Malasseziaのアトピー性皮膚炎(AD)への関与を明らかにするには,まずAD患者における菌相を明らかにすることが不可欠である.Malasseziaの分離・培養は一般に容易でないことから,正確な菌相を明らかにすることは困難であった.著者らは,分離・培養技術に依存しない非培養法であるPCR-based non-culturable methodを新たに開発し,AD患者および健常人のいずれにおいてもM.globosaが最も高頻度で定着していることを明らかにした.さらに,M.globosaのIGS (intergenic spacer)領域には多型が存在し,AD患者と健常人由来のM.globosaのIGS配列は異なっていた.従って,ADの増悪には特定の遺伝子型を有するM.globosaが最も重要な役割を演じていると考えられる.

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アトピー性皮膚炎(AD)患者においてヒトにおける常在真菌であるマラセチアについて検討した.AD患者の約半数はマラセチア特異IgE抗体を有し,重症例ほど有意に高い抗体価であった.マラセチアの精製抗原としてmanganese superoxide dismutase (MnSOD), cyclophilin, Malf2に対するIgEを測定すると各成分に対する抗体が検出されたが,陽性率,抗体価は症例間で一定の傾向はなかった.In vivoでの皮内テストの結果を皮膚炎のない喘息患者のそれと比較するとAD群ではマラセチアに対する遅延型反応陽性率が喘息群に比べて高いのが特徴的であった.またin vitroで末梢血液単核球をマラセチアと培養し,IL-5産生をみたところ陽性例が存在し,特に顔面に皮疹を有する例に有意に産生がみられた.前額,胸部,上背部からマラセチアの検出を試みたところ,検出率は42-71%でいずれの部位も無疹部からの方が菌数が多く認められ,皮疹部からは検出率,菌数ともに低かった.
マラセチアは皮表に常在し,特にAD患者においてはマラセチアに対する反応を明らかに有する例が存在したことから,マラセチアがADにおける抗原のひとつであることが示唆された.しかしながらマラセチアのメジャーアレルゲンはまだ決定されておらず,また誰にでも存在する常在菌がどのようにADの病因として関わっているのかなど,さらなる研究が必要である.

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ヒト皮膚より分離した.M.furfur,M.globosa,M.restricta,M.slooffiae,およびM.sympodialisからβ-mercaptoethanol処理により菌体成分を抽出(2-ME extract)し,これらに対するアトピー性皮膚炎患者血清中のIgE抗体について調べた.2-ME extractのCBB染色およびレクチンプロットの結果から,マラセチア種間で菌体成分に明らかに違いがある事が確認できた.2-ME extractを用いたウェスタンブロットにより患者血清中のマラセチア種に対するIgE抗体を調べたところ,それぞれの菌種の陽性率は83%(M.globosa),74%(M.sympodialis),65%(M.furfur),56%(M.restricta)and 50%(M.slooffiae)であった,さらに,M.globosaと他の種との交差性を調べるためにM.globosaの2-ME extractによる吸収試験を試みた.結果,マラセチア種間の共通抗原と種特異抗原の存在が示唆された.M.globosaの2-ME extractから分子量約46kDa(Malg46b)の成分を精製し,これの主要抗原性について検討した.Malg46bによるドットブロットでは,全アトピー性皮膚炎の患者血清の69%,M.globosa陽性血清では83%の血清が本成分と反応した.Malg46bによるドットブロットintensityと2-ME extractのintensityの間には高い相関(r=0.763)があり,本マラセチア種の主要抗原成分であることが示唆された.さらにこのMalg46bに対するポリクローナル抗体によるウェスタンブロットで,この成分はM.globosaに特に多く,M.restrictaでわずかに発現されることがわかった.

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脂漏性皮膚炎は,脂漏部位である頭部・顔面中央・耳・胸部正中および間擦部に生じる油性の落屑性紅斑を特徴とする疾患である.本疾患の詳細な発症機序はまだ解明されていないが,癜風菌が発症ないし悪化に深くかかわっていることは間違いない.本疾患は,客観的な検査法が確立されていないため,臨床症状に基づいて診断される.したがって鑑別診断を注意深く行う必要がある.直接鏡検による癜風菌の確認,皮脂量の測定,IgE抗体価,パッチテストなどを組み合わせて除外診断を行う.治療に関してはケトコナゾールクリームなど再発までの期間が長い抗真菌剤を積極的に使用したい.

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近年のDNA塩基配列読み取り技術の進歩に伴い全ゲノムシークエンスが次々に報告されており,病原性真菌においても多数のゲノムシークエンスプロジェクトが進行中である.その中でスタンフォード大学において進められて来たCandida albicansのゲノムシークエンスプロジェクトは終了に近付いている.ここではC.albicansのゲノム解析の歴史と合わせてシークエンスプロジェクトの現状について紹介する.

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The emergence of azole-resistant Candida spp. is a significant problem after long-term treatment of recurrent oropharyngeal candidiasis in HIV-infected patients. Several mechanisms can cause this resistance.
An important mechanism of azole resistance is reduced intracellular accumulation of the drug. Among the multidrug efflux transporters, ABC transporters and the major facilitator superfamily are reported to cause the resistance.
Erg11p, sterol C14α-demethylase, is a target of azole derivatives. It was reported that ERG11 over-expression had only a modest effect on the development of azole resistance. However, mutations in the ERG11 gene can cause the resistance, probably by reducing binding of azole to the target enzyme. We sequenced the ERG11 gene in a high-level azole resistant C. albicans strain, Darlington, and found that two amino acid substitutions, Y132H and I471T, had been encoded in the Darlington ERG11 gene. To assess the significance of these substitutions, we replaced one of the two copies of ERG11 gene in an azole-susceptible strain of C. albicans with a copy of the Darlington ERG11 and this resulted in a modest increase in azole resistance. Furthermore, to estimate the effect of Y132H and I471T individually, ERG11 genes with either or both mutations were expressed in S. cerevisiae. The I471T substitution, not previously described, conferred azole resistance when overexpressed alone and increased this resistance when added to the Y132H substitution.
Alterations in the sterol biosynthetic pathway are another resistance mechanism. Inhibition of 14α-demethylase by azole results not only in ergosterol depletion but also in accumulation of methylated sterol 14α-methylergosta-8, 22 (28)-dien-3β, 6α-diol. We deleted the ERG3 gene, which encodes a sterol 5, 6-desaturase, in C. albicans, and the deletion resulted in reduced susceptibility of the mutant to azoles. Sterol analysis revealed that erg3 mutant lost both ergosterol and diol when cultured with fluconazole.

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工業的・医学的に重要視されている酵母Candida tropicalisでは,グルコースを炭素源とする半合成液体培地にエタノールを添加した培養で,高率に菌糸形成が誘導される.C.tropicalisのエタノール添加培養と,無添加の酵母型増殖を示す培養との間での遺伝子発現の差異を利用し,両者で共通に発現する遺伝子をハイブリド形成させて差し引くサブトラクション法によって,この菌糸形成過程で強く発現する遺伝子群を残し,それらを単離する方法を開発した.サブトラクションの後にクローン化した遺伝子群の相補的DNAの塩基配列を決定し,相同性検索を行ったところ,分裂酵母のチアミン生合成遺伝子nmt1⁺やパン酵母のチアミン合成遺伝子THI5と相同性の高いホモログ(Ctnmt1⁺と命名)が分離された.Ctnmt1⁺の転写発現は,エタノール無添加培養では,対数増殖期後期で強く,定常期に入る前のPost-diauxicな増殖期では微弱となった.一方エタノール添加培養での発現は,酵母の脱極性化の進む第一相で強く,菌糸の伸長が起こる第二相で微弱となった.第一相の増殖期にチアミンを培地に添加すると,その後の菌糸伸長に遅れを生じ,酵母型に近い短い菌糸が連鎖し枝分かれした菌糸体が形成された.
この遺伝子を機能喪失させるため,URA3及びハイグロマイシン耐性の遺伝子を挿入させて遺伝子破壊を行ったところ,エタノール無添加培養でも菌糸形成が起こるようになり,またチアミンの類似物であるオキシチアミン添加によっても,エタノール無添加培養で菌糸が形成されるようになることから,Ctnmt1⁺の発現によるチアミン生合成は菌糸の伸長を第一相でむしろ抑制することにはたらいていることが示唆された.さらにこの遺伝子破壊株がチアミン要求性にはならないことから,C.tropicalis酵母には,Ctnmt1⁺以外にもチアミン生合成に必須な別の遺伝子群があることが示唆された.

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出芽酵母において,外界の無機リン酸濃度の変化を敏感にキャッチして細胞内のリン酸代謝を巧みに制御する系としてPHOシステムが知られている.この制御系においてきわめて重要な役割を果たしているのは負の制御因子として発見されたPho85である.病原性酵母Candida albicansより当研究室で分離したプロテインキナーゼ遺伝子は解析の結果,出芽酵母のゲノム塩基配列におけるPho85との相同性(62% identity,アミノ酸レベル),イントロンの位置の類似性,出芽酵母pho85変異の相補性,Pho85と同様のATP結合ドメインおよびキナーゼドメインの存在,等の事実から出芽酵母PHO85のホモログ(CaPHO85)と結論された.

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遺伝子制御発現系は,遺伝子の機能解析を行うのに便利な道具として,原核生物,真核生物を問わず,多くの生物種で使用されている.しかしながら,病原性真菌では,遺伝学的背景が複雑なため,形質転換法やhost-vector系など,遺伝子操作の手法や道具の確立が遅れ,確立された遺伝子制御発現系も少ない.Candidaにおいては,いくつかの遺伝子発現系が利用できるが,その多くは使用するプロモーターの性質上,機能しうる培養条件が限定されるなどの実験的な制約をうけている.そのため,宿主体内での遺伝子機能の解析も含め,いろいろな培養環境で使用できる,新しい遺伝子発現系の構築が期待されている.
本総説では,この問題を解決するべく構築した,テトラサイクリン応答性遺伝子発現制御系について報告する.また,この系が,ある遺伝子が抗真菌剤の標的分子になるか否かを評価するのに適した手法であるだけでなく,化合物の探索(screening)や評価(evaluation)にも応用可能であることも併せて紹介する.

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The Japanese Society for Medical Mycology (JSMM) decided in 2002 to establish guidelines for the clinical evaluation of antifungal agents. The JSMM committee presents here guidelines for the clinical evaluation of topical antifungal agents in the dermatology field. “Guidelines for the Clinical Evaluation of Antibiotic Agents” established by the Japanese Society of Chemotherapy were referred to, and the diseases subjected to clinical evaluation include tinea (tinea pedis and tinea glabrosa), cutaneous candidiasis, and pityriasis versicolor.
Among superficial mycoses, tinea pedis is viewed as the pivotal disease because it is intractable and is the most common. Therefore, the clinical efficacy of antifungal agents for external use in this condition should be established, and tinea pedis is subjected to phase III clinical studies. If efficacy of the antifungal agents is confirmed in the treatment of tinea pedis, a comparative study need not necessarily be performed for tinea glabrosa. If the number of patients is adequate for statistical analysis, a comparative study should be considered for both cutaneous candidiasis and pityriasis versicolor. However, if the number of patients is low, the efficacy of the agents should be evaluated based on their antifungal activity on pathogens and the results of open trials, and a comparative study is not necessarily performed for such diseases. The safety should be strictly evaluated.

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生毛部白癬に対するterbinafine 250mg/日,2日または3日間の短期投与法の有効性を検討した.投与期間は,連続2日間投与群17例と連続3日間投与群24例の2群ヘオープンに割り付けた.その際,外用剤は併用しなかった.効果判定は,2週間目にその臨床効果と真菌検査結果を総合して判定した.結果は,2日投与群では著効5例,有効3例,やや有効9例で,有効以上47.1%,著効以上29.4%,菌陰性化率47.1%であった.3日投与群では著効12例,有効4例,やや有効8例で,有効以上66.7%,著効以上50.0%,菌陰性化率66.7%であった.総合効果判定は,両治療群間においてWilcoxonの順位和検定では有意差はなかった.いずれの群においても副作用は,認められなかった.今回の結果より,生毛部白癬の治療ではterbinafine錠250mg/日の2～3日間投与程度の短期少量投与でもある程度の良好な結果が得られることが示唆された.

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本研究ではcyclophosphamide(CY),5-fluorouracil (5-FU),doxorubicin(DXR)またはprednisolone(PS)の前処置によって免疫抑制状態にしたマウスにactive hexose correlated compounds (AHCC)を腹腔内前投与した場合のCandida albicans感染に対する感染防御効果について検討した.CYまたは5-FU処置群におけるAHCCの腹腔内前投与はC.albicans感染に対する防御効果を示した.またDXR処置群においてもAHCCはC.albicans感染に対する防御能をわずかに亢進したが,PS処置群においてはAHCC投与による防御能亢進はみられなかった,つぎに5-FU処置群で,AHCCの経口投与による感染予防効果とその機序について調べた.AHCCの2.5%経口投与群は非投与群にくらべて有意な感染防御能亢進を示した(p<0.05).AHCC経口投与群の末梢血中の好中球数は非投与群と比較して有意な高値(p<0.05)を示し,腎内C.albicans生菌数においてもAHCC経口投与群で減少がみとめられた(p<0.01).以上の成績から,制癌剤によって好中球が減少した宿主でAHCCは感染防御能を亢進することが示され,その機序として好中球の機能亢進が示唆された.

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The role of chlamydospores in the conversion process from a mycelial-to-yeast form using the slide culture method was studied. Three clinical isolates and two other isolates from armadillo, belonging to the fungal species Paracoccidioides brasiliensis, were cultured on Sabouraud dextrose agar (SDA), potato dextrose agar (PDA) and brain heart infusion dextrose agar (BHIDA). Initially, the mycelial forms of each isolate were grown at 25°C for 7, 14, 30 or 60 days on slide cultures and then the temperature was shifted to 35°C. Interestingly, the slide cultures of all the isolates at 25°C formed chlamydospores on either SDA or BHIDA, whereas, on PDA medium, aleurioconidia were formed. If the slide cultures on BHIDA were incubated at 35°C for 7 to 14 days, multiple budding forms could be observed. This phenomenon was not evident in the slide cultures of SDA or PDA. The results of this morphological study indicate that in P. brasiliensis, chlamydospores may play an important role in the conversion process from a mycelial-to-yeast form.

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Immunomagnetic separation (IMS) was utilized for the selective isolation of Cryptococcus neoformans from environmental sources, such as soils and pigeon droppings. Magnetic beads coated with anti-cryptococcal IgG (serotypes A and B) were used to isolate the fungus. In a modeled spiking experiment using C. neoformans serotype A strain and anti-serotype A antibody, the recovery rate of the cells was more than 47%. Specificity experiments using C. neoformans and Candida albicans showed that the beads, when coated with specific antibody for C. neoformans, were highly effective for the separation of C. neoformans strains from C. albicans (more than 97%). The IMS of serotype B cells with purified anti-serotype B antibody indicated a high specificity. When this IMS technique was applied to soils and pigeon droppings, C. neoformans cells were selectively isolated from 3 out of 8 samples, and C. neoformans DNAs were identified by PCR. Therefore C. neoformans cells were thus selectively isolated and the efficiency of the technique further confirmed.

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