アブシジン酸(ABA)情報伝達経路に関わる因子の同定を目的として、我々はABA類縁体を用いたABA感受性変異体の探索を行ってきた。
ABA類縁体である#18はABA様の発芽阻害作用を示す。ABA誘導性遺伝子発現解析等により、#18はABAと同様の様式で働いていると考えられた。しかし、#18に対しての感受性は生態型間で異なっており、ColとLerではColの方が高感受性を示したのに対し、ABAにおいてはColよりもLerの方が高感受性を示した。このことから、#18とABAの構造の違いによって感受性に影響を及ぼす因子の存在が示唆された。現在マッピングによってこの原因遺伝子の同定を試みている。
また、ABA類縁体PBI-51を用いた探索によってABA高感受性変異体が単離された。我々はこれらの変異体の内、ahg1、ahg3変異体の原因遺伝子は共にPP2Cをコードしている事を明らかにしている。これらの遺伝子は種種子で強く発現しており、ahg1ahg3二重変異体では発芽時において非常に強いABA高感受性を示す。このahg1ahg3二重変異体と野生型においてリン酸化タンパク質を比較解析する事により、PP2Cのターゲットとなる分子を探索しようと試みている。

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Suaeda salsa is a main halophyte in saline soils of China with dimorphic seeds (brown and black seeds). Brown seeds show higher germination percentage than black seeds. The effect of salinity on gibberellins (GAs) and abscisic acid (ABA) during germination of S. salsa seeds was invested. ABA content in dry brown seeds was about 2.7 times of black seeds, and decreased quicker than black seeds after imbibition. NaCl stress slightly prevented decreasing of ABA content in germination seeds and fluridone alleviate seed germination under salinity stress. Bioactive GAs and their biosynthetic precursors were higher in brown seeds than black seeds in all treatmens. Deactivated GAs forms were higher in black seeds than brown seeds in all treatments. GA4 declined in response to salinity for both seeds in early stage of germination. GA4 is more active than GA1 in promote seed germination.

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［目的］タマネギは初夏の長日条件に反応し葉鞘基部を肥大させて鱗茎を形成する。鱗茎形成は、形成を促進する物質と阻害する物質のバランスで制御されていると考えられている。GAは阻害物質の候補とされてきたが実際の鱗茎形成への関与は不明である。また促進物質は明らかにされていない。そこで本研究ではそれらの解明を試みた。［方法・結果］GAが鱗茎形成阻害物質であると考えられていたため、GAの生合成阻害剤を高濃度ショ糖と組み合わせてタマネギ幼植物に与えたところ、in vitroで鱗茎が形成された。そこでこの培養系を鱗茎形成活性検定法として用い、タマネギの鱗茎形成を制御する内生因子を探索した。鱗茎形成が始まる以前のタマネギ葉から得られたヘキサン可溶性画分には阻害活性が認められた。精製の結果、最も強い活性を示す物質として遊離の不飽和脂肪酸類が単離された。なお、GAを含むと考えられる酢酸エチル可溶性画分には阻害活性は見られなかった。一方、鱗茎形成開始時の葉から抽出した水溶性画分には強い促進活性が認められた。この画分にはショ糖が含まれるが、ショ糖は高濃度でわずかな促進活性を示すに過ぎなかった。現在、促進物質の分離を試みている。現在、圃場での鱗茎形成に伴う不飽和脂肪酸類の量的変動を検討中である。また、GA生合成阻害剤によるin vitroでの鱗茎形成促進が不飽和脂肪酸類の減少を介しているかも調べている。

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GAMYBは大麦のアリューロンにおいてジベレリン（GA）応答遺伝子群の発現を制御する転写因子として同定された。今までに我々は、イネを用いた解析から、GAMYBが脂肪酸代謝酵素CYP703A3の遺伝子発現を誘導することで、花粉表面のエキシン形成に関与することを見いだした。最近、GA受容システムが維管束植物の発生後に誕生し、保存されていることが報告された。そこで本研究では、GAMYBによるエキシン形成制御機構も維管束植物間で保存されているかを、小葉類イヌカタヒバ(S.moellendorffii)を用いて検証した。
まず単離したSmGAMYBとSmCYP703A遺伝子の発現パターンを調べたところ、両者はタペータムと雄性胞子でのみ発現していた。またSmGAMYBがSmCYP703A遺伝子のプロモーター領域にin vitroで結合すること、イネのgamybとcyp703a3変異体を用いた相補性検定の結果から、SmGAMYBとSmCYP703Aがイネと同等の機能を有することを確認した。さらにGA生合成阻害剤を処理した個体ではエキシン形成異常が見られ、且つこの異常がGA処理により回復した。これらの結果は、少なくとも維管束植物の発生後にはGAがエキシン形成過程に関与していたことを示唆している。本研究の一部は、文科省特定領域研究「植物ゲノム障壁」の支援をうけて実施された。

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昨年の大会で、われわれはステビオール合成活性をもつシトクロームP450遺伝子をシロイヌナズナゲノム中からクローニングしたことを報告した。本遺伝子を過剰発現するシロイヌナズナは、活性型ジベレリン、GA₄を含む13位非水酸化GAの量が減少し、逆に活性型GA₁（シロイヌナズナにおいてはGA₄よりも生物活性が弱い）を含む13位水酸化GAが増加しており、GA合成不全変異体に似た半わい性を示した。今回、同様の活性を持つイネのオルソログ遺伝子の探索を、同じCYP714ファミリーに分類されるイネのP450遺伝子群を対象に行った。その結果2つの遺伝子についてシロイヌナズナで過剰発現させた場合、半わい性を示すことが明らかになった。GA内生量を測定したところ、各過剰発現シロイヌナズナともシロイヌナズナのステビオール合成遺伝子過剰発現体と似たGA内生パターンを示した。以上の結果から、イネには13位水酸化ジベレリンの生合成に関わるシトクロームP450遺伝子が少なくとも2つ以上存在すると考えられた。

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ブラシノステロイド（BR）は植物の成長調節に必須な植物ホルモンであることが、主に種子植物を用いた実験により明らかにされている。しかしながら、コケやシダ類におけるその存在や生理作用はあまりよく調べられていない。ゲノム解読の完了したヒメツリガネゴケにおいてBR生合成に関係する相同遺伝子を検索すると、ステロール生合成に必要な遺伝子は高く保存されているが、その下流のBR生合成に必要な酵素遺伝子（主にP450酵素）については、その機能が保存されているといえるほどの遺伝子は存在していない。また、BR受容体BRI1に相同性の高い遺伝子も存在しない。そこで、実際にヒメツリガネゴケでBRが合成されているのかどうか、GC-MSを用いて内生分析を行った。その結果、種子植物で活性型として存在するカスタステロンとブラシノライドはヒメツリガネゴケからは検出されなかった。しかしながら、6-デオキソカスタステロンなどの前駆体BRは検出された。ヒメツリガネゴケから検出されたBRと生合成酵素の候補となる相同遺伝子により、その生合成経路を推定する。

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ブラシノステロイドの働きは、被子植物、特にシロイヌナズナで盛んに研究が行われ、植物の正常な成長や分化に必須であることがわかっている。しかし、コケ植物などそれ以外の植物であまり研究は行われていない。本研究では、コケ植物であるヒメツリガネゴケで、ブラシノステロイドの働きを調べた。
ヒメツリガネゴケをブラシノステロイド生合成阻害剤であるブラシナゾール、スピロノラクトンを含む培地で生育させたところ、茎葉体数の減少と仮根の伸長異常が見られた。
また、シロイヌナズナのブラシノステロイド生合成遺伝子であるAtDWF7と高い相同性を示す塩基配列をヒメツリガネゴケで見つけ、PpDWF7と名づけた。相同組換えでPpDWF7の破壊株を作製したところ、その表現型は、ブラシノステロイド生合成阻害剤を投与した時と同様に、茎葉体数の減少と形態の矮小化、仮根の伸長に異常が見られた。
これらのことから、ブラシノステロイドはヒメツリガネゴケの茎葉体と仮根の形成に関わっていると考えられる。

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維管束植物のうち裸子植物と被子植物の内生ブラシノステロイドはよく研究されており、茎葉、根、種子、花粉などから多種類のブラシノステロイドが同定されている。しかしながら、維管束植物のうち進化上、下位にあるシダ類の内生ブラシノステロイドについては確実な証拠が得られていない。本研究では、数種のシダ類についてガスクロマトグラフィー／質量分析法（GC-MS）を用いて内生ブラシノステロイドの分析を行った。調べた組織は、スギナ（Equisetum arvence）の栄養茎と胞子茎、ゲジゲジシダ（Thelypteris decursive-pinnata）の葉、ワラビ（Pteridium aquilinum）の葉、ゼンマイ（Osmunda japonica Thunb.）の葉である。その結果、すべての組織からブラシノステロイドが同定された。活性ブラシノステロイドとしては、すべての組織からカスタステロンが同定されたが，ブラシノライドは検出されなかった。カスタステロンの前駆体としては、種子植物と同じ種類のブラシノライドが同定された。各シダの内生ブラシノステロイドの特徴についてはシロイヌナズナと比較しながら議論したい。

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我々はイネのブラシノステロイド（BR）シグナル関連因子の解明を目的とし、BR生合成酵素をコードするOsBR6ox（OsDWARF）の機能欠損変異体brd1にブラシノライドを添加し、発現が変化する遺伝子を網羅的に探索してきた。今回はその中で、bHLH型転写因子をコードすると推測されるOsBU3,17についての解析結果を報告する。
OsBU3の過剰発現体(OsBU3:OX)では、イネ特異的なBRの作用であるラミナジョイントが激しく屈曲した表現型を示した。逆に発現を抑制したイネでは、葉身が立った表現型を示した。また、OsBU3:OXはBR生合成阻害剤ブラシナゾールに対して抵抗性を示したこと等から、OsBU3がBRの生合成の促進ではなくシグナル伝達の促進因子であることが示唆された。さらにpromoter-GUS植物の解析から、OsBU3はラミナジョイントで特異的に発現していることが示された。また、OsBU3:OXの種子では大粒化及び稔性の減少が認められた。
OsBU17:OXは、OsBU3:OXとは逆に葉身が立つBR欠損変異体様の表現型を示した。しかし、BR欠損に特徴的な矮化が認められなかったため、ラミナジョイントの屈曲にのみ関連する因子であると考えられた。

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ブラシノステロイド（BR）はシトクロムP450モノオキシゲナーゼ（P450）により不活性化される。シロイヌナズナ由来CYP734A1（BAS1）およびトマト由来CYP734A7は、BR生合成経路の下流に位置するカスタステロンとブラシノライドのC26位を水酸化することによりBRを不活性化することが示されている。一方、イネにはCYP734Aホモログは4つ（CYP734A2,4,5,6）存在している。これらのP450を過剰発現させたイネはCYP734A5を除いて矮小な形態を示し、内生BR含量は減少していた。そこで我々は、イネのBR不活性化機構を酵素化学的に解明することを目的として、イネCYP734Aの組換え酵素をバキュロウイルス昆虫細胞系で発現させ、様々なBR中間体を基質として酵素アッセイを行った。イネCYP734Aは広い基質特異性を示し、また、BR生合成経路における上流の中間体に対して高い活性を示した。さらに、その酵素反応生成物を詳しく解析した結果、イネCYP734AはBRに水酸基を導入し、さらにアルデヒドを経てカルボン酸へと三段階に酸化していることが明らかとなった。以上より、イネのBR不活性化機構はトマトやシロイヌナズナとは異なることが示された。

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ジャスモン酸 (JA) は植物が食害や傷害を受けたときに急速かつ多量に生合成される植物ホルモンで、食害の進行や病原菌の感染を防ぐのに必要なさまざまな応答反応を誘導する働きがある。しかし、食害や傷害によるJA生合成の活性化がどのようにして起きるのかはよくわかっていなかった。JA生合成酵素の多くは傷害によって発現が上昇するが、その多くは生成したJAによるポジティブフィードバックを強く受けるため、傷害とJAの効果が重なってしまって両者を別々に評価するのが難しい。その点、JA生合成の最初の反応を触媒するリパーゼDEFECTIVE IN ANTHER DEHISCENCE1 (DAD1) の遺伝子は、傷害によって強く発現が誘導されるがJAにはほとんど反応しないので、傷害による発現制御機構を解析するのに有利である。これまでの解析で、DAD1の傷害による発現を制御する領域は遺伝子の3’側にあり、この領域は遺伝子の5’側につないでも傷害誘導を引き起こすことがわかっている。
そこで、この傷害誘導発現制御領域を塩基配列レベルで同定するため、DAD1の3’側領域をさまざまに欠失させてGUSレポーターにつなぎ、傷害を加えたロゼット葉での発現を調べた。その結果、この発現制御配列が存在する範囲を約40 bpの範囲に絞り込むことができた。

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ジャスモン酸は、病傷害に対する抵抗性、花粉の成熟と葯の裂開、老化促進、離層形成などの作用を持つ多機能な生理活性物質である。ジャスモン酸生合成の最初の反応は、リパーゼによって葉緑体の膜脂質からリノレン酸が切り出されることである。この反応に関わるリパーゼとして、我々はシロイヌナズナのDAD1およびDAD1-LIKE LIPASE1～6(DAL1～6)を見出し、これらには機能分担があるらしいことを明らかにしてきた。しかし、どのように使い分けられているかはまだよく分かっていない。そこで、まだ発現プロファイルが詳細に調べられていないDAL1～6について、それぞれのプロモーター領域をGUSレポーター遺伝子に連結してシロイヌナズナに導入し、これらの遺伝子がいつ、どのような条件下で、どこで発現しているかを解析した。現時点で結果が得られているDAL1,2,5,6に関して、まず、通常の生育条件下で最も多くのジャスモン酸が作られるつぼみで、DAL1,2,6が発現していた。ただし、つぼみの中でのジャスモン酸生合成部位と考えられている雄しべの花糸で発現していたのはDAL2のみであった。また、傷害を加えた葉では、DAL1,2,5,6全ての発現が認められたが、発現している細胞は遺伝子によって異なっていた。DALの中には、ジャスモン酸生合成を直接触媒するのではなく関連した別の機能を持つものもあるかもしれない。

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セルロース合成が阻害されると植物は形態変化、リグニン合成増大等の様々な応答を示す。ジャスモン酸等のホルモン量も変化することが示されている。我々はセルロース合成阻害剤 (2,6-dichlorobenzonitrile, DCB) に対する感受性が変化した変異体を複数単離し分析している。本発表ではこれらの変異体が示すホルモン関連形質について報告する。
DCBに対する感受性が低下した変異体 (css1)は、ミトコンドリアのNADH脱水素酵素の正常な構築に必要な因子（At-nMat1a）に変異が生じている。その結果セルロースを含む多様な基礎代謝産物の量に変化が生じている (PCP 47:772-83(2006))。css1変異体は培地の糖濃度が低い、高いどちらの条件でも生育が抑えられた。しかしその機構は不明だった。糖応答と植物ホルモン、特にABAは関連が深い。そこでcss1変異体のABA感受性を調べた。その結果野生型より低濃度のABAで発芽後の生育（子葉の拡大、緑化）が強く抑えられた。ABAと関連する遺伝子のmRNA量も野生型より増加していた。この変異体でのミトコンドリアに関連する異常が、基礎代謝だけでなくABA代謝にも影響を及ぼしている可能性が考えられる。現在この変異体の植物ホルモン定量を試みている。他のDCBに対する感受性が変化した変異体に関してもホルモン関連の性質を調べている。

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被子植物は有性生殖を行う。雌性生殖器官である胚珠には、卵細胞や中心細胞が形成される。一方、雄性生殖器官である雄ずいは、花糸と葯から構成され、葯の中に雄性配偶子である花粉が形成される。この花粉が柱頭に付着し花粉管を伸長させ、二つある精細胞がそれぞれ胚珠の中に存在する卵細胞と中心細胞と融合する。受精後、卵細胞は胚に、中心細胞は胚乳に分化して種子を形成する。この過程を重複受精と呼ぶ。
これら配偶子形成から種子形成に至る過程は、特殊に分化した多くの細胞が関与していることに特徴があり、温度・水分・栄養などの環境ストレスに感受性が高いことが知られているが、なぜ感受性が高いのか分子レベルでの理解は進んでいない。そこで我々は、本現象に関わるシグナル伝達系を同定するために、生殖成長期に高温ストレスに感受性の高い植物ホルモン関連遺伝子の変異体を探索した。
開花期の高温ストレスに感受性が高く不稔となりやすい変異体を、3系統同定した。また、花粉形成期の高温ストレスに耐性となる変異体を1系統同定した。現在、更に変異体を探索しながら、これら変異体が高温ストレス感受性・耐性となる原因を解析しているので合わせて報告したい。

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我々は、MAPKカスケードの構成因子が、植物細胞の細胞質分裂に必須であることを明らかにしている。タバコの NPK1 MAPKKKは、キネシン様タンパク質 NACK1と結合して活性化され、その下流因子として同定した NQK1 MAPKK、NRK1 MAPKは、M期後半の細胞板形成時に同時に活性化される。これらは、細胞板の形成に必須な情報伝達経路 (NACK-PQR経路)を構成していることが示唆されている。我々は、1, in vitroにおいて、シロイヌナズナの NQK1ホモログ ANQ/AtMKK6が、AtMPK4 MAPKを特異的に活性化すること 2, anq/atmkk6変異体において AtMPK4の活性が減少していること 3, AtMPK4の活性が細胞分裂の盛んな器官で高いこと 4, atmpk4変異体では、葉及び根で、不完全な隔壁と複数の核を持った大きな細胞が観察されること 5, タバコ培養細胞において AtMPK4-GFPが分裂赤道面に局在することから、AtMPK4が ANQの下流で機能し細胞質分裂を正に制御しているMAPKであることを明らかにした。しかし、atmpk4変異体は致死ではないことから、他に細胞質分裂を制御するMAPKがあることが予想される。今回はその候補として atmpk11、atmpk13変異体ついて報告する。

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植物の細胞周期中でG2/M期に特異的に発現する遺伝子の多くは，プロモーター領域にMSAエレメントと呼ばれるシスエレメントを持ち、そこにR1R2R3型のMyb転写因子が結合することがわかっている。本研究では，タバコR1R2R3-Mybの一つであるNtmybA2の働きを調べるため，全長のNtmybA2またはそのC末端領域を欠く高活性型NtmybA2 (NtmybA2ΔC)を過剰発現する形質転換BY2細胞を作成し，cDNAマイクロアレイを用いてトランスクリプトーム解析を行った。BY2細胞の同調培養系におけるトランスクリプトームと組み合わせて解析したところ，NtmybA2ΔCの過剰発現体ではG2/M期に特異的に発現する遺伝子群の転写産物量が選択的に増加しており、他の細胞周期中の時期に発現する遺伝子にはほとんど影響を与えないことが明らかになった。また，NtmybA2ΔCの過剰発現により発現が増加する遺伝子のいくつかを選抜してプロモーター領域の塩基配列を決定したところ，調べた全ての遺伝子にMSA様の配列が存在していた。これらの結果からNtmybA2は多くのG2/M期特異的遺伝子に対して共通に働く転写活性化因子であることが示唆された。

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TONSOKU (TSK)は頂端、根端双方のメリステムが異常なシロイヌナズナ変異体の原因遺伝子として同定され、タンパク質間相互作用に関わるドメインを2つ持つ機能不明のタンパク質をコードする⁽¹⁾。TSK は細胞周期のS期に強く発現し⁽²⁾、tsk 変異株ではDNA損傷応答性遺伝子の発現が高く、細胞周期のG2からMへの進行が遅延した細胞が多い⁽³⁾。DNA損傷はATRとATMのチェックポイントキナーゼを活性化して細胞周期を制御する。atm との二重変異株と異なり、tsk atr の二重変異株では、tsk の頂端と根端のメリステム異常やDNA損傷応答遺伝子の発現上昇などの表現型が抑制され、メリステム異常にはATRを介した細胞周期進行の異常が関わることが示唆された。しかし、tsk が示すヘテロクロマチンに由来するTSIの発現をatr は抑制しなかった。現在、tskが示すメリステム異常の表現型の原因を探るために、tsk やtsk atrに由来するRNAを用いたマイクロアレイ解析を進めている。 ⁽¹⁾Suzuki, T. et al., Plant J. 38:673 (2004), ⁽²⁾Suzuki, T. et al., Plant Cell Physiol. 46:736 (2005), ⁽³⁾Inagaki, S. et al., Plant Cell 18:879 (2006).

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細胞周期チェックポイントとは、DNA損傷や複製阻害などの異常に際して細胞周期の進行を一時停止し、適切な処理が行われるまで次のステップに移行しないようにする機構である。
我々はこれまでにシロイヌナズナのチェックポイントに関与するAtRAD26遺伝子を同定し解析を行って来た。AtRAD26欠損株は、チェックポイントで中心的な役割を担うAtATR遺伝子の欠損株と同様に、様々なDNA変異原や細胞周期阻害剤に対して感受性を示した。また、AtRAD26蛋白質のN末側領域には、ATRやATMなどを含むPIKKファミリーキナーゼのターゲット様配列が2カ所見出された。
今回、AtRAD26とPIKKキナーゼとの関係を明らかにする目的で、大腸菌中で発現させたN末側領域（AtRAD26NT）に対するリン酸化反応実験を行った。野生型の植物組織から核蛋白質画分を抽出し、[γ-³²P]ATPの存在下でAtRAD26NTとin vitroで反応させると強い³²Pの取り込みが見られたが、AtATR欠損株由来の核蛋白質画分では³²Pの取り込みが半減した。以上の結果から、AtRAD26がAtATRを主体としたPIKKによってリン酸化される可能性が示唆された。

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植物の細胞周期制御系は，多様なストレス応答系と協調的に複雑な制御を受けている．我々は，感染防御応答に伴い細胞周期調節因子cyclin Bの積極的な分解を伴う細胞周期停止が誘導されることを明らかにしている．動物や酵母の細胞周期制御において，E3ユビキチンリガーゼ複合体Anaphase-Promoting Complex/Cyclosome（APC/C）は，cyclin B等の分解に関与して細胞周期進行を制御する．APC/Cの構成因子は植物にも存在するが，その役割には不明な点が多い．本研究では，シロイヌナズナAPC5（AtAPC5）遺伝子に注目し，その機能解析を行った．
AtAPC5遺伝子のT-DNA挿入突然変異体のホモ個体は得られず，遺伝学的解析からこの突然変異体は雌性配偶体致死性を示すことが明らかとなった．雌性配偶体の発生過程を調べた結果，この致死性は雌性配偶体発生の初期段階（減数分裂直後の体細胞核分裂）における発生停止によるものだった．現在，ホモ個体の得られたミスセンス突然変異体を用いて植物個体レベルの解析を進めている．一方，AtAPC5遺伝子の過剰発現体は，細胞死を誘導するカビ毒fumonisin B1に対する感受性が上昇していた．AtAPC5遺伝子に関する種々の表現型から，APC/Cの細胞周期制御，発生，ストレス応答などにおける役割について考察する．

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酸性温泉に生息する単細胞の紅藻シアニジウムはpH 1～3の酸性pHで生育するが、その細胞内pHは強力なプロトンポンプの働きにより中性pHに保持されている。このように耐酸機構については解明されているが、好酸機構（なぜ中性pHでは生育できないか）については全く未解明である。そこで、本研究ではこの基本的な問題を明らかにする目的で、シアニジウムを中性pHで培養してみた。その結果、pH 7では細胞は死滅するが、pH 6では増殖はしないが一ヶ月以上生育可能であることが分った。pH 6で培養したシアニジウム細胞を光学顕微鏡で観察すると、培養時間とともに4個の内生胞子をもった大きな細胞が増加し、3週間後には約5割までに達した。この結果は、pH 6でもシアニジウム細胞は4個の内生胞子をもつ分裂直前までは生育できるが、細胞分裂できないことを示している。そこで、細胞分裂に必要な酵素が細胞外酵素であり、その酵素が酸性pHでないと機能しないのではと仮定して、pH 6で2週間培養したシアニジウム細胞を遠心した培養液の中に蛋白質が存在しないか調べてみた。その結果、約34 kDaと29 kDaのみかけの分子量をもつ蛋白バンドがSDS-PAGEで検出できた。なお、酸性pHで培養した場合には、培養液中には全く蛋白質は検出できなかった。現在、これらの蛋白質の諸性質を調べ、細胞分裂に関与するかどうか調べている。

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葯のタペータム内には、タペトソームとエライオプラストという二種類の特徴的な脂質系オルガネラが存在する。雄性配偶体は、花粉管を伸長する前に、柱頭上で吸水・接着・認識といった幾つかのプロセスを経るが、その際ポーレンコートとよばれる雄性配偶体表面に存在する脂質に富んだ成分が重要な役目を果たす。このポーレンコートが形成されるためには、タペータムからの脂質成分の放出と花粉壁エキシン間隙への沈着という特異のプロセスが必要である。また一方、雄性配偶体内にも多くの特徴的な脂質系オルガネラが時期特異的に出現し消失することが知られている。このように、雄性配偶体の形成には、倍数体世代および半数体世代のどちらの世代においても、各種の脂質系オルガネラが重要な役割を果たしていると考えられる。私達は、雄性配偶体をめぐるそのような様々な脂質系オルガネラの構造と機能の全貌を明らかにする目的で、化学固定および凍結固定を用いて、野生型シロイヌナズナの葯を詳細に電子顕微鏡観察した。その結果、それまで見分けがつかなかったオルガネラが固定法の違いで見分けられ、またこれまでとらえることができなかったオルガネラのエキソサイトーシスや融合のプロセス等を観察することができた。これらの観察結果は、雄性配偶体形成に関わる各種脂質系オルガネラの機能を明らかにするための基盤的知見となる。

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酵母を中心とした遺伝学的解析から、ペルオキシソーム形成維持に関わる因子として同定されたペルオキシソーム形成因子（PEX）はシロイヌナズナゲノム上に約20種類予測される。これまでに、我々はシロイヌナズナPEX遺伝子をRNAi法によって発現抑制し、これらの遺伝子がシロイヌナズナペルオキシソームの形態とマトリックスタンパク質の輸送に直接関与していることを明らかにした。また、ペルオキシソームマトリックスタンパク質輸送に関与する因子に焦点を当て解析を行った結果、これらの発現抑制株ではペルオキシソームの脂肪酸分解機能が著しく低下することが明らかとなった。その中でもPEX10発現抑制株では葉の部分的黄化や近接器官の融合がみられ、野生型の植物だけでなく、他のPEX発現抑制株と比較しても表現型が著しく異なっており、PEX10発現抑制株でみられる表現型はクチクラワックスに起因していた。本研究では、PEX10発現抑制株を用いたマイクロアレイ解析によって、PEX10の発現が低下した時に影響を受ける遺伝子群の同定を行い、PEX10特異的にみられる表現型の原因とPEX10特異的機能について検討する。

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ペルオキシソームに局在する蛋白質は、細胞質で合成された後、輸送シグナル（PTS）に依存して輸送される。主なPTSとして、蛋白質のC末端に存在するPTS1と、N末端延長配列中に存在するPTS2があり、N末端延長配列（PTS2と略す）は輸送後に切断される。
我々はPTS2の切断を行うプロセシング酵素の候補として、大腸菌DegQプロテアーゼのシロイヌナズナホモログであるAtDeg15に注目した。AtDeg15はC末端にPTS1相同配列を持ち、GFP融合蛋白質による局在性解析により、ペルオキシソームへの局在が確認された。シロイヌナズナT-DNA挿入変異体deg15を解析したところ、PTS1およびPTS2蛋白質の輸送能に異常は見られなかったが、PTS2蛋白質の高分子量前駆体が蓄積していた。前駆体の蓄積はDeg15のcDNAを強制発現させることにより解消され、Deg15がPTS2のプロセシング酵素であることがわかった。また、組換え蛋白質を用いてPTS2酵素の前駆体型と成熟型の活性を比較すると、前駆体型の活性は成熟型よりも低く、PTS2プロセシングが酵素の活性化に必要であると推定された。さらに、deg15ではβ酸化系の機能低下も確認されたことから、Deg15は、PTS2プロセシングを通じてペルオキシソームの機能発現に関与すると考えられる。

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高等植物のペルオキシソームは，脂肪代謝や光呼吸など様々な代謝系を担う細胞小器官である。ペルオキシソームに局在するリンゴ酸脱水素酵素PMDHはグリオキシル酸回路を構成する酵素の一つであり，シロイヌナズナには2つのアイソフォームが存在する。我々はこれまでに，発芽初期に発現するPMDH1 (At2g22780)が，発芽時の脂肪代謝に関与することを明らかにした（第49回日本植物生理学会年会）。本研究では，緑化組織において発現するPMDH2 (At5g09660)の機能に注目し，シロイヌナズナ欠損変異体pmdh2及びpmdh1pmdh2の解析を行った。定量PCRによって光呼吸系酵素群の遺伝子発現を解析した結果，野生型とpmdh1pmdh2の間に大きな違いは認められなかった。しかし，150μmol m^-2s^-1の白色光下で2週間生育したpmdh1pmdh2の生重量は，野生型の約50％であった。50μmol m^-2s^-1の弱光下で生育した場合，生重量に差はなかったが，pmdh1pmdh2の緑葉にはH₂O₂の蓄積が観察された。さらに450μmol m^-2s^-1の白色光を照射したpmdh2及びpmdh1pmdh2変異体の緑葉では，光化学系IIの最大電子伝達効率(Fv/Fm) の著しい低下や，細胞死が観察された。以上の結果は，PMDH2が緑葉における光ストレス耐性に不可欠であることを示唆している。

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オルガネラゲノムDNAにコードされる遺伝子は80～200種類と非常に少ない。オルガネラで働くタンパク質の多くは核ゲノムにコードされており、翻訳後にN末端シグナル配列の働きによりオルガネラへ輸送される。このような核コード遺伝子はオルガネラで機能するためにN末端シグナル配列を獲得したと考えられるが、その獲得過程の全体像はいまだ明らかではない。
前年度本大会で我々は、「核ゲノムに水平伝播した遺伝子には、5’側に延長したコード領域が付加される傾向があり、これによりゲノムに存在していた潜在的なシグナルをコードする配列をN末端に獲得した」という仮説を示した。
本発表では、核ゲノムへの水平伝播によって付加されたN末端領域とオルガネラへのN末端シグナル配列は共通して不規則領域である傾向が高いことが予測された事を報告する。
不規則領域とは特定の立体構造を形成しない領域であるが、特定のタンパク質や基質と相互作用することによって立体構造を形成し機能する例があることが知られている。本研究の解析結果に基づいて、核ゲノムへの水平伝播した遺伝子は不規則領域としての特性をもつ柔軟なペプチド配列をコードする領域を獲得し、その特性を生かしてオルガネラへのN末端シグナル配列に利用したという仮説を提唱する。

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我々は理研のシロイヌナズナDsタグライン約11000ラインから、albino or pale-green(apg)変異ラインを38ライン単離している。その中の一つアルビノの表現型を示すapg13変異体は、細菌のペプチドグリカン(PG)合成系で、UDP-N-アセチルムラミン酸-dipeptideにジアミノピメリン酸またはリジンを付加する酵素であるMurE遺伝子を原因遺伝子とする。apg13の解析結果は、この遺伝子がplastid-encoded RNA polymeraseによる色素体遺伝子発現に関わることを示しており、このことはMurEの機能がシロイヌナズナではPG合成から遺伝子発現関連へと変化していることを示唆している。今回我々は、新たなapg17変異体の原因遺伝子がMurEと同様に細菌のPGの維持に関与する遺伝子のシロイヌナズナホモログであることを見いだした。野生型における遺伝子発現は葉で最も強く、茎、花序、花でも発現が見られたが、根では発現は見られなかった。GFP融合タンパク質を用いた解析は、APG17タンパク質が葉緑体に局在していることを示唆した。apg17変異体は、葉が斑入りまたは薄緑色となり、葉緑素含有量は約70%に減少していた。また、野生型と比べ胚軸の長さが約1.4倍に伸長し、根は0.7倍に減少していた。apg17の変異形質について、現在更に解析を進めている。

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シロイヌナズナのCRUMPLED LEAF (CRL)遺伝子は色素体外包膜に局在するタンパク質をコードする核ゲノムの遺伝子である。CRLが色素体に局在するタンパク質であるにも関わらず、CRL遺伝子の変異体ではプラスチドの分裂阻害に加えて、植物細胞の分化や分裂方向に異常が観察される。これまでに我々は、プラスチド局在YFPタンパク質によるプラスチド可視化、DAPI染色によるプラスチドDNAの検出、いずれの方法を用いてもプラスチドが検出できない細胞がcrl変異体には存在することを明らかにしてきた。今回CRLの分子機能を明らかにする事を目的として、CRL複合体の精製を試みた。n-dodecyl-β-D-maltoside (DDM)および、digitoninを用いて、展開した葉から単離した葉緑体よりCRL複合体を可溶化したところ、いずれの界面活性剤を用いても1％の濃度でCRLは可溶化された。次にDDMで可溶化したCRL複合体をBlue Native PAGEとSDS-PAGEを用いて二次元電気泳動し、ウエスタンブロットを行った。抗CRLポリクローナル抗体を用いてCRLを検出した結果、見かけの分子量約640 KDaの位置にCRLと思われるシグナルが検出された。これより、CRLタンパク質は葉緑体の膜上で分子量640 KDa程度の複合体を形成していることが示唆された。

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植物細胞において、核DNA複製(nuclear DNA replication: NDR)とオルガネラDNA複製(organelle DNA replication: ODR)を協調させる機構については殆ど明らかにされていない。これまで我々は、オルガネラと核間のDNA複製の調節機構を明らかにするために単細胞紅藻Cyanidioschyzon merolae、およびタバコ培養細胞BY2を用いた解析を進めてきた。前年度の本学会年会において、我々は定量的PCR法を用いた解析によりNDRがODRによって制御されていること、そしてオルガネラから核へDNA複製の開始を伝えるシグナルとしてテトラピロールの一種であるMg-ProtoIXもしくはProtoIXが働いていることを報告した。本年会では、さらに詳細な解析を行うべく顕微鏡観察による直接的な核・オルガネラDNAの定量を行い、その結果、ODR、NDRの正確な開始時期を特定する事が可能になったので報告する。またDNA複製時の細胞内テトラピロール量を測定する事によって、ODRの開始に相関してMg-ProtoIXの細胞内蓄積量が一過的に上昇する事を明らかにした。さらに、Mg-ProtoIXによるNDR誘導のメカニズムに関しても解析を進めている。これらを踏まえた核・オルガネラDNA複製の同調機構のモデルを提示する予定である。

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Centromeres are universally conserved functional units in eukaryotic linear chromosomes. However, little is known about the structure and dynamics of the centromere in lower eukaryotic plant cells. Previously, our group reported that dynamic centromere reconstitution during the cell cycle in a primitive red alga, Cyanidioschyzon merolae, using anti-CENP-A antibody (Maruyama et al., 2007). In this work, we determined centromere regions of all chromosomes in C. merolae by ChIP-on-Chip method using anti-CENP-A antibody and whole-genome tiling array with high probe density. Averaged length of centromere regions was estimated about 2 kbp suggesting that the centromere of C. merolae is categorized into regional type centromere, although they did not have any highly repeating DNA sequences which are found in several higher eukaryotic species.

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単細胞性紅藻Cyanidioschyzon merolae10Dは核、ミトコンドリア、葉緑体が一つずつという極めて単純な細胞構造をもつ。我々は、この生物をモデルとした真核細胞の基本的構築に関する研究を進めるため、基盤となる形質転換技術の開発を進めている。
C. merolaeのURA5.3遺伝子は、オロト酸ホスホリボシル転移酵素(URA5)とオロト酸脱炭酸酵素(URA3)が融合した蛋白質をコードしている。前回までに我々は、C. merolae URA5.3遺伝子のURA3領域(3’側)を、別の単細胞紅藻Galdieria sulphurariaの対応領域と置換することで、URA3領域での相同組換えを避けるようなキメラ遺伝子を構築した。さらに5-フルオロオロト酸耐性を指標として取得されたURA5.3欠損株（URA5.3遺伝子中のURA3領域frameshift変異株：ウラシル要求性）を受容細胞として用いて形質転換実験を行った結果、ウラシル非要求性コロニーが得られ、このキメラ遺伝子がマーカーとして機能することを報告した（2007年度年会）。今回、このマーカー遺伝子に、RubisCOの転写因子であるCfxQ遺伝子の上下領域を連結した直鎖状DNAを用いて形質転換実験を行った。得られたウラシル非要求株を解析した結果、シングルクロスオーバーによりゲノムに組み込まれていることが示唆された。

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ミトコンドリア核（核様体）は、ミトコンドリアのもつ独自のDNAとタンパク質との複合体である。ミトコンドリア核内のDNAは、非常に効率よく圧縮されながらも、ゲノム機能を適切に発揮できるような様式で組織化されていると考えられる。しかし実際にどのように組織化がなされているのかは、これまで十分に検証が成されないままであった。そこで我々は、ミトコンドリア核にも細胞核におけるヌクレオソームのような基本構造が存在するかに注目して研究を行っている。タバコ培養細胞BY-2から単離したミトコンドリア核にmicrococcal nuclease (MNase) 処理を行うと、最小断片長約75 bpのDNAラダーが観察される。このことは、ミトコンドリア核にもヌクレオソーム様の構造が存在する可能性を示唆している。単離ミトコンドリア核を事前にRNase処理した場合にはDNAラダーが観察されるが、事前にproteinase処理もしくは1 M以上のNaClで処理した場合には、MNaseによる規則的なDNA切断は観察されなかった。この結果は、静電相互作用により結合するタンパク質によってミトコンドリアDNAが保護されることが、MNaseによるラダー状切断の原因であることを示唆している。今後は、電子顕微鏡を用いて形態的にもヌクレオソーム様の構造が見られるか検討予定である。

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植物を特徴づけるオルガネラである色素体は、植物の発達に従って、質的にも量的にも様々に変化する。色素体核様体は、120～150kbpの2本鎖環状の独自のDNAと、DNAポリメラーゼやRNAポリメラーゼなど様々なタンパク質を含む複合体である。従来法による色素体核様体精製では、色素体を界面活性剤で可溶化後の沈殿に、疎水性の膜タンパク質や光化学系のタンパク質が混入する問題があった。本研究ではこの問題を解決するため、PENDタンパク質のDNA結合ドメインとGFPとの融合タンパク質が、色素体核様体に局在することを利用して、核様体をアフィニティ精製した。PEND-GFP形質転換体のロゼット葉、子葉、根から抗GFP抗体を用いて色素体核様体を精製した。泳動分離後、MALDI-TOF-MSを用いたペプチドMASSフィンガープリンティングにより、構成タンパク質を解析した。その結果、従来法での色素体核様体では38％あった膜タンパク質のコンタミネーションが3％以下に減少した。

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植物・藻類のオルガネラゲノムの複製は、我々がPOPs (plant organellar DNA polymerases)と名付けた酵素が行っていると考えられている。前年会で我々は、紅藻シアニジオシゾンの細胞から精製したPOPの酵素活性を調べ、プロセッシビティーが高いことやホスホノ酢酸によって強く阻害されることを報告した。POPsは、動物と菌類以外の多くの真核生物において広く保存されており、繊毛虫のテトラヒメナにもPOP遺伝子が1コピー存在する。テトラヒメナは葉緑体を持たないが、広義の植物（Plantae）であると考えられている（野崎, 2003）。テトラヒメナミトコンドリアのDNAポリメラーゼの研究は数例あるが、詳細な解析は行われておらず、また、以前はテトラヒメナが動物であると考えられていたこともあり、DNAポリメラーゼγとして研究が行われていた。本研究では、テトラヒメナからPOPを精製し、酵素活性をシアニジオシゾンのPOP（CmPOP）と比較することを目的とした。抗CmPOP抗体を用いた免疫ブロット分析の結果、テトラヒメナのミトコンドリア画分においてPOPが検出された。単離ミトコンドリアにおいてDNA合成活性に対するホスホノ酢酸の効果を調べたところCmPOPと同様に強く阻害された。これらの結果から、ホスホノ酢酸による阻害はPOPsの共通の性質であることが示唆された。

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NOG1 is a P-loop GTPase that belongs to the Obg-Hflx super family and is conserved among archaea and eukaryotes. In yeast, and mouse, NOG1 has been shown to be essential for cell viability and functionally linked to 60S ribosomal maturation. Arabidopsis thaliana contains two NOG1 genes (NOG1-1 and NOG1-2), but only NOG1-1 is constitutively expressed in all developmental stages of plant. The NOG1-1 was accumulated in nucleolus and nucleoplasm. Fractionation analysis suggested that the NOG1-1 was present in the preribosomal fractions. Moreover, FRAP analysis revealed that the distribution of NOG1-1 protein between nucleolus and nucleoplasm was sensitive to transcription and translation inhibitors, and carbon and nitrate starvation, suggesting that NOG1-1 plays an essential role in early and intermediate steps of ribosomal biogenesis. Furthermore, The NOG1-1 protein disappeared in pre-metaphase, and is rapidly re-accumulated in peripheral chromosomal region in early anaphase. NOG1-1may also play another important role in nucleolus dynamics.

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高等植物においてバクテリア型葉緑体RNAポリメラーゼ(PEP)のシグマ因子(SIG)は核にコードされ、プラスチドの発生や分化の制御に重要な働きをしている。モデル植物であるシロイヌナズナやイネでは、SIG1からSIG6が存在し、これらSIG遺伝子の機能解析がなされてきた。我々は、栽培植物であるダイズにおけるSIG遺伝子の構造と役割について明らかにするために、SIG保存領域に基づいてディジェネレートプライマーを設計し、ゲノムDNAを鋳型として増幅を試みた。その結果得られたSIG5に相当する遺伝子の増幅が見られた。このSIG5のcDNAの作成及びゲノムサザン解析により、ダイズゲノム中には、少なくとも2つのSIG5ホモログが存在することが明らかになった（GmSIG5A, B）。SIG5は、シロイヌナズナなどにおける解析の結果、ストレス応答性のシグマ因子と考えられている。そこで本研究では、ダイズシグマ因子SIG5A, SIG5Bの発現の組織特異性、光応答性、ストレス応答性について解析した。またGmSIG5A, 5Bは、N末端領域の移行配列の違いにより、それぞれミトコンドリアとプラスチドにターゲットされる可能性が予測されたため、細胞内局在性についても検証した。

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植物に普遍的に存在するペンタトリコペプチドリピート（PPR）タンパク質は、植物オルガネラの機能発現、器官の発生や分化など幅広い植物生理現象に関わる重要なタンパク質である。PPRタンパク質はRNA結合能をもつPPRモチーフ以外に、様々な機能未知の保存配列モチーフをもつことが知られている。最近、我々はシロイヌナズナとイネのPPRタンパク質のC末端に存在するDYWモチーフが新規のRNA分解活性を有することを明らかにした（Nakamura and Sugita, FEBS Lett. 2008）。このような性質がDYWモチーフに共通したものかどうかを検討するため、ヒメツリガネゴケの10種のPPRタンパク質に存在するDYWモチーフの組換えタンパク質を作製し、11種類のRNA配列を基質に用いてRNA分解活性の有無を調べた。その結果、PpPPR_71はすべての基質RNAを分解したのに対して、PpPPR_56とPpPPR_77はある1種類の基質RNAのみを分解したが、それ以外の基質RNAを分解しなかった。これらの結果は、必ずしもすべてのDYWモチーフがRNA分解活性を有しているわけではないことを示唆している。RNA分解活性をもつことが判明した3種のPpPPR_56、PpPPR_71、PpPPR_77のDYWモチーフについて、さらにRNA分解活性の特性の相違について検討したのでその結果も報告する。

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植物ミトコンドリアゲノムには電子伝達系を構成する膜タンパク質、リボゾームタンパク質、rRNA及びtRNAをコードする約60の遺伝子が存在する。植物ミトコンドリア遺伝子の転写後の発現調節機構は、スプライシング、RNA編集、プロセシング及びポリアデニル化などが知られているが、その詳細なメカニズムは未だ明らかになっていない。ダイコンの細胞質雄性不稔に関わるミトコンドリア遺伝子としてorf125遺伝子が同定されており、その発現様式は植物ミトコンドリア遺伝子に典型的な複雑な転写産物パターンを示す。そこで、本遺伝子の転写後の発現様式に注目し、転写後の調節機構を明らかにする事を目的とした。orf125遺伝子の転写産物の分子種を明らかにするためにcircularized RNA RT-PCRを試み、プロセシング部位及び転写開始点を推定した。orf125遺伝子は上流のtrnfM遺伝子、下流のatp8遺伝子と共転写されていた。転写開始点の周辺には近年、シロイヌナズナで明らかとなったCNM (consensus nonanucleotide motif) 2プロモーター配列が存在した。また、プロセシング産物の3’末端を複数決定したところ、atp8のさらに下流まで転写されている事も明らかとなった。現在、orf125遺伝子の転写終結点の決定を試みている。

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スギには斑入りをはじめとする幾つかの葉色変異体が収集・保存されており、中でも葉色が変化する系統として黄金スギがある。黄金スギは、3月から4月にかけて展開する針葉が黄白色の形質を示し、8月から9月にかけてその形質が緑色へと変化する。大庭（1971）は、黄金スギの葉色形質のほとんどが花粉親からのみ遺伝することを明らかにしており、加えてその葉緑体構造に変異が生じていることを明らかにした。針葉樹では葉緑体ゲノムが父性遺伝することから黄金スギの葉緑体ゲノムには何らかの変異が生じている可能性が高い。
最近、我々はスギ葉緑体ゲノムの全塩基配列を決定し、同時に黄金スギの葉緑体ゲノムの全塩基配列を決定した。比較解析を行った結果、黄金スギの葉緑体ゲノム上にコードされているmatK遺伝子にフレームシフトを伴う19bpの挿入の変異があることが分かった。さらにその変異をマーカー化し、黄金スギと野生型との交配から得られた実生群で遺伝子変異と表現形質の関連解析を行ったところ、matK遺伝子の挿入変異は黄金スギの形質を持つ実生個体のみに検出することができた。これらの結果から、黄金スギの葉色変異には葉緑体matK遺伝子の変異が強く関連していることが分かった。

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一般に光合成活性を持つ緑色葉の葉緑体は、ストロマチラコイドとそれに隣接するグラナチラコイドから成る内膜構造（SGT）を持つと考えられている。しかし、展開中の若葉で観察される典型的なSGTは、葉の成熟に伴いストロマチラコイドを著しく欠いた構造(FGT)に変化することを観察し、すでに報告した。今回は、このようなチラコイド構造の変化が葉の伸展速度と密接な関係を持つ可逆的変化であることを報告する。シロイヌナズナを用いて、葉肉細胞中の葉緑体チラコイドの構造と葉の生育速度について調べた。その結果、生殖成長期に新たに展開する若い葉は、その葉緑体チラコイドの殆どがFGT型であり、SGT型の栄養成長期の若い展開葉に比べ伸展速度は明らかに遅かった。しかし抽だい花を摘花することにより、葉の伸展速度が回復するとともに葉緑体チラコイドは、栄養成長期と同じSGT型に変化した。一方、SGT、FGT型の葉緑体は一つの細胞内あるいは一枚の葉に混在する場合が多々観察された。以上を踏まえ、生育過程や部位の異なる葉をランダムに採取してFGT型の葉緑体が占める割合と葉の進展速度との相関性を調べた結果、この二者の間には、強い負の相関が得られた。また、SGT、FGT葉ではスターチ合成系にも違いが確認された。この結果は、SGTからFGT型チラコイドへの変化と光合成産物の代謝、転流とが密接に関係する可能性を示唆するものと考えた。

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植物細胞の伸長方向は、細胞周期間期の表層微小管や細胞壁最内層のセルロース微繊維によって制御されている。微小管の重合・脱重合の調節が表層微小管の配向に影響し、細胞の伸長方向に関わることが示唆されている。我々は表層微小管の構築や維持に関与する因子をさらに単離するため、微小管重合阻害剤プロピザミドに対して細胞伸長に影響を与える変異体を多数単離した。シロイヌナズナpropyzamide hypersensitive2は単一劣性変異体であり、通常の培地条件では、根の伸長方向は野生株とほとんど変化がない。ところが、3uMの薬剤存在下で、phs2変異体の根は野生型に比べ伸長阻害や細胞肥大を示した。また、鞘のねじれが見られる。phs2変異体は、新規の遺伝子に欠損があり、5’上流、3’下流を含むゲノム領域がphs2の薬剤高感受性を相補したことから、この遺伝子をPHS2と同定した。PHS2は11個のTPRリピートをもち、シロイヌナズナやイネでも遺伝子ファミリーを形成している。PHS2のN末端にGPFを融合した形質転換植物体はphs2表現型を相補し、表層微小管上に蛍光が観察された。以上のことから、PHS2が新規の微小管制御遺伝子として、植物細胞の表層微小管の配向制御等に関与することが強く示唆された。

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EB1は微小管のプラス端に集積するタンパク質であり、酵母から動植物にいたる幅広い生物に保存されている。シロイヌナズナには3つのEB1ホモログ(AtEB1a, AtEB1b, AtEB1c)が存在するがその機能の違いは明らかになっていない。我々はこれまでにAtEB1cが分裂領域において強く発現し、またそのC末に核局在シグナルを有することを明らかにした。本研究ではAtEB1cの細胞内局在性と生理機能に関する解析を行った。
微小管重合阻害剤であるオリザリンをateb1c変異体に処理したところ高感受性を示し、根の伸長が抑制された。このときateb1c変異体の根の分裂領域を調べたところ細胞の分裂面が大きく乱れていた。また細胞分裂に関わる微小管構造物である紡錘体やフラグモプラストを観察したところ、正常な分裂面に対し傾いていることが明らかとなった。相補試験を行った結果、ateb1c変異体の表現形の回復にはAtEB1cのC末が必要であることがわかった。タバコBY-2細胞においてAtEB1cホモログをRNAiにより抑制したところ染色体の分離に異常があることが明らかとなった。さらにAtEB1c-GFPはキネトコアマーカーであるRFP-CenH3と共局在した。以上の結果よりAtEB1cは分裂細胞における微小管を制御することで分裂面の規定や染色体の分離に関わっていることが示唆された。

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高等植物細胞は、細胞膜直下の表層微小管と、それにより配向が制御されている細胞壁内のセルロース微繊維により、その形が作られ維持されていると考えられている。しかし、表層微小管によるセルロース微繊維沈着方向の制御機構については、いまだ不明な点が多い。我々はこれまでに、ケミカルジェネティクスの手法により、表層微小管とセルロース微繊維の平行性を乱す新規阻害剤コブトリンを単離した。このコブトリンの標的因子を明らかにすることは、表層微小管とセルロース微繊維の平行性を制御する機構を解明する重要な足がかりになると期待される。そこで本研究では、アフィニティ精製法を用いた生化学的なアプローチと、シロイヌナズナFOXライブラリからコブトリン抵抗性を示す過剰発現体のスクリーニングを行う遺伝学的手法とを用いて、コブトリンの標的因子の探索を行った。前者の生化学的な手法では、コブトリン・アフィニティカラムに特異的に結合するタンパク質が得られず、コブトリンの標的因子がタンパク質ではないことが示唆された。一方後者の遺伝学的スクリーニングでは、新規レクチン様タンパク質、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼの3種類が恒常発現によるコブトリン抵抗性因子として得られた。この結果から、コブトリンの標的因子はペクチン糖鎖であることが推測された。本発表では、ペクチンのセルロース微繊維沈着に果たす役割についても考察する。

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細胞骨格繊維の一種である中間径フィラメント（IF）に関して、植物細胞においてはIFを構成するタンパク質の遺伝子はクローニングされておらず、IFが存在するか否かは確定していない。本研究では、植物細胞のIFタンパク質の遺伝子を同定することを目的として、まずヒトのIFタンパク質の遺伝子と推定アミノ酸配列レベルで相同性を持つシロイヌナズナの9種類の遺伝子を全ゲノムのデータベースより選び、GFPとの融合タンパク質を発現させた形質転換タバコBY－2細胞を用いて、それらのうちの7種類の遺伝子のコードするタンパク質について細胞内局在を調べた。その結果、それらのうちの1種類のタンパク質が間期の細胞では核周辺の細胞質に繊維状の構造をとることが分かった。これらの繊維状の構造物は、間接蛍光抗体法により染色した微小管あるいはアクチンフィラメントとは異なる場所にも見られた。また、分裂期の細胞では細胞板や紡錘体の近辺にシグナルが見られ、微小管と共局在する可能性が示唆された。シロイヌナズナの芽生えにおいてこのタンパク質をコードする遺伝子の発現の組織特異性を調べるためプロモーターGUS解析を行った結果、根端、茎頂、葉脈、葉の排水組織で発現が見られた。今後このタンパク質が植物細胞内で形成する繊維状の構造物がIFであるか否かについて微細構造レベルでの研究により明らかにしていく必要があると考えられる。

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シロイヌナズナのGFP-talinによるアクチン可視化株を用いた解析から、葉緑体光定位運動には葉緑体表面のアクチンフィラメント再構成・偏在化が関与することが示されている。野生株ではGFP励起用青色光連続照射によって逃避運動が誘導され、葉緑体アクチンフィラメントは一過的消失の後、葉緑体片側に再出現して偏在化し、その後、偏在部位を前端として葉緑体は運動を開始する。本研究ではこのアクチン再構成過程に対する赤色光同時照射の作用およびフォトトロピン変異体でのこの再構成過程を3秒間隔のイメージングによって解析したので、その結果を報告する。葉緑体逃避運動に対し赤色光同時照射は、弱赤色光で促進的、強赤色光では阻害的に働くが、アクチン再構成過程のうち、消失のタイミングには変化がなく、再出現のタイミングが変化することにより、運動開始のタイミングが変わることがわかった。また、逃避反応の変異体であるphot2、phot1phot2では葉緑体アクチン消失が起こらず、その後の偏在化も見られないことで運動が誘導されない。phot1変異体はアクチン消失、再出現いずれも起こるが、野性株に比べて早く起こり、結果として逃避運動の開始も早くなることがわかった。以上の結果は、複数の要因により葉緑体アクチンフィラメントのダイナミクスが調節されており、その結果として逃避運動が生じることを示唆している。

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我々は、セルラーゼを利用したバイオエタノール生産に適したイネの開発を目指し、セルラーゼの過剰発現がイネにどのような影響を与えるかを調べた。イネのセルラーゼのcDNAをトウモロコシのユビキチンプロモーターに連結し、イネに導入した。形質転換頻度の低下は見られず、またRNAレベルで過剰発現が確認されたことから、単一のセルラーゼの過剰発現では致死的には働かないと考えられた。しかし、得られた形質転換体には葉の早期褐変や白化が頻繁に見られ、また低頻度ではあるが葉身の分岐や切れ込みが見られた。以上のことは、セルラーゼの恒常的過剰発現がイネに様々な生理的、形態的変化を引き起こすことを示している。従って、セルラーゼを用いたイネの改変は可能であるが、誘導プロモーター等を用いた発生異常の回避が必要であると考えられた。

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ホウ素は高等植物の微量必須元素であり細胞壁ペクチンを架橋することによって細胞壁の構造を安定化させる働きがあると考えられている。演者はこれまでに低ホウ素条件下(5 μM)で成長可能なギンドロ培養細胞系(1/20-B)を確立し、ホウ素欠乏耐性機構について研究を行ってきた。その結果、1/20-B細胞ではペクチン間のカルシウム架橋形成に必要なペクチンメチルエステラーゼ(PME)活性の上昇、及びこの培養細胞からRT-PCRにより単離したpaPME1遺伝子の発現増加が観察された。これらの活性や遺伝子発現は細胞をホウ素が十分に存在する培地に移植すると低下することからPME活性はホウ素によって調節を受け、ホウ素欠乏耐性に関与している可能性が示唆された。しかし、培養開始後2日目に見られる特徴的なPME活性の上昇に対応するpaPME1遺伝子の発現増加が見られなかったことから他のPME遺伝子の関与が考えられた。今回、継代後2日目の1/20-B細胞からRT-PCRにより新たなPMEのcDNA (paPME2)を単離したので報告する。
単離したcDNAは約1,200 bpでポプラのPME2と相同性が高く約90%のホモロジーを示した。一方、paPME1とは約75%のホモロジーを示した。この結果は培養2日目の活性上昇にはpaPME1ではなくpaPME2の誘導が関与している可能性を示唆している。

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我々はこれまでにイネよりEarly-nodulin型タンパク質 (ENODL) を新規アラビノガラクタンタンパク質として同定し、その機能の追究を行っている。ENODLは銅結結合ドメインであるplastocyanin-like ドメインを有するphytocyaninと総称されるタンパク質ファミリーの一種であるが、銅結合に必要なアミノ酸残基が保存されておらず、その生体内での機能は未知である。今回、我々はENODLの機能解明を目的とし、ゲノム情報からシロイヌナズナENODLファミリーを明らかにし、T-DNA挿入ラインを用いたENODL遺伝子の網羅的な機能解析を行った。シロイヌナズナには22個のENODL遺伝子が存在し、そのうち18個がGPIアンカー型タンパク質であった。15個のENODL遺伝子についてT-DNA挿入ラインを入手しホモラインを選抜した結果、通常生育条件下で明瞭な表現型は観察されず、ENODL遺伝子間での機能重複の可能性が考えられた。そこで相同性が高いENODL遺伝子間で二重変異体を作製したところ、一組において二重変異体が得られる割合が非常に低かった。ENODL遺伝子の部位別の発現解析では、多くのENODL遺伝子が花器官で特異的な発現が見られ、ENODL遺伝子が生殖器官で機能を有する可能性が示唆された。

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細胞壁結合型キナーゼ（cell wall-associated kinases; WAK）は原形質膜貫通型キナーゼの一種であり，細胞外ドメインは細胞壁成分と結合すると考えられている。この構造からWAKは細胞壁と原形質の相互作用や情報伝達に関与することが示唆されるが，実際の機能は明らかでない。我々は，WAKの機能解明には相互作用分子の同定が必要と考え，生化学的解析に適したタバコ培養細胞BY-2を用いて研究を行なっている。
相同性検索に基づきタバコBY-2細胞におけるWAKホモログNtWAKL1（Nicotiana tabacum WAK-like protein 1）cDNAを単離した。NtWAKL1の推定細胞外ドメインはWAKの特徴である上皮成長因子様ドメインを有し，細胞内ドメインは自己リン酸化活性を示した。イムノブロット解析では推定分子量である68 kDに加え250 kD超のシグナルが検出された。250 kD超のシグナルは細胞のペクチナーゼ処理で消失した。C末端にGFPを付加したNtWAKL1-GFP蛋白質をBY-2細胞に発現させると蛍光は細胞表層に局在し，高浸透圧下では細胞壁から離れた。これらの結果は，NtWAKL1はペクチンと相互作用するが細胞壁に固定されてはいないことを示唆する。現在，TAPタグ融合タンパク質を用いてWAKを含む蛋白質複合体の単離を試みている。

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植物バイオマスの中でも種子油は、バイオディーゼル燃料や合成樹脂原料などのバイオマス資源として期待されている。一方で、植物種子中の油脂貯蔵メカニズムは不明な点が多く、油脂生産量の向上に結びつく分子育種の例は少ない。
そこで本研究では種子の油脂含量に関与する遺伝子の探索を目的に、CRES-T法を用いて約200種類の転写因子-転写抑制ドメイン融合遺伝子を発現したシロイヌナズナを作製し、T2種子中の油脂含量を1H-pulse NMRを用いて定量した。その結果、種子の油脂含量が1割以上増加した系統を複数見出した。これらの油脂含量増加系統の脂肪酸組成は変化せず、その内数系統では種子収量および植物体乾物重が増加した。CRES-T法が転写因子の機能解析のみでなく種子貯蔵油脂の量的形質の改変に有効であることが示された。また、油脂含量が増加した系統には種皮が黄色の表現系を示す系統が複数含まれそれらはフェニルプロパノイド合成系の制御因子に対するキメラリプレッサーを導入した株であり、種皮色と油脂含量の関連性が示唆された。これらの油脂バイオマスが増加した系統において、DNAアレイによる網羅的な遺伝子発現解析を行った結果より、転写因子-転写抑制ドメイン融合遺伝子と油脂生産のカスケードについて考察する。

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植物体の組織片を、適当量の植物ホルモン存在下で培養すると、シュートや根などの植物体を構成する全ての組織が誘導される。これより、多くの動物細胞と異なり、植物細胞には分化全能性が備わっていることが古くから提唱されてきた。しかし、何が植物細胞に分化全能性をもたらしているのか、そのメカニズムは依然として多くが未解明である。再生過程の植物細胞がどのような分化状態をたどっているのか、また、異なる組織由来の再生現象同士に共通の機構が存在するのか、といった基礎的な疑問ですら未だ解明が待たれている。これらの基礎的な疑問に答えるため、われわれは、根、双葉、花弁の三つの組織を用いて植物再生実験を行い、新組織形成の前段階に誘導される無定形細胞塊（カルス）のキャラクタリゼーションをそれぞれ行った。その結果、共焦点顕微鏡を用いた根組織マーカーの観察と、マイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析により、われわれは、どの組織由来のカルスもみな、根端分裂組織に類似した組織であることを示した。さらに、遺伝子変異体の解析により、カルス形成と側根原基形成が、それぞれの開始段階で、同様の分子制御下にあることを示唆した。

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