シロイヌナズナ側根形成変異体を用いた分子遺伝学的な解析から、側根形成においてSLR/IAA14やAuxin Response Factor 7 (ARF7)およびARF19によるオーキシン誘導性の転写制御が重要であること、さらにこれらの下流でLateral Organ Boundaries domain 16/Asymmetric Leaves2-like 18 (LBD16/ASL18)およびLBD29/ASL16が機能することがすでに明らかになってきた (Okushima et al. 2007)。LBD/ASLタンパク質群も核に局在し、転写因子として機能すると考えられている。そこで、側根形成で機能するLBD16/ASL18の下流遺伝子の同定を目的に、側根形成能が顕著に低下したarf7 arf19二重変異体背景においてLBD16/ASL18の時期特異的な機能活性化によって発現が上昇する遺伝子を、マイクロアレイにより抽出した。得られた解析候補遺伝子のうち8遺伝子についてReal-time PCRにより発現解析を行ったところ、LBD16/ASL18の機能活性化によるこれらの遺伝子の発現誘導が確認できた。また、2遺伝子については、arf7 arf19、slr-1、lbd16-1各変異体における発現のオーキシン誘導性が低下していた。本発表では、各候補遺伝子の解析状況について報告する。

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双子葉植物の側根は、根の内鞘細胞の分裂によって新たな側根メリステムが形成されることで形作られる．シロイヌナズナにおいてこの過程は、SLR/IAA14を始めとするオーキシン応答リプレッサータンパク質Aux/IAAと，オーキシン応答転写調節因子ARF (Auxin Response Factor)であるARF7, ARF19を介したオーキシンに応答する遺伝子発現によって制御されている．さらにARF7/19の直接の下流でLBD (Lateral Organ Boundaries-domain)/ASL (Asymmetric Leaves2-like)ファミリーに属するLBD16/ASL18とLBD29/ASL16が発現制御され，側根形成に関与することが示された(Okushima et al., 2007)．LBD/ASLファミリーは植物特有のファミリーであり，シロイヌナズナには42のLBD/ASL遺伝子が存在する．LBD16の単独欠損変異体は顕著な表現型を示さないことから，このファミリーには機能の重複性があることが示唆されている．本研究では，根においてオーキシンによって発現誘導されるLBD/ASL遺伝子群(LBD16, 17, 29, 33)に注目し、それらの側根形成における機能を明らかにすることを目標として，多重変異体の作成，各遺伝子の発現部位の解析を行っている．

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イネはいわゆる“ひげ根状根系”を形成し、地上部茎葉節から数多くの不定根（冠根）を発生させる。イネではこれまでにAUX/IAAおよびARFタンパクによるオーキシンシグナル伝達系の下流に位置し、AS2/LOBドメインをコードするCRL1遺伝子がこの冠根形成に関与していることが判明している。そこでcrl1変異体と同様に冠根原基のinitiationが阻害されるcrl5変異体の原因遺伝子の単離を試みた結果、CRL5遺伝子はシロイヌナズナのAINTEGUMENTAと相同性の高いタンパクをコードしていることが判明した。本遺伝子はCRL1遺伝子と同様にオーキシンによりその発現が誘導された。一方、crl1 crl5二重変異体の表現型を解析するとともに各変異体でのCRL1あるいはCRL5遺伝子の発現性を解析した結果、CRL1とCRL5遺伝子は冠根形成に関して異なる経路で機能していると考えられた。そこで現在はcrl1およびcrl5変異体を用いたマイクロアレイによる個々の冠根形成経路の下流因子について網羅的に探索を行っている。今回の発表ではCRL5遺伝子の過剰発現による解析や、CRL下流遺伝子候補についての発現解析ならびにノックアウト変異体の解析結果について報告する。

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ネナシカズラはヒルガオ科に属する、完全寄生性の被子植物である。ネナシカズラは茎から吸収器官（いわゆる寄生根）を形成して宿主植物に寄生する。ネナシカズラの寄生根形成では、宿主植物に巻きついた茎の皮層細胞から、頂端分裂組織と類似した分裂細胞群が一過的に発生し、それが寄生根へと分化する。我々は、ネナシカズラの寄生根分裂組織形成の分子機構の解明を目的として、頂端分裂組織の形成・維持に関わる種々の遺伝子を単離し、寄生根形成過程における発現について調査している。これまでに、class1 KNOXファミリーやNACファミリーに属する遺伝子など、シュート頂分裂組織の発生に関わる遺伝子が、寄生根形成過程において発現することが明らかとなっている。しかし、寄生根形成過程における、皮層細胞から分裂組織が新たに形成される機構や、形成された分裂組織が寄生根分化後に消失する機構については明らかとなっていない。そこで、本研究では、新たに、不定芽形成の際に発現が誘導されるCUP-SHAPED COTYLEDON2と、幹細胞の形成・維持に働くWUSCHEL、CLAVATA1の各相同遺伝子をネナシカズラから単離し、寄生根形成過程における発現挙動を調査した。得られた結果について、寄生根分裂組織の形成過程において発現が上昇する遺伝子に関するこれまでの知見を交えて議論する。

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E.globulus は成長性、パルプ化適性に最も優れた樹種として知られており、オーストラリア、チリ、ポルトガルなどでの植林においては主要な樹種とされている。しかし、E.globulus は発根率の低さ、根系の発達不良などから挿し木による増殖が難しい。そこで、我々はE.globulus の組織培養によるクローン苗増殖法について検討している。
今回、高濃度CO₂（1,000ppm）条件下でのE.globulus の不定根形成に与える影響について調査した。その結果、高濃度CO₂により、E.globulus の発根率は著しく上昇し、根系の発達（根の数、長さ）が確認された。リブロース二リン酸カルボキラーゼ小サブユニット（rbcS ） の遺伝子発現を調べたところ、高濃度CO₂ 施用後2～4日目から発現の上昇が見られた。これは、高濃度CO₂ によるE.globulus の発根率の上昇は光合成活性の増加によるものであることを示唆している。また、オーキシン極性輸送阻害であるN-1-naphthylphalamicb acid (NPA) 処理により不定根形成が抑制されることから、高濃度CO₂条件下での発根率上昇には、内生オーキシンが重要な役割を果たしていることが考えられる。現在、不定根形成に内生オーキシンが与える影響について詳細に検討している。

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白色光、酸性条件下（pH 4）でレタス芽生えを培養すると根毛形成が誘導される。地上部を切除した芽生え（単離根）を同条件下で培養すると根毛が全く形成されず、同時にクロロゲン酸（CGA）の含有量も低下するが、CGAを培地中に添加すると根毛形成の回復が見られたことなどからCGAが酸性条件下での根毛形成に必須であることを以前に報告した（第46回日本植物生理学会年会、2005、新潟）。
暗黒下では無傷芽生えであっても酸性条件による根毛形成は全く起こらなくなるが、CGAを添加すると根毛形成の回復が見られた。さらに、暗黒下での根のCGA含有量が白色光下と比較して3分の1に減少することから、酸性条件下での根毛形成においてCGAは光によってその合成を誘導され促進的に働く可能性が示唆された。しかし、単離根においては、酸性条件下でも暗黒下ではCGAによって根毛形成が回復しなかったことから、地上部はCGA以外の根毛形成に必須な要因を供給していることが示唆された。CGAと共に糖を培地に添加すると、暗黒下、酸性条件下の単離根でも根毛形成の回復がみられた。また、単離根の培地に糖を添加し白色光を照射すると、CGAの顕著な合成と根毛形成の回復がみられた。
以上の結果から、光は少なくとも糖の供給とCGAの合成を介して根毛形成に働いていると考えられる。

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植物は病原因子から身を守りつつ成長する為の感染応答の仕組みを持つ。我々は、感染応答機構で働くCC-NB-LRRファミリーに属するUNI遺伝子の変異により、感染応答反応の一部が常に生じるとともにユニークな形態の異常を示すuni-1D変異体を用いて、感染時における形態変化というほぼ未解明な現象の解明に取り組んでいる。この研究は、感染応答と形態形成を結ぶ分子機構に迫るとともに、形態形成の制御機構を解明する為の全く新しい切り口の発見にも結びつくと考えている。
uni-1D変異体の特徴として、感染応答の指標の一つであるPR1/5遺伝子の発現上昇、葉腋での異所的な腋性分裂組織形成、茎頂分裂組織の維持機構の異常、の三つがある。まず分裂組織の制御に関わる遺伝子の変異体や発現レポーターなどを用い、uni-1D変異体での分裂組織に関わるイベントを解析した。さらに、uni-1D変異体の形態異常を抑圧する変異体を複数単離し解析した。これらから、uni-1D変異体の上記の特徴に、共通して関わる機構と別個に関わる機構の存在が示唆された。興味深いことに、抑圧変異体の中には単独変異体として分裂組織にユニークな異常を示すものもあり、uni-1D変異体で影響を受ける機構には野生型においても形態形成に関わるものがあることが示された。uni-1D抑圧変異体探索が形態形成の新奇な制御機構の発見につながると期待される。

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植物の道管は、縦に連なった細胞が連続的に管状要素と呼ばれる細胞に分化することで形成される。その際の分化誘導因子として、私たちのグループではヒャクニチソウ葉肉培養細胞から分泌されるアラビノガラクタンタンパク質xylogenを見出した。シロイヌナズナにおいても、これと相同性の高いタンパク質をコードしている遺伝子は数多く存在し、このうちヒャクニチソウxylogenと最も相同性の高いAtXYP1およびAtXYP2はxylogenとして協調的に働いている。これらxylogen様遺伝子に関する網羅的な発現解析を行った結果、主にxylogenとしての機能を担っているのは根や節などの維管束に発現の見られるAtXYP2であると予測された。XylogenはGPIアンカー型タンパク質であり、極性を持って細胞外へ分泌されることがその機能にとって重要と考えられるため、AtXYP2内部にGFPを導入したレポーター遺伝子を作製し、シロイヌナズナ個体中でのAtXYP2の局在について詳細な解析を行った。その結果、根の中心柱において分化段階ごとに異なるAtXYP2の特徴的な局在が観察された。また、輸送小胞により極性を持って細胞外へと輸送されることが示唆された。現在、各種植物ホルモンおよび輸送関連遺伝子の突然変異体を用いてその局在に与える影響を解析中であり、これらを基にAtXYP2の挙動に関する報告を行う予定である。

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葉緑体の機能分化の制御機構を解明する目的で、アクティベーション・タギングにより脱分化細胞においても光合成遺伝子が発現するcallus expression of RBCS (ces) 遺伝子群を報告した (Plant Cell Physiol., 47, 319-331, 2006)。これらと相対する制御として、カルスの緑化を抑制する遺伝子群の探索を試みた。カルスが緑化する培養条件を用い、アクティベーション・タギングにより、緑化カルスが黄化するsuppressed greening of calli (sug) 変異系統を選抜した。
変異系統カルスからDNAを調製し、thermal asymmetric interlaced (TAIL)-PCRを行った。その結果、4遺伝子座を同定した。これら遺伝子座近傍の遺伝子発現をリアルタイムRT-PCRにより解析し、エンハンサーによって発現が増大している遺伝子を特定した。増大が認められた遺伝子をSUG遺伝子候補とした。これらを植物およびカルスにおいて強制発現させ、形質転換体を解析することにより、SUG遺伝子の同定を試みた。また、植物体においては、緑化の抑制は致死となり、形質転換体が選抜できない可能性がある。このため、ホルモン誘導型ベクターpTA7002を用いた形質転換も行った。

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穀類の収量を増加させるには、植物を倒伏させずに穎花（粒）数を増加させることが最も重要である。穀類の育種においては、半矮性は穂が地表に倒伏するリスクを少なくする望ましい形質である。イネ密穂型変異体dense panicle 1 (dn1)は全生育期間にわたって半矮性で、ポテンシャルとしての個体あたり粒重も増加していた。dn1個体では、粒重は小さくなるが個体あたり穎花数は反対に増加する。原因遺伝子は過去50年にわたり、中国のジャポニカ高収量品種群の育種に利用されてきた。dn1個体の細胞や各種器官は長さが短く幅が広くなった。ブラシノステロイド、ジベレリン、サイトカイニンないしはオーキシンに対するdn1個体の反応は、野生型と異ならなかった。単離したDN1遺伝子は主に葉的器官の原基で発現していた。DN1が膜貫通型ドメインを持つこと、変異型は膜貫通型ドメインのC末側の大半を欠失すること、タマネギ表皮細胞へのトランジェントアッセイではDN1は細胞膜と核に局在するが変異型では核への局在は見られなくなることから、DN1は膜貫通型レセプターで細胞外からのシグナルを受容すると細胞内ドメインが切断されて核に移行すること、細胞外ドメインを失うことによりシグナルが伝達されなくなり、半矮性および穎花数増加がもたらされることが示唆された。

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アサガオは光条件に敏感な短日植物で、幼植物期の茎頂は暗処理後2時間で成長相が生殖成長へと移行する。我々は、アサガオ茎頂における花成誘導初期の成長制御機構の解明に向け、茎頂の機能維持に関わる遺伝子の単離を試みた。
その結果、茎頂の機能維持について中心的な役割を果たすWUSCHEL（WUS）遺伝子とSHOOTMERISTEMLESS（STM）遺伝子及び花成初期に発現が誘導されるFRUITFUL（FUL）遺伝子オーソログ（それぞれPnWUS1、PnSTM1、PnFUL1）が単離された。茎頂内における発現をin situ hybridizationによって解析した結果、3遺伝子ともに他植物オーソログ遺伝子と類似した発現様式を示した。 また、近年WUS遺伝子とSTM遺伝子についても花形態形成への関与について解析が進められていることから、アサガオでも花成誘導初期の茎頂と花器官における3遺伝子の発現を解析した。その結果、PnFUL1遺伝子は早くも暗処理終了時に対照区の10倍以上の蓄積が見られ、花器官では萼片を中心に広く全体に蓄積していた。一方、PnWUS1とPnSTM1遺伝子は花成誘導初期の茎頂内における蓄積量に大きな変化は見られなかった。これらの結果について、他植物で報告されている花成誘導と花器官形成のメカニズムと比較・考察した。

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シロイヌナズナTERMINAL FLOWER 1 (TFL1) は、開花を遅延させ、花序メリステムを維持する働きを持つ。一方、TFL1とアミノ酸配列が59%保存されているFLOWERING LOCUS T (FT) は、開花を促進させる。これまでの研究から、これらタンパク質は花成制御に関与するbZIP転写因子FDおよびFD PALALOG (FDP) に結合して機能調節を行うというモデルが提唱されている。すなわち、TFL1はFDの転写活性能を抑制し、FTはFDの転写能を活性化させると考えられている。しかしながら、TFL1ならびにFTがどのようなメカニズムで転写調節に関与しているかについては明らかにされていない。そこで、我々は植物体内でのTFL1およびFTの分子機能を確認するために、転写活性化ドメインや転写抑制化ドメインを融合したTFL1およびFTタンパク質をシロイヌナズナに導入し過剰発現させた。本発表では、その表現型とターゲット遺伝子の発現解析の結果について報告する。また、TFL1、FTとFD、FDPとのタンパク質間相互作用を酵母two-hybrid系を用いて解析した結果、ならびにtfl1、ftとfd、fdp変異体との遺伝学的解析の結果についても報告したい。

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シロイヌナズナの花茎は方向性をもって伸長を開始する。小花柄と果実の伸長方向がより下向きになるcorymbosa1 (crm1 )/big 変異体を用いた抑圧変異体の単離により、伸長方向の変化が正常なLEAFY (LFY )の機能に依存すること明らかにした。さらにcrm1 変異体ではLFY の発現量が発生後期にのみ増加していることがわかった。そこで誘導系を用いて発生後期にLFYを活性化すると、小花柄の向軸側と背軸側の偏差成長の欠損と導管の過剰な発達が起こって、小花柄と果実がより下向きに伸長した。この変化に対応して、極性と維管束、特に導管の発達を制御するREVOLUTA 遺伝子の異所的な発現が見られた。
次にLFY から伸長方向の決定に至る分子カスケードの解明を目指し、LFYに転写活性化される直接標的遺伝子、APETALA1 (AP1 )に注目した。ap1 変異体でAP1を活性化した場合、LFYを活性化した場合よりも小花柄と果実の伸長方向に対する影響は小さくなった。一方、ap1 変異体でLFYを活性化した場合は、lfy変異体でLFYを活性化した場合とほとんど同様の変化が観察された。これらの結果から、適切なLFY の発現がAP1 だけでなく、さらに重要な他の因子を介して、小花柄の極性と維管束の発達の度合いに影響を与え、小花柄と果実の伸長方向を決定することが示唆された。

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分枝パターンは植物地上部の形態を決定づける大きな要因の1つである。イネの栄養生長期では分げつとして、生殖生長期では枝梗および穎花として分枝が形成される。イネlax panicle 1 (lax1) は生殖生長期における分枝形成が抑制された変異体として単離され、原因遺伝子であるLAX1はイネの分枝形成に重要な役割を果たす。LAX1 mRNAは新しく形成される腋生分裂組織の向軸側境界部で層状に発現し、分裂組織そのものでは発現が観測されない。従ってLAX1シグナルが腋生分裂組織へ伝わると考えられるが、この細胞非自律的な現象の分子機構は不明であった。
今回我々はGFP::LAX1及び3xGFP::LAX1融合タンパク質を用いた解析からLAX1タンパクが境界部位から腋生分裂組織へと時期特異的に移動しており、その移動が腋生分裂組織の形成・維持に必要であることを明らかにした。また我々はlax1変異体では栄養生長期における腋芽形成にも欠失があることを見出した。そこで、in situハイブリダイゼーションにより腋芽形成過程におけるLAX1の役割を調査したところ、LAX1はP4ステージ特異的に機能することが判明した。P4ステージは腋生分裂組織の細胞数が確保される時期であり、従ってLAX1は腋生分裂組織細胞の分裂活性を正に制御することにより分枝形成に役割を果たすことが示唆された。

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植物のほとんどの器官は、分裂組織（メリステム）から形成される。この際に重要なのは、メリステムと器官、あるいは器官同士を物理的に隔てる境界部を作ることである。シロイヌナズナのCUC1, CUC2及びCUC3遺伝子はNACドメインをもつ転写因子をコードし、一生を通じてシュート器官の境界部で機能する。
境界部形成の仕組みを調べるために、CUC1タンパク質の直接の転写ターゲットを、マイクロアレイとin situ発現解析によって複数得た。そのうちのひとつ、LIGHT- DEPENDENT SHORT HYPOCOTYLS 4 (LSH4)は、核局在性のタンパク質をコードする。LSH4は胚、栄養成長期、生殖成長期において、器官境界部で発現していた。興味深いことに、LSH4を過剰発現させると、葉にしわがよる・葉柄と葉身の区別がなくなる・花に余分な器官ができるなどの異常を示した。
シロイヌナズナでLSH4にもっとも高い相同性を示すLSH3遺伝子も、LSH4と同じくシュート器官の境界部で発現していた。また、CUC1によってその転写が直接誘導されることも示された。本会では、境界部で働くLSH3とLSH4の機能解析について発表する。

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我々は、ゴマノハグサ科のトレニアをモデルに、新形質を有する花きを効率的に作出する手法の開発を複数のアプローチで進めている。ここで得られた植物に、第2ウォールが萼化した変異体(系統番号252)が見出された。この変異体の表現型は、花器官形成のABCモデルにおけるクラスB遺伝子機能の欠損に原因があると予想された。本研究は、この252変異体表現型の原因遺伝子の特定と、トレニアにおける花器官形成に関わる情報の収集を目的とした。
トレニアのクラスB遺伝子の発現をRT-PCRにて解析した結果、変異体ではTfGLOの発現が全く認められなかった。しかしながら、変異体におけるTfGLOのゲノム配列に変異は見られなかった。このことから、変異体におけるTfGLOの発現の欠損は、上流の発現調節因子への変異に起因することが推察された。他植物種では、クラスB遺伝子の発現に関与する調節因子としてSQUA、LFYおよびUFOが報告されている。これら因子の発現をRT-PCRにて解析した結果、変異体ではTfUFO mRNAの蓄積が減少していた。変異体におけるTfUFOのゲノム配列を調べた所、アミノ酸置換が生じる変異が認められた。変異体でTfUFOを過剰発現させると変異表現型が回復し、野生型でのRNAiによるTfUFOの抑制が変異体と同様の表現型を示したことから、変異の原因はTfUFOの機能喪失であることが示唆された。

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花き園芸植物は古くから交配育種により新しい花色や花形の作出が試みてこられたが、多大な時間と労力を要する。近年形質転換による分子育種は、従来育種では得られない形質を持つ花きの作出を可能にしている。花き園芸植物はゲノムやEST情報が乏しいが、シロイヌナズナの遺伝子が異種間でも機能し、容易に形質変化を誘導できることが示されている。一方でどの遺伝子が有用形質を付与するかは、形質転換体作出後でしか評価できないという問題もある。この問題を解決し、効率的に新規の有用形質を選抜する方法として、我々はマイクロアレイデータよりシロイヌナズナの花で発現が高い転写因子42遺伝子を選抜し、このキメラリプレッサーコンストラクトを混合してアグロバクテリウムに導入し、これを用いてトレニアを形質転換するというバルク感染を行った。得られた形質転換体348系統のうち、表現型に何らかの変化が見られた約200系統について導入遺伝子を調査したところ、8割以上が単一遺伝子の導入であった。また、42遺伝子中39遺伝子の導入が確認された。単一遺伝子導入系統のうち約3割、遺伝子別では22遺伝子で、花色や花形における明確な表現型変化が観察された。以上のように、期待通り花での形質が変化したものが多数得られ、バルク感染により効率的に新形質花きを作出できることが示された。現在新たなバルクセットでトレニアの形質転換を行っている。

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基部被子植物やモクレン類、基部真正双子葉類といった祖先的な分類群の花は、不特定多数の花器官がらせん状に配列する。特に、スイレン科やモクレン科、キンポウゲ科などのいわゆる多心皮類では、多数の雄しべ・雌しべがらせん状に配列する花を持つ植物が多く存在する。このような花を祖先的と考える真花説が提唱されている。それに対して、派生的な中核真正双子葉類は、花器官の数が一定で輪生状に配列する花が多い。このように、花の構成は中核真正双子葉類とそれ以前の分類群では大きく異なる。
花の形態形成を説明するABCモデルに関与するMADS-box遺伝子ファミリーは、中核真正双子葉類の基部で重要な遺伝子重複が起きており、新しい又は副次的な機能分化が起きていると考えられる。つまり、中核真正双子葉類とそれ以前に分岐した分類群ではABC機能遺伝子群の機能が異なり、花形態形成のしくみが異なることが予想される。
そこで本研究では、基部真正双子葉類のキンポウゲ科に属し多心皮類の花形態を持つタガラシから、FUL-like, B, C機能遺伝子群を単離し発現解析を行った。発現解析の結果から、基部真正双子葉類と真正双子葉類との間で機能分化が起きている可能性が示唆された。さらに、多心皮類の花形態におけるFUL-like遺伝子群の役割を考察するために、多心皮類が多くの雄しべと雌しべを生み出す仕組みについて仮説を立てた。

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キクは三大花きとして世界中の園芸界で重要な品目である。花は受粉のため、様々な色の花弁を持つことで花粉媒介者を誘引する。しかし野生種の中には、無花弁のキクが存在する。
キク花弁の黄色はカロテノイドの蓄積による。花弁中のカロテノイドを分解して花弁を白色に保つCmCCD4a遺伝子が既に単離されており(本学会年会で発表済)、その発現は舌状花弁特異的である。舌状花の無い野生ギクでは、この遺伝子は機能する部位が無いため、機能を保っているのか、そもそもゲノム中に存在しているかどうか不明であった。
舌状花弁の無い野生ギクでCmCCD4aがゲノムに存在するかを調べた。2種の2系統ずつを供試すると、CmCCD4aが存在している系統が見出された。次に、このCmCCD4aが確かにカロテノイド分解酵素 (CCD)として機能しているのかを、舌状花弁は持つがCmCCD4aを持たない黄色栽培品種との交雑により解析した。CmCCD4aを持つ野生ギクとの実生からは例外なく白色花弁の後代のみ、かつCmCCD4aの無い野生ギクとの実生からは黄色花弁の後代のみ得られた。この事実から、舌状花弁のない野生ギクのCmCCD4aも、確かにCCD酵素として機能している事が解った。

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種子植物では雄性配偶体である花粉が葯で発達する。葯の中では配偶子体型および胞子体型の両方の組織があり、それぞれの組織で様々な遺伝子が発現することにより葯の発達を制御しているが、葯内の配偶子体型である小胞子あるいは花粉（Microspore/Pollen）と胞子体型のタペート細胞(Tapetum)の遺伝子発現プロファイルを比較した例はない。そこで本研究では、イネの葯を用いて小胞子あるいは花粉とタペート細胞での遺伝子発現をレーザーマイクロダイセクション法によりそれぞれの細胞から抽出したRNAを用いてマイクロアレイを行った。
葯の発達過程で小胞子・花粉あるいはタペートで有意に発現している遺伝子を28,141同定し、20のクラスターに分類した。いくつかのクラスターでは小胞子・花粉とタペートで同調的な発現パターンがみられた。また、いくつかのクラスターでは花粉の成熟、花粉の発芽、花粉壁形成等葯の発達過程で起こる生物学的な現象と遺伝子発現が関連づけられた。
本研究の一部は、文科省特定領域研究「植物ゲノム障壁」の支援をうけて実施された。

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葯発達過程における植物ホルモンの役割を包括的に理解するため、イネの葯における各種植物ホルモン量の測定を行うとともに、小胞子/花粉およびタペータムにおける植物ホルモン関連遺伝子群の発現をlaser-microdissectionと44Kマイクロアレイを組み合わせたLM-array法により網羅的に解析した。
活性型サイトカイニンおよびABAの成熟葯における内性量は他の器官に比べ大きな差は認められなかったが、IAAは他の器官より最低でも20倍以上、生物活性を有するジベレリン（GA₁およびGA₄）は最低でも5倍以上多く蓄積していた。
上記の植物ホルモンに加え、ブラシノステロイド, エチレン, ジャスモン酸の合成・シグナル伝達にかかわる因子をコードする遺伝子群の小胞子/花粉およびタペータムにおける発現を葯の発達ステージを追って解析したところ、それぞれの植物ホルモンにおいて特徴的な発現パターンが認められた。特にオーキシンとジベレリン（GA）の合成に必要な遺伝子群の発現は花粉の2核期から3核期にかけて顕著に増加しており、オーキシンとGAが花粉成熟期あるいはその後の発芽や花粉管伸長に重要であることが示唆された。一方、GAのシグナル伝達因子をコードする遺伝子群は小胞子やタペータムにおいて高い発現が認められた。本研究の一部は、文科省特定領域研究「植物ゲノム障壁」の支援をうけて実施された。

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近年、花粉を飛散しない雄性不稔スギが各地で発見され、スギ花粉症対策として利用する取り組みが進められている。富山不稔1号は最初に発見された雄性不稔スギであり、遺伝様式の解析により雄性不稔形質が単一の劣性遺伝子に支配されていることが明らかになっている。しかし、その分子機構は不明である。本研究では、スギESTのクラスタ配列情報をもとにDNAマイクロアレイを設計し、富山不稔1号のF2家系を用いて、正常個体と雄性不稔個体の雄花で発現する遺伝子の網羅的解析を行った。光学顕微鏡による花粉発達過程の観察では、花粉母細胞期や減数分裂期には違いが見られず、不稔個体では四分子から小胞子が放出される時期に崩壊することが確認された。マイクロアレイによる解析の結果、正常個体と不稔個体の雄花で4倍以上の発現量の有意な違いが見られたクラスタ配列数は、花粉母細胞期と減数分裂期では20程度であったのに対し、小胞子期では100以上存在した。雄性不稔個体の小胞子期において発現量の減少が見られた配列には、細胞壁の構築に関連する遺伝子と相同性を示す遺伝子が多かった。本発表では、マイクロアレイの結果を基に、雄性不稔原因遺伝子により影響をうける遺伝子群とその役割について考察する。

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ユビキチン化は最も主要なタンパク質翻訳後修飾の一つであり、標的タンパク質のプロテアソームによる分解を導くだけでなく、DNA修復や細胞内輸送といった細胞機能を導くシグナルとしても着目されてきている。標的タンパク質のユビキチン化はE1（ユビキチン活性化酵素）、E2（ユビキチン結合酵素）、E3（ユビキチン連結酵素）による一連の反応により行われる。これらの酵素自体が複合体を形成したり、エンハンサータンパク質と相互作用することから、1つの標的タンパク質のユビキチン化に関わるタンパク質は複雑なネットワークの中で機能していると考えられている。さらに、個体の発生ステージや組織ごとに標的タンパク質やそのネットワークが変化するケースも推測できる。
植物の雄性配偶子形成でも、ユビキチン化が重要な関連を持つことが示唆されているものの、標的タンパク質を含む関連タンパク質についての情報は極めて寡少である。そこで本研究では、雄性組織で発現して且つユビキチン化に関わるタンパク質の精製と同定を試みた。材料にはテッポウユリ葯を利用し、同定されたタンパク質のシロイヌナズナオーソログタンパク質を決定した。現在は、花粉で特異的に強く発現するタンパク質として同定された細菌型のPEPCに着目して、花粉発生における機能とユビキチン化との関連について調査を進めている。

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花粉母細胞が減数分裂を終えた四分子期にタペート細胞で一過的に発現するMS1遺伝子は、その後の花粉成熟に必須な転写因子をコードしている。ms1突然変異体では花粉壁エキシン構造が見られないことから、MS1はエキシン形成に必要な遺伝子群を制御していることが示唆されている。一方、MS1制御下の遺伝子群には、一連の脂質及びフェニルプロパノイドの生合成・代謝系遺伝子群が含まれている。エキシンはスポロポレニンと呼ばれる、脂質とフェニルプロパノイドから成る重合体を主成分とすることが示唆されていることから、これら遺伝子群はスポロポレニン生合成酵素遺伝子の可能性がある。これらのうち、リグニンモノマー生合成系のアシル基転移酵素遺伝子とホモロジーを有する遺伝子について、今回、遺伝学的・分子生物学的・メタボローム的手法を用いた解析からこの遺伝子機能を考察する。

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多くの植物の成熟花粉の表面は、ポレンコートと呼ばれる親油性物質の層で覆われている。ポレンコートには、紫外線からの花粉の保護、花粉媒介者である昆虫の誘引、花粉への粘着性付与による花粉媒介者への粘着などの機能がある。さらにポレンコートに含まれるタンパク質の中には、自己・非自己の認識（自家不和合性）に関与するものがあり、種の認識に関わる物質も含まれていると推測されている。このように植物の生殖に必要不可欠なポレンコートであるが、その成分や形成機構については未だ不明なことが多い。
本研究では、ポレンコート構成成分の同定とそれらの解明を目的として、まずはポレンコートの脂質・タンパク質成分の網羅的解析を試みた。シロイヌナズナの花粉表面から脂質成分を抽出しGC-MSで分析した結果、ポレンコートの脂質は主に炭素数24～31の直鎖飽和炭化水素、2位にメチル基を有する分枝炭化水素および各種のステロールエステルで構成されることが明らかになった。この他にも薄層クロマトグラフで検出できる脂質がいくつかあるので解析を進めている。また、分子量15000を超えるタンパク質のうち主要なものは十数種類しかないのに対し、それ以下の低分子量タンパク質やペプチドは多量に含まれていることが明らかになり、両者について順次同定を進めている。

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ホスファチジルイノシトール3キナーゼ（PI3K）はエンドサイトーシスや細胞増殖、気孔開閉や重力応答のシグナリングなど多様な生理機能を担っている。我々もシロイヌナズナのPI3K遺伝子（AtVPS34）を欠損した花粉が発芽できず雄性不稔になることを以前報告した。その後、GFP-AtVps34蛋白の花粉管での局在解析やatvps34/qrt変異体花粉の詳細な顕微鏡観察を進め、花粉発芽におけるPI3Kの役割について考察を行った。
AtVps34および、PI3Kの活性調節を行うAtVps15やAtVps30、いずれの破壊株も花粉の大半は正常な形態を示した。このことから、PI3Kは花粉の成熟には必須ではなく、花粉発芽特異的なシグナル伝達を制御していると考えられる。また、PI3K下流のシグナルイベントとして活性酸素種(ROS)の関与も想定している。ただ、atvps34変異体花粉の一部については、核分裂や液胞形態の異常が最近報告されている(Lee et al. 2008)。このような形態異常はatvps30花粉には見られず、完全なPI3K活性の欠損が花粉発芽とは別に花粉の発育にも影響を与えることを示唆している。

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ホウ素は植物にとって必須栄養素である。花粉管の伸長にもホウ素は重要であり、雄性不稔はホウ素欠乏症状の一つである。ホウ素トランスポーターBOR6,BOR7は花粉管で特異的に発現している。本研究では、BOR6,BOR7が花粉管伸長に必要なホウ素の輸送に関わると仮説を立て、その役割と受精に与える影響を明らかにすることを目的とした。
BOR6またはBOR7へのT-DNAの挿入をヘテロに持つ株をホウ素欠乏条件下で生育させ後代でのT-DNAの分離を調べたところ、T-DNAホモの割合が減少し、T-DNAを持たない株の割合が増加した。in vitroで花粉管を伸長させると、BOR6、BOR7にT-DNAの挿入をホモに持つ花粉の花粉管は野生型株に比べ短かった。次に、雌ずい内におけるin vitroでの花粉管の動向をアニリンブルー染色を用いて観察した。BOR6,BOR7双方にT-DNAの挿入をホモに持つ系統を自家受粉して観察するとホウ素欠乏条件下において、野生型株の花粉管より短かった。また、花粉管が雌ずい上部で伝達組織を出て胚珠に到達しているのが観察された。これらの結果から、BOR6,BOR7は受精の重要なプロセスである花粉管伸長に関わっていることが明らかとなった。また、BOR6、BOR7が機能することで花粉管が十分に伸長し、雌ずい内の全ての胚珠に到達することを可能にしていると考えている。

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単為結果とは植物において受精を経ずに果実形成・肥大する現象であり、植物ホルモンのジベレリンやオーキシンの関与が示されているが、果樹における単為結果機構の詳細は未だ不明な点が多い。そこで本研究はナシを用いて単為結果性機構を解明することを目的として行った。まず一部の品種が単為結果性を示すとされているセイヨウナシとチュウゴクナシを用いて単為結果性品種の探索を行った。チュウゴクナシ27品種、セイヨウナシ8品種及びセイヨウナシとニホンナシの雑種2品種を用いて除雄のみ、除雄＋自殖、除雄＋他殖の3区で試験を行った結果、チュウゴクナシ12品種、セイヨウナシ7品種及び雑種2品種の除雄あるいは除雄＋自殖区で果実形成が見られ、それぞれ9品種、5品種及び1品種で果実肥大が観察された。セイヨウナシの単為結果性は次世代でも観察されたことから優性あるいは半優性の形質であると予想された。一方、自家和合性ニホンナシの「おさ二十世紀」とチュウゴクナシの「慈梨」から自殖F2集団を作成し、257のF2集団中に単為結果性を示す3個体を見いだした。このうち1個体は雄性不稔であり、他2個体は種子形成が中断していた。これらと単為結果しないF2個体の開花時の花を用いて、マイクロアレイ解析を行った結果、3個体で共通に39遺伝子の発現が2倍以上変化していた。この結果から、3個体に共通の単為結果機構が存在する可能性が示唆された。

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機能未知の遺伝子OsCEO1が変異したflo2変異体は高温環境での登熟で生じる白未熟米と類似した胚乳を形成する。両者についての網羅的な遺伝子発現解析結果では共通して、デンプン生合成系や貯蔵タンパク質遺伝子、またATP合成酵素やリボソームや翻訳開始複合体遺伝子の発現が減少していた。前者は胚乳の主要な機能である物質貯蔵、後者は生物の基幹的機能を担う遺伝子群である。このことから、flo2変異体と高温登熟環境では細胞機能が著しく阻害されており、特にATPをはじめとしたエネルギー状態が悪化していることが考えられた。そこで開花後10日目の種子に含まれるATP濃度を解析したところ有意な低下が認められた。また、種子に含まれるタンパク質を解析したところ、完熟種子では一粒あたりの総タンパク質量と一部分子種の蓄積量低下が認められたが、開花後10日目の種子のタンパク質蓄積量は野生型よりも大きかった。これらのことから、flo2変異体と高温環境では登熟期に共通してATPが欠乏し、大規模な細胞機能の改編が起こっていることが推測された。また興味深いことに、シビアな表現型はむしろOsCEO1遺伝子後半部に塩基置換を持つ個体で観察され、前半部に終止コドンを生じたアリルでもマイルドな表現型が観察された。このことは、OsCEO1遺伝子の機能発現に複雑な機構が存在することを示唆している。

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イネのflo2変異体はデンプン生合成や貯蔵タンパク質に関わる遺伝子の発現量が低下し、種子の胚乳が白濁する表現型を示すことが明らかとなっている。このため、flo2変異の原因遺伝子はこれらの遺伝子群の発現を広範に制御する因子であると考えられる。精密マッピングを行った結果、この遺伝子座は第4染色体の110 cM付近の約37 kbの範囲に存在することがわかった。野生型と塩基配列を比べた結果、1つの遺伝子のコード領域内に終止コドンを生じる点変異が見つかった。また、独立した他の7系統のflo2変異体においても、この遺伝子に変異が生じていた。野生型のこの遺伝子のゲノム領域をflo2変異体に導入した形質転換体の種子は、正常な胚乳を生じ、胚乳デンプン組成も野生型に戻った。さらに、変異体で発現量が激減することがわかっているデンプン枝つけ酵素RBE1とアレルゲンタンパク質RA16の発現量も野生型と同程度に回復することが明らかになった。これらのことから、この遺伝子がflo2変異の原因遺伝子であることが同定された。そこで、この遺伝子をOsCEO1（Conductor of Endosperm Organogenesis 1）と名付けた。OsCEO1は葉と未熟種子で強く発現していることがわかった。酵母two-hybrid法により、OsCEO1と相互作用をする因子を探ったところ、14個の候補が得られた。

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トマトの栽培においては、様々な栽培環境不良によって結果不良になるという問題を生じる。そこで、結果安定のためには、果実形成や結果性機構の解明及び優れた形質を持つ単為結果性トマトの育成が求められている。本研究では、果実形成や結果に関与すると考えられるチトクロームP450(CYP78Aサブファミリー)の機能解析を行い、トマト果実形成に関与する重要因子の解明及び同遺伝子を制御した単為結果性トマトの作出を試みる。
これまでに、我々はトマトから4種類のCYP78 AサブファミリーのcDNA (LeCYP78A1-4)を単離し、LeCYP78A2の子房での発現が受粉や合成オーキシン処理により100倍以上に誘導されることを確認していた。今回、我々はこの遺伝子の機能を解析するため、トマトに過剰発現させたところ、果実の大きさや種子形成に変化が見られることを確認した。また、この遺伝子をRNAiで発現抑制した形質転換トマトは短節間、花器官の異常、葉の小型化などの形態変化を示した。以上のことから、LeCYP78A2はトマトの果実形成や形態形成に重要な遺伝子であることが示唆された。

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雑種致死を起こすタバコ種間雑種（N. gossei x N. tabacum）の培養細胞GTH4は細胞死を抑制する37度から26度への遷移で急速に致死する。他方、致死抑止型変異細胞GTH4Sでは細胞死は起きない。細胞死の進行には37度での遺伝子発現、タンパク質合成が必要であるため、GTH4とGTH4Sの比較から細胞死に関連する遺伝子やタンパク質を解析できる。今回我々は、GTH4に検出できるがGTH4Sには検出できない複数のタンパク質のイオン交換クロマト／SDS-PAGE およびMALDI-TOF MSによる解析から、細胞周期に関連するタンパク質であるAnnexin（AY14973）に着目した。AnnexinはSuppression Subtractive Hybridization法によりGTH4が優先的に発現する遺伝子のcDNAライブラリのスクリーニングでも検出され、GTH4の細胞死との関連性に興味が持たれた。データベース上に公開されたタバコ属植物のAnnexin遺伝子ファミリーの塩基配列情報をもとに複数の遺伝子についてRT-PCRにより両細胞での発現を調べた。AY14973はGTH4で発現していたが、GTH4Sでは全く発現せず、タンパク質の解析データと一致した。他方、生物／非生物的ストレスに応答するAY965682とAY965683はGTH4がGTH4Sよりも強く発現していた。

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我々は、動物のinhibitor of apoptosis protein (IAP) の保存領域に弱い相同性を示すBIR like domain (BLD)を保持するArabidopsis thaliana IAP like Protein 1 (AtILP1) およびAtILP2を新規細胞死制御候補因子として見出した(Higashi et al.,(2005) Apoptosis 10:471-480)。これまでに、タバコ培養細胞BY-2を用いた細胞死アッセイで、AtILP1およびAtILP2が細胞死に影響を与える可能性を示してきた(小林ら，植物生理学会第47回年会)。
ILPについて更に解析するため、タバコのILP遺伝子の単離と解析を試み、tblastn相同性検索の結果見出されたタバコBY-2由来のEST配列、AJ718124をもとに、RACE法により、ORFを含むほぼ全長のcDNA配列を決定し、NtILP1と名付けた。この配列を元に作成した過剰発現用コンストラクト、および RNAiによる、遺伝子発現抑制用コンストラクトを導入したタバコBY-2形質転換細胞を用い、Phytophtora cryptogea由来のタンパク質性エリシター(cryptogein)で誘導されるタバコのPCDに対するILPの効果より、植物のPCDにおけるILP遺伝子の役割について議論したい。

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シロイヌナズナのAtLSD1はプログラム細胞死(PCD)の負の制御因子であり、転写因子との相互作用を介し、細胞質リテンションタンパク質として間接的に転写制御を行うことを明らかにしてきた。AtLSD1はLSD1タイプのジンクフィンガーモチーフ(zf-LSD1)を3つ持つが、同様の構造を持つホモログAtLOL1は相反するPCDの正の制御因子である。貴報の論文やゲノム情報を利用して他の植物のzf-LSD1を3つ持つタンパク質を調べると、イネには3つ、トマト、ブロッコリーには2つ、ヒメツリガネゴケとクラミドモナスにはそれぞれ1つ存在することが明らかになった。酵母のツーハイブリット法を用いた解析を行ったところ、zf-LSD1を3つ持つこれらのLSD1様タンパク質も、シロイヌナズナのAtLSD1と相互作用する転写因子と”GxP”モチーフを介して相互作用することを明らかにした。AtLSD1のC末端領域には、AtLOL1には存在しない他の植物のLSD1様タンパク質と高い相同性を示す領域が存在するが、興味深いことに、ヒメツリガネゴケとクラミドモナスにはこの領域を持つAtLSD1型の遺伝子しか存在しなかった。これらの知見から、進化の過程で植物は新たにAtLOL1型の遺伝子を獲得し、タンパク質としての機能が高度に保存された複数のLSD1様タンパク質によるPCDの調節機構を獲得してきたと示唆される。

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シロイヌナズナのCLAVATA2（CLV2）には、系統間で異なるアミノ酸置換が多く蓄積しており、その中でもWs系統由来のCLV2^Wsの機能発現には、小胞体局在型の分子シャペロンHSP90であるSHEPHERD（SHD）が必要なことが、これまでの解析で明らかになっている。このことは、Ws系統のCLV2に生じた変異をSHDが隠蔽していることを示しており、「HSP90の作用によって変異を表在化させずに隠蔽した結果、系統間で多数の潜在変異が蓄積している」というRutherfoldとLindquistの仮説（1998）を支持する1つの証拠だと考えている。
そこでまず我々は、CLV2^WsのSHD依存性の原因となったアミノ酸置換の同定を試みた。部位特異的にアミノ酸を置換したCLV2^Ws遺伝子をshd変異体に導入してそのSHD依存性を評価し、CLV2^WsがSHD依存的になったのは1個のアミノ酸置換が原因であることを明らかにした。次に、シロイヌナズナ93系統のCLV2遺伝子のシーケンス解析を行い、32パターンのアミノ酸配列を同定した。このように多様なCLV2が上記の仮説に基づいて現れたのだとすれば、CLV2^Wsと同様にSHDによりその変異を隠蔽されているCLV2が他にも存在するはずである。そこで、代表的な15パターンのCLV2に着目し、それらのSHD依存性について解析を行った。

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側根の伸長は根の構造を決定する重要な因子の一つである。我々は、イネの分げつ芽の伸長が抑制されるreduced culm number 1変異体(rcn1)の解析から、RCN1/OsABCG5が腋芽伸長に必須なタンパク質であることを報告した。今回は、2種類のrcn1変異体rcn1-1とrcn1-2の根の構造を精査することでRCN1/OsABCG5の根の発達への影響を検討した。寒天培地上で28℃明期16時間/24℃暗期8時間条件で育苗したrcn1-2は、側根、冠根、種子根の伸長抑制がみられた。次に、同環境下にて液体培地で育苗したWTと両rcn1の種子根表面に出ていない側根と出ている側根数を比較した。種子根1cmあたりの出根側根と未出側根を加えた側根数で表される側根密度にはrcn1は影響せず、側根原基数への影響はなかった。一方、全側根に占める未出根の割合は、両rcn1で著しく増加した。根端から1cm毎に未出根の占める割合を比較すると、WTでは根端寄りに未出根が占めるのに対し、両rcn1変異体では、根端部から基部まで分布した。この基部までの未出根は、38℃明期16時間/34℃暗期8時間の高温条件下で育苗した両rcn1で消失し、高温で復帰する温度感受性であることが示された。以上より、RCN1/OsABCG5がイネの側根伸長と側根の出根の制御を介して側根の発達に影響することを明らかにした。

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植物の根と地上部の先端に存在するメリステム細胞は細胞の伸長に先立って急速に分裂を繰り返し、分裂活性の高い細胞が形成される。その後、細胞分裂活性は低下し、細胞の体積が劇的に増加して急激に細胞が伸長する。このような細胞の状態によりシロイヌナズナの根はメリステム領域と伸長領域とに明確に区別されている。通常メリステム領域の細胞数はほぼ一定に保たれており、根が伸長するにはメリステム領域と伸長領域の境界に存在する位置情報が重要な役割を果たしていると考えられている。しかし、この境界情報を制御し細胞を急激に伸長させる転写ネットワークは全く解明されていない。
このネットワークに関わる転写因子を同定する為に、我々の研究室で構築した詳細な根における遺伝子発現地図(Root Map)を用いた。急激な細胞伸長を制御する転写因子はメリステム領域と伸長領域の境界で遺伝子発現のピークを示すと考え、Root Mapからこの境界領域で発現のピークを示すいくつかの転写因子を選抜した。それらのT-DNA遺伝子破壊株の表現型を観察したところ、UPBEAT1(UPB1)遺伝子破壊株は野生型株より長い根を示した。
UPB1は現在までに詳細な機能解析がなされていない新奇の転写因子である。よってUPB1の機能を解析することで、急激な細胞伸長を制御する分子メカニズムに新しい知見をもたらすと考えられる。

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イネEL5遺伝子は、RING-H2フィンガードメイン（RFD）を含む膜局在性ユビキチンリガーゼ（E3）をコードしている。これまでに、RFD内のアミノ酸置換によってE3活性を改変したEL5を発現する優性阻害変異イネを作製した。EL5W165A（E3活性欠損型）を発現させたイネは冠根原基が壊死して無根になるが、EL5V162A（E3活性低下型）を発現させたイネ（mEL5-5）は硝酸態窒素を含まない培地では発根する。また、EL5W165A発現カルスではNO感受性が高まることが示されている。
今回、我々はmEL5-5の根をより詳細に解析した。硝酸態窒素非含有培地（－N培地）におけるmEL5-5の冠根長は、非形質転換イネ（NT）のものと有意差が認められなかったが、側根形成数は約4倍に増加していた。－N培地で冠根を伸長させたmEL5-5を1mM亜硝酸で24時間処理した結果、側根形成部に褐変化をともなう細胞死が観察された。しかし、亜硝酸処理によるNO産生量や産生部位は、mEL5-5とNT間で有意差が認められなかった。一方、亜硝酸処理によるROS産生量はmEL5-5でのみ増加し、その局在部位はNO局在部位や褐変化をともなって壊死する部位と一致した。以上の結果から、EL5は活性窒素シグナルの下流で誘導される活性酸素産生を制御することで、側根形成や細胞死抑制に関与していることが示唆された。

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細胞極性の形成における細胞内のカルシウムイオン（Ca²⁺）やホスファチジルイノシトール（PI）リン脂質代謝の関与は多くの真核生物で報告されている。我々は海産紅藻スサビノリの単胞子における細胞運動や細胞分化に必須な細胞極性形成機構の解析を行っているが，これまでに細胞運動に必須なF-アクチンの不均一分布の形成におけるPI3-キナーゼの重要性を明らかとしている。本研究では，さらに他のPI代謝関連因子とCa²⁺の役割について解析した。まず，単胞子の運動がカルシウムキレート剤（EGTA）とカルシウムチャネル阻害剤（LaCl₃）により完全に抑制されることを見いだした。この場合，同時にF-アクチンの極性分布が抑制されたことから，細胞運動における細胞外からのCa²⁺流入の重要性が示された。また，ホスホリパーゼC（PLC）とホスホリパーゼD（PLD）はCa²⁺依存的な活性調節を受けるが，F-アクチンの不均一分布を指標にした場合，PLC特異的阻害剤（U73122）が抑制的に作用したのに対し，PLD阻害剤（1-butanol）は影響を及ぼさないが細胞運動を阻害した。以上の結果より，単胞子の細胞運動時における細胞極性の形成とそれに基づくF-アクチンの極性分布は，Ca²⁺の細胞内への流入とそれに続くPLCの活性化で制御されること，さらに形成された極性の維持にPLDが関わっていることが示された。

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カルシウムイオン（Ca²⁺）は通常、細胞質内で極低濃度に維持されているが、外部刺激などによる細胞外やカルシウム貯蔵オルガネラからのCa²⁺の流入により、急激なイオン濃度の上昇が引き起こされる。このようなCa²⁺濃度変化は、カルモジュリンやCDPKなどのカルシウムイオンセンサーとなるCa²⁺結合タンパク質によってシグナルとして受容・伝達され、多様な生理的作用を誘導していると考えられている。
我々は植物細胞内でのCa²⁺が担う機能に注目し、Live cellでのCa²⁺の動態を観測するため、マメ科植物ミヤコグサにおいてCaイメージング技術を確立した。マメ科植物は菌根菌・根粒菌との共生において周期的なカルシウムイオン濃度変化であるカルシウムスパイキング（Caスパイキング）を示すことが知られている。その特徴的なオシレーションの振幅や周波数は共生シグナル伝達経路において何らかのシグナルをコードしているのではないかと考えられている。このCaスパイキングが誘導される根毛細胞内で、我々は共生型とは異なるパターンを持つCa²⁺濃度の周期的な変化が、根毛の伸長時に観測されることを発見した。この非共生型Caオシレーションの根毛伸長との関連を解析するとともに、共生型Caスパイキングとの比較解析をおこなった。

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植物の生長に伴う水吸収においては、道管の周囲の柔組織シンプラストをとりまくアポプラストカナルにおける溶質濃度分布が大きく寄与するというモデルが提案され、多くの有意義なシミュレーション結果や解析結果がすでに発表されている。しかし、アポプラストからシンプラストへの溶質の流出量と道管からアポプラストへの溶質の流入量については、厳密に計算されていなかった。そこで今回は、定常状態と非定常状態それぞれにおける量を計算して比較した。すなわちアポプラストカナルでは、定常状態においては、シンプラストへの溶質の流出量は、道管からの流入量と全く等しい。一方シンプラストへの溶質の流出量がステップ状に増加するときは、シンプラストへの溶質の流出量は、道管からの流入量より大きい。今回は、シンプラストへの溶質の流出量と道管からの流入量を直接計算して比較することにより、解析的にこれらを明らかにする。

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近年，シロイヌナズナゲノム解析の進展に伴い，多数の分泌型低分子ペプチドをコードする遺伝子群が見出され，それらの機能解明に大きな注目が集まっている．分泌型低分子ペプチドは，通常N末端に分泌型シグナルを持つ100アミノ酸前後の前駆体ペプチドとして翻訳されるが，チロシン硫酸化やヒドロキシプロリン化などの翻訳後修飾を受けた後に，プロセシングにより短鎖に切断され，成熟体として細胞外へと分泌されるタイプと，複数のシステイン残基（6-8残基）を介して分子内ジスルフィド結合を形成後そのまま分泌されるタイプに分けられる．我々は，前者の前駆体配列には構造的特徴（Cys残基が少なくC末端付近に保存配列を持つ遺伝子ファミリーを形成）があることに着目し，TAIRデータベースより候補遺伝子群をin silico抽出し解析を行なっている．また，それらの過剰発現株のアポプラスト成分をnano LC-MS/MS解析することで，翻訳後修飾の有無やプロセシングの位置など成熟型ペプチドの構造解析を進めている．我々は，この方法論により，チロシン硫酸化修飾を受けた新しい14アミノ酸ペプチドを同定した．このペプチドの発現部位や生理機能の解析経過について報告する．

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KODAはリノレン酸由来のオキシリピン類の一つで、乾燥ストレスを与えたアオウキウサや暗処理したアサガオの実生に内生することが確認されている。したがってKODAはストレス誘導物質、花芽形成促進物質として機能すると推測される。その生合成の過程は2段階で進行し、lipoxygenase（LOX）がヒドロペルオキシ基をリノレン酸の9位に導入し、続いてallene oxide synthase（AOS）が10位の酸化を触媒すると考えられている。オキシリピン類植物ホルモンであるJAではヒドロペルオキシ基が13位に導入され、12位はAOSによる酸化を受ける。しかし、シロイヌナズナのLOXコード遺伝子は6個存在するがAOSは1個だけであり、AOSの基質特異性を含めたこれらの酵素機能の詳細には不明な点が多い。シロイヌナズナに対するKODAの作用は連続噴霧投与によって花序や葉の伸長促進傾向が認められるが、明確ではない。そこで、シロイヌナズナのLOXおよびAOSの欠損および過剰発現株を作成し、それらの表現型とKODA内生量の関連を調べた。定量分析にはGC/MS法を用い、同位体で標識した合成KODAを内部標準に用いて測定を行った。その結果、野生型と比較してLOXやAOSの変異株では内生KODA量が変化する事、表現型の違いは葉身及び花序に現れる事が明らかになった。

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フタテンチビヨコバイは九州中部を北限として旧大陸の熱帯～亜熱帯に広く分布する昆虫で、様々なイネ科植物を寄主とする。本種に加害されたイネやトウモロコシでは、葉脈がこぶ状に隆起してゴール化するとともに、新規展開葉の生長が著しく抑制され萎縮する。この症状はワラビー萎縮症と呼ばれ、九州の飼料用夏播きトウモロコシでは、本症状による生産性の大幅な低下が問題となっている。ゴールや萎縮症は、ヨコバイの雌雄や成虫・幼虫を問わず、本種の吸汁時に展開する葉に生じることや、ヨコバイ除去後に展開する葉では発症しないこと、ヨコバイの密度や吸汁時間に依存して劇症化することなどから、ヨコバイが摂食時に植物体内に注入する化学物質が茎頂分裂組織や葉原基に作用することにより発症すると考えられる。
本種によるゴール形成機構を明らかにするため、LC-ESI-MS/MSを用いた一斉解析により、イネの吸汁葉やゴール形成葉、トウモロコシの茎頂分裂組織における植物ホルモンの定量を行った。その結果、イネの感受性品種では、コントロールに比べてゴール形成葉におけるサリチル酸量が少なくアブシジン酸量が多いこと、こうした違いは抵抗性品種では見られないこと、トウモロコシでは、ヨコバイによる吸汁開始から数日以内に茎頂分裂組織周辺にアブシジン酸が大量に蓄積することなどが明らかになった。結果を踏まえ、本種によるゴール形成機構について考察する。

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植物の発生から栄養生長、花芽分化から種子形成にいたる様々な局面で植物ホルモンは情報分子として極めて重要な役割を演じている。個々のホルモンは各々の情報伝達系を介し遺伝子発現を制御するとともに、他のホルモンとの量的バランスによる相互制御により、多様な作用を可能にしている。ここ数年主要ホルモンの生合成や情報伝達に関わる重要遺伝子が同定されたが、それらの機能や種々の変異体の表現型を生理学的に説明するには実際の組織中に存在する複数のホルモン分子種含量を知ることが重要である。我々は半自動固相抽出法とUPLC-タンデム四重極質量分析器を利用することで、活性型分子種を含むサイトカイニン23種、IAAとそのアミノ酸縮合体を含むオーキシン7種、アブシジン酸、そしてジベレリン12種の計43分子種を同じ植物試料から測定する方法を確立している。さらにカルボン酸修飾試薬ブロモコリンを利用することでジベレリンなど負に荷電するホルモン分子種の検出感度を数十倍に上昇することにも成功した。この方法を用いることで10 mg ～ 100 mg新鮮重量組織から同時に180サンプルの抽出・測定ができ、一連の変異体コレクションなどのホルモンプロファイリングも可能になった。現在この技術を利用して、イネの内生ホルモン量を支配する重要遺伝子座をQTL解析により探索している。この概要についても報告する予定である。

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アグロバクテリウム(A. tumefaciens)は根頭癌腫病を引き起こす。腫瘍誘発遺伝子群のうち6b遺伝子(AK-6b)を導入したタバコでは、1.ホルモンフリー培地で増殖を続ける、2.オーキシンの極性移動が低下する、3.6b遺伝子は転写因子として働く、4.オーキシンの局在を改変する、などが報告されている。今回我々は、オーキシン局在の重要性を明らかにするために、デキサメタゾン(Dex)誘発性のプロモーター制御下に発現されるAK-6bをもつ形質転換タバコに対し、オーキシンの細胞への流入キャリア阻害剤としてナフトキシ酢酸(NOA)を投与した。Dexのみを含むMS培地ではAK-6b-タバコ芽生えは子葉の裏側や周辺に腫瘍組織が生ずる。in situ hybridizationによる解析から、AK-6b遺伝子発現と腫瘍組織の部分とは良く一致していた。一方、Dexと共に種々の濃度のNOAを含む培地では子葉の腫瘍は縮小し、下胚軸に新たな腫瘍化が見られた。ベクターのみを導入したタバコではDexやNOAが存在しても形態変化はなかった。オーキシン応答性のレポーター遺伝子DR5::GUSによるGUSアッセイでは腫瘍組織と正常組織の結合部分に顕著な活性が見られた。以上のことからAK-6bによって局在化されたオーキシンがNOAによって再分配され、さらなる形態変化が引き起こされたと考えられる。

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被子植物を用いた実験において単離した植物細胞はオーキシン存在下で培養すると、細胞の分化転換を経て完全な植物体に再生するが、これらの過程におけるオーキシンの作用のしくみは不明な点が多い。我々は幹細胞への分化転換におけるオーキシンシグナリングの役割を明らかにするために、高い分化転換能を持つヒメツリガネゴケを用いて研究を進めている。ヒメツリガネゴケでは葉を茎葉体から切り離し光条件下で培養すると、切断面の細胞が原糸体幹細胞に分化転換するが、この過程は抗オーキシンBH-IAAによって抑制された。BH-IAAはオーキシン受容体TIR1に対しオーキシンと競合することで、その下流のオーキシン応答性転写調節因子ARFを介した転写制御を抑制するものと考えられている。よって、葉細胞から原糸体細胞への分化転換にはARFを介した遺伝子発現ネットワークが重要であるものと考えられる。そこでネットワーク解明の足掛かりとして、ヒメツリガネゴケの全ARF遺伝子の同定と単離を行った。その結果、13の遺伝子の存在を確認し、またこれらのうちの4遺伝子ではスプライスバリアントが存在することを明らかにした。現在、葉細胞の分化転換に関わるARFを同定するために、分化転換期のARF遺伝子発現解析および熱ショック誘導型のARF高発現株、機能欠損株の作成を進めており、これらについても報告する予定である。

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オーキシンは酸成長と細胞壁分解酵素（イネ科植物ではエンド型1,3:1,4-β-グルカナーゼ, EI）の発現を通して細胞壁のゆるみを引き起こし、伸長を促進すると考えられている。しかしEIの発現はオーキシン処理後4時間以降でないと検出できず、オーキシンによる成長が短時間(30分以内)に誘導されることから、初期のオーキシンによる伸長誘導は酸成長が、後期はEIが関与すると説明されてきた。そこで後期の伸長関与をさらに詳しく調べることにした。黄化オオムギ幼葉鞘をIAAおよび2％Sucroseで処理し伸長の様子を調べると、IAAにSucroseを加えることでさらに伸長が促進されることが分かった。細胞壁ヘミセルロース中に含まれるグルコース量を測定すると、IAAのみで処理したものはグルコース量が減少し、Sucroseを加えたものはグルコースが多く検出されたことからSucroseでヘミセルロースの分解が抑制される可能性が生じた。
次に伸長実験後のサンプルのEI遺伝子の発現量をRT-PCRで定量した。その結果IAAのみで処理したものはEIの発現が促進されるが、Sucroseを加えると逆に発現が抑制されることが分かった。以上の結果は、オーキシンによるイネ科細胞壁中の1,3:1,4-β-グルカンの分解はオーキシンによる伸長成長の原因ではない可能性を示唆している。

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オーキシンによる伸長誘導は，細胞壁がゆるむことで膨圧が減少し吸水生長が起きるためと考えられている．オーキシンが細胞壁をゆるませる機構については，細胞壁ヘミセルロースをオーキシンによって誘導された酵素が分解するためではないかと考えられてきた．特に双子葉植物では，エンド型キシログルカン転移/加水分解酵素（XTH）がキシログルカンを分解/つなぎ換えすることにより伸長が起きると考えられてきた．しかし，シロイヌナズナのColumbiaでは下胚軸切片がオーキシンに反応しにくいことから，オーキシンによる伸長生長とXTH遺伝子の発現の関連については詳細に調べられていない．また，スクロースなどの糖は生長制御作用を示すが，この系にスクロースが及ぼす作用も調べられていない．
そこで我々は，暗所で栽培したColumbiaの下胚軸切片をオーキシンやスクロース溶液に浸したときの伸長速度とXTH遺伝子の発現パターンを調べた．その結果，スクロースの有無に関わらずIAA存在下では2時間以降で下胚軸切片は有意に伸長した．発現パターンを調べるために，既知の33種類のXTH遺伝子の発現量をリアルタイムPCRで定量した．黄化下胚軸切片ではXTH4,15,17,18,24,27,30が他より高い発現量を示した．オーキシン作用に対するスクロースの影響についても調べている．

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植物は栄養成長期に光エネルギーを利用しソース器官である葉で炭素や窒素を同化し糖やアミノ酸を合成する．生殖成長期になるとこれの同化産物をシンク器官である実に輸送し蓄積・利用する．このソースシンクのバランス制御は植物の成長制御における重要な要素である．この制御機構の解明は，人為的な有用化合物の効率的な蓄積技術の開発に繋がると考えられることから我々は特に窒素化合物の代謝制御に着目し解析を行なった．まずシロイヌナズナを用いたモデル実験系を構築しシンクソースバランス制御に関わる因子の同定を目指した．シンクソースバランスの一過的な改変手法として結実後に抽台茎の切除を行ない，葉での代謝物（アミノ酸），遺伝子発現の変化を解析しその影響を調べた．その結果，葉の生育ステージの進行に伴い増加（または減少）する代謝物および遺伝子の多くが茎切除後に減少（または増加）することを見出した．さらに茎切除後に葉におけるサイトカイニン合成酵素AtIPT3の発現が上昇し，それに引き続きサイトカイニン含量が増加した．サイトカイニン合成酵素遺伝子(AtIPT3)破壊株およびサイトカイニン受容体遺伝子(AHK3)破壊株を用いた解析から，茎切除後の葉でアミノ酸や遺伝子発現変化の一部がサイトカイニンによって制御されることを示唆する結果を得た．

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