60.5%)、100 nM添加区は1000 nM添加区よりも高かった。M-_II_期への到達率は、PMA無添加区(18.2%)と1000 nM添加区(25.6%)に差はなかったが、それらと比較して10 nM(40.2%)および100 nM添加区(47.6%)で高かった。10 nM PMAと1 mM dibutyryl cAMPを培養前半20時間のみ添加した場合のM-_II_期到達率(70.7%)は、それらを含まない対照区(11.4%)や10 nM PMA(43.1)または1 mM dibutyryl cAMP単独添加区(56.5%)と比較して高かった。 【結語】以上の結果から、ゴナドトロピン・フリー完全合成培地中にPKC活性化剤PMAを10∼100 nM添加した培地中でブタ卵丘細胞-卵母細胞塊を培養すると卵母細胞の成熟率が改善されること、また1 mM dibutyryl cAMPとの組み合わせによってブタ卵母細胞の成熟効率はさらに高まることが明らかになった。

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