マメ科植物はその根において窒素固定細菌（根粒菌）と共生系を確立し、高効率の窒素固定器官である根粒を形成する。この根粒の形成には、植物由来のシグナル分子であるフラボノイドの根からの分泌や、根粒組織内での炭素源と窒素化合物の交換など、様々な膜輸送系が複雑に関わっている。MATE (Multidrug And Toxic compound Extrusion) 型トランスポーターは二次輸送体に区分され、輸送駆動力としてH+ またはNa+ を利用し、生体異物や内在性の低分子有機化合物を対向輸送メカニズムで運ぶことが知られる。我々はミヤコグサの根粒形成に応答する輸送体研究の一環として、今回MATE型トランスポーターの1つLjMATE1を見い出し、その輸送機能と生理的役割を明らかにすることを目的として解析を行っている。
Real Time RT-PCR を用いた解析よりLjMATE1は根粒菌感染後12日目のミヤコグサ地下部で最も高く発現し、その後発現が減少することが確認された。さらに詳細な発現をGUS 活性により調べたところ、LjMATE1は根粒内の内皮層において特異的に発現していることが明らかとなった。現在、酵母にLjMATEを発現させ、細胞輸送系において輸送基質の検討を行っている。

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自然界の植物の表面、内部、根圏には様々な細菌が存在し、植物との相互作用により多様な役割を担っていると考えられている。我々は、栽培イネの内部より分離したAzospirillum属細菌について、イネへ再接種して内部に定着させた際のイネの生育に与える影響を評価した。温室試験では、3葉期のイネの根本にAzospirillum属細菌懸濁液 (1x10⁸ CFU/ml) を処理し、自然光、明期25℃、暗期19℃で栽培を行った。その結果、Azospirillum属細菌処理区において第5葉の伸長の促進が観察され、また、地上部の乾物重が有意に増加していた。次に、実際のイネ栽培における評価を行うため、このAzospirillum属細菌を処理したイネの栽培を圃場で行った。その結果、処理区において分げつ、草丈、穂数が有意に増加し、最終的に種子収量が増加した。穂の大きさには処理区と無処理区の差は見られなかった。以上から、イネ内部に定着したAzospirillum属細菌がイネの生育、分げつを促進し、その結果、穂数が増えることにより種子収量が増加することが明らかになった。

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イネ葉組織内から単離された細菌エンドファイトAzospirillum sp.を感染させたイネおよびシロイヌナズナでは病害抵抗性が付与されることが明らかになっている。しかし、本菌が植物にどのような働きかけをすることにより耐病性が誘導されるのか等のメカニズムの詳細は明らかになっていない。そこで本研究では、Azospirillum sp.とシロイヌナズナの直接的な相互作用を見出すために、無菌栽培時のシロイヌナズナの生育にAzospirillum sp.が及ぼす影響を観察した。
1/2MS培地上で栽培させたシロイヌナズナの根に対するAzospirillum sp.処理の影響を検討した結果、播種10日後に通常根が約20 mm伸長するのに対して処理区では約2 mmまでに抑制された。種子から離れた場所に本菌を浸み込ませたろ紙を静置しても根の伸長抑制効果は認められたが、その効果は距離依存的であった。また、暗黒条件化で生育させた場合、この根の伸長阻害効果は認められなかった。以上の結果から、Azospirillum sp. は植物の生長に影響を及ぼす物質の生産を介して植物と相互作用している可能性が示唆された。

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植物の防御応答において、植物ホルモンは重要なシグナル伝達機能を果たしている。アブシジン酸（ABA）は、多くの場合、植物の防御応答を負に制御することが報告されているが、その分子機構については不明な点が多い。本研究では、イネ-いもち病菌相互作用において、誘導抵抗性に重要な役割を果たすサリチル酸（SA）シグナル伝達経路に対し、ABAが抑制的に作用していることを見いだした。
イネ幼苗にABA処理すると、SAシグナル伝達のキー因子であるWRKY45およびOsNPR1のSAまたはbenzothiadiazole (BTH)による転写誘導が抑制され、いもち病抵抗性が著しく低下した。ABAのこのような作用はWRKY45またはOsNPR1の過剰発現により顕著に打消された。ABA処理による内生SAレベルの変化は認められなかった。これらの結果から、ABAはSAの下流、WRKY45／OsNPR1の上流においてSA経路に対して抑制的に作用し、それがいもち病抵抗性低下の要因となっていることが推察された。また、いもち病菌は自ら産生したと推測されるABAを菌糸および胞子に蓄積し、また菌体外に分泌することが見いだされた。以上の結果から、いもち病菌の感染戦略の一つとして、自らのABA により感染部位における宿主細胞内のABAレベルを上昇させ、SA経路を抑制することにより防御応答を回避している可能性が推測された。

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MAPKカスケードは病原体が持つエリシターの認識から、防御応答反応の発動に至るシグナル伝達において、中心的な役割を担うと考えられている。我々はイネにおいてエリシターにより活性化されるMAPKK、OsMKK4を見出し、OsMKK4を介したMAPKカスケードが制御する防御応答反応について解析を行っている。昨年度までに、活性型OsMKK4タンパク質（OsMKK4DD）によりOsMPK3、OsMPK6が活性化され、一連の防御応答反応（防御応答関連遺伝子群の発現上昇、細胞死の誘導、ジテルペン型ファイトアレキシン、フェニルプロパノイド類の生合成）が誘導されることを見出している。また、osmpk6変異体ではOsMKK4DDによる細胞死は誘導されず、OsMKK4に転写が制御される遺伝子群についても、その大多数について変動幅が小さくなることから、OsMPK6はOsMKK4による遺伝子制御の大部分に関与することを確認している。本年度は、OsMKK4DDの誘導から防御反応につながるシグナル経路の解明をめざし、細胞死、ジテルペン型ファイトアレキシン、フェニルプロパノイド類の生合成のそれぞれの反応について関連が推測される転写因子に着目し、OsMKK4-OsMPK6カスケードとの関連について解析を行っている。

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我々はケミカルバイオロジー手法を用いて抵抗性遺伝子依存性の病害応答機構の解明を行っている。独自のスクリーニング系を用いた市販の多様性化合物ライブラリーの大規模スクリーニングを実施し、これまでにシロイヌナズナ培養細胞がトマト斑葉細菌病菌DC3000 Rpm1株の感染に対して示す過敏感細胞死を亢進する低分子有機化合物を7種類単離している。この中の一つであるCB_6は植物体に添加するとサリチル酸(SA)合成能非依存的に防御遺伝子PR1の発現を誘導した。一方でSA内生量には影響しなかったことから、CB_6はフィードバック制御には関与しないSAのパーシャルアゴニストであると考えられた。パーシャルアゴニストは機能重複によって解明が困難であったアブシジン酸受容体の解明を成功に導いた実績があることから、現在CB_6を用いた遺伝学的及び生化学的アプローチによってSA下流シグナルの解明を進めている。今回、シロイヌナズナのEMS処理種子からCB_6の生育抑制効果に非感受性を示すsgi (SA agonist insensitive)変異体を28個体単離した。これらは非感受性の程度により二群に分類された。また非感受性の程度が弱いものの中には、SA(400mM)含有寒天培地における感受性試験において、npr1変異体と同様に白化するものが4個体含まれていた。

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ケミカルバイオロジーは、生体機能を阻害または亢進する低分子有機化合物をツールとして用い、その標的分子や作用機序から生命現象を理解しようとする研究手法である。我々はケミカルバイオロジー手法を用いることにより、植物の病害応答機構の解明を目指している。これまでにシロイヌナズナ培養細胞とトマト斑葉細菌病菌DC3000 Rpm1株を用いた独自のアッセイ系を確立し、化合物ライブラリーを使った大規模スクリーニングによって防御応答の指標である過敏感細胞死を亢進する薬剤を7種類単離することに成功した。そしてこれらの薬剤はシロイヌナズナ植物体に病害抵抗性を誘導することを明らかにしている。これらの薬剤の作用様式は、サリチル酸（SA）内生量の変化、並びにSA欠損変異体であるsid2における作用の有無の検証により、1．SA合成活性化型、2．SA作用模倣型、3．SA不活性化経路阻害型、に分類されることを明らかにした。単離した薬剤のうちCB_8、CB_9及びCB_11はSAを不活性化する酵素として知られるSA配糖化酵素（SAGT）の活性を阻害していた。今回、シロイヌナズナのSAGTの一つであるUGT74F1の大腸菌リコンビナントタンパク質を用い、これら薬剤のSAGTに対する阻害効果の酵素学的解析を行った。UGT74F1の反応速度論と薬剤の阻害定数からSAGT阻害機構を考察する。

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MAPKカスケードは、植物の防御応答において重要な役割を担っている。これまでに、ジャガイモのSIPKオルソログであるStMPK1によりin vitroでリン酸化されるタンパク質としてStWRKY8を同定している。ベンサミアナのStWRKY8ホモログ (NbWRKY8) はin vitroでSIPK、Ntf4、WIPKによってリン酸化された。アラニンスキャニング解析から、NbWRKY8のN末端領域に存在するGroup I 型WRKYに保存された複数のSP配列がSIPKによりリン酸化されることが推定された。また、その内の少なくとも2カ所のセリン残基がINF1エリシターおよびMEK2恒常活性型変異体の発現に応答してin vivoでリン酸化されることが、抗リン酸化ペプチド抗体を用いた解析で明らかとなった。NbWRKY8はMAPKによるリン酸化でDNA結合活性および転写活性化能が上昇した。さらに、NbWRKY8疑似リン酸化変異体の発現は、その下流遺伝子として単離されたHMGR2やNADP-MEの発現を野生型と比較して顕著に誘導した。NbWRKY8をノックダウンしたベンサミアナは、ジャガイモ疫病菌に対する感受性が強くなった。これらの結果は、NbWRKY8がMAPKの基質であり、リン酸化活性制御を受けることで防御応答に関わる下流遺伝子群の発現を正に制御することを示している。

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SGT1，RAR1およびHSP90は、抵抗性遺伝子が介在する抵抗性の誘導に重要な役割を果たすことが知られているが，親和性相互作用における役割は解明されていない。本研究では、ウイルス誘導ジーンサイレンシング（VIGS）法により、NbSGT1、NbRAR1およびNbHSP90をそれぞれ抑制した植物を作製し、ナス科青枯病菌Ralstonia solanacearum-N. benthamiana をモデルに、NbSGT1、NbRAR1およびNbHSP90の親和性相互作用における役割を解析した。N. benthamianaに対して病原性のR. solanacearum OE1-1株（RsOE1-1）を各VIGS植物に接種したところ、NbRAR1-VIGS植物では、対照植物と比較して、細菌の増殖に変化は認められなかった。一方、NbSGT1-VIGS植物とNbHSP90-VIGS植物においては、細菌の増殖抑制が認められ、病徴の進展も顕著に遅延した。さらに、RsOE1-1を接種したNbSGT1-VIGS植物とNbHSP90-VIGS植物では、対照植物と比較して、PR遺伝子の発現上昇が認められた。以上の結果から、NbSGT1とNbHSP90は、R. solanacearum-N. benthamiana親和性相互作用において、N. benthamianaの防御応答の抑制に関与することが示唆された。

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植物の病原菌に対する受容性誘導、あるいは発病機構を解明するために、Ralstonia solanacearumの病原性株RsOE1-1の接種により、Nicotiana植物で特異的に発現する遺伝子NbPAP（Nicotiana benthamiana phosphatidic acid phosphatase）を同定した。RsOE1-1を接種したNbPAPサイレンシング植物では、コントロール植物と比較してジャスモン酸（JA）経路のマーカー遺伝子PR-4の発現量の増加、および活性酸素種（ROS）の蓄積による細胞死の誘導が認められ、植物におけるRsOE1-1の増殖とRsOE1-1による萎凋症状の進展が抑制された。NbPAPサイレンシングによるRsOE1-1の増殖と発病の抑制は、JA情報伝達因子COI1、あるいはROSの生成に関わるRbohBとの二重サイレンシングにより、部分的に緩和された。一方、NbPAPをサイレンシングしたサリチル酸を蓄積できないNahG植物では影響されなかった。また、NbPAPサイレンシングによってタバコ野火病とタバコ黄がさ細菌病の発病も抑制された。
以上の結果から、NbPAPは抵抗性誘導に関与するJA-、ROS-シグナル伝達の負の制御因子であり、NbPAPは植物病原細菌に対するNicotiana植物の感受性遺伝子であることが示唆された。

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植物の病原体の攻撃の認識から抵抗性発現にいたる一連の反応は、遺伝子対遺伝子説およびガード説により説明されている。しかし、私共はシロイヌナズナのゲノム上で隣接する異なる2つのR-遺伝子が、異なる3種の病原体の攻撃を認識し、抵抗反応を起動することを世界で初めて発見した。私共はnatural variation解析および逆遺伝学的解析によりアブラナ科野菜類炭疽病菌(Colletotrichum higginsianum)に対応するR-遺伝子RPS4およびRRS1を同定した。これらはそれぞれトマト斑葉細菌病菌(Pseudomonas syringae pv. tomato)と青枯病菌(Ralstonia solanacearum)に対応するR-遺伝子として知られており、このことから植物の異なる2つのR-遺伝子が異なる3つの病原体の攻撃を認識し、抵抗性を誘導することを発見した。本発表では、2つのR-遺伝子が炭疽病菌に対する応答反応に必須であること、さらにトマト斑葉細菌病と青枯病の認識においても複数のR-タンパク質が関わっていることについて報告する。

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約13,000種類のイネ完全長cDNAを高発現するシロイヌナズナ系統（イネ－ナズナFOX系統）2.1万系統について演者らは、シロイヌナズナの病原糸状菌Colletotrichum higginsianumに対する感染抵抗性スクリーニングを実施した。4次スクリーニングまで実施して112の抵抗性系統を選抜し(全体の約0.52%)、挿入遺伝子のすべてを同定した後、現在までに再導入系統で24の原因遺伝子の抵抗性を確認した。また、その選抜された112の抵抗性系統について、病原細菌Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000に対する感染抵抗性系統を調査したところ、18系統で強い抵抗性を、24系統でやや強い抵抗性を示した。さらにC. higginsianum抵抗性選抜した病害抵抗性候補遺伝子をイネで過剰発現し、イネの病原糸状菌であるいもち病菌(Magnaporthe grisea)感染抵抗性が得られるか調査したところ、現在までに10種のうち3種で抵抗性を示した。抵抗性を示した遺伝子によるシロイヌナズナおよびイネにおける抵抗性機構についても現在解析中で報告する予定である。

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イネのWRKY45は、BTHやプロベナゾールによる誘導抵抗性に必須の転写因子であり、WRKY45過剰発現イネは、いもち病および白葉枯病に高い抵抗性を示す。抵抗性反応に通常ともなう生育阻害が軽度であることなどから、その実用化が期待される。WRKY45の活性発現はプライミングによって制御されると考えられたが、過剰発現体の解析等から転写後または翻訳後制御の関与が推測されたため、その解析を行った。
mycタグWRKY45過剰発現株イネを作製し、抗myc抗体を用いて植物ホルモンや各種阻害剤に対するmyc-WRKY45タンパクの挙動の変化を調べた。その結果、プロテアソーム阻害剤MG132に特異的に応答してmyc-WRKY45タンパク量が増大した。抗ポリユビキン抗体を用いた免疫沈降実験により、myc-WRKY45がイネ細胞内でポリユビキチン化されることが確認された。タンパク合成阻害剤を用いた実験により、myc-WRKY45の半減期は1時間未満と推定された。以上により、WRKY45のユビキチン-プロテアソームによる分解制御が明らかになった。また、脱リン酸化処理およびMG132処理を組み合わせた実験により、特定部位のリン酸化とmyc-WRKY45の安定性がリンクしていることがわかり、WRKY45のユビキチン-プロテアソーム制御にリン酸化が関与していることが示唆された。

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葉緑体は、光合成の他に、ホルモン合成や活性酸素種生成といった生体防御反応においても重要な器官であると考えられている。我々は、葉緑体が細胞内Ca²⁺シグナルを介して感染シグナルを素早く認識していることを見いだした。しかし、免疫応答における葉緑体の役割はほとんどわかっていない。これまでの研究から、葉緑体チラコイド膜に局在するCa²⁺結合タンパク質CASが、細胞外Ca²⁺による細胞質Ca²⁺シグナルの制御と気孔閉鎖に関与することを明らかにした。今回、免疫応答におけるCASの役割を調べるために、CASノックアウト変異体（cas-1）にPseudomonas syringae pv. tomato DC3000（Pst DC3000）を接種し、菌数増殖を測定した。その結果、cas-1ではPst DC3000に対して抵抗性が低下することがわかった。また、過敏感細胞死への影響を調べるためにPst DC3000(avrRpt2)を接種したところ、WTよりも細胞死が遅延することがわかった。さらに、Nicotiana benthamianaにおける CASサイレンシング植物体において、INF1、Cf-9/Avr9により誘導される過敏感細胞死が顕著に遅延することが明らかとなった。これらの結果から、CASは植物の生体防御反応において重要な役割を果たしている可能性が示唆された。

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植物の全身獲得抵抗性（SAR）は病原体の感染部位における防御応答を契機として、サリチル酸（SA）の蓄積およびPR遺伝子の発現が誘導され、様々な病原菌に対する抵抗性が誘導される植物独自の自己防御機構である。SAR誘導剤はイネにおいて実用化されているが、十分な効果が得られない場合もあることから、何らかの環境要因の影響を受けることが推察された。また、シロイヌナズナにおいてアブシジン酸（ABA）を介する環境ストレス応答とSARの拮抗的な相互作用が報告されている。そのため本研究ではイネにおいて環境ストレスがSARの誘導に与える影響について解析を行なった。SAR誘導化合物であるBITを用いてSARを誘導したイネではイネいもち病に対する抵抗性が増強されたが、環境ストレスである低温を前処理した植物ではBITによる抵抗性が抑制された。ABAを前処理した植物においても、BITによる病害抵抗性が抑制された。ABA生合成阻害剤であるアバミンと低温を同時に処理した植物では、低温による抵抗性の抑制が解除された。これらの結果から、イネにおいてもABAを介する環境ストレス応答はSARを抑制することが明らかになった。

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シロイヌナズナのAtDREB1A はプロモーター領域に DRE 配列を有する遺伝子の発現を制御する転写活性調節因子であり、同遺伝子を導入した遺伝子組換え体が環境ストレス耐性を示す事が報告されている。先行研究により、AtDREB1A の機能的相同遺伝子がまだ報告されていないバレイショにおいても同様の結果が示されたが、そのストレス耐性機構は未だ解明されていない。
本研究では、バレイショが持つと考えられる DREB1A により制御を受ける環境ストレス耐性機構の解明を目的に、マイクロアレイを用いて環境ストレス及び AtDREB1A により発現が誘導される遺伝子群の探索を行った。その結果、シロイヌナズナにおいてその相同遺伝子が AtDREB1A の下流因子として報告されている heat shock protein, dehydrin などを含む 47 個の遺伝子を同定した。この結果から、AtDREB1A がバレイショにおいても環境ストレス耐性に関与する遺伝子の発現を制御する転写活性調節因子として働くことにより、ストレス耐性が付与されることが考えられた。また、バレイショにおける環境ストレス耐性機構に AtDREB1A の機能的相同遺伝子が関与していることが示唆された。本研究では更に、同定された遺伝子の 5’末端上流の配列解析についての結果も合わせて報告する。

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これまでの研究により植物個体での細胞死関連因子の発現部位をウェスタンブロット及びプロモーター GUS形質転換体の組織染色により発現部位を解析した結果を報告してきた。その結果、花弁の離層、莢において開裂部分、根においては根端及び維管束系等プログラム細胞死の生じる形態形成組織において発現していることが示された。また、ストレス、薬剤等どのようなシグナルがプログラム細胞死を誘導するか解析するためには植物個体よりも細胞レベルでの解析の方が鋭敏な反応が観察できるため、シロイヌナズナの葉より24時間培養後の生存率が80％ 程度維持される葉肉プロトプラストの調製培養方法及び調製したプロトプラストによる細胞死を誘導する実験系も確立できた。
しかしながら、この高生存度プロトプラスト化の過程において、植物体の生育スペースの制約、および植物体からのサンプリングに多大な時間と労力を必要であり、このステップがプロトプラストの生存度にも影響していることが判明してきた。これらの問題を改善するため、シロイヌナズナ培養細胞系の導入を検討した。今回、理化学研究所バイオリソースセンター実験植物開発室よりシロイヌナズナT87培養細胞株の譲渡を受け、この培養細胞を使用した細胞死誘導実験系の確立を試みた。

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In plant behavioral ecology, plant behavior is defined as environmentally induced (e.g. chemical, UV) phenotypic plasticity. Plants' ability to rapidly and reversibly respond to stimuli thereby effecting morphological plastic growth (i.e. variable morphological characteristics over time with respect to stimuli) with increased basal fitness generally defines this unique behavior. In this paper, we described fruit bicoloration behavior in selected plant species found in Panay Island, Philippines. We argued for the best definition of a genuine bicolored fruit display by examining how this signal design fare on Hasson's amplifier effect theory. A genuine bicolored fruit displays two colors in the mature stage (e.g. Dehaasia sp., Clerodendrum sp., etc.) that promote higher fitness of the signaler (e.g. plant) by improving fruit visibility relative to the animal disperser. It also usually involves color contrast between the fruit and the pedicel. Physiological perspectives in the exhibited plant behaviors (e.g. fruit bicoloration) were shown to broaden future research insights in endogenous signals leading to morphological signal design in plant-animal communication study.

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The present research aims to determine the relationship of cytokinin (CK) levels in barley kernels to kernel mass, kernel number, and plant yield. Early studies with barley found a positive relationship between CK content and kernel mass. With the advent of more sensitive and selective mass spectrometric techniques and established methods for extracting and purifying CKs, the roles of CKs in barley kernel development can be more precisely re-examined. To this end, CK profiles across early developmental stages have been generated for kernels of high-yield and low-yield barley varieties. Analysis and subsequent quantification was achieved by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Our results indicate that there is a relationship between concentration in kernels and increased plant yield. Furthermore, we will also discuss the results of an investigation into how CK oxidase might regulate CK levels in barley kernels through the degradation of CKs.

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近年、低分子化合物を用いたケミカルバイオロジー、ケミカルジェネティクスにより多くの生命現象が明らかにされつつある。この手法は生物種を問わず利用でき、冗長性や致死性により表現型が得られない遺伝子の機能を見いだす事が可能である。一方、その標的因子の探索は生化学的手法を用いる場合、困難である事が多い。私たちはこれまでにヒメツリガネゴケの幹細胞化過程を阻害する化合物(RIN)を単離しており、その次なる展開としてRINが直接標的とする因子の同定を、分子間相互作用を測定する水晶振動子マイクロバランス(QCM)とT7ファージディスプレイを合わせた手法を用いて試みている。まず、既に相互作用をすることが報告されているブラシノステロイド合成阻害剤Brz2001とブラシノステロイド生合成酵素AtDWF4を用いて、この手法の有効性を調べた。その結果、Brz2001ビオチン化誘導体とAtDWF4のC末端領域を発現させたT7ファージの間でQCM法による相互作用が確認された。続いて、ヒメツリガネゴケの幹細胞化過程を阻害する化合物(RIN)の標的因子を探索するために、ヒメツリガネゴケの均一化cDNAを作成し、それを用いてT7ファージライブラリーを作製した。現在、このライブラリーとRINのビオチン化誘導体を用いて標的因子の探索を行っており、本大会ではこの結果と手法の有効性について議論したい。

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ヒメツリガネゴケの葉を切断し明条件下で培養すると、24時間以内に切断面の葉細胞は原糸体頂端幹細胞へとリプログラミングされる。この過程を包括的に分析するために、次世代シーケンサーSOLiDを用いたデジタル遺伝子発現解析を行い、35,937のコケ全遺伝子についての葉の切断後0から24時間目までの時系列遺伝子発現データを得た。
このデータから統計的に有為な発現変動が見られる3,530遺伝子を選抜し、自己組織化マップアルゴリズムを使用して、発現パターンの類似性で9つのクラスターに分けた。それらは、リプログラミングの進行に伴う発現誘導、リプログラミング過程を通しての発現抑制、3時間以内の一過的な発現誘導、3時間後の一過的な発現抑制を示す4つに大別されることが分かった。
各クラスターに属する遺伝子の特徴を調べるためにGene Ontology解析を行った。その結果、発現上昇するクラスターでは遺伝子発現やストレス応答に関連するもの、一過的な発現誘導または抑制されるクラスターではタンパク質キナーゼに関連するもの、一過的に発現抑制されるクラスターでは光合成関連のGOカテゴリーが濃縮されていた。また、転写因子やクロマチン関連因子群についても特徴的な発現パターンを見いだした。さらに、いくつかの発現上昇遺伝子のpromoter-reporter系統の解析から、空間的に異なる発現制御系の存在も示唆された。

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苔類は現生陸上植物の系統の中で最も古く分岐したグループとされる。苔類ゼニゴケは、根・茎・葉のない単純な体制を有する一方で、植物形態形成の特徴である頂端成長や環境応答の基本的な仕組みをもつ。30個の常染色体由来PACクローンのショットガンシークエンスにより約3.3 Mbのゲノム配列情報を解析したところ、235個の遺伝子が予測され遺伝子密度は約1個／15 kbと推定された。ゼニゴケのゲノムサイズは約280 Mbであることから総遺伝子数は2万個弱と見積もられ、被子植物や蘚類ヒメツリガネゴケと比較して遺伝子の重複が少ないというEST解析からの予測が裏付けられた。また常染色体にはトランスポゾン様配列やリピート配列は少なく単純なゲノム構成であることが示唆された。そこで、次にアグロバクテリウムによる形質転換法を用いて、T-DNAタギングにより形態形成変異株の取得を試みた。ゼニゴケは半数体であり形質転換体当代においてT-DNA挿入変異株の表現型が観察できる。バイナリーベクターpCAMBIA1300を用いて得られた形質転換体の中から、1万株について連続白色光照射条件における形態形成を観察し、葉状体が形成されないカルス様株、同化組織である気室の形態異常株、無性芽を形成する杯状体の形態異常株などを含む、計22株の形態形成変異株を選抜した。これらの変異株における変異原因遺伝子の探索についても報告する。

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ゼニゴケは新たなモデル植物として注目されその分子生物学的手法の基盤整備が進められているが、これまでに核ゲノム形質転換選抜用マーカーとして利用可能な遺伝子は、hptとaadAの2遺伝子が報告されているのみである。そこで我々は、これまでに多種の被子植物において核ゲノム形質転換選抜用マーカーとして利用実績のある変異型アセト乳酸合成酵素 (Mutated Acetolactate synthase: mALS) が、ゼニゴケにおいても核ゲノム形質転換選抜用マーカーとして有効であることを明らかにしたので報告する。まずゼニゴケのEST情報からゼニゴケアセト乳酸合成酵素 (MpALS) をコードするcDNAを入手し、スルホニルウレア系除草剤Chlorsulfuronへの耐性を付与するアミノ酸置換を導入したMpmALS (P207S/R198S/W574L) を作出した。MpmALSを35Sプロモーターで発現誘導するベクターを作製し、このベクターを用いてアグロバクテリウム法による形質転換を行った。形質転換体をChlorsulfuronで選抜して得られたChlorsulfuron耐性植物よりベクター配列の導入が確認できたことから、MpmALSがゼニゴケの新規核ゲノム形質転換選抜用マーカーとして利用可能であることが明らかとなった。本研究の成果はゼニゴケにおける機能解析の推進に寄与するものと考えられる。

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近年、植物科学の世界においてもメタボロミクスを用いた研究が飛躍的に進歩し重要な役割を占めるようになった。メタボロミクス研究において、分析データからの物質同定や分析結果の生物学的意味の解析を行う上で、化合物データベースや代謝経路データベースなどの化合物を核とした統合的なデータベースは不可欠である。従って、植物メタボロミクス研究においても、代謝化合物を鍵とした統合データベースの整備は重要であるといえる。
筆者らの研究室は、文科省統合データベース事業に医薬品・化合物データベースの統合化を担当する分担機関として参画しており、その成果をゲノムネット化合物データベースとして公開している。本データベースでは、ゲノムネットを核として、筆者らの研究室が以前から構築しているKEGGの化合物情報（KEGG LIGAND）と国内外の化合物・医薬品関連情報（KNApSAcKなど）を統合的に検索可能である。また、ゲノムネット計算ツールとして、ケミカル情報解析ツールも公開している。さらに、ゲノムネット化合物データベースはKEGGとも高度に連携しており、化合物検索から目的の化合物が関係する代謝経路（ネットワーク情報）や酵素（配列情報）などに容易に到達でき、他のオミックスデータと組み合わせた解析にも利用できる。今回、植物研究の観点から、ゲノムネット化合物データベースと関連ツール群の最新状況について紹介する。

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植物二次代謝産物は，アグリコン化合物の多様な化学的修飾過程を経て蓄積する．その過程は組織・器官特異的に，あるいは様々なストレスへの応答反応として，遺伝子発現レベルや酵素活性レベルで調節されている．多様な形態で貯蔵・蓄積される二次代謝化合物の動態を把握することによって，生合成と貯蔵，さらに配糖体加水分解によるアグリコン放出などの動的制御の生理・生物学的な意味づけが可能になると考えられる．
本研究では，ジャガイモ塊茎を供試し，二次代謝産物であるソラニンおよびその配糖体化合物類の蓄積とともに，一次代謝に関与する生体成分の比較を目的とした定量メタボロミクスプラットフォームを構築した．糖・アミノ酸・有機酸などの一次代謝産物は GC-MS分析によって，アルカロイド配糖体はLC-ESI-MS分析により定量した．定量性を検証するために，それぞれの一次代謝産物に対して抽出効率を検討した．また，部位別にサンプリングしたジャガイモ植物体を用いて定量分析を行い，一次代謝産物およびステロイドアルカロイド配糖体について含有量の比較をした．

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植物液胞は有機酸・二次代謝物などの蓄積場所であり、植物代謝産物の貯蔵にとって重要なオルガネラである。しかしながら液胞に蓄積する代謝物の多様性や細胞質液胞間の代謝物輸送制御機構は明らかにされてはいない。そこで我々は液胞膜トランスポーター候補遺伝子の機能解析を行なっている。その中で、これまでに機能未知のMATE Efflux Family遺伝子を過剰発現したシロイヌナズナ培養細胞や単離液胞の包括的代謝物解析を実施してきている。本研究では、この遺伝子を過剰発現したシロイヌナズナ植物体での代謝物解析を行なった。
シロイヌナズナのロゼット葉サンプルを用いた代謝物の包括的解析では特に二次代謝物に注目し、高速液体クロマトグラフィー－フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析装置（LC-FTICR-MS）を用い、ESI positive・negativeモードによる分析データの解析を行った。過剰発現植物体のPositiveモード解析では、既知のフラボノールの蓄積が増加する傾向があることや、含硫化合物やトリプトファンの減少が見られた。Negativeモード解析では、インドール性化合物の蓄積の増加などが見られた。培養細胞液胞での解析結果と合わせてこのトランスポーター候補遺伝子の液胞膜輸送における機能を議論する。本研究は科学技術振興機構・CRESTの支援をうけて実施された。

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Botryococcus brauniiは光合成により大気中の二酸化炭素を固定し、石油に似た炭化水素成分を有するオイルを生産する。B. brauniiが産出するオイルは石油代替資源となる可能性を秘めているが、未だ実用化には至っていない。実用化に向けてB. brauniiの遺伝子資源の利用は有効であると考えられるが、この生物種に関する遺伝子情報は非常に少なく、その大部分は系統分類に用いられたrRNA遺伝子の塩基配列である。そこで、我々はB. brauniiで発現している遺伝子に関する情報を網羅的に得るためにEST解析を行った。分離培養した144の無菌株のうち増殖能および炭化水素生産能の優れた国内産の3系統（BOT70、BOT22、BOT88-2）を材料とした。BOT70についてはオリゴキャップ法により作成した全長cDNAライブラリーからランダムに選んだ11904クローンの5’末端をシーケンスした。これにより、2897個の独立した遺伝子の塩基配列を得た。BOT22およびBOT88-2については、断片化したcDNAを無作為にシーケンスすることにより、それぞれ209429リードおよび185936リードの塩基配列を得て、15517個および15145個の独立した遺伝子の塩基配列を得た。現在は、これらのEST解析結果に基づきB. brauniiにおける炭化水素生合成経路の解明に取り組んでいる。

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種特異的分子マーカー(SSM)は生物多様性や生物間相互作用を研究する上で強力なツールであるが、遺伝子情報が少ない植物種でSSMを作製することは煩雑な作業を伴う。SSMをDNAアレイ法を用いて効率よく取得する事を目的として以下の研究をおこなった。
セイヨウアブラナ、カラシナ、アブラナのcDNAを蛍光ラベルし、アフィメトリクス社のシロイヌナズナDNAアレイ（ATH）を用いて解析した。DNAアレイのシグナル強度が種間で10倍以上異なる遺伝子を416個選抜した。さらに、シグナル強度の分散が3種間で大きいものから順に192遺伝子座を選び、アフィメトリックス社より提供されている情報からPCRプライマーを設計した。設計したプライマーを用いて、シロイヌナズナ、セイヨウアブラナ、カラシナ、アブラナのDNAをテンプレートとしてPCRをおこなった。アニーリング温度を50℃、55℃、60℃の3条件でおこなった。その結果、44遺伝子座ではシロイヌナズナのDNAをテンプレートにしてもDNAの増幅が見られなかった。4種類すべてで増幅されたのは53遺伝子座であった。このうち43遺伝子座の増幅されたDNAの塩基配列を決定し、3種を比較したところ、少なくとも2種間で塩基配列の変異が存在した。以上の結果、SSMの探索には、DNAアレイを用いることが有効であると考えられる。

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Messenger RNAs with premature stop codons (PTCs) are targeted by RNA quality control systems such as nonsense mediated mRNA decays (NMD). Several recent researches found that it is a common regulatory mechanism of RNA metabolism to generate alternatively spliced mRNAs with PTCs under certain regulation, which are followed by NMD. This mechanism is called RUST (Regulated Unproductive Splicing and Translation). For understanding complex systems of RNA metabolism, studying which genes are subjected by RUST is important. In this study, we developed a novel method to evaluate NMD effects on every intron based on tiling array results. We have performed 18 sets of tiling array experiments to take transcriptome of Arabidopsis thaliana for specific tissues, those under environmental stresses, and those on several developmental stages. We computationally analyzed them and listed introns which possibly retained in mature mRNAs in certain conditions. Besides, in several cases, the genes had small expression values in the conditions where the introns were retained. These results suggested that we successfully found introns which were affected by NMD and RUST.

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理化学研究所バイオリソースセンター（BRC）実験植物開発室では文部科学省ナショナルバイオリソースプロジェクト（NBRP）に参加して「シロイヌナズナ/植物培養細胞･種子」の課題を実施している。平成21年度はシロイヌナズナFOXラインとタバコBY-2培養細胞由来ESTクローン（完全長含む）の追加公開を実施し、更に個別のシロイヌナズナ変異体・形質転換体、Thellungiella halophila完全長cDNAクローンの新規公開、形質転換培養細胞の公開に向けて準備を進めている。特に理研PSCから寄託を受けたシロイヌナズナFOXラインは完全長cDNAの強制発現株で、スクリーニング用プールとして提供しているが、導入された遺伝子を明記した個別種子としても今後提供を開始する予定である。これら新規リソースに関して紹介するとともに、研究の促進に貢献するサービスについても情報を提供したい。

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植物培養細胞は細胞学的・生化学的・分子生物学的な研究に広く利用されている重要なリソースである。理化学研究所バイオリソースセンター実験植物開発室では、様々な培養細胞株の収集・保存・提供事業を実施している。
モデル植物シロイヌナズナの培養細胞は広範な用途での利用が期待されるが、実験植物開発室から提供可能な細胞株は少ない。そこで、新規細胞株の樹立を試みた。エコタイプCol・Ler・Wsの本葉に由来する複数の懸濁培養細胞株を得た。これらの細胞株は異なる特性を保持していた。また、安全で効率的な維持のために超低温保存を検討した。その結果、すべての細胞株を液体窒素保存できることが確認された。今後、細胞株の提供とともに、詳細な特性情報を公開する予定である。
実験植物開発室では高品質なリソースの提供および特性情報の整備を推進している。培養細胞の特性解析・品質管理のためには標準的な検査技術の開発が不可欠である。培養細胞の安定性の実態を明らかにするために、シロイヌナズナ懸濁培養細胞株をモデルとしていくつかの特性をモニタリングしている。さらに、トランスクリプトーム解析による評価を検討する予定である。

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理化学研究所バイオリソースセンター（BRC）では、世界各地で単離されたシロイヌナズナアクセッションを仙台アラビドプシス種子保存センター（SASSC）から移管を受けて、系統管理し研究者への種子の分譲を行っている（http://sassc.epd.brc.riken.jp/sassc/create_search_panel2.php?mode=general）。これらシロイヌナズナ野生株は、自然変異を伴ってそれぞれの環境に適応し生存してきており、環境適応と自然変異との関係を調べることができる重要な材料であると考えている。
我々は、これらシロイヌナズナ野生株の表現型情報を取得する試みを行った。表現型情報として環境ストレスへの応答に着目し、今回はマニトールによる浸透圧ストレスに対する応答を調べた。方法は、マニトールを含むあるいは含まない培地で一定期間育成した後、根長の比較を行うというものである。この結果、試験したシロイヌナズナ野生株の中にはマニトールを含む培地でも良好に根の伸長を示す野生株や、逆に生育が著しく阻害される野生株が存在していた。今後、この表現型情報をもとに自然変異との関係を解析することが可能であると考えている。現在、表現型情報の公開を行うべくデーターベースの作製を行っている。

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スギ（Cryptomeria japonica D. Don）は、わが国の主要な林業樹種である。目的形質のみ付与できる遺伝子組換え技術は、育種年月の短縮等、林木育種に大きく貢献する可能性がある。しかし組換え体を野外で栽培するにあたり導入遺伝子の同種野生植物への拡散が懸念されている。そこで現在、導入遺伝子の拡散防止技術として遺伝子組換えによるスギの雄性不稔化を試みている。
ポプラ等において、花器官特異的な発現を司る転写調節領域にRNase等の遺伝子をつないだ構築物を導入して雄性不稔個体の作出に成功している。我々はスギにおいて同様の手法を試みた。サブトラクション法により、雄花特異的発現を示す7遺伝子の単離に成功した。またTAIL-PCR法によってそれら遺伝子の転写調節領域を単離し、GUS遺伝子を連結してシロイヌナズナ及びスギに導入した。その結果1009-C47あるいは1009-C96遺伝子の転写調節領域を用いた場合、シロイヌナズナ及びスギのタペート細胞で強いGUS活性が確認された。また同転写調節領域をBarnase 遺伝子に連結してシロイヌナズナ及びスギへの導入を行っている。形質転換シロイヌナズナの花粉形成能の評価結果、ならびにスギ組換え体作出の進歩状況を報告する。
本研究の一部は、農林水産省「遺伝子組換え生物の産業利用における安全性確保総合研究」の一環としておこなった。

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イネの根から分泌されるタンパク質を網羅的に解析するために、無菌水耕栽培を行い、培養液に分泌されたタンパク質を回収した。発芽後約1～2週間の幼植物を供試した。根をサンプリングした後に、培養液は400mlから約100μlまで濃縮し、濃縮後に2-D clean-up kitを用いて精製した。精製したタンパク質を根から回収したタンパク質と同時にSDS-PAGEを行なった所、そのバンドパターンは明白に異なっており、根から選択的に培養液に分泌されていると推察した。さらに分泌物のタンパク質に対して二次元電気泳動により分離し、得られたスポットからMALDI-TOF-MSにより同定を試みたが、4種類のタンパク質の同定にとどまった。そこでLC-MS/MSを用いたショットガンシーケンスを行なった結果、多くの感染防御に関わるタンパク質などを同定することに成功した。

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シロイヌナズナをモデル植物として用いることによって、花・葉・茎・根など植物の各器官に大胆な形態異常を持つ突然変異体を多数単離し短期間のうちに遺伝子解析をおこなうことが可能になった。私は1986年より、花、葉および根の形成、特に時間空間的に特異な細胞分化の機構に着目して、分子機構の解析をおこなってきた。葉や花器官など側生器官は、直交する3本の軸(基部-先端軸、表-裏軸、中央-周縁軸)に沿って成長し、組織が分化する。表-裏軸に沿った組織分化に関わる遺伝子として、FIL遺伝子が裏側領域の組織分化に必要であり、葉や花器官の原基の裏側領域で発現すること、FIL遺伝子の裏側領域特異的な発現には、5’上流領域の二カ所のcis配列が必要であることを見いだし、microRNA165/166が表側領域の形成に必要な classIII HB-ZIP遺伝子群の発現領域の決定に関与している機構や表裏の境界の決定機構について解析を続けている。一方、中央-周縁軸に沿った細胞分化機構においては、周縁部の細胞で特異的に発現するPRSおよびW0X1が必要で、prs wox1二重突然変異体では表側組織と裏側組織の分布パターンが乱れることから、表側と裏側特異的な組織の維持に周縁領域が深く関わっていることがわかった。今後は、これらの軸依存的な器官発生に関わる細胞間シグナル因子の役割の解明を目指したい。

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小胞や小管を介したオルガネラ間輸送，いわゆる「膜交通（メンブレントラフィック）」は，原始真核生物から人間や植物を含む現存の生物に至るまで保存された，真核細胞に普遍的な生命活動である．同時に，多様な体制や生命現象に応じ，その分子機構や生理的機能は進化し，洗練されてきたと考えられる．我々は，植物が示す多様な高次機能において膜交通（特にポストゴルジ輸送網）が果たす役割を明らかにするとともに，植物が進化の過程で獲得した独自の膜交通制御システムの分子機構と生理的意義の解明を目標とし研究を行っている．真核生物におけるオルガネラや膜交通の多様化の過程には，RAB GTPaseやSNAREなどの分子の多様化が重要な役割を果たしたと考えられている．そこで，植物が独自に獲得したRAB GTPase（ARA6）とSNARE（VAMP727）に注目し，その機能解析を行った．その結果，それらの分子が制御する膜交通経路を明らかにし，植物が独自の仕組みによりポストゴルジ輸送網を多様化させてきたことを示すことができた．本講演では，植物の膜交通の独自性に焦点を当て，その分子機構と生理機能，および進化について考察したい．

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多細胞生物の個体、器官、組織、細胞などのサイズがいかに決定されるかという課題は基礎、応用研究上非常に重要であるが、その分子機構については未解明な点が多い。私達はこれまで特に植物の器官サイズ、細胞サイズを制御するメカニズムの解明を目指した研究を進めてきた。多くの植物細胞はDNA複製と細胞分裂が交互に起きる細胞分裂周期を経た後、細胞分裂を伴わずDNA複製のみ起こる核内倍加周期に移行する。核内倍加は特に高等植物に頻繁に見られ、葉や根、茎等の細胞が数回の核内倍加周期を繰り返して核内のDNA含量（核相）を上昇させる。これまでの研究から上昇した核相と細胞サイズの間にしばしば正の相関が見られることが知られているが、これらの過程を司る分子メカニズムはよく分かっていない。また植物の器官形成、成長には細胞分裂周期、核内倍加周期が時間的、空間的に正しく進行することが重要であるが、これら2つの細胞周期が発生段階でどのような制御を受け、またどのように器官形成、成長に貢献するのかについては未だに解析が進んでいない。今回の講演では私達が最近単離した核内倍加周期への移行を司るSUMO E3 ligaseや、核相依存的な細胞生長を制御する転写因子GTL1についての研究を紹介し、植物の形態形成と細胞周期の関わりについて議論したい。

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RNAサイレンシング経路においてAGO遺伝子は中心的な役割を果たしている。今回、我々はシロイヌナズナAGO2およびAGO5に取り込まれているsmall RNAを解析した。興味深いことに、AGO2、AGO5に取り込まれていたsmall RNAの大部分は5'末端の塩基はそれぞれアデニン、シトシンであった。AGO2の区では、miR163-LL、miR390、miR172が、そしてAGO5の区では、miR163-UL、miR390*が多くクローニングされた。免疫沈降／ノーザン解析によって、それぞれのsmall RNAとAGO2,AGO5との特異的結合が確認された。miR163-LLとmiR163-UL、またmiR390とmiR390*はそれぞれひとつの二本鎖small RNAに由来する。人為的に5'末端の塩基を逆置換作成したmiRNAとの結合実験を行ってみると、AGO2,AGO5は逆鎖側の人為smallRNAと結合するようになった。このことから、AGO2およびAGO5は末端の塩基を認識してsmall RNA鎖を選択的に取り込むことが明らかとなった。以上の結果は、同一の二本鎖small RNAからでもAGO2とAGO5の間で、取り込まれるsmall RNA鎖が逆となること、small RNAをとりこむ機構がAGO間で異なることを示している。AGO2は核と細胞質、AGO5は細胞質に局在した。

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現在, 様々な高等植物のオミックス情報が蓄積し, データベースから利用可能となっている. それらには, ゲノムや遺伝子などの塩基配列, ゲノムの機能と構造のアノテーション, 遺伝子発現パターン, 代謝パスウェイ, ジーン・オントロジーなどが含まれる. 例えば, NCBIは, 多くの生物種のUniGeneやオーソログ, 多様なサンプルに由来するマイクロアレイ実験データなどを提供している. また, イネやシロイヌナズナ, トマトなどの植物種に特化したデータベースも多く運営されており, ゲノム, EST, 完全長cDNAに関するアノテーション, 代謝パスウェイ・マップ, 実験リソース, 遺伝子発現ネットワークなどの詳細な情報を提供している. 今後, これらデータベースから提供されている大規模なオミックス・データを収集・解析することにより, 新たな知見が得られると期待される. ここでは, 特に, RAP-DB, MSU Rice Genome Annotation Project, OryzaExpress, MiBASE, KaFTomなど, イネとトマトのオミックス情報を提供するデータベースの現状と活用法について紹介する.

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ミヤコグサは、二倍体で染色体数がn=6で、ゲノムサイズが小さく、自殖性であり、世代期間が2-4ヶ月と短いことから、マメ科のモデル植物として認知されている。また、共生窒素固定などのマメ科特有の現象や、形態形成に関する変異体が単離され、様々な研究が進められている。LegumeBase（http://www.legumebase.agr.miyazaki-u.ac.jp/）では、基盤研究としてのミヤコグサと応用研究としてのダイズまでを広くカバーできる様々なリソースを収集・保存・提供することで、マメ科植物における研究基盤の構築を目指している。
本講習会では、LegumeBaseを中心としたリソースの整備状況を紹介するとともに、ミヤコグサ研究に必要なリソースの特性と分譲依頼、およびゲノム情報関連データベースの紹介を行う。リソースについては、ミヤコグサの播種・育成・交配・採種までを動画にて公開しており、誰でも実験を開始できるように整備している。また、ゲノム情報は、かずさDNA研究所にて解読されており、ミヤコグサ根粒菌のゲノム情報も解読されていることから、植物と微生物の相互作用に関する研究基盤が整っている。これらの情報のデータベースからの検索法とその利用について概説し、その利用例として分子進化・系統学的解析ソフトウエアMEGAを用いた分子系統樹の作成等についても紹介する。

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近年のイメージング技術の進化により、in vivoでのタンパク質やオルガネラ観察が容易となり、大量の画像や動画データが生産されデータベースに蓄積されている。植物オルガネラは、その機能や形、大きさ、数、細胞内局在性などを、植物の種類はもちろんのこと、同じ植物種においても組織や細胞、生長段階、環境からの刺激などにより柔軟に変化させる。この柔軟なオルガネラのダイナミクスこそが高等植物の特徴ではあるものの、同時に解析を複雑にさせており、ゲノムからのテキスト情報だけではその動態を理解することは難しい。画像データベースは、オルガネラの動態を可視的に提供できるため、ユーザーにとってはテキスト形式のデータに比べ、より理解しやすい形でオルガネラの動態を把握できる。また、画像や動画データは、オルガネラの形や大きさ、数などの情報を含んでいるため、画像データベースに蓄積されているデータを解析し、トランスクリプトームやプロテオームなどのオミクス解析データを組み合わせることで、システムバイオロジーへの応用も可能と考えられる。そのためのコンピューター解析用ソフトに開発も積極的に進められている。本発表では、演者らが構築している「The Plant Organelles Database 2 (PODB2)」を中心に植物オルガネラ研究に役立つと考えられる画像データベースの紹介とその利用方法について紹介する。

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植物の目や科名には大別してAPG-II、クロンキスト、新エングラー体系が使われる。学術界では遺伝子情報に基づくAPG-II（被子植物のみ）が標準といわれるが、多くの図鑑や書物は旧体系に従っており、APG-II分類を記していない論文も数多く見られる。いっぽう、趣味で植物図鑑や写真館を作成するサイトが数多くある。非常に多くの画像が掲載され学問的にも有用ながら、専門的なサイトと結びついていない。こうした情報流通の齟齬を解消するため、Metabolomics.JP (http://metabolomics.jp/)では植物の分類情報、フラボノイド約7,000構造、200種以上の生薬情報に加え、画像、情報サイトへのリンクを加えたポータルを提供している。

参考：植物科名を調べるには
"An update of the Angiosperm Phylogeny Group classification for the orders and families of flowering plants: APG II" THE ANGIOSPERM PHYLOGENY GROUP Botanical Journal of the Linnean Society, 2003, 141, 399-436.

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植物細胞において液胞は細胞体積の約8割を占めるオルガネラであり、単位膜である液胞膜に囲まれている。液胞の機能として、膨圧形成、無機イオンや代謝産物の蓄積、不要となったタンパク質の分解などが知られており、細胞内恒常性の維持に重要な役割を果たしている。その機能から液胞膜を介したさまざまな物質の輸送や液胞内における酵素の働きが予想されるが、その機能を支える分子や機構の解明はまだ十分ではない。我々は、植物細胞より液胞をインタクトな状態で単離し、液胞膜と液胞内に存在するタンパク質について網羅的な解析を進めてきた。その結果、既知の液胞膜タンパク質と共に、多数の機能未知膜タンパク質の存在が、また液胞内に見いだされたタンパク質から、分解系に加え、様々な代謝反応が液胞で行われている可能性が示唆された。さらに我々は、液胞膜から界面活性剤不溶膜画分（DRM: Detergent Resistant Membrane）を調製し、プロテオーム解析を行った結果、DRMにはV-ATPaseが豊富に含まれていることが示され、免疫染色の結果も、V-PPaseが液胞膜全体に分散しているのに対し、V-ATPaseは局所的に偏った分布を示した。
本発表では、プロテオミクスの結果から見えてきた新たな液胞の機能について、また液胞膜にマイクロドメイン（脂質ラフト）が存在する可能性について紹介したい。

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ペルオキシソームには、オイルボディや葉緑体、ミトコンドリアなどと協調して生理機能を担う多くの代謝系が存在する。こうした代謝系はペルオキシソーム膜を介して他のオルガネラと基質のやり取りを行う必要があるが、これまでペルオキシソーム膜に局在する輸送体はほとんど知られていなかった。そこで、我々はペルオキシソーム膜局在型輸送体を網羅的に同定することにより、ペルオキシソームを中心としたオルガネラ間コミュニケーションの実体解明を目指した。
ダイズ黄化子葉からの高純度ペルオキシソーム膜画分の単離法及び膜タンパク質の同定法を確立した。本法によって、ペルオキシソーム膜タンパク質から機能未知の新規タンパク質PNC (Peroxisomal Adenine Nucleotide Carrier)を同定した。PNCは発芽時の子葉において、脂肪酸の代謝に機能が特化したグリオキシソームの酵素と同様の挙動を示した。大腸菌の細胞膜上に発現させたダイズPNC及びシロイヌナズナPNCはATPに対して輸送活性を持つことが明らかとなった。また、PNC遺伝子の発現を抑制したシロイヌナズナの芽生えでは貯蔵脂質の分解が抑制されており、ショ糖要求性を示した。以上の結果から、PNCは発芽時のグリオキシソーム膜において脂肪酸β-酸化回路で消費されるATPを輸送していることが示された。

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細胞核は遺伝情報の収納と機能発現を担い，その名の通り様々な生命現象の核となるオルガネラである．しかし意外なことに，高等植物における細胞核の構造がどのような分子基盤に支えられているかはほとんど分かっていない．細胞核の機能の普遍性の高さゆえに見過ごされがちだが，植物は非常にユニークな機構で細胞核を進化させてきた．例えば，高等動物で広く保存されており核構造の基盤となるラミンタンパク質や核膜タンパク質は植物には存在していない．私たちは細胞核の分子基盤を明らかにすることを目的として，プロテオミクスを用いたアプローチで研究を行っている．
単離した細胞核からタンパク質の可溶化を行い，ショットガン方式でOrbitrap型の質量分析機に供してタンパク質の同定を行った．結果，1536種類のタンパク質を同定することに成功し，植物特異的な新規核膜タンパク質を見つけた．次に植物における核膜孔複合体の構成成分を明らかにするために，インタラクトーム解析を行った．GFPを融合した核膜孔タンパク質を発現する形質転換体の抽出液を用いて， GFP抗体カラムで複合体を生成した．複合体に含まれるタンパク質を同定したところ，植物の核膜孔複合体は動物細胞と一部共通した因子から構成されることが分かった．オルガネラプロテオミクスとタンパク質複合体解析を組み合わせることで，細胞核のより詳細な機能解析に迫ることができると期待している．

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イネの免疫応答において，低分子量Gタンパク質であるOsRac1が重要な制御因子として機能し，いもち病菌などの外的因子を認識後の活性酸素種の産生，抗菌性物質の合成，細胞壁の再構築といったさまざまな防御応答反応を制御していることをこれまでに明らかにしてきた．さらにわれわれはこのOsRac1をより詳細に解析するため，ポストゲノム技術であるプロテオミクスの手法を用いた解析を行うことで，OsRac1のタンパク質レベルでの解明を試みてきた．これまでにOsRac1のアフィニティークロマトグラフィーにより相互作用因子を探索し，質量分析装置により同定したところスキャホールドタンパク質であるRACK1やHsp70，Hsp90とそのコシャペロンであるSti1，さらに抵抗性遺伝子産物に高く保存されるNB-LRRを持つタンパク質等が候補として得られた．われわれはこれら相互作用因子により構成されるOsRac1複合体をDefensomeと命名し，イネ免疫応答においてどのような形でどのように機能しているかを解明するために研究をおこなっている．本シンポジウムではプロテオミクス技術により得られた結果を中心に紹介し，イネ免疫機構におけるDefensomeの役割について考察したいと考えている．

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植物の新規シグナル応答因子の同定を目的とした、ナノフロー液体クロマトグラフィーとオンラインで接続されたイオントラップ型質量分析計（MS）を用いた3つのプロテオーム解析を紹介する。例1では、イネより調製した核及び核酸付随タンパク質のプロテオーム解析により、約150個のシグナル伝達あるいは応答に関与すると見られるタンパク質を同定した。これにより、植物だけでなく酵母や動物においても保存されており、また、グルコース応答性を示す2つのWD40タンパク質と1つのarmadillo/pumilioタンパク質を見出した。例2では、インセクトレーザー法により調製したイネ篩管液より3種類のFTファミリーに属するタンパク質を同定した。これらは長距離輸送型の新規シグナル伝達分子である可能性が示唆された。例3では、MS強度の比較による同位体標識を用いない新規な比較プロテオーム解析の系を確立した。この系を用いたイネの緑化過程の比較プロテオーム解析により、889個のタンパク質について相対量の変動を推定した。また、トランスクリプトーム解析の結果との比較により、緑化の過程で翻訳またはタンパク質分解レベルの制御を受けていると推定されるタンパク質も同定した。以上の結果をもとに、新規植物シグナル応答タンパク質のスクリーニングにおけるプロテオミクスの有用性について議論したい。

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高等動植物の細胞内では、成熟したタンパク質がリン酸基、メチル基、アセチル基といった化学基、あるいはユビキチンやSUMOといったタンパク質などにより修飾を受ける。こうした修飾は、タンパク質を細胞内で適切な場所に局在化させたり、適当量に分配したり、不必要なタンパク質を分解したり、あるいは酵素活性を変化させる上で重要な仕組みであり、タンパク質を介した細胞内シグナル伝達制御の骨子と考えられている。SUMOはユビキチンと類似した構造を持つが、その機能はユビキチンとは異なり、タンパク質の活性・局在の変化、安定化などに機能している。
シロイヌナズナのSUMO分子には、8種のアイソフォーム（AtSUMO1-8）が存在し、他の生物に比べて多数の因子から成る遺伝子ファミリーを形成している。このことは、それぞれのSUMO分子に発現部位特異性や基質特異性などの点で機能的分担があることを示唆している。我々は、特定のSUMO分子により修飾を受ける標的タンパク質の同定及び修飾部位の同定に向けて、大腸菌を宿主としたシロイヌナズナSUMO化修飾系を構築した。この系により、大腸菌内でSUMO化修飾を受けたタンパク質を容易に産生することができ、質量分析法を用いた修飾部位の同定も可能となった。各SUMO分子(AtSUMO1-8)の解析結果と併せて議論する予定である。

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多様な色調を発現しているアントシアニンについての研究は、本邦では20世紀の初頭に始まり、すでに一世紀を越えて受け継がれてきた。その中でも、花弁の多様な色調発現機構に関してはWillstatter等によって提唱されたpH説、柴田桂太による金属錯体説、それにRobinson夫妻によるco-pigment説が広く知られている。金属錯体に関しては、ツユクサから最初に単離されたコンメリニンについて林孝三を中心とした詳細な研究がなされ、近年その立体構造が解明された。その後、Co-pigmentに関しては、異分子間ではなく、同一分子内で自己会合を生じ、安定な色調を呈する色素が、1970年代キキョウやサイネリアの青紫花弁から相次いで単離された。これらの色素は、ほとんどすべてが2分子以上の芳香族有機酸によってポリアシル化されたアントシアニンであった。以後、この色素の構造と安定化機構に関してはNMRやMassで詳細に研究されている。PH説に関しては、以前は花弁搾汁を用いた研究が主であったが、今では単一細胞レベルでの測定が可能となり、花弁のpH変化がミクロのレベルで解明されている。最近、サントリーが最新のバイオ技術を駆使して作出した青バラが市場に出た。この成果は、アントシアニン研究者に将来への夢を与えてくれた。本講演では、研究の歴史を振返り、研究最前線を鳥瞰しつつ今後の研究方向について言及したい。

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野生植物および園芸植物の大多数の花色はアントシアニンとカロテノイドのどちらか、あるいはその両方によって発現している。その一方で、少数ではあるがそのどちらにもよらない花の色もまた存在する。その代表的な色素がベタレインで、マツバボタン、サボテン、ケイトウ、マツバギクなどナデシコ科とザクロソウ科を除くナデシコ目の9科に属する植物がこれに相当する。これらの赤紫の花はベタシアニンに、黄色はベタキサンチンに、その中間色は両者の共存によって発現している。フラボノイドのカルコンやオーロンもカーネーション、コスモス、トサミズキ、キンギョソウなどで黄色系の花色に貢献している。ゴシペチンなどの6-あるいは8-位に水酸基が置換されているフラボノールもまた、ヤグルマギク属やフヨウ属の黄色花では重要な役割を果たしている。また一方で、クェルセチンのような一般的なフラボノールもまたクレマチスなどの淡黄色花では多量に存在する場合、色素として機能していることが報告されている。最近、ツバキ科のキンカチャの濃黄色花が一般的なフラボノールとアルミニウムが錯体を形成することによって発現していることが明らかとなった。アロエとその近縁属も黄～橙色の花をつけるものが多いが、これらもアントシアニンではなく、アントラキノン系の色素によって発現していると推定されている。

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