ミロシナーゼはシロイヌナズナ単離孔辺細胞プロトプラストにおいて極めて大量に含まれるタンパク質である．ミロシナーゼの二重欠損株の気孔は，野生株とは対照的に，ABA・MeJA・H₂O₂によって閉口しなかった．一方，Ca²⁺誘導性気孔閉口とABA誘導性活性酸素種発生は正常であった．このことは二つのミロシナーゼ, TGG1とTGG2がABAおよびMeJA誘導性気孔閉口において，ROS発生の下流および細胞内Ca²⁺上昇の下流で，冗長的に機能している事を示唆している．

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植物ホルモンであるジャスモン酸メチル（MeJA）は細胞内カルシウムイオン濃度変化に依存した経路を介して気孔閉口を誘導することが知られているが、そのシグナル伝達機構の詳細は不明である。我々は、MeJAが誘導する気孔閉口シグナル伝達経路に関する更なる知見を得るために、カルシウム依存性タンパク質リン酸化酵素（CDPK）に着目した。過去の研究によって、シロイヌナズナのCDPKであるCPK3、CPK4、CPK6、CPK11がアブシジン酸の誘導する気孔閉口シグナル伝達経路に関与することが明らかとなっている。そのため我々は、この4つのCDPKの遺伝子破壊変異体を用いてMeJA誘導気孔閉口の観察を行った。結果、CPK6の遺伝子破壊変異体でのみ、MeJA誘導気孔閉口が抑制されていた。CPK6の役割をより明確にするために、気孔閉口に関与する孔辺細胞原形質膜イオンチャネルの活性や活性酸素といったセカンドメッセンジャー産生の解析も行った。我々の結果は、CPK6がMeJAの誘導する気孔閉口シグナル伝達経路で正の制御因子として機能することを示唆している。

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私たちはこれまでに青色光受容体であるクリプトクロムをイネから3種類（cry1a, cry1b, cry2）単離し、それらが青色光下で幼葉鞘、葉鞘、葉身の伸長抑制、葉身の傾斜拡大に関与していることを明らかにした。
葉身の傾斜は群落の光受容効率に大きく影響するため、その制御機構の解明は重要であるが、青色光依存的な葉身傾斜に関与する因子は今まで不明であった。O.glumaepatulaと台中65号の染色体部分置換系統群を九州大学より分与していただき、それらを青色光下で生育し表現型を解析したところ、WTよりも顕著に第2葉身の傾きが大きくなる系統（IL113）が見出された。一方、青色光下での伸長抑制反応や赤色光、遠赤色光に対する光応答反応は台中65号と同様であったことから、IL113は青色光依存的な葉身傾斜する反応だけが過敏になっていることが分かった。IL113以外の系統は青色光下で葉身の傾きが大きくなる表現型を示さないことから、IL113系統でのみ置換されているO.glumaepatulaのゲノム断片の領域である第4染色体の長腕部分に原因遺伝子があることが示唆された。現在、候補領域を460 kbにまで絞り込んだ。
また、青色光下での葉身の傾斜する過程をモニタリングした結果や、疎植、密植条件でのIL113と台中65号の農業形質を測定したので、それらについても報告する。

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気孔は強い赤色光の存在下でシグナルとしての弱い青色光に応答して開口する。青色光は細胞膜H⁺-ATPaseを活性化し、H⁺を細胞外に放出させ細胞膜を横切る電位差を増大させる。この膜電位の過分極は電位依存性の内向き整流性K⁺チャネルによるK⁺の取り込みを促進し、孔辺細胞内に蓄積したK⁺は主にリンゴ酸によって電気的なバランスが保たれる。赤色光は孔辺細胞葉緑体の光合成電子伝達反応を駆動し、細胞膜H⁺-ATPaseにATPをリンゴ酸生成に還元力を供給すると考えられるが、直接的証拠は得られていない。本研究では赤色光の役割を解明するため、様々な条件下でリンゴ酸と気孔開口を測定した。赤色光と青色光は孔辺細胞におけるリンゴ酸の蓄積と気孔開口に相乗的に作用しており、この両方が光合成電子伝達の阻害剤3-(3, 4-dichlorophenyl)-1, 1-dimethylureaによって阻害された。また、H⁺-ATPaseの阻害剤であるvanadateによっても阻害された。これらの結果は青色光によって誘導されるリンゴ酸の蓄積と気孔開口反応に、孔辺細胞葉緑体の電子伝達反応で生成したATPや還元力が寄与することを示している。

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緑葉ペルオキシソームはミトコンドリア、葉緑体と協調して光合成に付随しておこる光呼吸の代謝系を担っている。今回我々は、オルガネラの局在機構と代謝の効率化との相関性を明らかにするために光合成組織でペルオキシソームを中心としたオルガネラの接着機構に注目して解析を行った。その結果、ペルオキシソームは暗所では球形で葉緑体との接着も減少したが、明所では楕円形となり葉緑体に寄り添う形態を取った。形態変化を伴った同様の現象は、ミトコンドリアでも観察された。さらに、2光子励起レーザー顕微鏡を用いた解析からペルオキシソームと葉緑体との接着は青色光と赤色光により制御されることが明らかになった。そこで、光合成の電子伝達系阻害剤であるDCMU, DBMIBを添加した明所での細胞を観察するとペルオキシソームは暗所同様の表現形を示し接着も弱くなった。ペルオキシソーム、ミトコンドリアと葉緑体との接着機構に関しても光合成阻害剤は同様な影響を与えた。また、光合成の不活性化がおきているvar2変異体の白い領域の観察を行ったところ、ペルオキシソームは不活性化しており、葉緑体との接着も弱くなっていた。これらの結果から、接着機構は確かに光合成制御下にあり、光呼吸が光合成に付随しておこることを考えると合理的な現象であることが示唆された。

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クロレラの生育は窒素源（硝酸）が十分存在するgrowing phaseの細胞と、窒素源が枯渇したresting phase の細胞からなる。以前 growing phaseでは硝酸（アミノ酸・アンモニア）輸送が、グルコース添加（青色光照射）により抑制をうけることを見出した。また resting phase の細胞では硝酸（アミノ酸・アンモニア）輸送系は、グルコース添加（青色光照射）により顕著に誘導されることが認められた。
Growing phaseの細胞の硝酸取り込みの抑制は、青色光による硝酸還元酵素活性化の結果から、生成したアンモニアによる抑制と考えられた。一方resting phaseの細胞では、アミノ酸（グリシン）酸化酵素が青色光により活性化され、生成したアンモニアによるデンプン分解が誘導され、増加したグルコースが硝酸（アミノ酸・アンモニア）輸送系の誘導を引き起こすと推測された。
以上の現象は、growing phaseとresting phaseにおける青色光受容体の違いによるものと考えられる。クロレラは窒素源をアンモニアで培養すると、硝酸還元酵素が欠損する。アンモニア培養細胞でも青色光による呼吸の誘導（デンプン分解）が認められたことから、クロレラの窒素代謝は複数の青色光受容体（硝酸還元酵素、アミノ酸酸化酵素）により制御されると考えられる。

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VOZは、維管束組織において特異的に発現するone zinc-fingerタイプのDNA結合タンパク質であり、陸上植物のゲノムにおいて広く保存されている。シロイヌナズナには2種類のVOZ(AtVOZ1, AtVOZ2)が存在するが、遺伝学的な解析から花成制御や低温ストレス応答などの現象に関与することが示されている。しかしながら、転写制御におけるVOZの分子機能については、未だ不明な点が多い。本研究では、VOZにMBF1が相互作用することを見出したので報告する。MBF1は、古細菌から真核生物まで広く保存されている転写コアクチベーターであり、シロイヌナズナにはMBF1a,b,cの3種類が存在する。Y2Hやin vitroでの相互作用解析の結果、VOZ1,2は、共に、MBF1bとのみ特異的に結合することが分かった。さらに、プロモーター解析から、VOZ1,2及びMBF1bが維管束組織において共発現していることも明らかになった。現在、MBF1b変異体での花成時期や耐凍性についての評価を進めており、その結果も踏まえて、転写制御におけるVOZ1,2とMBF1bとの関係を考察する予定である。

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環境ストレスにさらされた植物では、大部分のmRNAからの翻訳が抑制されるが、一部のmRNAでは翻訳が維持されることが知られている。我々は、これまでにシロイヌナズナ培養細胞T87株を材料に熱ストレス下でも翻訳が維持されるmRNAをポリソーム・マイクロアレイ解析によるゲノムワイドな探索によって特定した。また、環境ストレス下における翻訳状態を規定する重要な要因が5’UTRにあることが明らかにされている。本研究では、この翻訳制御に関わる5’UTRの重要性を詳細に調べるために、翻訳が抑制されない遺伝子(At1g77120)および、顕著に抑制される遺伝子(At3g47610)の5’UTRをレポーター(GUS遺伝子)に連結した発現ベクターをT87株に導入した。得られた形質転換細胞を通常条件(22℃/10min)および熱ストレス条件(37℃/10min)にて培養し、GUS mRNAの翻訳状態を解析したところ、由来する遺伝子と同様な翻訳特性を示した。本発表では、翻訳制御に関わる5’UTRの配列的特徴についても合わせて報告する。

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コリンはCDP-コリン経路を介してホスファチジルコリン（PC）に代謝される。PCは植物の成長およびストレスに対する生理応答に重要なリン脂質であるが、PC代謝におけるCDP-コリン経路の生理的役割は依然明確でない。私たちはCDP-コリン経路の初段階を触媒するコリンキナーゼ（CK）に注目し、植物の生育および耐塩性におけるコリンリン酸化の役割について発表する。
シロイヌナズナCKをコードするAtCK1とその同質遺伝子［CK2 (At1g74320), CK3 (At4g09760)］に関して、葉ではNaCl処理後3時間までにCK2の発現量が上昇し、24時間以降はAtCK1およびCK3の発現量が増大した。T-DNA挿入変異系統を生育させたところ、ck2変異体では野生型に比べて花茎の伸長が遅延し、葉のPC含量が野生型と比較して18%程度低下していた。また、ck2およびck3変異体ではNaClを含む培地において低い発芽率を示し、ck2変異体では根の伸長が抑制された。正常に発芽させた後NaClを含む水耕液で生育させた場合も、ck2およびck3変異体では野生型に比べて生育の抑制が顕著であった。以上の結果から、シロイヌナズナではCK2が葉におけるPCの生産および植物体の成長、CK3が植物体の耐塩性維持に関与しているのではないかと考えている。

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高等植物においてCPD光回復酵素は、UVBによって誘発されるDNA損傷であるシクロブタン型ピリミジン二量体(CPD)を修復する主要な酵素であり、またその活性の高低はUVB抵抗性を決定する。植物細胞の核、葉緑体、ミトコンドリアは独自のDNAを有しており、各DNAにはUVBによってCPDが誘発されている。これまでに我々は、イネにおいてCPD光回復酵素はDNAを有する全てのオルガネラに移行して機能する “triple targeting protein” であることを示してきた。しかし、CPD光回復酵素のアミノ酸配列上には、各オルガネラへの移行が予想されるシグナル配列は見いだされず、その移行のメカニズムは不明である。そこで本研究ではまず、核、ミトコンドリア移行に関与する配列を同定することを目的に、CPD光回復酵素の部分配列とGFPとの融合タンパク質を用いた発現解析を行なった。その結果、(1) イネCPD光回復酵素(全長506アミノ酸)の438から506番目のアミノ酸配列とGFPの融合タンパク質においては、核へのGFP局在が観察され、(2) 385から437番目のアミノ酸配列とGFPの融合タンパク質においては、ミトコンドリアへのGFPの局在が観察された。現在は、各オルガネラへの移行に必要なシグナル配列の同定に向けて、CPD光回復酵素のアミノ酸配列部位をより限定して解析中である。

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紫外線B（UVB: 280-320 nm）照射によって生じる主なDNA損傷であるシクロブタン型ピリミジン二量体（CPD）を修復するCPD光回復酵素は、イネのUVB耐性を左右する主要因子である。我々は、イネから精製したCPD光回復酵素がリン酸化修飾を受けていることを報告してきた。リン酸化修飾が酵素機能に与える影響を明らかにするためには、リン酸化修飾を受けるアミノ酸配列を同定することが重要である。そこで我々は、部位特異的変異導入法とタンパク質の強制発現系を用い、リン酸化修飾を受けないCPD光回復酵素を発現するDNA配列を見出すことで、リン酸化部位の同定を試みた。これまで我々は、大腸菌において発現・精製したイネCPD光回復酵素は、リン酸化修飾を受けないことを見出している。そこで、大腸菌よりも翻訳後修飾が起こりやすいとされる昆虫培養細胞抽出液を用い、無細胞タンパク質合成系により合成したイネCPD光回復酵素のリン酸化の有無を検出したところ、リン酸化修飾を受けていることを見出した。そこで、部位特異的変異導入法により、リン酸化修飾をうける可能性のあるアミノ酸配列をアラニンに変異させたCPD光回復酵素配列を作製し、昆虫培養細胞抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系を用いて合成させた。この結果を含め本発表では、CPD光回復酵素のリン酸化修飾が酵素機能に与える影響を考察したい。

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Cyanidioschyzon merolae (シゾン)は高温（42°C）、強酸性（pH2.5）に生息する単細胞光合成真核生物である。我々はシゾンがこのような極限環境に適応するための遺伝子を探索し、高等植物へ導入することで、ストレス耐性植物を作出することを目的として研究を行った。シゾンのEST解析の結果から、活性酸素消去酵素であるストロマ型アスコルビン酸ペルオキシダーゼ（stAPX）が顕著に高く発現していることが明らかになった。そこで、CmstAPX(シゾンstAPX)と内在性のAtstAPX（シロイヌナズナstAPX）をシロイヌナズナで過剰発現させた株を作製し、ストレスに対する耐性を比較した。免疫蛍光顕微鏡観察を行ったところ、CmstAPXは葉緑体のストロマに局在することが明らかになった。また、このCmstAPX過剰発現株は可溶性APX活性が野生型やAtstAPX過剰発現株と比べ著しく高く、葉緑体内で活性酸素を発生させるメチルビオローゲンや高温に対しても高い耐性を示すことが明らかになった¹。現在、詳細な解析を行っており、その結果もあわせて報告する。
¹Hirooka S et al. Plant Cell Rep. 2009 Dec;28:1881-1893

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動物や酵母の核小体ヌクレオリンはpre-rRNAの転写、プロセシングと修飾、リボソームタンパク質の核への輸送やアセンブリーなど、リボソーム形成の様々なステップに関わる。シロイヌナズナは若い組織で発現するAtNuc-L1と、通常は花芽でのみ弱く発現するAtNuc-L2の2つのヌクレオリン遺伝子を持ち、糖に応答するAtNuc-L1の発現は細胞増殖と強くリンクしてその破壊株(atnuc1-1)は生育遅延や様々な形態異常を示す。一方、AtNuc-L2破壊株は異常を示さないが、atnuc1-1ではAtNuc-L2が発現しており、両遺伝子の二重破壊は胚性致死となる。植物体を22℃から15℃に移すと、1日以内にAtNuc-L1のmRNAが誘導され、3日目からはタンパク質レベルが増加した。atnuc1-1の生育は15℃ではほぼ停止した。atnuc1-1にRPS5Aプロモーターに繋いだAtNuc-L1 cDNAを導入すると、AtNuc-L1 mRNAが野生型株の20～70％に回復し、種々の形態異常と共に15℃での生育も不完全ながら回復した。組織新鮮重当たりの25Sと18S rRNA量もatnuc1-1では顕著に低下し、RPS5Ap::AtNuc-L1導入によって不完全ながら回復した。以上のことから、AtNuc-L1はリボソーム形成を通して低温下での生育に必要であると考えられる。

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LEAタンパク質は強親水性のタンパク質で，疎水性領域をほとんどもたないことから，特定の3次元構造をとらず，煮沸によっても変性沈殿しない特徴をもつ．種子や脱水ストレス下の組織に高蓄積し，タンパク質や生体膜を保護すると考えられている．我々は低温馴化したコムギより新規な配列をもつタンパク質をコードするWCI16遺伝子を単離した．本発表では，WCI16が新しいクラスのLEAタンパク質であることを示す．発現解析により，WCI16は低温，乾燥，塩，ABA処理により発現が誘導された．組換えWCI16タンパク質を100 ^oCで20分間加熱しても凝集はおこらなかった．更に，組換えWCI16タンパク質の¹H-NMRスペクトルによる解析から，このタンパク質は特定の3次元構造を形成していないと考えられた．また，試験管内凍結保護実験において，WCI16は一般的な凍結保護剤であるウシ血清アルブミンより高い凍結保護活性を示した．したがって，WCI16は新規なクラスのLEAタンパク質であると結論された．WCI16はゲルシフトアッセイ法により，二本鎖DNAと特異的に結合し，核内における保護機能が推定された．更に，WCI16を過剰発現したシロイヌナズナは野生株と比較して耐凍性が向上した．したがって，WCI16は低温馴化過程で誘導され，コムギの耐凍性獲得に重要な機能を果たすと考えられる．

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微細藻類の寄託株の低温保存法の確立を目指して、単細胞真核緑藻クラミドモナスをモデルとして低温応答機構の解析を進めている。低温での生存率、増殖能を解析したところ、25℃明所で培養した対数増殖中の細胞を4℃暗所で培養した場合、7日目までは非常に高い生存率が維持されたが、その後は徐々に低下した。70日目までにはほとんどの細胞が死滅すると考えられたが、生残した細胞の増殖能は低温処理前の条件で培養した場合とほぼ同程度であった。このことから、クラミドモナスは低温傷害によって生存性が低下するが、ある程度の適応能力も有している可能性が示唆された。さらに低温応答の分子機構の解析を進めるため、マイクロアレイを用いた網羅的な遺伝子発現解析を行った。その結果、転写因子、光合成関連、代謝酵素など様々な遺伝子の発現が上昇もしくは低下することを見出し、さらにRT-PCRによって低温への応答の特異性を解析したところ、概日リズムに関係する遺伝子が発現上昇することを明らかにした。低温馴化能を有するシロイヌナズナにおいて概日リズムと低温応答の密接な関係が示されており、微細藻類においても高等植物と類似の機構の存在の可能性という興味深い知見が得られた。

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これまでに我々は、高等植物の環境ストレス応答機構の解明を目的として、強光・高温応答性遺伝子群の単離を行ってきた。その中にSgt1aが含まれていた。シロイヌナズナゲノムにはSgt1aとbのホモログが存在し、Sgt1bは病原菌あるいはオーキシン応答のシグナル伝達経路に関与することが明らかとなっているが、Sgt1aの機能は不明であった。そこで本研究では、環境ストレス条件下におけるSgt1aの機能解析を行った。5日齢の野生株、Sgt1aおよびSgt1b過剰発現植物（Ox-Sgt1aおよびOx-Sgt1b）、Sgt1aノックアウト株（KO-Sgt1a）、Sgt1b変異株（edm1）の基本高温耐性および獲得高温耐性を評価した。いずれの植物においても、基本高温耐性能に違いは認められなかった。しかし、Ox-Sgt1a、Ox-Sgt1b、edm1の獲得高温耐性能は野生株と同程度であったが、KO-Sgt1aの耐性能は顕著に低かった。そこで、KO-Sgt1aの耐性能低下の原因を調べるため、野生株、KO-Sgt1aおよびedm1において種々の熱応答性遺伝子の発現レベルを解析した。その結果、Hspを含むいくつかの遺伝子の熱応答が野生株およびedm1に比べてKO-Sgt1aで顕著に抑制されていた。以上より、Sgt1aは熱応答性遺伝子の発現誘導を介した獲得高温耐性能に機能することが示唆された。

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陸上植物は固着性であるため、環境ストレスに直接さらされており、種々の遺伝子発現や代謝を調節して様々な環境に適応していると考えられている。低温ストレス環境下においても、多くの低温誘導性遺伝子が発現していることや糖やアミノ酸の蓄積量が増加していることが報告されている。シロイヌナズナにおいては、低温誘導性転写因子DREB1Aについての研究報告が数多くあり、DREB1Aを恒常的に過剰発現させた形質転換植物は、低温ストレスに対する耐性能が向上することから、DREB1Aが制御する下流遺伝子は、低温耐性の獲得において重要な役割を果たしていると考えられた。この下流遺伝子がコードするタンパク質には、LEAタンパク質、解毒酵素、シャペロン、転写因子、葉緑体膜タンパク質などが存在すると考えられている。
我々は、DREB1Aが制御する機能未知のタンパク質ファミリーであるCOR413ファミリーに注目して研究を行っている。このファミリーに属する3遺伝子IM1、IM2.1、PM1は低温で誘導されることが確認された。また、GFPタンパク質を利用して、この3遺伝子がコードする各タンパク質の細胞内局在を調べた結果、IM1とIM2.1は葉緑体膜に局在していることが明らかになった。一方、PM1は小胞体に局在していると考えられた。さらに、各遺伝子の過剰発現体を作出し、T-DNA挿入型変異株と共に表現型解析を行った。

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シロイヌナズナのDREB2タンパク質は、高温・乾燥・塩などのストレス応答に関与する転写因子であり、多くの環境ストレス誘導性遺伝子のプロモーター領域に存在するDRE/CRT配列に特異的に結合することでそれらの遺伝子の転写を活性化する。イネにおいてDREB2タイプの遺伝子は5種類存在し、OsDREB2ファミリーを形成している。これまでの解析で、OsDREB2AとOsDREB2Bのみが非生物学的ストレス誘導性の発現パターンを示し、特にOsDREB2Bが強いストレス応答を示すことを明らかにした。また培養細胞を用いたトランジェント発現解析より、OsDREB2Bは細胞内で核に局在し、OsDREB2ファミリー内の他の遺伝子と比べて高い転写活性化能を示すことを明らかにした。
今回我々はOsDREB2Bを過剰発現させたシロイヌナズナの解析を行い、シロイヌナズナのDREB2A標的遺伝子の発現が増加していること、形質転換植物の乾燥・高温耐性が向上することを明らかにした。このことからOsDREB2BはDREB2タイプの転写因子として機能していることが示唆され、イネにおいてもストレス誘導性遺伝子の発現制御に関与していることが期待された。現在、イネにおけるOsDREB2ファミリーの働きについてT-DNA挿入変異体などを用いた解析を行っており、それらについても合わせて報告する。

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シロイヌナズナの転写因子DREB2Aは、植物の環境ストレス応答において重要な役割を担っている。DREB2Aはユビキチン‐プロテアソーム系による安定性の調節を受けていて、ストレスのない状態では不安定であるが、セリンやスレオニンに富む「負の活性調節領域」を欠失させることで、恒常的に安定化させることができる。しかしながら安定性を決めているシグナルはいまだに不明である。DREB2Aには相同性の高い遺伝子としてDREB2Bが存在している。そこで、本研究ではこれらの転写因子の活性制御機構を解明するために、DREB2Bの機能を解析し、DREB2Aと比較することを目的とした。
DREB2B遺伝子の発現量はDREB2Aと同様に乾燥、高温、高塩濃度のストレス下で上昇した。DREB2Bから負の活性調節領域に相当する配列を欠失させ、一過的発現系で転写活性化能の解析を行ったところ、レポーター活性が増加したが、増加幅はDREB2Aの場合より小さかった。一方、一過的発現系でGFP融合タンパク質を発現させ、蛍光観察およびイムノブロット解析を行ったところ、DREB2BはDREB2Aとは異なり、負の活性調節領域を欠失させなくても安定に核に局在することが示された。従って、DREB2Bに対する安定性制御はDREB2Aより弱いものと考えられた。現在、DREB2B過剰発現体のストレス下での表現型について、解析を進めている。

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シロイヌナズナの転写因子DREB2Aは、熱ストレス・水分ストレスに応答した遺伝子発現において重要な役割を担っている。DREB2Aタンパク質は、ユビキチン‐プロテアソーム系による安定化制御を受けていて、ストレスのない条件下では不安定化されているが、ストレス条件下では安定に核に存在できることが明らかになっている。また、DREB2Aから30アミノ酸からなる領域を除くことで、DREB2Aを恒常的に安定な活性型（DREB2A CA）に改変できることが分かっている。しかしながら、ストレスに応じてDREB2Aを安定化するシグナル伝達経路がどのようなものであるか実体は不明である。
我々は、シロイヌナズナの葉肉プロトプラストで構成的プロモーターによりDREB2AおよびDREB2A CAを一過的に発現させ、熱ストレスに応答した翻訳産物レベルの変化をイムノブロットにより調べた。DREB2Aタンパク質は、GFP融合タンパク質の蛍光観察により示唆されていたように、熱ストレスに応答して著しく蓄積した。意外なことに、DREB2A CAもDREB2Aと同様に、熱ストレスに応答して蓄積レベルが上昇することが見出された。このことからDREB2A CAもストレスのない条件では分解を受けている可能性が考えられた。現在この系を用いて、各種のストレス条件や阻害剤がDREB2Aの安定性に及ぼす影響を調べている。

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植物は塩ストレス条件下で、細胞内に流入したNa ⁺により障害を受ける。これに対し、原形質膜上のK⁺輸送系のK⁺/Na⁺選択性を高めることが、塩ストレスへの適応に重要であると考えられている。K⁺/Na⁺輸送体であるHKT（High-affinity K⁺ Transporter）はK⁺の取込みやNa⁺の取込み・排出に働いており、植物の耐塩性に関わっている。本研究では、HKTによるK⁺取込みと耐塩性の関連を解明することを目的として、HKT過剰発現形質転換イネの作出と解析を行った。イネに存在する8種類のHKTのうち、OsHKT2;2はK⁺-Na⁺共輸送体であり、Na⁺輸送体OsHKT2;1の変異体であるOsHKT2;1S88GはK⁺輸送体であることがこれまでに酵母発現系の実験で示されている。これらのHKTをそれぞれ導入した形質転換イネを作出し、それらの低K⁺高Na⁺条件における生育を調査した。また地上部のK⁺含量、Na⁺含量を測定し、K⁺/Na⁺比を求めた。その結果、OsHKT2;2系統とOsHKT2;1S88G系統でコントロールに比べ、相対生長とK⁺/Na⁺比が高かった。以上の結果からOsHKT2;2とOsHKT2;1S88Gが高Na⁺条件でK⁺取込みに機能し、耐塩性に寄与していることが示唆された。

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本研究ではFOXハンティング法を利用して環境ストレス耐性に関わるイネ遺伝子群を探索し、それらの遺伝子の有効な活用法を開発することを目指している。イネにおいて塩や低温等種々の環境ストレスに対する耐性メカニズムが重複している点に着目し、耐塩性を獲得した遺伝子過剰発現系統の選抜を行う。イネの耐塩性選抜系を確立し、既存FOX系統種子およびT0形質転換植物を用いて包括的なスクリーニングを行っている。また、植物のストレス耐性に関する研究基盤を元に、およそ100種の環境ストレス耐性関連遺伝子群（TOP100）を選定し、種々のストレスに対する耐性の評価やストレス耐性植物作出の為のリソースとして活用すべく各系統の種子ストックの整備を行っている（戦略的FOX系統）。
現在、新たに作出したT0植物215系統、および約15,000系統の農業生物資源研究所のFOXイネ系統種子コレクションのうち約2,200系統について、順次高耐塩性系統の選抜を行い、候補系統を得た。また、戦略的FOX系統TOP100の候補として選定した遺伝子のうち72遺伝子について過剰発現系統の整備を行い、耐塩性試験を実施している。一方、ストレス耐性系統として登録されている既存イネ品種・系統群から、複数の塩耐性候補系統を得ている。今後ストレス耐性遺伝子導入との組合わせ試験を行い、より高いストレス耐性の獲得を目指す予定である。

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イネのUVB耐性獲得に関わる主因子の1つは、UVBによって誘発されるシクロブタン型ピリミジン二量体(CPD)を修復するCPD光回復酵素であるが、いまだUVB耐性機構の全容は明らかになっていない。そこで、UVB耐性遺伝子資源の探索を目的に、UVB抵抗性イネ・ササニシキに炭素イオンビーム（320 MeV：¹²C⁶⁺, 80 Gy）を照射して、UVB耐性、感受性を示す変異体の選抜を行った。その結果、親株のササニシキよりも耐性を示す変異体UVTSa-319および感受性を示す変異体UVSSa-1の選抜に成功した。これらの変異体は、親株のササニシキと比較して既知のUVB耐性因子（DNA修復酵素活性、UV吸収物質の蓄積量）に変異は認めらなかった。変異部位を同定するため、UVTSa-319、およびUVSSa-1のゲノムDNAを用いたアレイCGH法により、各変異体の欠損領域の推定を行った。UVTSa-319では第7染色体の二つの機能未知遺伝子（AK111251、AK071492）、UVSSa-1では第七染色体の二つの遺伝子（AK073884,AK121807）の欠失が推定され、ゲノムPCRによってもこの領域が欠失していることを確認した。本大会では、各変異体と親株間で行った発現アレイ解析の結果を含め、変異原因遺伝子とUVB耐性との関係について考察する。

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チオレドキシン(Trx)は、生物に普遍的に存在している蛋白質で､細胞内の酸化還元状態に応じて下流の蛋白質に還元力を供給している。シアノバクテリアは2種類のTrx還元経路を持ち、それぞれNADPH-Trx還元酵素(NTR)､Fd-Trx還元酵素(FTR)を用いている。Synechocystisの6803株では､NTR破壊株とFTR破壊株の酸化ストレス感受性の違いからNTR経路が主に酸化ストレスに対して重要な役割を担っていることは分かっていたが、各々の還元経路から電子を受け取るTrxの制御下にある蛋白質はまだ明らかになっていない。私達は、蛍光二次元電気泳動法によって野生株と各破壊株の蛋白質の酸化状態を比較した。実験では､細胞を破砕すると同時にフリーのSH基を修飾し、その後、酸化状態にあったジスルフィドのみを蛍光で検出する方法を用いた。フィコシアニンの自家蛍光が強いため、その周辺に分布する蛋白質の酸化状態を比較することはできなかったが、還元経路の破壊によって酸化状態に置かれている複数の特徴的な蛋白質を検出することができた。また、Trxシステムによって調節を受けている蛋白質を比較するため、各株の発現蛋白質が酸化ストレスの有無でどのように変わるかを調べた。これらの方法で同定できた蛋白質の結果や含有色素量などの結果を合わせて、各々の還元経路の役割分担を考察する。

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タンパク質合成は酸化ストレスに対して感受性が高い。近年、シアノバクテリアSynechocystis sp. PCC 6803のin vitro翻訳系を用いた研究から、翻訳因子EF-Gの失活がタンパク質合成の酸化ストレス傷害の主な要因になっていることが明らかにされている。さらにEF-Gの失活が特定のCys残基の酸化とジスルフィド結合の形成によることも示唆されている。本研究では、Synechocystisの3つのEF-Gホモローグ（Slr1463, Sll1098, Sll0830）の中で葉緑体型のSlr1463に着目して、その過剰発現株および酸化の標的Cys残基をSerに改変した変異株を作製し、強光に対するタンパク質合成の応答を調べた。EF-G (Slr1463)過剰発現株では、光依存的なD1タンパク質の新規合成が強光下で促進していたが、他の多くのタンパク質の新規合成は抑制されていた。この株では、バクテリア型のEF-GホモローグSll1098の発現が低下していた。これらの結果から、EF-G (Slr1463)は光依存的なタンパク質合成に関与する一方、EF-G (Sll1098)は光非依存的なタンパク質合成を支えていることが示唆される。現在、Cys変異株におけるタンパク質合成を解析している。

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活性酸素種（ROS）を介した酸化的シグナリングは種々の環境ストレス応答に必須の役割を担っている。高等植物において、葉緑体は主要なROSの生成部位であるため、種々のシグナルの発信源であると考えられる。これまでに我々は、葉緑体由来のROSを介した環境ストレス応答機構を明らかにするため、シロイヌナズナにおけるチラコイド膜結合型アスコルビン酸ペルオキシダーゼ（tAPX）の一過的発現抑制系を構築してきた。マイクロアレイ解析を行ったところ、tAPXの抑制に伴い約800の遺伝子群が誘導／抑制され、それらには種々の植物ホルモンや耐病性、細胞死などに関連する遺伝子群が多く含まれていた。そこで、葉緑体由来の酸化的シグナリングの分子機構を明らかにすることを目的として、葉緑体ROSに応答する遺伝子群の破壊株から、パラコートによる光酸化的ストレスに対して感受性あるいは非感受性を示す変異株（それぞれpssおよびpsi）の選抜を試みた。その結果、独立した3つのpsi（psi1~3）株および1つのpss（pss1）株が得られた。PSIsおよびPSSI株の転写レベルはパラコート処理後の初期段階で抑制されたが、後期段階で誘導された。現在、新たな変異株の選抜とともに、PSIsおよびPSSIの機能解析を進めている。

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オゾンは光化学オキシダントの主要成分であり、その強い酸化力により植物に光合成や生長の阻害などの重大な被害をもたらす。現在、大気汚染物質の中でもオゾンは最も広範囲に及ぶ地域で植物に影響を及ぼしており、今後地球温暖化に伴ってその濃度が世界各地で上昇することも予想されている。従って、植物のオゾン被害の対策、作物の品種改良や大気のモニタリングにおいて、植物のオゾンに対する応答機構の解明は重要である。これまでに、オゾンは植物の活性酸素ストレスや植物ホルモンのシグナル伝達を介したプログラム細胞死を誘導することが報告されている。また、近年のトランスクリプトーム解析等の研究により、その仕組みの一部が明らかにされつつある。しかしながら、植物のオゾン応答機構は複雑であり未だ不明な点も多い。本研究では、オゾン応答に関わる転写因子を同定することを目的として、シロイヌナズナの転写因子CRES-T形質転換植物ライブラリーの中からオゾン感受性が野生株と異なる植物をスクリーニングした。CRES-T法とは、任意の転写因子に転写抑制ペプチドを融合したキメラリプレッサーを植物体内で発現させることにより、目的の転写因子だけでなく機能重複する内在性の転写因子も効率的に抑制することができる技術である。これまでに、オゾン耐性変異株を複数個体得ており、同定した転写因子のオゾン応答機構における役割について考察する。

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湿地性植物は、根に通気組織と呼ばれる細胞間のスペースを発達させることで、地上部からのガス供給を行う。通気組織形成過程の解明は植物の嫌気応答のしくみを明らかにする上で重要なテーマであるが、通気組織は細胞間隙であるため、通気組織そのものを蛍光色素等の生体染色により可視化しその発達を経時的に追跡することは困難である。本研究では、放射光施設SPring-8のビームラインBL20B2を使ってX線CT撮影を行い、イネ（Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare）の一次根における通気組織の非破壊的な観察を試みた。
筆者らは、根の側面を寒天で挟んで2方向から異なる処理を施し、マンニトール処理区側と対照区側との間で組織の発達を比較する実験系を用い、X線CT観察を試みた結果、マンニトール側において、通気組織が発達していることが確認され，通気組織の観察にX線CT撮影および3Dモデルによる視覚化は非常に有効であることが示された。次に、ポリスチレンチューブ内に作製した培地で根を生長させることで、根を取り出さずにX線CT観察を行うことを可能とした。この方法を用いることで、破生通気間隙形成の開始部から基部にかけて通気組織の三次元的なつながりを捉えるとともに，その全体像をほぼ丸ごと捉えることに成功した。

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植物は乾燥ストレスに曝されることでアントシアニンを蓄積することが知られている。植物ホルモンのアブシジン酸(ABA)欠損変異体や非感受性変異体では、乾燥ストレス後のアントシアニンの蓄積量が減少しており、逆にABAを過剰蓄積する変異体では、その蓄積量が増加していた。フラボノイド合成酵素群やそれに関わる転写因子群の遺伝子発現がABA欠損変異体や非感受性変異株でもその誘導が認められるが、ABA過剰蓄積変異体では相乗的に誘導されていた。この結果から、乾燥ストレス時におけるアントシアニン量の蓄積は、乾燥ストレスおよびABAを介した制御機構の両方によって制御されていることが示唆された。一方で、アントシアニンは抗酸化物質として知られているため、乾燥ストレス時における植物体内で発生する活性酸素の除去に関わっているかを検証した。ABA欠損変異体では、乾燥ストレス後の活性酸素の蓄積が顕著に観察されたのに対して、ABA過剰蓄積変異体ではその蓄積が抑えられており、アントシアニンの蓄積量と負の相関を示した。さらに、アントシアニンを過剰に蓄積する形質転換体において乾燥ストレス試験を実施した結果、乾燥ストレス耐性が顕著に向上していた。現在、アントシアニンの生合成変異体でストレス耐性試験と活性酸素の蓄積量に関して解析を進めている。この結果を総合して、乾燥ストレスに対するアントシアニンの生理作用を議論したい。

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Plant cells respond to the environmental stress through reversible posttranslational modifications of important signal molecules. The dynamic glycosylation of serine or threonine by O-linked β-N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) is critical to many cellular response and reciprocal to O-phosphorylation. In Arabidopsis, SPINDLY (SPY) gene encodes an O-GlcNAc transferase (OGT), which was originally identified as a negative regulator in GA signaling. In this study, we found that spy mutants are more tolerant to osmotic stress, such as high salinity and dehydration. SPY gene expression is specifically drought inducible. Transcriptome analysis of spy-3 mutant discovered that the expression of some drought-inducible genes, in addition to many GA inducible genes, was upregulated. More evidently, in 2h dehydrated spy-3 plants, the expression of many drought-responsive genes, especially LEA protein genes, is higher than that in wild-type plants. In addition, some DREB2A specific downstream gene expressions were enhanced in spy-3 mutant, in early dehydration stress.

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陸生ラン藻の類縁株である Anabaena sp. PCC7120は耐乾燥性研究に有用なモデル生物であり、DNAセグメントアレイ解析により見出された乾燥応答遺伝子を遺伝子破壊で解析し、窒素固定条件（窒素飢餓条件）で耐乾燥性能に関与することを見出した。遺伝子情報をデータベースで検索した結果、複数のストレス応答遺伝子が含まれていたことから、これらの遺伝子が乾燥等の極限環境下で起こる細胞内外の現象に対応するために誘導されていると考えられた。
そこで、窒素固定時の耐乾燥性能を利用した環境改善といった応用が可能な材料として、耐乾燥性で窒素固定可能な陸生ラン藻 Nostoc communeの単離を進め、無菌化した。これは上記のラン藻の類縁株であり、細胞外多糖を多く含むことから、遺伝子解析だけでなく植物栽培に必要な根の成長、窒素源の供給だけでなく、無菌化されているので食品等様々な応用が期待される。植物に必要とされる窒素の供給源としてラン藻マットを使用することが可能かを検討する目的で、ラン藻マットでの植物栽培研究を進め、成長阻害が起きないことを確認したが、十分な成果を得るには複数の植物による栽培実験、陸生ラン藻の大量培養系が必要であり、複数の植物での結果についても報告する予定である。

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デンプンは植物の炭素貯蔵の最も重要な化学形態である。酵母や動物でグリコーゲン合成の開始反応について十分に解明されてきたが、植物におけるデンプン合成の開始反応の機作はまだ未解決なままである。私たちは冠水耐性野生イネFR13Aを冠水処理することで誘導される遺伝子として、動物のグリコーゲン合成開始酵素グリコゲニングルコシルトランスフェラーゼと相同性の高いOsGGTを発見した。日本晴品種においてOsGGTの昼夜の発現様式はデンプン合成のそれと強く関連していた。GGT変異体系統でOsGGTの発現を抑制するとデンプン含量の明確な減少を示した。OsGGTを過剰発現した形質転換イネは野生型イネと比べて、1.3倍のデンプン含量を示した。さらに、完全冠水2日後に、OsGGT過剰発現イネは冠水前のデンプン含量の61%を維持したのに対し、野生型イネでは34%しか維持できなかった。これらの結果はOsGGTがイネにおけるデンプン合成開始に関わるタンパク質である可能性を示唆し、その過剰発現はイネのデンプン合成を高め、冠水耐性を高めるための新しい研究戦略であることを示す。

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ハマニンニク(Leymus mollis)は海岸に育ち、高塩水、冠水に適応している。また、本植物はコムギ(Triticum aestivum)の野生類縁種でコムギの品種改良の重要な遺伝資源と考えられている。私たちはSSH法でハマニンニクから乾燥と塩に応答する遺伝子を同定した。21種の遺伝子を同定し、異なった調節を受けることが確認された。葉緑体イノシトールフォスファターゼ(CIP)、フォスフォエタノールアミンメチルトランスフェラーゼ(PEAMT)、ETTIN様オーキシン応答因子(ARF)と未知遺伝子乾燥ストレス課で高調節された。一方、アレンオキシドシクラーゼ(AOC)とメチルジャスモン酸誘導性リポキシゲナーゼ(LOX)遺伝子は塩ストレスで高調節された。これらの遺伝子はジャスモン酸やアブシジン酸への応答において異なった調節を受けることが示された。ハマニンニクを用いたサザン分析でPEAMT、CIP 、ARFは中国春コムギと比べて、多くのイソ遺伝子が存在することが示された。これらの遺伝子の同定、機能解析は、育種、遺伝子導入によるストレス耐性コムギの開発にとって有益な情報をもたらす。

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植物のプリン分解代謝は，空中固定窒素の利用に必須の代謝経路であるため，主にマメ科植物を対象として長い研究の歴史を持つ。しかし，根粒菌と共生関係にない大多数の植物種においては，その確たる存在意義や重要性は理解されていない。私たちは，プリン分解代謝の初発かつ律速酵素であるキサンチン脱水素酵素（XDH）を標的としたRNAiにより，当該代謝の機能不全が通常条件下におけるシロイヌナズナの生育に著しい支障をきたすことを明らかにしている。XDHはハウスキーピング酵素に分類されるが，乾燥などのストレス条件下でも遺伝子発現や酵素活性が増大することが報告されている。そこで本研究では，ストレス条件下におけるプリン分解代謝の生理的意義の解明を目的に，XDHの発現抑制がシロイヌナズナの乾燥耐性に与える影響を調査した。乾燥処理を施したRNAi発現抑制株では，野生株と比較してクロロフィル含量や生長量が顕著に減少するとともに，過酸化水素の蓄積量や細胞死の割合が有意に増加した。一方，RNAi発現抑制株にXDHの代謝産物である尿酸を与えることで，これらの乾燥ストレスに対する感受性は相補された。尿酸をはじめとするプリン代謝中間体は抗酸化能を有することから，ストレス下におけるプリン分解代謝は，抗酸化物質生成系として植物の乾燥ストレスへの適応に寄与している可能性が示唆された。

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植物の根は、重力、光、接触、水分等の刺激に応答して屈性を発現する。根の水分屈性は水分勾配に応答して水の多い方向に屈曲する現象であるが、地球上では水分は重力方向と同じ方向に分布し、また根が重力屈性も発現することから、水分屈性だけを解析することは困難であった。近年、シロイヌナズナを用いた水分屈性実験系を開発し、水分屈性を示さない変異体MIZU-KUSSEI1(MIZ1)を単離し、その原因遺伝子を見出している。MIZ1相同遺伝子は陸上植物には存在するものの、藍藻や緑藻、動物には存在しないことから、陸上化に伴い進化してきた遺伝子と考えられる。我々はコケ植物蘚類ヒメツリガネゴケから3つのMIZ1相同遺伝子PpMIL(MIZ1-Like)1-3を見出し、その全長cDNA配列を決定した。ジーンターゲティング法を用い、現在までにPpMIL1, 2, 3について、単一遺伝子破壊ラインを各遺伝子についてそれぞれ2ライン取得している。更に、PpMIL1/2二重遺伝子破壊ラインについて6ライン、PpMIL1/2/3三重遺伝子破壊ラインを1ライン確立した。現在、確立した破壊ラインを用いて水分勾配に対する表現型の解析を進めており、その結果についても報告する。

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イグサ (Juncus sp.) は、塩湿地や海岸に生息する最も強力な耐塩性を有する単子葉塩生植物の1種であるが、イグサの耐塩性機構を遺伝子レベルで解析した研究例はほとんどない。本研究では、500 mMの NaCl 存在下で生育したイグサ植物体から、mRNAを抽出し、6×105 独立クローンを含むイグサ cDNA ライブラリーを作成した。「大腸菌を用いた機能スクリーニング法」により、このcDNAライブラリーから耐塩性に関与すると考えられるcDNAの探索を試みたところ、211 アミノ酸からなるプロリンに富んだタンパク質をコードする cDNA が導入された形質転換大腸菌に顕著な耐塩性の向上が認められた。この cDNA は、シロイヌナズナのClassical arabinogalactan protein とアミノ酸レベルで 51％ の相同性を有することが確認された。35S CaMv プロモーターを用いて、このタンパク質を過剰発現する形質転換シロイヌナズナ培養細胞を作出したところ、得られた形質転換体には顕著な耐塩性の向上が認められた。イグサのプロリンリッチタンパク質はイグサのもつ強力な耐塩性機構に重要な役割を担っていると考えられた。

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我々の食の安全を脅かす要因の一つに、有害物質であるカドミウム（Cd）の農作物への蓄積がある。農作物へのCdの蓄積を抑制する技術の確立には、植物体内におけるCdの動態を解明し、それらを制御する必要がある。我々がこれまでに行った研究で、植物のCd処理に応答して篩管液中のグルタチオン（GSH）濃度が上昇することを確認した。本発表では、GSHを植物体の特定の部位（根、ソース葉、シンク葉）に施用し、それらがCdの移行と蓄積に及ぼす影響を調べた。
実験には水耕栽培をしたアブラナ（品種：農林16号）を用いた。植物のCd処理は10μMの濃度で2日間とし、同時にこれらの植物にGSH処理を行った。収穫した植物の地上部・地下部におけるCd蓄積濃度はICP発光法により測定した。また、植物のCdの吸収・移行・蓄積の様子をポジトロン放出核種イメージング装置（PETIS）によってモニタリングした。
根にGSHを処理した植物では、地上部へのCd蓄積濃度が、通常のCd処理を行った植物に比べて、約20％に減少していた。一方で、地下部におけるCdの蓄積濃度には有意な差は見られなかった。この時、亜鉛、鉄などの重金属元素には植物体の地上部への移行と蓄積の抑制は見られなかった。また、PETISを用いた実験でも根へのGSH処理が植物体の地上部へCdの移行・蓄積を抑制することを確認できた。

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ホンモンジゴケ(Scopelophila cataractae）は、寺院の銅葺き屋根の下など銅濃度の高い環境下に分布、生育し、体内に銅を蓄積する生理学的に興味深い蘚類である。しかし、その銅耐性や高濃度の銅環境下への効率的な分布拡大様式のメカニズムに関する生理学的な知見はほとんど得られていない。そこで、我々はホンモンジゴケ原糸体の銅に対する応答性について生理学的解析を行った。まず、培養2週間後の原糸体コロニー成長への影響を調べた結果、銅添加区（～800μM）では銅無添加区に比べて、最大で1.3倍の成長促進がみられた。一方、銅無添加区では、対照的に無性芽形成数の増加が生じた。これらの結果から、ホンモンジゴケが環境中の銅濃度に応答して、形態形成を変化させることが示唆された。現在、無性芽形成制御の詳細なメカニズムと主な銅蓄積の場である細胞壁への影響なども含め、統合的な銅応答性の解析を進めている。本発表では、上記の結果と、そこから考えられるホンモンジゴケのユニークな生理生態について報告したい。

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A. thaliana Metal Tolerance Protein 1 (AtMTP1)は液胞膜に局在し、細胞質亜鉛を液胞へ能動輸送するZn²⁺/H⁺ exchangerである。AtMTP1は6回膜貫通型で、細胞質側にヒスチジン残基を25個もつHisリッチループがある。我々はこれまでに酵母異種発現系を用いた解析よりHisリッチループを欠失変異体AtMTP1Δ185-216は輸送活性が顕著に増加することからHisリッチループが輸送活性調節に関与する事を報告している。本研究で亜鉛高蓄積植物の作製およびHisリッチループの生理的役割の解明を目的に、WT-AtMTP1およびAtMTP1Δ185-216をA. thaliana野生株とAtMTP1遺伝子欠損株mtp1へ過剰発現させ解析を行った。亜鉛感受性株mtp1へAtMTP1Δ185-216過剰発現すると亜鉛耐性が回復すること、膜透過性亜鉛蛍光プローブを用いた解析よりAtMTP1Δ185-216の発現により根の液胞内へ亜鉛が高蓄積されている事が確認された。植物細胞内でのHisリッチループの有無によるAtMTP1タンパク質の安定性、イオン選択性、亜鉛輸送能について報告する。

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マメ科木本植物のAcacia mangiumは野生条件下でアルミニウム(Al)に耐性を有し、酸性土壌での旺盛な生育が可能である。2009年大会で我々はA. mangium胚軸由来の培養細胞を用いてDDRT-PCR法及び半定量RT-PCR解析を駆使して複数の低pHストレス応答遺伝子を検出した。現在、それらの遺伝子の完全長cDNAクローニングを行っている。
プロトン(H⁺)の毒性と共に、Alストレスは酸性土壌において植物の生育を制限する最も重要な要因である。そこで，アルミニウムのA. mangium培養細胞の成長に及ぼす影響と、Alストレスにおける低pHストレス応答遺伝子の発現パターンを評価した。その結果、いくつかの遺伝子では、低pHストレスとAlストレスで発現パターンの相違が認められ、その生理学的意義が興味深い。
さらに、既報のAl耐性関連遺伝子の配列情報を利用したdegenerate PCRにより、aluminum activated malate transporter (ALMT)、aluminum activated citrate transporter (AACT)などに相同性を示す遺伝子をA. mangium培養細胞から検出した。これらの遺伝子のAlストレスにおける発現解析の結果についても報告する。

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ラン色細菌Synechocystis sp. PCC6803においてsll1558が、pH3.0の酸性ストレス条件下のマイクロアレイ解析によって発現増加する遺伝子として同定された。その遺伝子の0.5h,1h,4hでの相対的な発現レベルはそれぞれ、3.51,6.94,4.05倍であった。また、同遺伝子はD-mannose-1-phosphateをGDP-D-mannoseへと触媒し、N-グリカンの生合成に関与しているmannose-1-phosphate guanylyltransferase(EC 2,7,7,13)であるとアノーテートされている。今回我々はこの遺伝子の酸性ストレス耐性について、sll1558とホモログの関係にある遺伝子sll1496とともに欠失変異体を作製し、酸性ストレスに対する生育の違いを検討した。その結果、sll1558欠失変異体では酸性ストレス培地(pH6.0 BG-11) に対して、野生株と生育を比較した際に有意な差が見られた。さらに、他の環境ストレスに対して調べた結果、塩ストレス培地(pH8.0 BG-11 0.5M NaCl)や浸透圧ストレス培地(pH8.0 BG-11 0.5M sorbitol)においても、同様であった。

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金属水素化物を入れた水が植物に及ぼすさまざまな影響について、過去2か年に渡り発表してきた。この水を吸わせた切り花は、不思議な現象を引き起こしていく。切り花が水の中で成長し丈も伸び、更には新たな花をつける。切ったそのままの状態を維持する。葉だけ、時には花だけをつけて行く。突然、枯死する事もある。
切り花は、普通、萎れていくものであるが、水素化金属を入れた水を吸わせると、生命活動を維持しているようである。そして、水のpH、ORPまでも切り花がコントロールしていく。
金属水素化物の中でも、CaH₂などのイオン結合性水素化物は、水素がマイナスイオン状で結合されている事から、このマイナス状の水素イオンがさまざまな現象を引き起こしていると推察される。このマイナス水素イオンの量を変える事により、成長促進、延命（現状維持）開花などのコントロールが可能になり、その結果、切り花だけではなく、無肥料の野菜等の水耕栽培、成長促進、結実などのコントロールが可能になり、農業分野での応用が期待される。
現在どのような条件下でその現象が起こるのかを分析、解明中である。当日は、その途中経過を報告する。同じpHのアルカリイオン水では、同じ現象は起こらない事をつけ加えておく。

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ジャスモン酸（JA）は病傷害のシグナル伝達を担う植物ホルモンである。近年、JAシグナルのリプレッサーとしてJAZ（Jasmonate ZIM-domain）タンパク質がシロイヌナズナで見出され、その機能性が証明された。JA誘導体により、F-boxタンパク質をコードするCOI1タンパク質とJAZタンパク質の複合体が形成された結果、26SプロテアソームによってJAZタンパク質が分解され、これによってJAシグナルが下流に伝達される。
JAZ遺伝子群は高等植物に広く保存されていると考えられるが、イネゲノム上では15種のJAZ遺伝子が存在すると推定されている（Ye et al. Plant Mol. Biol. 2009）。しかし、イネにおいてそれらの機能は不明であるため、本研究では、イネにおけるJAZ遺伝子の機能解明を目的とした。
6種のイネJAZ遺伝子をそれぞれユビキチンプロモーターの下流に連結したコンストラクトを日本晴に導入し、JAZ高発現株を作出した。そのうち1種のJAZ高発現株では全長、桿長及び止葉長がいずれも増加した。また、そのJAZ遺伝子の発現に対する植物ホルモンへの応答を解析したところ、JA及びサリチル酸（SA）により強く誘導されることが明らかとなった。これらのことから、イネにおいてJAZ遺伝子が伸長促進に機能すること、またJA及びSA応答に関与することが示唆された。

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植物は、病原菌のような生物的ストレスだけではなく、乾燥・低温などの非生物的ストレスにも常にさらされている。このような様々なストレスに適応するため、植物は独自の自己防御機構を発達させているが、外的なストレスにより全身に誘導される応答シグナルでは植物ホルモンが重要なシグナルとして働くことが知られている。病害応答に働くサリチル酸シグナル、病傷害応答に働くジャスモン酸シグナル、環境ストレス応答に働くアブシジン酸シグナルは相互に拮抗的関係にあり、外からの生物的・非生物的ストレスに対する応答が三つ巴の関係で相互に制御されていることが明らかになってきた。環境ストレスや病害ストレスのような刺激に対して、植物は細胞・組織レベルで各植物ホルモンの濃度を調節し、その結果起こる植物ホルモンのバランスの変動により、様々な生理作用を発揮することが考えられる。今回は、サリチル酸、アブシジン酸、ジャスモン酸処理の葉組織の植物ホルモンシグナルのバランスを遺伝子の発現を指標として明らかにするために、植物ホルモンシグナルのバランスと病傷害抵抗性に関わる植物ホルモン応答性の遺伝子発現との関係について解析した。

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Root-knot nematodes (RKNs) are a major parasite of plants, causing approximately 5% loss of total agriculture world-wide. RKN are sedentary endoparasites that establish a single permanent feeding site within plant roots as a juvenile, and then spend their whole remaining life-cycle at this single site. This is achieved by inducing normal plant cells to change into a new specialised cell-type, a Giant Cell (GC), that functions as a nutrient transfer cell. The pathway for formation of a GC from a normal plant cell remains unclear, mainly due to the difficulties in directly studying the early infection stages hidden within the host root. Using the tomato variety Micro-Tom as a model system, we have initiated a forward genetics approach to identify host genes involved in RKN-induced GC formation and are also studying the early GC cells directly. Lab home page: http://gotolab.cris.hokudai.ac.jp

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マメ科植物は根粒を形成し、根粒菌と共生する。Inverted Repeat Lacking Clade (IRLC)に属するマメ科植物の根粒はindeterminate型であり、根粒中のバクテロイド（共生状態の根粒菌）は培養菌体と比較して形態的・生理的に大きく変化している。このバクテロイドの変化は、宿主植物由来のNodule specific Cysteine Rich（NCR）ペプチド群によって誘導されることが示唆されている。一方、ミヤコグサ、ダイズ等のグループの根粒はdeterminate型であり、バクテロイドは培養菌体と大差なく、NCRペプチドは存在しない。ギンネムはマメ科の中で系統的に初期に分岐した種であり、indeterminate型根粒を形成するが、バクテロイドの特徴については未検討である。本研究では、ギンネムを用い、バクテロイドの観察とNCRペプチド群の存在の有無を確認することによって、根粒の形状とバクテロイドの生理的・形態的特徴、NCRペプチド群との関連性について検討した。ギンネムのバクテロイドにはIRLCマメ科植物のバクテロイドの様な変化は観察されず、NCRペプチド群も検出されなかった。このことから、NCRペプチドによるバクテロイド化の誘導は、IRLCマメ科植物のみが獲得した形質であると予想される。

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動物・植物病原菌の中には、3型分泌系と呼ばれる細胞膜上の複合体により、宿主細胞へタンパク質（エフェクター）を注入するものが知られている。エフェクターは宿主細胞の防御システムを破壊することで病原菌の感染を促進する。一方、宿主の中には、エフェクターを認識して防御応答を起こすものも存在する。マメ科植物と共生する根粒菌の中にも3型分泌系を持つものが見出されているが、エフェクターや宿主側の標的については不明な点が多い。本研究では、ミヤコグサの根粒菌Mesorhizobium loti MAFF303099株の3型分泌系について解析を行った。
3型分泌系関連遺伝子群の発現は，マメ科植物由来のフラボノイドにより制御されており、T3SSがマメ科植物への感染時に働いていることを示唆した。野生株とT3SS遺伝子破壊株の共生能を比較した結果、T3SSの変異により共生能力が低下する宿主植物と、逆に変異株の方がよく共生する宿主の存在することが判明した。共生成立を阻害するエフェクターとして同定されたMlr6361は、内部に40～45アミノ酸残基からなる15回の繰り返し配列を持ち、C末端にシキミ酸キナーゼ様ドメインを持つという特徴を有していた。相同タンパク質が植物病原菌にも存在していることから、Mlr6361は宿主により病原菌由来として認識され、感染抑制シグナルを誘導している可能性がある。

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根粒菌とマメ科植物の共生成立には、根粒菌のリポ多糖(LPS)が重要な要素であることを示す報告は多い。しかし、植物による細菌のLPS認識機構は未解明である。動物では、リポ多糖結合性タンパク質（LBP）が、細菌由来のLPSと複合体を形成し、自然免疫を活性化する。植物のLBPを探索した結果、ミヤコグサゲノム上に、LjLBP1、2、3、4の4種を同定した。本研究では、根粒菌との共生における宿主植物のLBPの機能解明を目指し、ミヤコグサのLBPの発現を定量RT-PCRで解析した。
NH₄Cl 0.5 mMを与えて栽培したミヤコグサを根粒非着生体、根粒菌を接種して栽培したものを根粒着生体とし、葉、茎、根、根粒に分けて発現量を解析した。ただし、LjLBP3と4は、cDNAの相同性が96％と高いため、両遺伝子の発現量の総和（LjLBP3/4）として解析した。各組織のLjLBPの発現量を根粒非着生体と根粒着生体で比較すると、いずれのLjLBPも根粒着生体での発現量が低かった。特にLjLBP3/4の発現量は著しく抑制された。また、根粒菌接種後0h、4h、10h、24hでの初期応答を解析したところ、LjLBP3/4は根粒菌接種後4hで発現量上昇が見られた。このことからLjLBP3/4はLjLBP1及びLjLBP2とは役割が異なる可能性が示唆される。

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共生窒素固定（SNF: Symbiotic Nitrogen Fixation）はマメ科植物などに形成される根粒で行われるが、根粒形成とSNF機構において物質輸送は様々な局面で重要な役割を果たしているものと考えられる。植物の膜輸送系タンパク質のなかでATP binding-cassette(ABC)タンパク質は最大のファミリーを形成し、その輸送能を介して様々な生理機能を担っていることが解明されているが、SNFにおいても重要な役割を果たすABCタンパク質のメンバーがあると予想される。
マメ科のモデル植物ミヤコグサについて組織別発現をリアルタイムPCR法で解析したところ、根粒菌が感染した時に根で発現が顕著に上昇するABCタンパク質としてフルサイズABCGファミリーのメンバーが多いことが判明した。特にこれらのうちchr3.CM0026.74は、河内らによるcDNAアレイ解析（Kouchi et al., DNA Research 11: 263-274, 2004）で根粒感染初期に発現が誘導されることが示されていることから、根粒形成初期において発現が著しく上昇し、根粒形成に深く関与しているとことが示唆されたため、ミヤコグサABC タンパク質LjABCG1に注目しこの遺伝子をLjABCG1と名づけ、その発現および機能解析を行った。

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植物の8割はアーバスキュラー菌根(AM)菌と共生する。AM菌が皮層細胞内に侵入すると菌糸が分枝してアーバスキュールを形成する。そこで菌糸は植物由来のペリアーバスキュール膜（PAM）で包まれ、例えば土壌から運ばれたリン酸はPAM局在のリン酸トランスポーター（PT）により植物に取り込まれる。我々はAM菌を介した窒素養分の吸収機構を調べるために、ダイズのゲノムから16分子のアンモニウムトランスポーター（AMT）遺伝子を見いだし、さらに菌根誘導型GmAMT4.1を特定した。GmAMT4.1プロモーターGUSの発現はアーバスキュールを含む細胞にのみ見られた。またGmAMT4.1-GFPはPAMに局在し、PAM以外の菌糸を包む膜や細胞膜には蓄積しなかった。この局在様式は菌根特異的PTと酷似しており、菌根におけるアンモニウムの取り込みもリン酸と同じくPAMで行われることが示唆された。また種々のAMTsのアミノ酸配列から進化系統樹を作製すると、GmAMT4.1はAMTのクレード4に属し、AM菌と共生しないアブラナ科植物にはこのクレードは見当たらなかった。したがってクレード4のAMTsはAM菌からのアンモニウムの取り込みに重要な働きを持つ可能性がある。ポプラでは14分子中5分子、ダイズでも16分子中6分子がクレード4であった。AMTsの分子進化と菌根共生の関わりについても議論したい。

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