果実の形成および成熟は農業的に重要な特質であり，生長の中で強度に制御かつ高度にプログラムされている．果実形成および成熟の分子機構を明らかにすることは，農業利用だけでなく植物の生長の制御機構を理解する上でも有意義であると考えられる．ゲノム研究が始まったトマトは、果実生理研究における優れたモデルシステムであり、変異体の単離・解析は、機能解析における非常に有用なツールである。我々は果実形成の分子機構に関する知見を得ることを目的として、極矮性系統である「Micro-Tom」への重イオンビームやガンマ線照射によって整備した変異誘発集団から、花器官に変異を生じた系統の探索を行った。
種々の強度の炭素もしくはネオンイオンビームを照射したM₂世代2,360系統およびガンマ線300Gyを照射したM₂世代2,500系統についてスクリーニングを行い、花器官の形態に異常が見られる個体を選抜した。そのうち4系統のM₃世代において、野生型よりも肥大した子房および柱頭が確認できた。これらの系統について、現在トマトのほぼ全てのユニジーンを搭載したマイクロアレイによる遺伝子の発現解析をはじめている。

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転写終結領域（ターミネーター）は遺伝子の3’末端領域に位置し、転写終結およびmRNAの3’末端修飾（pre-mRNAの切断、poly(A)付加）を行う。この3’末端修飾を担うシスエレメントの変異はリードスルーを引き起こし、逆に効率の良い3’末端修飾は効率良く転写を終結させる。このため効率の悪いターミネーターは自身の発現量の低下に加えて、下流遺伝子の発現抑制やサイレンシングのトリガーとなる可能性が考えられる。
我々は効率の良いターミネーターを取得するため、様々な発現様式を示す遺伝子の3’末端領域を解析した。シロイヌナズナ、タバコおよびイネを用いた一過性発現実験において、解析したほとんどのターミネーターは対照としたNOSターミネーターと同程度であった。ところがheat shock protein (HSP ) 遺伝子のターミネーターはシロイヌナズナ、タバコでは2～3倍、イネでは発現を5倍増加させた。この発現の増加はmRNA量の増加と相関していた。またシロイヌナズナシングルコピー形質転換体を用いた解析においても、HSPターミネーターはNOSターミネーターの2～3倍のGUS活性およびGUS mRNA量の増加を示した。HSPターミネーターと翻訳エンハンサー（NtADH 5’-UTR）を組み合わせることにより、GUSタンパク質は全可溶性タンパク質の1％程度まで高蓄積した。

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CRES-T法（Chimeric REpressor gene-Silencing Technology）は任意の転写因子に転写抑制ドメイン（SRDX）を融合したキメラリプレッサーを植物体内で発現させる方法で、内在性の機能が重複した転写活性化因子が複数存在する場合でも優性に働いて標的遺伝子の発現を抑制し、機能欠損の表現型を引き起こすことができる。当研究グループでは、これまでに、主にCaMV35Sプロモーター制御下で、さまざまな転写因子のキメラリプレッサーを発現させ、転写因子の機能を抑制することに成功している。しかし、CaMV35Sプロモーターでは本来の機能を反映しない恐れがあるほか期待した効果が得られないことも散見される為、内性の自分自身のプロモーターによる発現が望ましい。本研究では、MultiSite Gatewayを利用し、プロモーターと遺伝子を自由な組み合わせで効率的に挿入できるCRES-T法用ベクターを作成した。attR4-attR2のGatewayカセット（Nakagawa et al., 2008）の下流にSRDX、Nosターミネーターを有するバイナリーベクターを作成し、CaMV35S プロモーターまたは各転写因子のプロモーターと、転写因子をコードする遺伝子を挿入した。これらのキメラリプレッサー発現コンストラクトをシロイヌナズナに導入し、CRES-T法の効果を検証した。

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シロイヌナズナは、植物固有の AP2 DNA結合ドメインを 2 つ持つ AP2 型転写因子を 14 個持ち、花器官形成に関わるクラス A ホメオ因子 APETALA2 (AP2)、花成抑制因子 TARGET OF EAT (TOE)、胚珠成長に関わる AINTEGUMENTA (ANT)、胚発達に関わる BABY BOOMER (BBM)、根端分裂組織の形成・維持に関わる PLETHORA1, 2 (PLT1, 2)、など発生・分化に重要な役割を担うものを多く含む。これまで、ANT の結合する DNA 配列が報告されているが、これら因子の直接の標的は報告されていない。WRINKLED1/ASML1 (WRI1) は種子登熟中期に強く発現し、種子での油脂貯蔵に必須の AP2 因子である。私たちは、WRI1 はプラスチド内での脂肪酸合成に関わる一群の遺伝子の転写開始点近傍や 5'-UTR などに保存された配列に結合して種子成熟期での発現に働くことを明らかにし、更に、ビーズ固定化 WRI1 に結合するランダム配列オリゴヌクレオチドを濃縮する操作を繰り返すことで結合のコンセンサス配列を明らかにしてきた。今回我々は、WRI1 を含む 7 種の AP2 型因子の結合するコンセンサス配列を決定してドメイン構造と対応させて比較し、さらに 2 つの AP2 ドメインそれぞれの役割を明らかにした。

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植物の成長・発達においてシグナル伝達は不可欠な過程であり、受容体型キナーゼ（RLK）はその信号伝達を担う重要な因子の1つである。シロイヌナズナゲノムには400種以上のRLK遺伝子が存在するが、そのうちロイシンに富むモチーフの繰り返し（Leucine rich repeat: LRR）を持つタイプが最も大きな集団である。茎頂分裂組織で細胞増殖と分化の調節をしているCLAVATA1もLRR-RLKに属し、キナーゼドメインを持たないLRR型受容体タンパク質CLAVATA2と共に機能している。シロイヌナズナゲノムにはCLAVATA2のようなLRR型受容体遺伝子が多数存在しており、これらが特定のLRR-RLKと複合体を形成して信号伝達を行っていると考えられる。そこで本研究ではシロイヌナズナのLRR型受容体タンパク質遺伝子についてプロモーター：レポーターによる発現解析を行い、植物体における機能部位に関する知見を得ることにした。

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自然環境において、植物は複合的なストレスにさらされている。特に乾燥と高温の複合ストレスは地球上の多くの地域で発生し、植物の生存を妨げていると考えられるが、生理学的な影響や応答のしくみはほとんど明らかになっていない。シロイヌナズナの転写因子DREB2Aはシス配列であるDREを介して乾燥および高温ストレスに応答した遺伝子の転写活性化に関与しており、これらのストレスシグナルのクロストークにとって重要な位置を占めている可能性がある。DREB2Aの下流遺伝子にはストレス特異的な発現パターンを示すものがあるので、これらの発現に注目して解析を行った。
シロイヌナズナの植物体を用いて乾燥と高温ストレス処理を同時に行うと、高温応答性の下流遺伝子はより強く発現し、葉の温度もより高くなっていた。したがって、高温に乾燥が伴うと植物はより強い高温ストレスを受け、応答も強くなると考えられた。次に乾燥または高温ストレスに特異的な発現パターンを決める因子を明らかにするために、乾燥および高温ストレス応答性のDREB2AからDREを含むプロモーター断片を単離し、その制御下でGUSを発現するシロイヌナズナを作出した。これらの植物体にストレス処理を行ったところ、GUSは内生の遺伝子と同じ発現パターンを示した。この結果からDREB2Aのストレス特異的発現パターンはプロモーターの塩基配列によって制御されると考えられた。

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植物の転写因子DREB1/CBFは、DRE/CRT/LTREと呼ばれるシス配列に特異的に結合し、環境ストレスに対する耐性獲得に関わる多くのストレス誘導性遺伝子の発現を制御する。DREB1遺伝子の発現は、通常の生育条件下では低く抑えられて概日リズムによって制御されており、低温条件下で一過的に非常に強く誘導される。これらのプロモーター領域は相同性が高いことから、共通の転写制御機構を持っていると考えられた。そこで、本研究では、DREB1遺伝子の転写制御について解析を行なった。
DREB1Cのプロモーター配列をつないだGUSレポーター遺伝子を導入した形質転換植物の解析により、発現制御に関わる67bpの領域を同定した。この領域内には、低温応答において転写を正に制御する配列と概日リズムにおいて負に制御する配列の両方が含まれていた。酵母のワンハイブリッド法により、この67bpの配列に結合するタンパク質をコードするcDNAクローンを単離した。このcDNAは、フィトクロムとの相互作用を持ち、光応答のシグナル伝達に関わるbHLH型転写因子PIFファミリーの一つをコードしていた。プロトプラストを用いたトランジェント発現系による解析から、このPIFはDREB1Cのプロモーター上の保存配列中のG-boxに結合することが示唆された。現在、T-DNA挿入変異植物体を用いてDREB1遺伝子の発現を解析している

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NIP5;1遺伝子は低ホウ素条件でのホウ素の効率的な輸送に必須であり、その転写産物の蓄積はホウ素欠乏で高まる(Takano et al, 2006)。本研究ではNIP5;1の低ホウ素栄養応答機構の解明のため、NIP5;1プロモーター領域(2.2k bp)と5’UTR(312 bp)領域のホウ素欠乏応答における役割について検討を加えた。
NIP5;1プロモーター領域を5’側から順に欠損させた各配列に5’UTR配列とGUS遺伝子を連結したコンストラクトを作成した。得られた各形質転換植物において、ホウ素欠乏および十分条件下におけるGUS活性を調べた。その結果、根のある特定の部分におけるホウ素欠乏条件での発現に、NIP5;1プロモーター内の3つの異なる領域が関与していた。これらの植物でのGUS活性はホウ素通常条件では検出されなかった。また、NIP5;1プロモーター-5’UTR-GFP-NIP5;1を導入した形質転換体の根では、GFP蛍光はホウ素欠乏条件下観察されたが、ホウ素十分条件下では観察されなかった。一方、5’UTRを含めずにNIP5;1プロモーターにGFP-NIP5;1を連結し、形質転換植物に導入したところ、GFP蛍光はホウ素欠乏条件下でもホウ素十分条件下でも観察された。以上のことから、5’UTR領域がNIP5;1転写産物のホウ素栄養に応じた蓄積に重要であることが示唆された。

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シロイヌナズナの低親和型硫酸イオントランスポーターSULTR2;1は、植物体内の硫酸イオンの分配に働くと考えられている。一方､SULTR2;1の根における遺伝子発現は環境中の硫酸イオン濃度の減少（-S）に応答して増加し、地上部では逆に減少する。私たちは植物の-S応答の分子機構を明らかにすることを目的として、SULTR2;1の硫黄栄養応答領域の同定を試み、根におけるSULTR2;1の-S応答には3’非転写領域が必須であることを見出した。さらにSULTR2;1の3’領域に含まれるシス因子を同定するためのデリーション実験を行い、終止コドンより下流361-372-bp、450-459bpの二つの領域が-S応答に必要であることを示した。この領域はSULTR2;1の3’UTRよりも外側に位置することから、転写レベルでSULTR2;1の発現を制御していると推定した。また、SULTR2;1-3’領域は35Sプロモーター等を用いた場合にも効果を発揮することから、基本的な転写機構に作用すると考えられる。各種プロモーターを用いてSULTR2;1-3’領域の組織特異性を検討したところ、SULTR2;1-3’領域は根の基部側における発現を誘導することが明らかになった。

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高親和性硝酸イオン輸送体(NRT2)は、植物の主要な窒素源である硝酸イオンを外界から吸収する際に重要な役割を担っている。ヒメツリガネゴケの8つのNRT2のうち、主成分であるNRT2;1～NRT2;4の発現はすべて硝酸イオンと亜硝酸イオンによって活性化され、グルタミンによって抑制されるが、グルタミンへの感受性と硝酸イオンへの依存性に違いがある。すなわち、硝酸イオンに対する親和性が特に高いNRT2;1、NRT2;2、NRT2;4は無窒素条件下でも発現するのに対し、NRT2;3の発現には硝酸イオンが必要である。またNRT2;3は他の3つに比べグルタミンに対する感受性が低い。このような窒素化合物に応答するシス因子を同定するためにNRT2;1とNRT2;3の上流配列をluc遺伝子につないだ融合遺伝子をヒメツリガネゴケへ導入したところ、NRT2;1の転写開始点から-2440bp、NRT2;3の-3288bpまでの配列を融合した場合、それぞれ硝酸イオンによる発現の活性化が確認された。さらにNRT2;1の上流配列を上流側から削った結果、-2440bpから-2079bpまでの領域が硝酸イオン及び亜硝酸イオンによる転写活性化に必要であった。現在、比較のためにNRT2;3についても同様の解析を進めている。

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O. brevisは水生ラン藻であるが、主にAg、Cu、Zn、Cd等の重金属に耐性を持つ。我々は既にこれらの重金属に対する耐性に関連する3遺伝子bmtA、bxa1、bxmRの存在を明らかにした。さらにこのラン藻のリプレッサーであるBxmR蛋白も1、2価の重金属で誘導されること、メタロチオネインをコードするbmtA遺伝子と重金属排出ポンプをコードするbxa1およびbxmR遺伝子自身の3者を制御することも報告している。今回、このBxmR蛋白とbmtAおよびbxmR遺伝子上流に存在するプロモーター領域の転写調節での関わりを調べた。まず、ゲルシフトアッセイ（EMSA）により結合位置を確認し、DNAフットプリンティングでBxmR蛋白の結合する具体的な領域を特定したところ、BxmR蛋白は両遺伝子配列の上流域に存在する12-2-12 inverted repeat領域に結合することが分かった。さらに、変異導入した12-2-12領域を含むDNA断片とBxmRとの結合力の変化をEMSAにより解析した結果、低下することが分かった。また、Fe、Au、La、CrなどによるBxmR蛋白のプロモーター結合能に対する影響も検討した結果、Auに特に応答し、解離した。さらにO. brevisにAuを暴露した際、bmtAとbxa1遺伝子発現量の上昇が見られ、in vivoとin vitroの結果が非常に良く一致した。

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WRKY遺伝子は植物の病傷害応答に関わる重要な転写因子である。我々はWボックスTTGACの繰り返し配列に結合する因子として酵母ワンハイブリット法によりホウレンソウからWRKY遺伝子（SoWRKY1）を単離した。SoWRKY1とGFPとの融合タンパク質は細胞核へ局在し、SoWRK1タンパク質はWボックス配列に特異的に結合することが確かめられた。ホウレンソウにおいてSoWRKY1はサリチル酸と傷害によって誘導されるのに対し、エチレンとジャスモン酸処理では誘導されなかった。SoWRKY1を過剰発現したシロイヌナズナでは、酸性PR遺伝子PR1,PR2遺伝子の発現が誘導され、塩基性PR遺伝子PDF1.2は誘導されなかった。以上の結果からSoWRKY1はサリチル酸シグナル伝達経路に関与し、植物防御応答に関わると考えられる。

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スギ（Cryptomeria japonica D. Don）は、わが国の主要な林業樹種であり日本人の生活に深くかかわってきた。遺伝子組換え技術による特定形質の付与は、より社会から求められる品種の作出を実現すると期待される。しかし、組換え体を野外に出すにあたり導入遺伝子の同種野生植物への拡散が懸念されている。その媒体となる花粉を作らなくすればその可能性は軽減される。さらにスギの雄性不稔化はスギ花粉症の緩和にもつながる。
シダレカンバ等いくつかの植物種において、花器官特異的な発現を司るプロモーターにRNase等の遺伝子をつないだ構築物を導入することによって雄性不稔個体の作出に成功したことが報告されている。我々はスギにおいて同様の手法を試みるために、雄花形成過程の異なる3時期（花粉分化初期、花粉四分子期、成熟花粉期）を選択しサブトラクション法をおこない、雄花特異的かつ時期特異的発現を示す7遺伝子の単離に成功した。これら遺伝子の転写調節領域を単離するためにTAIL-PCR法をおこなった。得られた領域の機能解析をおこなうためにGUS遺伝子を融合しアラビドプシスに導入した。現在アラビドプシスにおけるGUS遺伝子の発現組織の解析を進めている。
本研究の一部は、農林水産省「遺伝子組換え生物の産業利用における安全性確保総合研究」の一環としておこなった。

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IDDタンパク質は4つのジンクフィンガーを含むIDドメイン(IDD)が保存されている植物に特有な転写因子ファミリーを形成しており、シロイヌナズナで16、イネで14、トウモロコシで21以上の遺伝子があると考えられている。その中でも現在機能が明らかになっているのは、トウモロコシおよびイネの花成制御に関わるINDETERMINATE1(ID1)およびOsId1、シロイヌナズナのシュートにおける重力感知に関わるSGR5である。 しかし、最近の報告でシロイヌナズナのIDDファミリーであるJACKDAWおよびMAGPIE がGRASファミリーであるSHORT-ROOT(SHR)とその下流遺伝子であるSCARECROW(SCR)と相互作用することで、根の放射状パターン形成や幹細胞の維持に関与していることが示された(Welch D et al., 2007)。
本研究では、イネおよびシロイヌナズナの根におけるIDDファミリー遺伝子の機能を明らかにするために、IDDファミリーと、SHRおよびSCRのタンパク質間相互作用のネットワークを解析したので報告する。

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シロイヌナズナのDREB2Aは乾燥や高温に応答した遺伝子発現に関与する転写活性化因子で、シロイヌナズナでは9遺伝子からなる遺伝子ファミリーの一員である。多くの植物でDREB2Aホモログが報告されているが、アミノ酸配列の相違が大きいために、どのタンパク質がDREB2Aと相同な機能を持ちうるのか、またどのアミノ酸が機能的に重要であるのかを推定することが難しかった。そこで、GenBankのタンパク質データベースに対してBLASTP検索を行い、DREB2Aと相同性の高い遺伝子のアミノ酸配列を取得した。これらを用いて分子系統解析を行い、DREB2型転写因子のクラス分けと特徴づけを行った。さらに得られた特徴をもとに各種植物のゲノム配列に対するTBLASTN検索の結果を解析し、未知のDREB2型転写因子のアミノ酸配列を推定した。以上の解析の結果、DREB2型転写因子は4つのサブファミリーに分けられること、各サブファミリーにおいてDNA結合ドメイン以外に保存領域がいくつかあることを見出した。その一部はシロイヌナズナのDREB2Aにおいて欠失させると活性が変化することが既に示されており、構成アミノ酸や二次構造がDREB2型転写因子に共通した活性制御機構にとって重要である可能性が示唆された。そこで、イネ、ダイズのDREB2A相同遺伝子の相当する領域に変異を加え、転写活性化能に与える影響を評価した。

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NF-Y複合体は3つのサブユニット(NF-YA/NF-YB/NF-YC)から構成され、真核生物の遺伝子プロモーターに多くみられるCCAATボックスに結合し転写調節を行っている。酵母および動物ではNF-Yサブユニットをコードする遺伝子はそれぞれ単一遺伝子であるのに対し、シロイヌナズナやイネでは約10コピーからなる遺伝子ファミリーを形成していることから、植物においてNF-Y複合体は様々な組み合わせとなって多様な生命現象に関与していると推察されるが、個々のサブユニットの機能はほとんど明らかにされていない。基部陸上植物ヒメツリガネゴケにおいてもNF-Y遺伝子ファミリーが存在し、NF-YA/NF-YB/NF-YCについてぞれぞれ2/6/6コピーであること、藻類では0/3/3コピー存在することから、植物は進化の過程でNF-Y遺伝子群のコピー数を増加させてきたことが示唆される。我々は、ヒメツリガネゴケのPpNF-YC1が種子におけるABAシグナル伝達を制御する転写因子であるシロイヌナズナABI3のヒメツリガネゴケオーソログ(PpABI3A)と相互作用することを、酵母ツーハイブリッド法により明らかにした。ヒメツリガネゴケの一過的発現系においても、PpABI3AとPpNF-YC1が協調的にABA誘導性プロモーターを活性化することから、両因子がin vivoにおいても相互作用することが示唆された。

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Processing body(PB)は酵母およびヒトの細胞質に点在するメッセンジャーRNAを含むリボ核タンパク質(mRNP)の集合体で、mRNAの脱キャップ化、翻訳抑制、RNA干渉に重要な役割を担う場であると考えられている。PBで行われるmRNAの脱キャップ化はmRNA発現抑制の重要な段階であり、近年の研究により脱キャップ化酵素は植物にも保存されていることが明らかにされた。しかし、PB形成がどのように植物の成長や生育環境によって制御されているかについてはいまだに知られていない。本研究では、mRNA脱キャップ化酵素であり、PB構成因子であるDCP2/TDTが、Arabidopsis thalianaの花粉細胞質において顆粒を形成することを明らかにした。また、この顆粒は花粉管伸長に伴って花粉管を進んでいくことも発見した。シクロヘキシミドやピューロマイシンで処理するとDCP2顆粒の数が変化することから、ポリソームからのmRNA流入が顆粒形成にかかわっていることが示唆された。花粉で形成されるDCP2顆粒は生殖細胞内でのmRNA代謝に重要な役割を担っているのではないかと予想された。

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日本型イネにはプラスミド様の内在性dsRNA（Oryza sativa endoranavirus）が存在する。一般にdsRNAはRNA干渉のトリガーとなるが、内在性dsRNAは全ての組織の細胞から一定コピー数で検出される。我々は内在性dsRNAとRNA干渉機構の関係を解析するため、RNA干渉関連遺伝子ノックダウン系統における内在性dsRNAの有無を解析した。その結果OsDCL2ノックダウン系統T1世代から内在性dsRNAが検出されなかった。また、内在性dsRNAを保持する個体との交雑により導入したF1個体、さらにF2個体の解析を行ったところ一部の個体において内在性dsRNAの脱落現象がみられたことを以前に報告した。この関係をより詳細に解析するために内在性dsRNA由来のsmall RNAの検出をおこない、特定の発育ステージを除いて極微量のsmall RNAを検出した。そこで、先の脱落現象が見られたOsDCL2ノックダウン系統において同様の解析を行ったところ、small RNA蓄積量とdsRNAの脱落現象との相関は示されなかった。内在性dsRNA由来の検出されたsmall RNAは極微量であり、内在性dsRNAは安定に存在することから、内在性dsRNAは宿主のRNA干渉機構を回避することが示唆された。

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シロイヌナズナのacl5変異株は，花茎の伸長に特異的な欠損を示す。この表現型を抑圧するサプレッサー変異株sac51-dの原因遺伝子は転写因子をコードし，そのmRNAには5つのuORFがある。sac51-dでは第4uORFに変異が生じた結果，転写因子が過剰翻訳されて茎の伸長回復がもたらされたと考えられている。本研究では，SAC51遺伝子の複数のuORFがそれぞれどのように発現に関与しているのかを解析するために，各uORFの開始コドンを破壊したプロモーター/5’リーダー配列にGUS遺伝子をつないだ融合遺伝子を導入した形質転換植物を作成した。得られた植物のGUS活性を測定した結果，20アミノ酸をコードする第1uORF，16アミノ酸の第2uORF，48アミノ酸の第3uORF，6アミノ酸の第5uORFの破壊では活性の低下，54アミノ酸をコードする第4uORFの破壊では発現の上昇が認められた。すなわち，第4uORFが特異的に下流のメインORFに対して翻訳抑制効果を持つ一方，他のuORFは翻訳促進効果を持つことが確かめられた。SAC51遺伝子は，ACL5によって作られるサーモスペルミンに応答して発現が増加する。そのシス配列を同定するためのSAC51プロモーターの解析もすすめている。

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シスタチオニン γ-シンターゼ (CGS) は植物のメチオニン生合成の鍵段階を触媒する酵素である。CGS をコードするシロイヌナズナの CGS1 遺伝子の発現は、メチオニンの代謝産物であるS-アデノシルメチオニンに応答し、mRNAの安定性の段階で負のフィードバック制御を受ける。この制御において、CGS1 遺伝子の第1エキソンが必要十分で、第1エキソンの中でも特に MTO1 領域のアミノ酸配列が重要であることが示されている。このMTO1 領域のペプチドがリボソームにシスに作用して翻訳が一時停止し、それと共役して自身をコードする mRNA の分解が誘導されると考えられている。
この制御に関与するトランス因子を遺伝学的に同定するため、CGS1 第一エキソンを GFPおよび GUS 遺伝子にそれぞれつないだ2種類のレポーター遺伝子を持つ形質転換シロイヌナズナを親株として用い、2つのレポーター活性を指標にして CGS1 転写後制御の欠損変異株の分離行った。翻訳や mRNA 分解に関わる普遍的な因子の関与が考えられたため、そのような因子の変異株も温度感受性変異株として分離できるようにスクリーニングを行った。その結果、CGS1 の転写後制御にトランスに働く因子の突然変異株であると考えられる4つの候補株が分離された。現在はこれらの候補株の解析、および原因遺伝子の同定を行っている。

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シスタチオニンγ-シンターゼ（CGS）遺伝子の発現はメチオニンの代謝産物であるS-アデノシルメチオニン（SAM）に応答してmRNAの分解の段階で負に制御されている。この制御には、CGSの第1エキソンが必要十分な領域であり、この領域内の77-RRNCSNIGVAQIVAA-91という配列（MTO1領域）が特に重要である。試験管内翻訳系を用いた解析によって、mRNA の分解に先立ちMTO1領域の直後で翻訳が一時停止することが示されている。一般に新生ペプチドはリボソーム内部の出口トンネルという構造を通過することから、CGS新生ペプチドのMTO1領域は出口トンネル内で何らかの機能を発揮していると考えられる。そこで出口トンネル内においてSAM が新生ペプチドと相互作用しているという作業仮説を立てた。この仮説を検証するために、MTO1領域内の80番目のシステインと81番目のセリン を他のアミノ酸に置換したときの効果を解析した。またSAMのアナログであるS-アデノシルエチオニン（SAE）を用いて解析したところ、野生型のMTO1領域ではSAMとSAEで応答に差違がなかったが、80番目と81番目を様々なアミノ酸に置換した場合は差違がみられるものがあった。以上より、80番目と81番目の位置のアミノ酸がエフェクター分子のメチル基／エチル基の認識に関与している可能性が示唆された。

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真核生物のmRNAには5’非翻訳領域に小さなORF（upstream ORF: uORF）が存在する場合がある。その中でuORFにコードされるペプチドが下流のORFの翻訳制御に関与する例がいくつか知られている。それらの制御では、uORFにコードされる新生ペプチドが自身を翻訳したリボソームに作用して、uORF上でリボソームの停滞を引き起こし、それによって下流のORFの翻訳が妨げられると考えられている。ところが植物におけるuORFペプチドによる翻訳制御としては、これまでに唯一シロイヌナズナのSAM decarboxylase遺伝子の例が報告されているのみである。
本研究では、シロイヌナズナにおいて新生ぺプチドにより制御される遺伝子を新たに同定することを目的として、シロイヌナズナの完全長cDNAデータベースを用いて転写因子やアミノ酸生合成に関与する遺伝子の中から5’非翻訳領域にuORFを含む遺伝子を検索し、その中からuORFのアミノ酸配列が下流ORFの翻訳に影響を与えるものを探索した。その結果、いくつかの遺伝子においてフレームシフト変異等によってuORFのアミノ酸配列を変えた場合に、下流ORFの翻訳に影響がみられた。またそのうちの一つでは、選択的スプライシングと新生ぺプチドによる翻訳抑制の組み合わせにより制御される可能性が示唆された。

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メチオニンとトリプトファンを除く全てのアミノ酸には2～6種のコドンが対応しており、同義コドンの使用（出現）頻度は生物種によって異なっている。一般的にコドン使用頻度は対応するtRNA量や翻訳効率を反映していると単純に考えられてきた。しかし葉緑体では、1）RNAエディティングによりコドン置換がおこること、2）葉緑体ゲノムに存在しているtRNA遺伝子だけでは全てのアミノ酸コドンに対応できないこと、3）葉緑体遺伝子の発現調節は主として転写後の段階で制御されていること、などの理由から同義コドンの使用頻度と翻訳効率が異なっている可能性が高い。我々は、タバコ葉緑体in vitro翻訳系を基に、個々のコドンの翻訳効率を測定する手法を開発し、これを用いて葉緑体における同義コドンの翻訳効率を測定し、使用頻度との比較解析を行った。その結果、チロシンおよびフェニルアラニンをコードする同義コドンでは、使用頻度と翻訳効率が逆転していること、アルギニンをコードするCGAコドンとAGAコドンでは、使用頻度がほぼ同じであるにもかかわらず翻訳効率に約20倍もの差があること見出した。本研究では、このような同義コドンの翻訳効率の違いが、タンパク質コード領域の翻訳効率にどの程度の影響を与えているかについて、数種のタバコ葉緑体mRNAを用いて解析した。

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タバコ葉緑体ゲノムには約80種類のタンパク質がコードされており，それらは葉緑体に存在する独自の遺伝子発現系により合成される．基本的に原核型の装置により翻訳される葉緑体mRNAには，大腸菌等のmRNAにみられるShine-Dalgarno(SD)様の配列がないものが多く，そのようなmRNAの翻訳開始には核コードのトランス因子が関与すると考えられている．我々はタバコ葉緑体由来のin vitro翻訳系やゲルシフト等の手法を用いて葉緑体における翻訳開始機構を解析し，これまでに真の翻訳開始点や翻訳開始に必要なシス配列を明らかにしてきた．しかし，トランス因子は明らかになっておらず，メカニズムにも不明な点が多い．そこで，いくつかのSD様配列を持たないmRNAの翻訳開始に共通のトランス因子が関与する可能性をゲルシフト法で調べた．psbN 5'非翻訳領域（5'-UTR）上のU-richな領域へのトランス因子の結合は，atpB 5'-UTR上のU-richな領域に強く阻害された．この他にも，psbN 5'-UTRへのトランス因子の結合を阻害する5'-UTRが複数見つかった．また，この結合はpolyUにも阻害されたが，polyAやpolyGでは阻害されなかった．以上の結果から，psbN翻訳開始機構を考察する．

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ndhK遺伝子はNADHデヒドロゲナーゼのサブユニットをコードしており、タバコでは葉緑体ゲノム上で上流に存在するndhC、下流に存在する ndhJ両遺伝子とともに共転写され、蓄積したポリストロニックmRNAが翻訳されてndhK遺伝子産物が合成される。タバコ葉緑体in vitro翻訳系で解析した結果、ndhKの翻訳は、主にndhC終止コドンの4塩基上流に存在するAUGコドンから開始され、この翻訳はndhC終止コドンに強く依存していることが明らかとなった。また、ndhC5’ UTRを取除いても終止コドンに依存したndhKの翻訳が検出された。このことから、ndhKの翻訳には、上流のndhCの翻訳に共役した機構以外に新たな機構が関与していることが示唆された。

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葉緑体遺伝子から転写されたmRNA前駆体はRNA鎖切断、RNAスプライシング、RNAエディティング、トリミングなど複雑な過程を経て成熟mRNAとなる。葉緑体mRNAの5’非翻訳領域は数十から数百ヌクレオチドの長さであり、葉緑体内では転写開始点からのものと途中で切断されて短くなったものが混在している場合が多い。この5’非翻訳領域の切断が翻訳効率に影響するかどうかを植物体(in vivo)を用いて調べるのは難しいので、我々の開発した試験管内(in vitro)翻訳系を用いて解析した。翻訳反応は、mRNA鋳型が不飽和で、反応がほぼ直線的に進行する時間内で測定した。今回は、タバコ葉緑体のatpIとpsaCの各mRNAについて調べた。atpI mRNAはコード領域上流-208と-131から転写が開始され、-85に切断点がある。2箇所の転写開始点からのmRNAはいずれもほぼ同程度に翻訳されたが、-85で切断されたmRNAは極めて高い翻訳活性を示した。psaC mRNAは上流-234から転写され、-173に切断点がある。この場合も同様に切断されたmRNAがより強く翻訳された。これらの結果をもとに5’非翻訳領域の切断の意義を考察する。

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高等植物の葉緑体は独自のゲノムと遺伝子発現系を持ち、遺伝子発現は主に翻訳段階で制御されているため、翻訳の制御機構の理解は重要な意味を持つ。
翻訳はmRNA上の遺伝子産物をコードしている配列（コード領域）より上流に存在する5’非翻訳領域（5’ UTR）によって制御されていると考えられてきた。しかし、実際には強力な5’ UTRをさまざまなコード領域に連結しても、その本来の翻訳活性が得られない場合が多い。これは5’ UTRとコード領域の特に開始コドン周辺配列との相互作用に起因すると考えられる。
そこで、タバコ葉緑体で最も翻訳活性の高いpsbA mRNAを用いて葉緑体in vitro翻訳反応を行い、開始コドン直後のコード領域の配列が翻訳に与える影響について解析した。

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RNAエディティングは、遺伝情報をRNAレベルで変化させる現象であり、様々な生物で観察される。植物では、葉緑体mRNAとミトコンドリアmRNAの特定の部位で、CからUへのエディティングが観察される。また、核や葉緑体にコードされるtRNAでは、アンチコドンのゆらぎの部位でAからIへのエディティングを受けるものが存在する。これらのRNAエディティングは、いずれも脱アミノ化反応であり、哺乳動物や酵母などでは、すでに反応を触媒するデアミナーゼが同定されている。しかし、植物の塩基置換型のRNAエディティングの分子機構に関しては不明な点が多く、触媒活性を担う酵素もまだ明らかにされていない。本研究では、植物においてデアミナーゼがRNAエディティングに関与するかどうかを検討するため、シロイヌナズナにおけるデアミナーゼ遺伝子ファミリーの特徴付けを行った。
データベース検索の結果、シロイヌナズナのゲノムにおいてデアミナーゼドメインをコードする遺伝子は17種類見出された。これら遺伝子のうち、tRNAのエディティングに働くアデノシンデアミナーゼのグループに属するものが6種類あったが、動物においてmRNAのエディティングに働くデアミナーゼのグループに属するものは見出されなかった。本研究では、17種全てのデアミナーゼ遺伝子の構造や発現パターン、細胞内局在についても合わせて報告する。

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植物では，tRNA^TyrとtRNA^Met-eをコードする核遺伝子のみがイントロンにより分断されている。前駆体tRNAのスプライシング反応は3つの酵素の連携による。すなわち，エンドヌクレアーゼ (Sen)によるイントロンの切断，tRNAリガーゼ (tRL)によるエキソン同士の結合，そして2'-フォスフォトランスフェラーゼ (Pt)による2'-リン酸基の除去からなる。最近，酵母前駆体tRNAスプライシングが細胞質で進行することが報告されたために，我々は植物におけるtRNAスプライシング酵素の局在をGFPとの融合蛋白質を指標として調査した。その結果，いずれの蛋白質ともに核局在を示した。このことから，植物では核がtRNAスプライシングの場であると考えられる。更に， N末端側に葉緑体への移行シグナル (CTS)が予測されたtRLとPtは，葉緑体（プロプラスチド）への局在も観察された。Ptについてはミトコンドリアへの局在も同時に観察された。少なくともtRL遺伝子の最初の開始コドン前後の配列はコンセンサスから逸脱しており，部分的にスキップして第2開始コドン以降から翻訳が始まることが考えられる。以上より，植物のtRLとPtは翻訳レベルでの開始コドンの選択によって細胞内の複数のコンパートメントに移行したものと考えられる。オルガネラ移行を示した酵素の機能について考察する。

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通常の翻訳では、翻訳開始複合体がmRNA上の最も上流に存在する翻訳開始コドンを認識することで翻訳を開始する。しかし一部には、翻訳されるべきタンパク質をコードする領域 (Major ORF) の上流に短いORF (Upstream open reading frame : uORF )を持つmRNA が存在ことが知られている。これらのmRNAでは、uORFが下流のMajor ORFの翻訳を制御していることが報告されている。OsMac1 遺伝子の5’UTRは、選択的スプライシングが生じるために、3種のスプライシングバリアントが存在し、それぞれの5’UTRには3個のuORF が存在することがわかった。そこで、この 5’UTRが下流のORFの翻訳に対してどのような影響を与えているかを解析した。OsMac1のこれらの3種のスプライシングバリアントに対応する 5’UTR の下流に GUS 遺伝子を連結したレポーター遺伝子を構築し、イネ培養細胞(カルス)に導入した。これらの形質転換体カルスにおけるGUS活性を調べたところ、3種のうちの1種の5’UTRでは非常に強いGUS活性が検出された。一方、その他の2種では、コントロールよりも弱いGUS活性が認められた。これらの結果から、OsMac1では、5’UTR 選択的スプライシングによって下流ORFの翻訳量に差が現れることが示唆された。

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真核生物においてDNAはクロマチンという高次構造に内包されている。クロマチンの状態は遺伝子のエピジェネティック制御を規定し、膨大なゲノム情報を整理して有効活用することを可能にしている。クロマチンを介したエピジェネティックな情報はDNA複製・修復の前後でしばしば維持されており、この維持は生物のゲノム統合性と個体の正常な発達に極めて重要であると考えられているが、その維持機構は未だ多くの謎に包まれている。本研究では、DNA複製・修復後どのようにクロマチンが再構築されるかについての知見を得ることを目的とし、DNA損傷応答とエピジェネティック制御の双方に関与する植物特有の核内因子BRU1の機能解析を行っている。BRU1はDNA複製・修復後のクロマチン再構築に関与していると考えられているが、最近の解析から、BRU1は既に報告されているヘテロクロマチン領域のエピジェネティック制御以外にも、メリステム形成や種子形成に関わる遺伝子群の発現制御にも関与していることが判ってきた。これらの結果及びマイクロアレイを用いた遺伝子発現プロファイルの解析から、bru1変異が広範なエピジェネティック制御に影響する可能性が示唆された。現在、BRU1複合体の精製を試みており、併せて報告したい。

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茎頂分裂組織における生理現象に関して、被子植物では、茎頂分裂組織や葉の形態形成にsmall RNAが関与すること、花成における春化依存促進経路で条件的ヘテロクロマチン形成が関連遺伝子の発現を制御することなどが報告されている。しかし、裸子植物においても同様の機構が存在するのか否かについての情報は、現在、皆無である。
スギは、一定の温度および日長条件下でジベレリン処理を行うことにより、挿し木苗に花成を誘導することができる。短日・恒温（8時間日長、15℃）条件下で休眠させた、2年生および3年生挿し木苗にジベレリン処理（100ppmまたは500ppm）を施し、7週間後（11月上旬）、自然日長、明期20℃暗期15℃の環境条件に移したところ、数週間の栄養成長を経て雌雄花が分化した。これは、ジベレリンによるスギの花成誘導にエピジェネティクスが関与することを示唆している。
そこで、本研究では、エピジェネティクスに関する分子機構を解明することを目的として、まず、生殖器官が分化する位置の特定を試みた。なお、今回、上記条件に加えて、雌雄花の分化誘導条件として、自然日長、明期30℃暗期25℃条件（明期25℃暗期20℃条件での2週間の移行期間を経る）を追加した。本発表では、各挿し木苗の枝毎の雌雄花の分化状態を解析し、その規則性について考察する。

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プロテアソームは生体内で短寿命タンパク質や異常タンパク質を分解する巨大なタンパク質複合体として機能している．植物ではサブユニットの多くが重複したパラログ遺伝子によりコードされている．これは植物プロテアソームの大きな特徴の1つだが，その生理的意義についての知見はほとんどない．当研究室での実験から，特定のパラログ分子の変異体が栄養ストレス過剰応答となることが示されており，パラログ間での機能分担の可能性が示唆された．また，プロテアソームのもつ3種類のペプチダーゼ活性は栄養ストレスに応じて変化することが既に報告されている．従って，植物細胞内には，様々な環境ストレスに対応した「環境ストレス適応型」プロテアソームが存在することが予想された．そこで，各環境ストレス条件下におけるプロテアソームのサブユニット構造を明らかにすることで，プロテアソームの構造・機能変換の実体解明を目指した．
そのためにまず，プロテアソームのアフィニティー精製およびMS解析によるハイスループットな構成サブユニットの同定系を確立した．さらに，精製産物を2次元電気泳動で分離することによりパラログ分子の判別に成功した．現在この実験系を用いて，栄養および酸化，病害等の環境ストレス下におけるプロテアソーム活性の変化とサブユニット構成の変換について解析を進めており，変異体を用いた遺伝学的な解析と併せて，これらについて議論したい．

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シロイヌナズナのAtbZIP10は、プログラム細胞死や病害抵抗性、浸透圧調節などの環境応答機構に関与するbZIP型の転写因子である。我々の予備的な実験により、シロイヌナズナのグループCに属するbZIP型転写因子（bZIP-C: AtbZIP9,10,25,63）が、植物細胞中で非常に不安定であることがわかっている。本研究では26Sプロテアソームによる分解系に注目し、AtbZIP10のユビキチン化を介した選択的タンパク質分解機構の存在を明らかにすることを目的とした。シロイヌナズナの葉肉プロトプラストを用いてAtbZIP10-GFPを発現させた結果、一過的に発現したAtbZIP10-GFPの経時的な分解が、26Sプロテアソームの阻害剤であるMG-132の処理により顕著に抑制された。また、AtbZIP10のデリーションクローンを用いた解析により、bZIP-C間で高度に保存されているドメインIIを欠いたクローンでは分解が抑制されることも明らかにした。このドメインIIにはユビキチンが結合するリジン残基が高度に保存されていることから、AtbZIP10を含むbZIP-Cはユビキチン化を介した選択的な分解を受けている可能性が示唆される。現在in vitro ubiquitination assayによりAtbZIP10のユビキチン化を検証しているので、この結果についても合わせて報告する。

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FtsHプロテアーゼは、葉緑体のチラコイド膜に存在しており、膜タンパク質の品質管理を行っている。光化学系IIのD1タンパク質は、光合成反応時に特に損傷を受けやすいため代謝回転が速い。FtsHプロテアーゼはこの分解を担う酵素の1つである。また、この酵素が欠損した植物は斑入りの表現型を示すことから、葉緑体の発達に重要な役割を担っていると考えられている。葉緑体の発達はタンパク質の合成と分解のバランス重要で、本酵素が欠損することでそのバランスが崩れるために、斑入りが形成されるものと考えられている。本酵素は、N末端側からチラコイド膜との結合に重要な膜貫通ドメイン、ATPaseドメイン、プロテアーゼドメインから構成されている。細菌由来のFtsHプロテアーゼによる研究から、基質タンパク質はATPaseドメインでエネルギー依存的に変性し、プロテアーゼドメインに輸送され、そこで実際に切断されると考えられている。シロイヌナズナには、核ゲノム中に12のFtsH相同遺伝子が知られており、本研究ではそのうち特に強い斑入りの表現系を示す遺伝子の1つであるFtsH5についATPaseドメインの解析をおこなった。発現系は大腸菌を宿主として構築した。可溶性画分に十分な量のタンパク質を回収し、生化学的および酵素反応速度論的に解析を行った。

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植物におけるFtsHプロテアーゼの主な働きは、光化学系●の中心タンパク質であるD1タンパク質の品質管理である。電子の移動が活発なD1タンパク質はダメージを受けやすく、代謝回転時にFtsHプロテアーゼによって分解されていることが知られている。FtsHプロテアーゼはN末端側から、膜貫通ドメイン、ATPaseドメイン、プロテアーゼドメインで構成されている。ATPaseドメインが基質タンパクを引き込み変性させて、プロテアーゼドメインに送り分解していると考えられている。
本研究では、FtsHのプロテアーゼドメインが導入された発現用ベクターpET21aを大腸菌BL21-CodonPlus (DE3)-RIL株に形質転換してIPTGにより発現を誘導した。細胞封入体として回収し、尿素により変性させて透析を行い活性化し、導入したHis-tagを用いてNi-NTAカラムにより精製を行った。
基質タンパク質にFITCカゼインを用いて、最適pH、2価イオン依存性、阻害剤の影響などの諸性質について解析を行った。その結果、弱塩基性で最適pHを示し、高濃度のMgイオンを要求することが示された。また、様々な基質に対しての活性を調べたところ、βカゼインに特異的な分解が見られた。この断片を、ペプチドシークエンスすることにより、βカゼインでの切断部位が明らかとなった。

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FtsHプロテアーゼは葉緑体の形成・維持に関わっていると考えられている。本酵素を欠損したシロイヌナズナは、正常な葉緑体を作ることができなくなり斑入りの表現系を示す。FtsHプロテアーゼは、光合成に関与する光化学系II複合体の一部であるD1タンパク質を特異的に分解するATP依存性金属プロテアーゼで、チラコイド膜に局在しストロマ側に露出している。FtsHプロテアーゼはN末側から膜貫通ドメイン・ATPaseドメイン・プロテアーゼドメインの3つからなる。ATPaseドメインの役割として、D1タンパク質などの基質タンパク質をATPのエネルギーを用いてアンフォールディングすることがあげられる。本研究はこの機構を明らかにするため、大腸菌BL21-CodonPlus(DE3)-RILを宿主としたATPase領域の発現系を構築した。用いた領域はvar2株の変異領域に対応するFtsH2のATPaseドメインである。Ni-キレーティングセファロースカラムによりタンパク質を精製し、N末端側の配列をペプチドシークエンスによって目的タンパク質であることを確認した。このタンパク質を用いて、最適pHや最適Mg2+濃度、様々な阻害剤の影響などの機能解析を行った。現在は、KmやVmax・Kcatなどのキネティクスなどを中心に生化学的解析を行っている。

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葉緑体は独自の原核生物型リボソームを持つが、この葉緑体リボソームには、7種類の葉緑体特異的に存在するリボソームタンパク質plastid-specific ribosomal protein (PSRP)を含むことが明らかになっている。いずれのPSRPタンパク質も機能が不明であるが、多くの陸上植物において高度に保存されており、葉緑体の機能に大きく関与するものと考えられる。7種のPSRPのうち、PSRP-1とPSRP-3は多くのシアノバクテリアにも存在しており、PSRP-1は大腸菌において定常期に翻訳を抑制するタンパク質hibernation promoting factor (HPF) と類似していることが報告されている。
我々はSynechocystis sp. PCC 6803株のpsrp-1破壊株及び過剰発現株を作成し、野生株との生育比較を行った。その結果、固体培地において30℃では生育にほとんど差が現れなかったが、40℃高温ストレス条件下では破壊株は急速に死滅した。しかし、培地にグルコースを添加して30℃で培養すると破壊株の生育が野生株よりも促進され、過剰発現株の生育は抑制された。このことから、PSRP-1が翻訳制御を通して細胞の活性を抑える働きをしていることが期待された。

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近年、ArabidopsisのmicroRNA, miR398がCuZn-SODを転写後制御していることが明らかにされ、miR398がストレス応答や銅代謝に関与していることが示された。miR398の標的配列はCuZnSODの保存されたコード領域にあることから植物のCuZn-SODは同様の調節を受けている可能性がある。しかしながら、トウモロコシでは(1)葉緑体型CuZn-SOD (SOD-1)は酸素発生のない維管束鞘葉緑体にのみ存在し、葉肉細胞葉緑体には無い。(2) Fe-SODの活性が検出できず、低濃度Cu応答におけるFe-SODのCuZn-SODに対する代替的役割は期待できない。これらのことから、SODのmiRを介した制御機構が異なっていることも考えられる。我々はSOD-1遺伝子やFe-SODのcDNAを明らかにしており、ここではSOD遺伝子の発現調節機構の解明を目的して、SODの金属や環境ストレスに対する応答を検討した。SOD-1遺伝子にはCu応答エレメントTnnnGCTGがプロモータに存在し、またmiR398と19/21マッチする配列が第4エキソンにあった。幼植物を高Cu処理および低Cu処理し、また同様にFe処理もおこない、CuZn-SODとFe-SODの応答を現在、検討している。さらに、低温、乾燥、MVなどの影響も調べたのでmicroRNAの関与の観点から考察する。

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シュウ酸は植物に含まれる有害食品成分として知られているが，その蓄積の植物生理学的意義の一つとして，重金属をキレートすることによりその無毒化に寄与する役割が提唱されている。私たちは，ツツジ葉においてNO₂暴露により発現誘導されるジャーミン様タンパク質（RmGLP2）の機能解析を目的にこれをタバコ培養細胞で構成的に発現させたところ，当該タンパク質はアポプラストに局在し，スーパーオキシドディスムターゼとシュウ酸酸化酵素（OxO）の両活性を有することを見出した。OxO活性は野生型細胞から調製したアポプラスト画分ではほとんど検出されないのに対し，RmGLP2を過剰発現する形質転換細胞では有意に上昇し，その結果，シュウ酸レベルが野生型細胞の20％程度まで減少していた。シュウ酸含量と重金属感受性との関連を明らかにする目的で，細胞増殖に対する重金属の影響を調査したところ，重金属を含む固形培地で培養した形質転換細胞は，野生型細胞と比較して顕著な生長阻害を呈した。以上の結果は，重金属耐性におけるシュウ酸蓄積の植物生理学的重要性を示唆している。

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植物特異的な蛋白質へのO-結合型糖鎖修飾の最初のステップは，蛋白質中のプロリン残基のヒドロキシプロリンへの変換であり，その反応には，1型または2型のプロリン水酸化酵素（P4H）が関与すると推定されている．この修飾機構の解析の一環として，今回はタバコの2型P4Hの解析を行った．まず，タバコから2型P4Hの完全長cDNAクローン3種類（NtP4H2.1，NtP4H2.2，NtP4H2.3）を単離した．これらのコードする蛋白質は共にN末端にシグナルペプチド，中間部分に活性ドメイン，C末端にTox1ドメインと呼ばれる機能未知のドメインを持っていた．続いて，タバコ培養細胞由来の膜画分を分画し，NtP4H2.2の分布を特異抗体を用いて解析したところ，その分布がシスゴルジのマーカーと一致することを見出した．また，分泌型GFPにN末端シグナルペプチドを除いたNtP4H2.2を融合させた蛋白質をタバコ培養細胞中に発現させると，シスゴルジのマーカーとの共局在を示すドット状のGFP蛍光が観察された．更に，ミクロソーム画分を超音波処理した後，膜画分と可溶性画分に分離したところ，殆どのNtP4H2.2は膜画分に回収された．従って，2型P4Hは，主にゴルジ装置に局在する膜蛋白質である．現在，細胞内局在と膜結合に果たすTox1ドメインの解析を進めており，これについても報告したい．

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活性部位にチオール基をもつシステインプロテアーゼ類は、種子の発芽、形態形成、プログラム細胞死など様々な生理学的過程に関与する。近年、このプロテアーゼ類は生物的、及び、無生物的ストレスの受容、シグナル伝達と応答などにも関与することが明らかになってきた。キウイフルーツ果実に含まれるアクチニジンはパパインファミリーに属し結晶構造も知られているが、等電点の異なる多種類のアイソザイムから成るとの報告もある。その生物学的役割として、貯蔵や防御が推定されている。我々は、新規な森林資源を開発するため、マタタビ果実に含まれるプロテアーゼの酵素化学的性質とそれらをコードする遺伝子を解析した。
1．サルナシ果実のジュースを硫安沈殿し、陰イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィーによって比活性の異なる3種類のシステインプロテアーゼを分離した（ピーク1, 2, 3）。そして、人工ペプチド基質を用いて酵素化学的諸性質を調べた。また、ピーク1と2の結晶構造を明らかにした。
2．サルナシ果実からDNAとRNAを抽出した。アクチニジン遺伝子の配列情報を基に合成したプライマーを使ってPCRで遺伝子増幅した。genomic PCR産物の塩基配列からエキソン部分を連結して得た配列をもつクローンをRT-PCRで増幅できた。
3．今後、様々なPCRプライマーを設計して多くの遺伝子を増幅する予定である。

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高等植物は土壌液中の硫酸イオンを細胞内に取り込み、複数の酵素反応を経て多様な有機硫黄化合物を合成する。硫黄同化系の第一反応は、ATPスルフリラーゼが仲介する硫酸イオンのアデノシン5’-ホスホ硫酸(APS)への変換である。APSは、システイン合成経路と、硫酸化代謝物の合成経路に分配される。シロイヌナズナのゲノムには4つのATPスルフリラーゼ遺伝子(ATPS1、ATPS2、ATPS3、ATPS4)が存在する。各ATPS遺伝子の発現が抑制された変異体シロイヌナズナを取得し地上部におけるATPスルフリラーゼ活性を測定した結果、atps1変異体、atps2変異体およびatps3変異体の地上部では野生型植物と比較して有意に活性が低下していることが示された。また、各ATPS遺伝子のプロモーター領域の下流にATPSコード領域とGFPコード領域をつないだ融合遺伝子を導入した形質転換シロイヌナズナを作出したところ、ATPS1、ATPS3およびATPS4はプラスチドに特異的に局在するが、ATPS2は細胞質とプラスチドの両方に局在することが示唆された。さらに、各ATPSはそれぞれ細胞特異性が異なることから、生体内において異なる役割を持っていると考えている。

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近年、海洋性珪藻 Phaeodactylum tricornutum及び Thalassiosira pseudonanaにおいてパーティクルガンによる安定な核ゲノムの形質転換が可能となった。しかし、利用できる挿入変異選抜系がそれぞれの種において1種類ずつしかなく、2遺伝子以上の遺伝子導入が難しい状態にある。そこで本研究ではこれら2種の海洋性珪藻の栄養要求性変異体を化学変異誘導によって作成し、1遺伝子導入による形質相補を利用した、新規挿入変異選抜系の確立を目的として実験を行った。 P. tricornutum及び T. pseudonanaを終濃度1mg/mLの化学変異原ENU( N -ehtyl- N -nitrosourea)で30分間処理したとき、未処理のものと比較して約70％の生存率を示した。変異誘導を終濃度1mg/mL ENUで30分間行った2種の珪藻を5-FOA (5-fluoro orotic acid) を0.6mM、ウラシルを0.5mM含む人工海水寒天培地に撒き、スクリーニングを行った。その後生育してきた株を5-FOA を1.8mM、ウラシルを0.5mM含む人工海水寒天培地に移し、さらにスクリーニングを行った。その結果、ウラシル要求性を示すP. tricornutumの変異体が得られた。このウラシル要求性変異体の解析結果について報告する。

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ロイシンリッチリピート受容体様キナーゼ(LRR-RLK)は植物の細胞間の情報伝達において重要な働きをしていることが遺伝学的に明らかになってきた。しかし、生化学的な解析を行うために十分量なタンパク質を植物体から得ることが困難であるため、LRR-RLKのリガンドの認識機構やシグナル伝達機構などの生化学的な機能は不明な点が多い。そこで、我々は酵母(Saccharomyces cerevisiae)を用いて、約20種類のLRR-RLKの発現の検討を網羅的に行った。
まず、幾つかのLRR-RLKを用いて、発現に適した株の検討を行った。その結果、液胞プロテアーゼ、pep4、prb1、prc1の欠損株であるBY2777が最も発現に適していることが分かった。続いて、異種分泌タンパク質を酵母で発現させる際、タンパク質のフォールディングや分泌を促進するキャリアタンパク質Hsp150Δと融合させて発現の検討を行った。その結果、幾つかのLRR-RLKで自身のシグナルペプチドよりも、Hsp150Δと融合させた方が発現、分泌が改善された。
現在、発現に成功したLRR-RLKの可溶化条件の検討、および、酵母で発現させたLRR-RLKが活性を有しているかを網羅的に調べるための1つの指標として、キナーゼの活性を調べている。

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一般に生体膜はリン脂質から成るが、高等植物の葉緑体ではそのチラコイド膜の約80％がモノガラクトシルジアシルグリセロール（MGDG）とジガラクトシルジアシルグリセロール（DGDG）の2種の糖脂質で占められている。これまでの研究から、モデル植物シロイヌナズナにおいて2種類のMGDG合成酵素が存在し、それらが機能分担をしていることが知られている。
これまでにリン欠乏下のシロイヌナズナで、リン脂質の減少とDGDGの増加が起こり、また、この時MGDG合成酵素typeBの発現量が増加していることが報告されている。本研究では、ゴマのリン欠乏応答機構の解明を目指すと共に、既にモデル植物で明らかになったリン欠乏応答性膜脂質転換の機構が、他の植物にも普遍的に存在するかを検証した。
ゴマをリン欠乏条件下で生育させたところ、シロイヌナズナとは異なり、リン欠乏時の根の顕著な伸長阻害が見られなかった。またリン欠乏下のゴマにおいてもDGDGが蓄積することが分かったが、根ではシロイヌナズナでは認められないMGDGの蓄積が見られた。
そこでゴマの2種類のMGDG合成酵素遺伝子を単離し、リン欠乏時における遺伝子発現解析を行った。その結果ゴマもシロイヌナズナと同様の発現パターンを示すことが分かった。
以上のことからゴマにも膜脂質転換機構が存在すると考えられるが、シロイヌナズナとは異なる特徴を持つことが分かった。

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イネを乾燥、塩ストレス、冠水処理した時にモノガラクトシルジアシルグリセロール合成酵素遺伝子(OsMGD)が誘導された(Qi, Tanaka et al., :Planta 2004)。本遺伝子を過剰発現させたタバコを用いて、塩や乾燥化での本酵素の役割について調べた。OsMGD形質転換植物の作出はゲノムPCRとイムノブロット法で確認された。OsMGD形質転換植物は、野生タバコと比較して、塩ストレス下でより良い成長と活力を示し、塩と乾燥ストレス下でより高い光合成活性と光化学系II量子収率を示した。形質転換植物は、野生植物と比べて、有意に高いモノガラクトシルジアシルグルセロールMGDG)，ジガラクトシルジアシルグリセロール(DGDG)、脂質リン含量を示した。塩ストレス時に、MGDG とDGDGは野生タバコより有意に高いレベルを示した。MGDG とDGDG中の全脂肪酸組成は野生タバコと形質転換タバコで、72時間の塩処理の間は変わらなかったが、野生タバコでのみ、両糖脂質中のα-リノレイン酸レベルのわずかな減少が認められた。これらの結果はOsMGD過剰発現植物は糖脂質組成を回復させることで膜構造と機能を安定化させることで、塩ストレス耐性に対応したことを示す。

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植物の生殖器官には脂質が多く含まれているが、個々の機能には未解明な点も多い。我々はステロールが生殖器官の発生に果たす機能を、シロイヌナズナを用いた逆遺伝学的なアプローチで解析した。
ステロール生合成の鍵酵素であるHMG-CoA還元酵素はシロイヌナズナではHMG1とHMG2によってコードされている。hmg1は矮性、早期老化、雄性不稔の形質を示し、hmg1 hmg2二重変異体は雄性配偶体致死となって単離できなかった。電子顕微鏡観察の結果hmg1では葯タペータムの脂質系オルガネラが縮小し、成熟花粉はポーレンコートレスに、hmg1 hmg2の花粉小胞子はつぶれていた。
次にステロール骨格形成段階に注目した。ステロール骨格はオキシドスクアレンがシクロアルテノールまたはラノステロールへと環化されることで形成される。前者をシクロアルテノール合成酵素（CAS1）が、後者をラノステロール合成酵素（LAS1）が触媒する。CAS1のノックアウトアリルであるcas1-2は雄性配偶体致死となって単離出来なかった。しかしcas1-2の花粉小胞子はhmg1 hmg2二重変異小胞子に比べて異常は小さかった。従って花粉小胞子の発達にはメバロン酸からオキシドスクアレンまでの中間代謝物または派生産物が重要であるか、ラノステロールを経由するステロール合成経路が重要であるかの可能性が考えられる。

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糖は植物において、様々な代謝や発生の課程を調節しているが、形態形成や発生における情報伝達及びストレス耐性に関与する正確な機構は十分に解明されていない。シロイヌナズナ新奇突然変異体sweetieは、糖質代謝異常によるトレハロース、トレハロース6リン酸及びデンプンの高蓄積に加え、形態の顕著な変異を示す。sweetieでは著しい矮性、lancet型の葉、早期老化及び不稔性が認められた。また、網羅的遺伝子発現解析により、sweetieでは、糖代謝、糖輸送、老化、エチレン生合成及び非生物的ストレスに関わる遺伝子発現が高くなっていることが示された。sweetieは代謝可能な糖であるショ糖とグルコースにより矮性と早期老化の表現型が促進されたが、高濃度ソルビトール存在下では表現型の一部復帰が見られた。しかし、SWEETIEと糖代謝に関与する既知のタンパク質との関連は見られなかった。SWEETIEは、糖やデンプンの蓄積やエチレン生成における著しい変化をもたらすような、代謝、ホルモン、ストレスに関与する複数の経路に影響する重要な調節機能を持つと考えられる。

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スフィンゴ脂質は、膜の構成成分ともに、生理活性物質としてプログラム細胞死や細胞増殖などに関与していることが報告されている。スフィンゴ脂質は、long-chain base（LCB）と呼ばれる共通した構造を持ち、植物ではこのLCBに、ファイトスフィンゴシンなどのC4位が水酸化されたものが多く存在する。LCBのC4位を水酸化する酵素は、ジヒドロスフィンゴシンC4ハイドロキシラーゼ（DSH）でありイネには5つのDSH遺伝子（OsDSH1 - OsDSH5）が存在する。我々は植物におけるDSHの機能を明らかにするため、これら5つの遺伝子について解析を行なった。OsDSH遺伝子群について発現を調べたところ、すべて植物体で発現しており、それらの組織発現パターンは、それぞれ異なっていることが明らかとなった。酵素活性を調べるためDSH欠損酵母を用いた相補実験を行なったところ、OsDSH1、OsDSH4が、酵母のDSHを相補することができた。植物体でのこれらの遺伝子機能を解析するために、それぞれの遺伝子について、RNAi発現抑制体と過剰発現体を作製した。その結果OsDSH1発現抑制体において不稔の形質を示した。またOsDSH5過剰発現体において顕著な矮性を示した。これらの解析によりOsDSH遺伝子群は、それぞれ異なった部位で、様々な働きをしていることが示唆された。

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