緑藻クラミドモナスは，周囲の無機炭素 (Inorganic carbon: Ci) 濃度が低い条件 (LC条件) に順化して、能動的に細胞内にCO₂を取り込むよう光合成特性を変化させる。これはCO₂濃縮機構 (Carbon-Concentrating Mechanism: CCM) の誘導による。CCMに関与する細胞表層炭酸脱水酵素の遺伝子Cah1の発現は光照射・LC条件下でCCM1並びにMYB転写因子LCR1を介して誘導される。また、ミトコンドリア炭酸脱水酵素の遺伝子Cah4も光照射・LC条件下で誘導される。両者の遺伝子は高CO₂濃度条件 (HC条件)で抑制を受けるが、その抑制機構に関わる調節因子は未同定である。Cah4の発現制御に関わる新奇調節因子の同定を目的とし、Cah4の5’上流領域約2kBにルシフェラーゼ遺伝子 (LucNC)を連結し、野生株に導入したところ、LC条件においてHC条件の35倍のLuc活性を誘導する株を得た。この株を宿主として，ハイグロマイシン耐性遺伝子 (APHVII)のタグを導入した形質転換株の作出、LC条件でルシフェラーゼ活性が低下した株、もしくはHC条件でルシフェラーゼ活性が上昇した株の単離について報告する。

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シアノバクテリアSynechococcus elongatus PCC 7942のプロモーター強度測定用のプラスミドベクターを作成し、各種DNA配列をクローン化して定量化を行うことを目的とした。レポーター遺伝子としてホタル(Photinus pyralis)のルシフェラーゼ(luc)遺伝子をpSP-luc+NF（プロメガ社）よりSD配列をもつluc遺伝子断片として取り出し、シャトルベクターpUC303のSacI-XhoI部位間にリンカーを介して連結し、プロモーター検索用ベクターpLUC1を作成した。pLUC1のluc遺伝子上流にあるSrfI部位に各種平滑化DNAを連結して大腸菌MOSblueおよびS. elongatus PCC 7942 R2-SPc由来のストレプトマシン耐性(rps12-R43) GRPS1株を形質転換した。
PCC 7942株のpsbAIプロモーター(193bp,97bp, 55bp)および大腸菌lacZプロモーター(107bp)を連結したpLUC1-psbAI-193, -97, -55とpLUC1-lacZ-107を作成した。組換えプラスミドを保持するS. elongatus GRPS1株のルシフェラーゼ比活性の測定より、正または負の調節因子と相互作用するpsbAIプロモーター領域が推定された。

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A polyubiquitin gene (McUBI1) promoter region including its 5' UTR together with its first intron was isolated from the genomic DNA of M. crystallinum using a primer walking protocol. A 726 bp intron was found immediately 5' to the translation initiation codon in the second exon. To establish this McUBI1 promoter as a native and constitutive promoter, we have improved a transient expression assay based on particle bombardment and the dual-luciferase reporter technique, which should facilitate investigations into the regulation of McUBI1 gene in vivo. An intronless 2.58 kb promoter fragment was fused with the firefly luciferase and Renilla luciferase reporter gene. These chimeric gene constructs were introduced into leaves of M. crystallinum by particle bombardment for transient assay. We observed high expression level from the intronless promoter in M. crystallinum which is more stable than that from CaMV35S promoter. We will investigate the effect of existence of intron on expression level in M. crystallinum.

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カロテノイド酸化開裂酵素遺伝子CmCCD4aはキク舌状花弁特異的発現を示し、管状花・葉・茎・根では発現が見られない。更にCmCCD4aは、舌状花弁に蓄積するカロテノイドの分解に関わっており、花色を白く保つ機能があることが示されている(Ohmiya et al. 2006)。舌状花弁特異的発現は転写レベルで認められるため、CmCCD4aプロモーターの単離・解析によって花弁特異的プロモーターを開発できると考えた。
キクゲノムからTAIL-PCR法によって全長約3 kbのCmCCD4a上流域を単離した。一過的発現系を用いた欠失解析の結果、開始コドン上流域1.2 kbがあればレポーター遺伝子GUSの舌状花弁特異的発現を再現できた。またプロモーター1.2 kb内に、器官特異的発現に関与する2箇所のcis領域: cis1, cis2を見出した。これらcis領域とCmCCD4aプロモーター1.2 kbを組み合わせる事で、プロモーター活性と舌状花弁特異性を更に高めることが出来た。今後は改変CmCCD4aプロモーター:: GUSコンストラクトを導入したキク形質転換体を作製し、花弁特異的発現を再現できるか調査する予定である。

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スクアレン合成酵素はステロール生合成系における最初の親油性前駆体を合成する酵素である（Suzuki et al 2002, Akamine et al 2003, Lee et al 2004, Uchida et al 2009）。群体性微細藻Botryococcus brauniiでは、二次代謝産物であるメチルスクアレンおよびその誘導体が、体外の細胞外マトリクスに放出、蓄積される。これまでにこの生物のスクアレン合成酵素遺伝子のcDNAクローニング・機能解析がなされ（Okada et al. 2000）、スクアレン合成酵素活性は細胞植え継ぎ直後に顕著に上昇し、微弱な活性がその他の時期に恒常的に検出されることが報告された。本研究では、Botryococcus brauniiのスクアレン合成酵素の転写の様態を解析するために、同遺伝子のゲノミッククローンの単離を試みた。その結果、0.55 kbのクローンと1.4 kbクローンを単離した。これらの塩基配列を解析した結果、第52番残基の第2番塩基の直後と第232番残基の第3番塩基の直後にそれぞれ223bp, 756bpの介在配列を確認した。現在、同遺伝子の他領域をカバーするクローンのPCR増幅と5’上流域のRESDA-PCRを行うとともに、誘導性発現・恒常的発現を行うと推測される他遺伝子のcDNAクローニングも行っている。

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クラミドモナスは生長速度が速く体細胞の核相が1nであり、遺伝子の表現系解析が容易な緑藻のモデル生物である。我々はスペクチノマイシン耐性遺伝子（aadA）をトランス遺伝子として持つクラミドモナス19-P(1030) 株にaadA inverted repeat DNAコンストラクトを導入してRNAiを誘起し、トランス遺伝子aadAがノックダウンされ、スペクチノマイシン耐性が低下した株（RNAi-37）を単離した。RNAi変異体を得るため、この株の核ゲノムにtag DNAとしてパロモマイシン耐性遺伝子（aphVIII）を導入し、RNAi反応が低下した株（92-12C-E）を得た。92-12C-E株はtagの導入に伴いゲノム領域の一部を欠損しており、その欠損領域には、機能未知のタンパク質、thioesterase様タンパク、PWI・Zn-fingerモチーフ配列を持つタンパクをコードする3つのORFの存在が予測されている。現在、欠損領域全域をカバーするBACクローンから各ORFとその上流域を少なくとも1.0 kb含むDNA断片をサブクローン化し、これら3つのBACサブクローンと、欠損領域全域を含むBACクローンを用いたコンプリメンテーション実験を進めている。

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RNA-induced silencing complex (RISC) はRNAサイレンシングによる遺伝子の転写後発現抑制やウイルスRNAの分解等において中心的な役割を果たすリボヌクレオタンパク質複合体である。RISCはコア因子としてARGONAUTEファミリーに属するタンパク質(AGO)と一本鎖の低分子量RNAを含むことが知られているが、これまで植物では無細胞RISC形成系が確立されておらず、その形成過程を生化学的に解析することができなかった。本研究で我々はタバコ脱液胞化プロトプラスト抽出液(BYL)を用いてAGO1と22ヌクレオチドの合成二本鎖siRNAからRISCを形成させる実験系を確立した。BYLにおけるRISC形成において、二本鎖siRNAはAGO1にATP、Mg²⁺、さらに分子シャペロンHSP90依存的に取り込まれ、続いて二本鎖siRNAのパッセンジャー鎖はAGO1のRNase活性依存的に取り除かれた。形成されたRISCはガイド鎖のsiRNAと相補的な配列を含む標的 RNAと結合しそれを切断した。

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ヒメツリガネゴケは相同組換えによる遺伝子ターゲティングが可能なので、逆遺伝学の優れたモデル植物として活用されている。しかし、遺伝子重複が種子植物より多いことから、二重または三重の遺伝子破壊を行わないと野生株と異なる表現型が出ない例が多く報告されている。この問題点を克服するため、我々は人工マイクロRNA（amiRNA）により遺伝子ファミリーを同時に発現抑制できる系の開発を試みた。いくつかのマイクロRNAは進化的に保存され、シロイヌナズナのmiR319aはヒメツリガネゴケにも存在する。シロイヌナズナではmiR319aを改変することで効果的に遺伝子発現を抑制することが報告されている（Schwabら2006年）。本研究では先ず、ある核移行タンパク質にGFPを融合させたキメラ遺伝子をヒメツリガネゴケに導入し、安定GFP発現形質転換株を作製した。次にGFPの発現抑制を目的としたamiRNAを設計し、アクチンまたはCaMV35Sプロモーターに連結したプラスミドを作製した。これらのプラスミドをパーティクルボンバードメント法でGFP発現株に導入してGFP発現が一過的に抑制されるかどうかを調べた。さらに、ヒメツリガネゴケゲノムのニュートラルサイトにamiRNAを導入した安定形質転換体を作製し同様の観察を行ったのでこれらの結果も合わせて報告する。

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NMD (Nonsense-mediated mRNA Decay)は、タンパク質コード領域にナンセンスコドン (PTC; Premature Termination Codon) を生じた異常mRNAの分解や、種々の特徴を持つ正常mRNAの翻訳とリンクした転写後制御に関わる真核生物に保存されたmRNA監視機構である。シロイヌナズナのNMD主要因子のAtUPF1 やAtUPF2 の欠損は致死となり、AtUPF1のlba1ミスセンス変異株は糖応答性遺伝子発現、成長、花成、発芽などに多面的な表現型を示す。野生型株に比べてlba1とatupf3-1の両方で量が増加した推定NMD標的mRNAには、選択スプライシングで生じるPTC⁺-RNA や5’-UTR 中の短いuORFを含むmRNAが濃縮された。このうち、基本転写因子TFIIIA遺伝子の選択スプライシングで生じるPTC⁺-RNAとbHLH型転写因子SAC51のuORFを含むmRNAは、翻訳に依存した分解を受け、その分解速度は野生型株に比べてNMD 変異株で低下したことからNMDの直接の標的と考えられた。lba1やatupf3-1は野生型株と比べて長軸方向に長く重い種子をつけ、それはNMD変異株では雌しべ形成過程で隔壁に形成される胚珠原基の間隔が野生型株よりも長いためであった。胚珠原基発生間隔制御に関わるNMD標的遺伝子を探索している。

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トランスポゾンの転移はしばしば有害な変異を誘発するため、多くの真核生物はRNAサイレンシングの機構により大部分のトランスポゾンを不活性な状態で維持している。しかしながら、トランスポゾンは多くの生物でゲノムの主要な構成因子である。このことはトランスポゾンのサイレンシングを抑制あるいは回避する機構が存在することを意味する。
本発表ではイネのCACTA DNAトランスポゾンから産生されDNAメチル基転移酵素遺伝子OsDRM1aを標的とするmicroRNA(miRNA)であるmiR820ファミリーの機能解析について報告する。まずmiR820がOsDRM1aの発現量を調節していることを明らかにするために、miRNAが不安定化する変異体を用い、miR820とOsDRM1aの発現量を調べた。その結果この変異体ではmiR820の発現量が低下しOsDRM1aの発現量が上昇した。このことから、miR820はOsDRM1aの発現を負に制御していると考えられた。次にOsDRM1aの発現をRNAi法により抑制した。その結果いくつかのトランスポゾン内の遺伝子発現が増加していた。以上の結果から、miR820はOsDRM1aの負の発現制御を介してトランスポゾンのサイレンシングを抑制すると考えられる。

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シロイヌナズナのacl5変異株は，花茎の伸長に特異的な欠損を示し，その原因遺伝子はサーモスペルミン合成酵素をコードする。サーモスペルミンはポリアミンと呼ばれる塩基性低分子化合物の一種で，スペルミンの構造異性体である。この変異表現型を抑圧するサプレッサー変異株sac51-dの原因遺伝子は転写因子をコードし，そのmRNAには5つのuORFがある。sac51-dでは第4uORFに変異が生じた結果，転写因子が過剰翻訳されて茎の伸長回復がもたらされたと考えられている。SAC51のプロモーターと各uORFを破壊した5’リーダー配列にGUSをつないだ融合遺伝子を導入した形質転換植物を作成し，GUS活性を測定すると，第4uORFを破壊した場合のみ発現(mRNAの蓄積)とGUS活性の増加が認められた。各植物にサーモスペルミンを加えると，いずれもGUS活性は増加したが，その効果は第4uORFがない場合には小さかった。一方，5’リーダー配列を含まないSAC51プロモーターGUS融合遺伝子には，外的なサーモスペルミンに対する応答性は認められなかった。従ってサーモスペルミンはSAC51遺伝子に対して，第4uORFを介した翻訳抑制を解除する作用とmRNAを安定化する作用を持つことが示唆される。サーモスペルミンが存在する組織のみで翻訳が促進される，ユニークな遺伝子発現調節機構と思われる。

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メチオニンとトリプトファンを除く全てのアミノ酸には2～6種のコドンが対応しており、同義コドンの使用頻度は生物種によって異なっている。一般的にコドン使用頻度は対応するtRNA量や翻訳効率を反映していると単純に考えられてきた。我々は、タバコ葉緑体in vitro翻訳系を用いて葉緑体における同義コドンの翻訳効率を測定し、使用頻度との比較解析を行った。その結果、葉緑体ではコドン使用頻度と翻訳効率が必ずしも一致しないことを明らかにした。この知見は、葉緑体mRNAでは翻訳効率の低いコドンが積極的に利用されていることを示している。そこで、タバコ葉緑体の個々のmRNAにおけるコドン使用頻度を詳細に解析し、翻訳効率の低いコドンが多く含まるmRNAを数種類発見した。本研究では、これら翻訳効率の低いコドンがタバコ葉緑体mRNAの翻訳効率にどの程度の影響を与えているかについて、rps16 mRNAをモデルに解析を行った。

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COP9シグナロソーム (CSN)は核内で情報伝達を制御するタンパク質複合体である。CSN1サブユニットのN末端領域 (CSN1N)は、動物で転写抑制能を示し、植物では生存に不可欠である。CSN1Nが担う分子機構を解明するためにCSN1Nと相互作用する因子群を、シロイヌナズナのcDNAライブラリを用いたYeast Two-Hybrid法によって単離した。その結果、植物固有の転写因子と推定される機能未知のタンパク質を得た。
このタンパク質には、既知のドメイン構造はなく、よく保存されたアミノ酸配列が存在していた。アミノ酸配列の二次構造に着目すると、この保存された領域は3つのヘリックスを形成することが予測され、このタンパク質がシロイヌナズナにおいてTrihelix protein ファミリーのメンバーであることが明らかとなった。このファミリーには転写因子として同定されているタンパク質が存在するが、多くのタンパク質は未だ解析されていない。
シロイヌナズナより単離したこのタンパク質を用いて、in vitro でCSN1Nとpull-downを行なったところ、このタンパク質はCSN1Nと特異的に結合した。今回、このタンパク質をコードする遺伝子の発現プロファイルおよび、機能欠失変異体の同定とその表現型を報告し、タンパク質のそのものの機能とCSN1の相互作用が担う役割について議論する。

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26Sプロテアソームは数十のサブユニットからなる巨大なプロテアーゼであり、生体内の不要となったタンパク質を能動的に分解することによって、様々な生命現象の制御に機能している。26Sプロテアソームを構成する数十のサブユニットタンパク質は、単なる複合体の構造要素として機能するだけでなく、個別の機能をあわせもっている。26Sプロテアソームを構成するサブユニットは、ATPase活性をもつRPTタンパク質群と、ATPase活性を持たないRPNタンパク質群からなる。
本研究では、シロイヌナズナ26SプロテアソームのRPTタンパク質群に着目し、解析を行っている。シロイヌナズナRPTタンパク質群はRPT1から6まで存在し、RPT3以外は重複がみられる。当研究室ではこれまでに、AtRPT2a欠損変異体およびAtRPT5a欠損変異体が、エンドリデュプリケーションの過剰促進による器官の巨大化を示すことを報告した。（Plant J. 60: 68, 2009）
本研究では、RPT2aのさらなる機能を解明するために、その相互作用因子の単離を試みた。エピトープタグをつけたAtRPT2aを用いて、免疫沈降およびMS解析を行った結果、複数の候補因子を同定した。現在これら因子のうち、19Sと相互作用していると考えられる4つについて機能解析を行っている。

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シロイヌナズナBOR1は低ホウ酸条件で重要なホウ酸トランスポーターであり、導管への効率的なホウ酸の濃縮を担う。BOR1のmRNA蓄積はホウ酸条件に関わらずに一定に蓄積する一方、BOR1タンパク質は高ホウ酸条件で分解されることが示されている。本研究では、ホウ酸栄養に応答した新たな発現制御機構として、BOR1の5´UTRを介した翻訳制御の可能性を見いだしたので報告する。
BOR1遺伝子の開始コドン上流3kbをプロモーターとしてレポーター遺伝子（GUS）を発現する形質転換シロイヌナズナを作出し、低ホウ酸濃度(0.3 μM)と高ホウ酸濃度(3 mM)で処理した。根におけるレポーター遺伝子のmRNA蓄積量とGUS活性を定量したところ、mRNA蓄積量あたりのレポーター活性の値(レポーター活性／mRNA蓄積量)が、高ホウ酸濃度条件では低ホウ酸濃度条件の40％程度に低下していた。5´UTRを除いたコンストラクトでは、mRNA蓄積量あたりのレポーター活性にホウ酸濃度条件間で有意な違いは認められなかった。また、低ホウ酸濃度下のmRNA蓄積量あたりのレポーター活性の値は5´UTRの有無によって影響を受けなかった。以上の結果より、BOR1は5´UTRを介して高ホウ酸濃度条件下で翻訳の抑制を受けることが示唆された。この現象は、ホウ酸濃度に依存した転写後の発現制御を担う新たな機構と考察される。

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グルコシノレート類は植物の防御機能において抗食害虫物質として機能するアブラナ科特異的な二次代謝産物である．グルコシノレートはその生合成前駆体となるアミノ酸の種類によりトリプトファン由来のインドールグルコシノレートとメチオニン由来のアリファティックグルコシノレートに大別される．これまでに，グルコシノレート生合成に関与するMYB様転写調節因子が特定され機能解析が進められてきている．MYB38/ATR1，MYB51，およびMYB122はインドールグルコシノレート生合成に関与し，MYB28，MYB29，およびMYB76はアリファティックグルコシノレート生合成を制御する．これらの転写調節因子は細胞傷害，病原体感染，昆虫食害等に対するストレス応答として発現調節され，それぞれが協調的・拮抗的に機能することが示唆されている．
本研究では病原体感染時におけるグルコシノレート生合成制御MYB転写調節因子間の相互作用に関わる新規転写調節因子を同定した．当該転写調節因子は病原体感染により顕著に発現誘導され，そのT-DNA挿入変異系統ではグルコシノレート生合成に関わるMYB転写調節因子の発現低下が見られた．今回，グルコシノレート類の蓄積プロファイルと遺伝子発現プロファイルから病原体感染時のグルコシノレート生合成と本転写調節因子の関係を議論する．

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シロイヌナズナの主要なファイトアレキシンであるカマレキシンの生合成は細菌や菌類などの病原体感染，あるいは硝酸銀処理やUV-B照射などの非生物的な刺激よって誘導される．カマレキシン生合成に関与する代謝酵素の遺伝子発現は病原体感染や硝酸銀処理によって顕著に誘導されるが，カマレキシン生合成の全反応経路は未解明であり，その制御機構も多くが不明である．
本研究では，カマレキシン生合成を制御する新規の転写調節因子を同定し，その転写調節因子により制御される新規のカマレキシン生合成経路遺伝子を特定することによって，カマレキシン産生機構を解明することを目的とした．
網羅的遺伝子解析によりカマレキシン生合成誘導時に顕著に発現誘導される21種の転写調節因子遺伝子を明らかにした．それらの遺伝子のT-DNA挿入変異系統を対象とし，カマレキシン生合成欠損株のスクリーニングを実施した．カマレキシン生合成欠損を示した変異体のT-DNA挿入遺伝子は，野生株において病原体感染や硝酸銀等により顕著に発現誘導された．またGUSレポーターアッセイの結果，病原体感染部位での転写調節因子遺伝子の組織特異的遺伝子発現が明らかとなった．
本発表では転写調節因子遺伝子のホルモン応答性や，転写調節因子が制御する病害応答性遺伝子についても報告する．

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シロイヌナズナにおいて、アントシアニン及びフラボノール生合成はMYB75/PAP1及びMYB12によって制御されている。フラボノイド生合成機構を理解する上で、これらの過剰発現体（pap1-D及びMYB12OX）は生合成遺伝子及び代謝物の解明を可能とした。そこで二つのMYB遺伝子同時過剰発現体（WOX1-1, 2）(1)を作出し、フラボノイド過剰蓄積に関する植物体内の生理現象の誘導を試みた。Col-0、MYB12OX、pap1-D、WOX1-1, 2の5系統についてメタボローム及びトランスクリプトームの統合解析を行った結果、WOX1-1, 2においてMYB12OXのフラボノール量とpap1-Dのアントシアニン量の加算的な過剰蓄積がなされていた。一方、遺伝子発現においてはWOX1特異的に発現誘導を受けているストレス応答関連遺伝子が認められた。ストレス実験（NaCl及びmethyl viologen）を行った結果、pap1-D及びWOX1-1, 2が両ストレスに耐性を示した。本結果はストレス応答研究におけるストレス応答段階のフラボノイド蓄積、抗酸化化合物過剰蓄積に起因するフィードフォワードな二次的な影響を分類する上で、有効な結果であると考えられる。

(1) Nakabayashi R, et al., (2009) Phytochemistry, 70: 1017-1029

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植物は多様な二次代謝産物を生産するが、アルカロイドは特有の植物種に限定されており、その発現制御機構もほとんど解明されていない。我々はアルカロイドのうち最も多様なイソキノリンアルカロイドの生合成制御機構を、キンポウゲ科のオウレン（Coptis japonica）のベルベリン生合成系をモデルとして解析してきた（Kato et al. , 2007）。今回オウレンプロトプラストを用いた一過的RNAi系において、生合成酵素遺伝子の発現を包括的に抑制する因子として単離したCjbHLH1について報告する。CjbHLH1は、RNAiによる発現抑制のみならず、一過的過剰発現においても生合成酵素遺伝子の発現を抑制しており、他の因子の関与が考えられるものであった。
CjbHLH1の詳細な機能解析のためにデータベースを検索した結果、CjbHLH1がイソキノリンアルカロイド生合成系に特徴的なbHLH転写因子であることが明らかとなった。さらにGFPとの融合タンパク質を用いた解析によりCjbHLH1の核局在性が確認された。また、CjbHLH1（同融合）遺伝子ならびに生合成酵素遺伝子プロモーターにルシフェラーゼ遺伝子を融合させたレポーター遺伝子を用いた一過的レポーターアッセイにより、CjbHLH1が生合成酵素遺伝子の転写を正に制御することが明らかとなった。現在、CjbHLH1の相互作用因子の探索を行っている。

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植物における代謝経路の改変によりゴムや医薬品原料などの有用物質をより効率的に生産できる可能性がある。近年、同一の代謝経路において機能する複数の代謝酵素遺伝子の発現を協調的に制御する転写因子の存在が明らかにされてきた。このような転写因子の機能を操作し複数の酵素遺伝子の発現を同時に制御することにより、単一の代謝酵素を操作するよりも効率的な代謝経路の改変が可能になると期待される。我々は転写因子を利用して二次代謝経路を人為的に操作することにより、有用物質を大量に生産する植物を作出することを目的とし、独自に開発した遺伝子サイレンシング法であるChimeric Repressor Silencing Technology（CRES-T)を用いて主要な二次代謝に関わる転写因子の同定を進めている。代謝経路の律速段階や、分岐点で機能する代謝酵素の精密な制御により多様な二次代謝産物の合成量が調節されていると考えられることから、これらの酵素遺伝子と発現パターンに相関がみられる転写因子をリストアップし、それらのCRES-T植物における二次代謝産物をメタボローム解析により調べた。これまでに二次代謝産物のパターンに変化の見られた転写因子を複数同定したので報告する。

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イポメア属植物のルコウソウ (Ipomoea quamoclit) は、アントシアニン濃度の違いによる、赤、桃、白色の3種類の花を咲かせる。本研究では、ルコウソウの花弁におけるアントシアニン濃度に違いがもたらされる機構を分子レベルで明らかにすることを目的とした。白花のルコウソウでは、アントシアニンが蓄積していなかったが、加水分解を行うことにより、アントシアニンの1種であるペラルゴニジンが検出されるようになることから、その前駆物質であるロイコペラルゴニジンまでは合成されていることがわかった。そこで、ペラルゴニジン合成に関与する酵素遺伝子である、フラボノイド3-水酸化酵素 (F3H)、ジヒドロフラボノール4-還元酵素 (DFR)、アントシアニジン合成酵素 (ANS) の発現解析を行った結果、ロイコペラルゴニジンより下流に位置するANSの発現が欠損していることがわかった。また、ルコウソウの近縁種のキバナルコウソウ（黄花）と、ルコウソウ（白花）の交配を行った結果、得られたF1植物はすべて赤色を呈し、ペラルゴニジンを蓄積していた。発現解析の結果、キバナルコウソウではDFRの発現が欠損していることがわかった。以上の結果から、F1植物は、ANSとDFRの発現が相補されることにより、ペラルゴニジンが合成されるようになったと考えられる。

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花色は花きの商品価値を決定する重要な要素の一つであるが、中でも、近年緑色の花きの需要が増えつつある。しかし、緑色の花弁の色素組成及び、その発色機構に関する知見は殆ど無い。我々はさまざまな植物の緑色花弁から色素を抽出し、HPLCによって解析した。その結果、トルコギキョウ(Eustoma grandiflorum)などの緑色花弁では、クロロフィルの他にフェオフィチンaを含むことがわかった。フェオフィチンaは、クロロフィルaのポルフィリン環からマグネシウムが脱離して生成される。また近年、クロロフィルの分解系において、フェオフィチンaからフィトール側鎖を加水分解する酵素、Pheophytinase (PPH)の遺伝子が同定された。PPHの発現が抑制された変異体の葉では、フェオフィチンaが蓄積すると共に、クロロフィルの分解も抑制され、stay-green phenotypeを示すと報告されている(Schelbet et al.,2009, Morita et al.,2009)。これらの知見から、花色が緑色を呈する機構に、PPHが関与しているのではないかと推察される。本研究では、トルコギキョウを材料として、PPH遺伝子を単離し、白色花弁と緑色花弁で発現を比較したので、その結果も報告したい。

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カフェインやテオブロミンは、チャ（Camellia sinensis）をはじめとするツバキ科ツバキ属チャ亜属の植物に存在するプリンアルカロイドである。プリンアルカロイドの合成は、合成系の最終段階に働くN-メチルトランスフェラーゼによって制御されている。カフェインシンターゼは、プリン環のN-3位とN-1位のメチル化を行い、7-メチルキサンチンからカフェインまでの合成に関与する。また、テオブロミンを蓄積する種では、カフェインシンターゼではなく7-メチルキサンチンのN-3位のメチル化を特異的に触媒するテオブロミンシンターゼが存在する。これまでに我々は、カフェイン合成能のないツバキ属植物にもテオブロミンシンターゼ遺伝子が普遍的に存在し、その転写産物が存在することを報告している。
本研究では、対象をツバキ属植物からツバキ科植物に広げ、12種の植物からカフェインシンターゼ相同遺伝子の単離を試みた。相同遺伝子がコードするタンパク質がチャのカフェインシンターゼと約70％の相同性を示した3種類の遺伝子の組換え型酵素を作製したが、テオブロミンシンターゼ活性を検出することはできなかった。得られた相同遺伝子の構造と機能を解析し、ツバキ科植物におけるこれらの遺伝子の分子進化について考察した。

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植物中で合成されるフロフラン型リグナンには，ヒトの健康維持に有効な生理作用を持つものがあり，健康食品として需要がある．当グループでは，リグナン代謝経路改変植物によるフロフラン型リグナンの効率的な生産を目指している．本研究では，フロフラン型リグナンを蓄積するように代謝経路を改変したシロイヌナズナ中のリグナンプロファイリングを行うことで，その代謝改変がシロイヌナズナのリグナン代謝経路に及ぼす影響を明らかにし，フロフラン型リグナンの効率的な生産に繋がる知見を得ることを目的とした．ゴマ由来フロフラン型リグナン代謝酵素である CYP81Q1 を導入した代謝改変株において野生株では検出されなかったフロフラン型リグナンが検出され，さらに，その量はピノレジノール／ラリシレジノール還元酵素 PLR のノックダウンによって増加した．以上の結果から，シロイヌナズナのリグナン代謝の改変により目的とするフロフラン型リグナンを蓄積させることが可能であることが明らかになった．

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我々はリグナンの効率的な高生産系の確立を目指し、基質リグナンとなるピノレジノールを多量に含有するレンギョウ葉の培養細胞を活用したリグナン生産を検討した。チョウセンレンギョウの葉から樹立した培養細胞では、ピノレジノールとマタイレジノールの配糖体が主なリグナン成分であった。更にピノレジノール量を増大させるため、ピノレジノールを代謝する酵素の一種、PLRの発現をRNA干渉法(RNAi)で抑制したところ、マタイレジノール配糖体を完全に消失させ、また、野生型培養細胞と比較して約20倍以上のピノレジノール配糖体を蓄積することができた。さらに、PLR-RNAi、および、ゴマでピノレジノールからフロフラン型リグナンを生合成する酵素、CYP81Q1を導入した組換えレンギョウ葉培養細胞では、ピノレジノール配糖体が高蓄積されるとともに、ゴマ由来のフロフラン型リグナンの生成を検出できた。以上の結果から、レンギョウ葉培養細胞は人工的にリグナンを生産させるための有用なツールであることが示された。また、本研究成果は、組換え培養細胞により異種植物由来リグナンの生産に成功した初めての例である。

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プレニルフラボノイド等のプレニル化芳香族化合物は、抗腫瘍活性、抗菌活性、抗NO産生、エストロゲン様活性等、多彩な生理活性を有するが、植物内での含有量が低く単離が困難、または希少植物種を起源とすることなどから安定供給系が確立されていなかった。
本研究では、フラボノイド基質をインビボで供給できるトマトをホスト植物として、放線菌(Streptomyces coelicolor A3(2))由来のSCO7190 (HypSc)、マメ科植物クララ(Sophora flavescens)由来のnaringenin 8-dimethylallyltransferase (SfN8DT-1) の2つのプレニル基転移酵素遺伝子を用いた代謝工学により、多彩な生理活性を有するプレニルフラボノイドを生合成・蓄積する植物の作出を試みた。果実特異的なE8プロモーター制御下で発現させたSCO7190 (HypSc)、SfN8DT-1形質転換体では、それぞれ3’位、8位にジメチルアリル基が導入されたナリンゲニンの生成が確認された。その一方で、シロイヌナズナをホストとした場合、SfN8DT-1を過剰発現させると、8-ジメチルアリルケンフェロールが蓄積するという報告から、生成する代謝物はホスト植物の違いに大きく影響されることが示唆された。

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セスキテルペンラクトン (STL) はキク科植物に主に見られる二次代謝産物である。多くのSTLが持つ生理学的、薬理学的な重要性にも関わらず、それらの生合成に関する分子レベルでの研究はほとんど進んでいない。そこで我々はSTL研究の第一歩として、最も単純な構造を持つSTLの一種であり、多様なSTLの前駆体であると考えられているcostunolideの生合成解明に取り組む事とした。
Costunolideはセスキテルペノイドの共通前駆体であるファルネシル二リン酸（FPP）からgermacrene Aとgermacrene A acid (GAA) を経由して生合成される。これまでに、FPPからgermacrene Aへの反応を行うテルペン合成酵素遺伝子が単離されており、最近当研究室から単離されたgermacrene A oxidaseはgermacrene A からGAAへの3段階の酸化反応を行う事が明らかとなった。最終段階であるGAAからcostunolideへの反応はP450が行う事が報告されている為、その遺伝子単離を現在目指している。具体的には、ヒマワリのトライコームESTライブラリーやレタスの豊富なEST情報を利用している。また、目的P450の基質となるGAAは入手が困難であるが、FPP高生産改変酵母中でGAA生合成酵素遺伝子群を発現させる事により、その調製に成功した。

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植物は多様な二次代謝産物を生産し、外敵から自らを守る自己防御システムとして用いている。タバコ属植物においては、主要アルカロイドのニコチンが昆虫への防御物質としての役割を果たす。ニコチンの生合成は虫害等によりジャスモン酸シグナル経路を介し、根で特異的に誘導された後、導管輸送により緑葉へ転流・蓄積することが知られている。しかし、その転流機構はこれまでほとんど明らかになっていない。演者らは近年、タバコ培養細胞BY-2において、ジャスモン酸処理によりニコチン生合成遺伝子と同様に発現誘導される4種類のトランスポーターcDNA (Nt-JAT1, Nt-C215, Nt-T449, Nt-T408) に着目し解析を進めている。本発表では、Nt-T408の解析結果について報告する。Nt-T408をクローニングしたところ、全長約2 kb、507アミノ酸をコードし、12回膜貫通型のNCS1（Nucleobase cation symporter-1）ファミリーに属することが判明した。本遺伝子は植物体の根、茎、葉の各組織で発現しており、またタンパク質は液胞膜に局在した。機能解析を目的として、Nt-T408発現酵母にニコチンを投与したところ、コントロール酵母に比べ細胞内ニコチン含量が有意に少なかった。現在、植物体での生理的役割を明らかとするため、形質転換体の作成を行っている。

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ホウ素は植物の必須栄養素であるとともに、過剰条件では毒ともなる元素であり、その土壌からの吸収と植物体内での移行は厳密に制御されている。シロイヌナズナNIP5;1は細胞へのホウ素の吸収を促進するホウ酸チャネルであり，低ホウ素条件時にホウ素の根への吸収を担う。一方，BOR1はホウ素の細胞外への排出を促進するホウ酸トランスポーターであり，低ホウ素条件時にホウ素の導管への輸送を担う。それら生理学的役割に対応するように、NIP5;1は根の表皮細胞において遠心側（土壌側）の細胞膜に、BOR1は表皮や内皮細胞において求基側（中心柱側）の細胞膜に極性を持って局在する。またBOR1は、高濃度のホウ素に応答しエンドソームへ移行し液胞において分解される。今回我々は両輸送体の特に極性局在のメカニズムを探るため、GFP-NIP5;1とBOR1-GFPのFRAP法による細胞膜内拡散速度の計測を行った。表皮細胞において、細胞膜に無極性に局在するマーカータンパク質であるLti6a-GFPと比較し、GFP-NIP5;1とBOR1-GFPは膜内拡散速度が1／10程度に遅いことが示唆された。また、全反射顕微鏡を用いてGFP-NIP5;1とBOR1-GFPの細胞膜とその近傍領域における局在解析を行っている。それらの結果をふまえ、NIP5;1とBOR1の極性局在メカニズムについて議論したい。

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真核生物ゲノムには、大腸菌グリセロール-3-リン酸輸送体(G3PP)のホモログが広く保存されている。大腸菌のG3PPは、内膜上でグリセロール-3-リン酸(G3P)と無機リン酸の対向輸送を行うものである。シロイヌナズナゲノムにはG3PPホモログ遺伝子が5つ(AtG3PP1 ～AtG3PP5 )存在しており、マイクロアレイデータベースGENEVESTIGATORによると、AtG3PP とAtG3PP4 の発現が塩ストレス、浸透圧ストレス、低温ストレスで顕著に上昇する。我々は、T-DNA挿入変異株g3pp4 は、塩ストレス条件下で発芽率が低下したり発芽時期が遅れたりすることから、AtG3PP4 がストレス耐性に関わっている可能性があると考えている(佐久間ら、日本植物生理学会2008年大会)。
本研究ではg3pp4 変異株についてさらに詳しい解析を行った。その結果、g3pp4 変異株は300 mMマンニトールによる浸透圧ストレスでも、発芽率の低下や発芽時期の遅れが観察された。さらにg3pp4 変異株の種子は野生株に比べ重量が約21%減少しており、貯蔵脂質量が低下している可能性が示唆された。一方、AtG3PP3 のT-DNA挿入変異株g3pp3 については上記のような表現型は見られなかった。以上のことから、AtG3PP4 がストレス耐性や脂質代謝に関わっていると考え、解析を進めている。

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これまで植物アセチルコリンエステラーゼ(AChE)の局在性は，組織化学的検出法やDTNB法を用いて行ってきた．トウモロコシ幼苗では鞘葉節の皮層細胞でAChE活性が検出された．また本研究室では，トウモロコシおよびサイラトロ幼苗よりAChE遺伝子を単離することに成功した．また，トウモロコシAChE(maize AChE)と相同性の高い2種類のAChEホモログ遺伝子を発見し，rice AChE1および2とした．これらの遺伝子にはシグナルペプチドが含まれ，細胞外に存在する分泌タンパク質であると予測された．さらにmaize AChE抗体を作製し，トウモロコシ幼苗におけるmaize AChEの局在性を観察した．Maize AChEは鞘葉，鞘葉節および胚軸の維管束，種子の内胚乳，根の維管束および内皮細胞で確認された．本研究では，maize AChE，rice AChE1および2をイネに導入し過剰発現体を作出した．そのイネ過剰発現体の葉を用いて，蛍光免疫染色法により各植物AChEの細胞内局在性を観察した．その結果，イネ過剰発現体では各植物AChEは細胞外領域に局在していた．現在，緑色蛍光タンパク質(GFP)を用いて各植物AChEの細胞内局在性を検討している．

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無機元素過剰時に関与する分子の同定が進む一方で、必須元素欠乏応答の解析はあまり進んでいない。この一因として、シロイヌナズナに栄養欠乏症状を出すことの難しさが考えられる。シロイヌナズナの栽培には、多くの場合、寒天やゲランガムなどの自然界由来のゲル化剤により固めた培地を用いて行われている。しかし、寒天には様々な必須元素が含まれており（Jain et al. Plant Physiol.,150,1033）固形培地での栄養欠乏実験は難しい。一方で、水耕栽培では多数の植物を扱うことが難しい。そこで本研究では、支持体として化学合成品であるウレタンを用いた水耕栽培を行い、必須元素の欠乏症について検討した。
欠乏症状の検討を行うため、水耕液から各々の元素を抜いた培地を作成しシロイヌナズナをウレタン水耕栽培した。水耕栽培を2週間行い、症状を観察したところ、試した13種類の元素のうち、CoとCl以外については地上部に欠乏症状が現れた。MoとBについては品種間差を見出すことができた。現在、MgとZnについて詳細な解析を進めている。
ウレタン水耕栽培は播種が簡単であり、1000粒であれば30分以内に完了する。多量のサンプルを必要とするオミクス解析や欠乏感受性株のスクリーニングに適している。現在、欠乏感受性株のスクリーニングを進めている。

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植物は、生育ステージやリン酸欠乏ストレスによりリン酸の吸収や転流を制御しており、その機構には複数のリン酸トランスポーターが関わっていると考えられている。
本研究では、マメ科モデル植物ミヤコグサのリン酸トランスポーターファミリーの遺伝子を単離し、6つのリン酸トランスポーター遺伝子の局在とリン酸欠乏応答性についてリアルタイムPCRとin situハイブリダイゼーションにより調べた。その結果、6つの遺伝子は根、葉、茎、花、さやでそれぞれ特異的に発現していた。リン酸欠乏処理時では、主に根、葉での発現量の増加が見られたのに対し、花やさや組織ではコントロールと同様のであった。LjPT1、LjPT2、LjPT3は根と葉において同様にリン酸欠乏時に発現量が増加していたことから、これらの機能を比較するために根、葉での発現量変化を詳細に解析した。その結果、LjPT1は根での発現量増加がほかの遺伝子より早く、成熟葉ではLjPT1、LjPT2の増加が著しかった。また、新芽では、どの遺伝子の発現量も増加していた。
また、当研究室で開発したリアルタイムRIイメージングシステムでの³²Pイメージング解析により、トランスポーター発現量に違いのあるミヤコグサ組織へ移行したリン酸の絶対量を求めた。その結果、組織へ単位時間あたりに移行したリン酸量はコントロールとリン酸ストレスサンプルで約5倍違っていた。

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これまでにモデル植物であるイネ(日本晴)を用いてMgの吸収・移行様式を解析し、輸送タンパク質が関与することを示唆する結果を報告した。その後、イネゲノムデータベースより、シロイヌナズナのMg輸送体(AtMGT)のオーソログを検索し、前報に報告した6遺伝子にさらに3遺伝子を加えた計9遺伝子(以下、OsMGTファミリー)を対象として、Mg輸送体が担う役割を解析したので報告する。これらOsMGTファミリーのアミノ酸配列には、自然界に広く存在することが知られるCorAスーパーファミリーに共通のGxNモチーフが存在した。そしてOsMGTの予想ORF部分を挿入したプラスミドをMg輸送能欠損酵母に導入し、様々なMg濃度の培地における生育速度を比較した。その結果、新たに検討した試料の中にも機能相補性を示すOsMGTが存在し、少なくとも3つのタンパク質についてMg輸送能を有する可能性が示唆され、それぞれのOsMGTが複合的にMg輸送を担っている可能性が考えられた。また、Mgの他に輸送することが報告されているCo²⁺などのカチオン輸送能についても解析中である。

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世界各地の高ニッケル土壌で発生する作物の生育障害は、必須元素であるニッケルが体内へ過剰蓄積されることに起因する。しかし、植物の根におけるニッケル吸収の分子機構はいまだ明らかにされておらず、吸収抑制による障害回避法は確立されていない。一方、鉄や亜鉛などの重金属の輸送体は比較的広い基質特異性を持つことが報告されているが、我々は過剰なニッケル条件でのニッケル吸収が、これらの輸送体の誤輸送によるものと予想した。そこで今回、シロイヌナズナをモデルとして、微量必須栄養素の中でも要求量が高い鉄の吸収系によるニッケル過剰吸収の可能性について検討した。4週間水耕栽培したシロイヌナズナを鉄添加条件もしくは鉄無添加条件で過剰ニッケル（25 μM, NiCl₂ ）に一週間暴露し、植物体中のニッケル量を比較した。その結果、鉄無添加区の個体でニッケルによる障害が顕著に認められ、鉄添加区と比較しニッケル吸収量が約70％増加した。続いて、シロイヌナズナの二価鉄イオン吸収を担うIRT1について、そのニッケル輸送能の有無を酵母発現系により検討した。その結果、IRT1発現酵母はニッケルへの感受性が上昇し、細胞内のニッケル蓄積量は野生株の二倍に達した。これらのことから、過剰なニッケルはIRT1による鉄輸送経路を介して取り込まれていることが示唆された。

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これまでに我々は典型的なケイ酸集積植物であるイネから内向きケイ酸輸送体Lsi1と外向きケイ酸輸送体Lsi2を同定し、これらの輸送体が根からのケイ酸の積極的吸収に重要であることを明らかにしてきた。またオオムギやトウモロコシからもそれらの相同遺伝子を単離し、イネのケイ酸輸送体と同じケイ酸輸送機能を有することがわかった。しかしその一方でオオムギやトウモロコシはイネに比べてケイ酸の吸収量が低く、植物の種類によってケイ酸吸収能力が異なる機構についてはまだ明らかにされていない。そこで本研究ではオオムギおよびイネ由来のケイ酸輸送体の発現量や局在性などを検討した。根での発現量をReal time PCR絶対定量法で比較した結果、Lsi1、Lsi2ともにオオムギよりイネで数倍高く発現していることが明らかになった。次に組織局在性の影響を検討するため、HvLsi1 promoter制御下でOsLsi1 およびHvLsi1をイネのlsi1変異体に導入した形質転換体を作成した。その結果OsLsi1、HvLsi1共に内皮細胞と外皮細胞に極性をもって局在し、イネ本来の輸送体と同じ局在性を示した。これらの形質転換体を用いてケイ酸吸収量を比較した結果、ケイ酸吸収量はOsLsi1を導入した株がHvLsi1を導入した株に比べ高い傾向が見られた。これらの結果はイネ由来の輸送体は強い輸送活性を有していることを示唆している。

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シンク葉の維管束篩部を構成する篩要素(SE)と伴細胞(CC)は、一次原形質連絡を介して連結しシンプラストを形成している。一方、葉のソース化に伴い小脈の篩部では、SE-CC間の細胞壁に二次原形質連絡が形成される。しかし、このような二次原形質連絡の形成メカニズムや、糖転流経路構築における生理学的意義はよくわかっていない。我々は、シロイヌナズナのロゼット成熟葉特異的に糖を蓄積する変異株rsx1 (restricted sucrose export1)では、SE-CC間の細胞壁に不完全な二次原形質連絡を形成することを見出している。細胞壁の中葉部にはペクチン層が存在し、細胞接着の役割を果たしていること、RSX1はシロイヌナズナに27個存在するペクチン酸リアーゼのひとつであることより、SE-CC間の細胞壁中葉のペクチン層を分解し二次原形質連絡の形成を促進する可能性が考えられた。このようなRSX1の機能を証明する上で、RSX1の細胞内局在を明らかにすることは重要である。本研究では、rsx1変異株をRSX1-sGFP融合タンパク質で相補した形質転換体において、融合タンパク質の発現部位を共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いて観察した。

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カドミウムはヒトや植物に対して有害な重金属の一つであり、コメへのカドミウムの蓄積は日本の農業における重要な問題の一つとなっている。我々はこれまでにイネの二価鉄トランスポーターOsIRT1、OsIRT2がカドミウムも輸送し、鉄の輸送メカニズムがカドミウムの輸送にも大きく関与していることを報告した。本研究では、イネから鉄のトランスポーター遺伝子であるOsNRAMP1を単離し、カドミウムの吸収や輸送について調べた。
OsNRAMP1とGFPとの融合タンパク質をタマネギの表皮細胞に導入したところ、GFP蛍光は細胞膜に観察された。また、OsNRAMP1を導入した酵母は、10μMのカドミウムを含む培地上ではベクターコントロールよりも生育が悪くなり、細胞内カドミウム含量も高かった。イネのカドミウム高蓄積品種であるインド型のハバタキとカドミウム低蓄積品種である日本型のササニシキで比較したところ、OsNRAMP1の塩基配列は100%一致していた。しかし発現特性は大きく異なっており、通常条件ではササニシキの根よりもハバタキの根で約6倍の発現がみられた。
以上の結果から、OsNRAMP1は細胞内へのカドミウムの吸収、蓄積に影響していること、また、根でのOsNRAMP1の発現量が地上部におけるカドミウム蓄積量にも影響を与えていることが考えられた。

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土壌の酸性化は植物に毒性を示すアルミニウムイオン（Al）の可溶化をもたらし、生育を阻害する。しかし一部の植物では様々なメカニズムによりAlを無毒化する耐性機構を獲得しており、一般的にはシュウ酸、クエン酸、リンゴ酸などのカルボン酸を中心とした有機酸でAlをキレートする機構が知られている。コムギではAlで活性化されるリンゴ酸トランスポーターALMT1によるリンゴ酸放出がAl耐性に関わっており、さらにALMT1遺伝子上流域の繰返しモチーフが遺伝子発現量に関与することが明らかになっている。一方、QTL解析などからコムギのAl耐性には複数の要因が考えられており、中にはALMT1の活性化に関わる因子の可能性も考えられる。我々は、ALMT1遺伝子の配列および発現量に差は見られないが、Al耐性の異なる2系統を選抜した。本研究は、2系統間の違いに関わる遺伝子の単離を目的とし、2系統間でサブトラクション法を行った結果、発現に差異のある数個の遺伝子を単離することができた。現在、これらの遺伝子の発現量とAl耐性ならびにALMT1の機能との関与を解析するとともに、座乗位置についても解析している。

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青色系統の花のほとんどはアントシアニンに由来する。その中でも2価、3価の金属イオンとアントシアニンとが錯体形成すると真の青色が発色する。我々は最近、チューリップ花弁の青色部分から液胞膜型鉄イオントランスポーターを見いだした。しかし、金属イオンの液胞内への輸送とそれに続く花色発現の機構については、未だ不明なことが多い。アジサイは、アルミニウムイオンが青色発現に必須であることがわかっている。しかしながら、アルミニウムの液胞への輸送に関わる遺伝子は全く同定されていない。そこで、花が青くなる現象の分子メカニズムを明らかにすべく、アジサイの液胞へのアルミニウムイオン輸送に関わる遺伝子の単離を目的に研究を行なった。アジサイのがく片からcDNAライブラリーを作製し、これを酵母のアルミニウムイオン感受性株に導入する方法を用いてスクリーニングした。数回のスクリーニングの結果から、アルミニウムイオン耐性となる酵母株が得ることができた。その株が、アジサイ由来のアルミニウムイオン輸送関連遺伝子を持っていると期待されたが、実際には、アジサイ由来の遺伝子は含まれていなかった。現在、液胞へのアルミニウムイオン輸送に関わる遺伝子を単離すべく、他の方法でも行っている。

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植物が低リン条件において根から分泌する物質は土壌中からのリン吸収に大きく関わっている。リン欠乏条件下で育つ植物は、リンゴ酸やクエン酸などの有機酸を根から分泌し、土壌中で鉄やアルミニウムなどの金属イオンに結合した形で存在しているリンを可溶化して利用している。そのため難容性リンの有効利用には根からの有機酸の分泌が非常に重要な役割を持つと考えられるが、これまでにリン欠乏に応答した有機酸の分泌を担うトランスポーター遺伝子は知られていない。そこで本研究は、シロイヌナズナを用いてリン欠乏に応答した有機酸の分泌を担うトランスポーターを単離し、その機能を解析することを目的として実施した。
リンを含む（＋P）または含まない（－P）培養液で水耕栽培したシロイヌナズナからRNAを抽出し、リン欠乏条件で発現が誘導される遺伝子をマイクロアレイ解析によって調査した。その結果、リン欠乏で発現が上昇した遺伝子の中に有機酸トランスポーターの候補遺伝子としてALMT、MATE、ABC タンパク質のホモログを見いだした。これらの遺伝子についてRT-PCRによって－P条件での発現誘導を確認したところ、低リン条件の根における強い発現が確認された。また、興味深いことにリン欠乏誘導型のALMT遺伝子に対応するナチュラルアンチセンスが発現していたため、ナチュラルアンチセンスによる発現制御の可能性について検討を進めている。

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水輸送に関わる膜タンパク質であるアクアポリンは植物では30種以上のメンバーから構成されている。この多様性は植物の体内での水や溶質の移動の際、それぞれのアクアポリンが重要で特別な役割を果たしていることを示唆している。これまでにイネ（cv.Akitakomachi）の根で発現量の多いアクアポリン、あるいは水ストレスに対して鋭敏に応答するアクアポリンはほぼ特定されたが、根で発現量が少ないものや水ストレスに対する応答性の低いアクアポリンも多かった。そこで本研究では地上部に着目し、葉、節間、節、穂首、穂、葯、花糸、めしべ、鱗被、登熟中の籾などの各器官からRNA抽出を試み、イネアクアポリン全33種の内30種についてrealtimePCR法にてmRNA量を定量し、発現部位や時刻変化を調べた。その結果、登熟中の籾、鱗被、葯では他の器官には見られない特徴的なアクアポリンの発現が見られた。また、節間におけるメジャーなアクアポリン5種は成熟部位より成長部位で発現量が多かった。特にPIP2;6、TIP2;2ではその傾向が顕著であった。これらは成長中の組織での水輸送に重要なアクアポリンである可能性が考えられた。葉、節間、節での時刻変化は同一のアクアポリンメンバーであってもそれぞれの部位で異なったパターンを示していた。これらの結果から、不明な点の多かった地上部のアクアポリンの役割が明らかになってきた。

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3量体Gタンパク質複合体は、細胞膜に局在し、外来シグナルの細胞内への情報変換を担っている。動物や酵母由来のα、β、γの3種類のサブユニットと相同性の高い遺伝子は、イネやシロイヌナズナにも存在し、形態形成や外来シグナル応答に重要な働きをすることが明らかになってきている。しかしながら、植物3量体Gタンパク質複合体のサブユニット構成は、不明な点が多い。現在までに、植物3量体Gタンパク質複合体は、3種類のサブユニット以外にも多数のタンパク質を含むことが示唆されている。我々は、この複合体を精製することを目的とし、現在、精製のための諸条件を検討している。
細胞膜から、αサブユニットを含む複合体を可溶化する際に使用される界面活性剤を再検討した。Nonidet P-40 (NP-40), Cholic acid, Brij 35, Digitoninの順で、βγダイマーがこの巨大複合体から解離する程度が増加した。つまり、Digitoninを用いた場合、βγダイマーは、巨大複合体から完全に解離した。精製過程でのβγダイマーの解離を防ぐために、NP40で可溶化したサンプルを、disuccinimidyl suberate (DSS)を用いてクロスリンクした場合、αサブユニットとβサブユニットがクロスリンクされることを確認した。現在、このクロスリンク表品の精製を進めている。

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シロイヌナズナのペプチドシグナルAtPep1とそのホモログは、病原体に対する抵抗性機構を強化する内在性エリシターと考えられている。AtPepペプチドの受容体は、細胞外にロイシンリッチリピートを持つ受容体型キナーゼAtPEPR1である。本研究では、AtPEPR1と相同性の高い受容体型キナーゼAtPEPR2の、AtPepペプチドの受容と抵抗性機構への関与について解析した。AtPEPR1とAtPEPR2の遺伝子発現は、傷、ジャスモン酸、AtPep1、細菌性エリシターによって誘導された。AtPep1処理による病害抵抗性遺伝子の発現誘導効果および、Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000への抵抗性増幅効果は、pepr1とpepr2変異株では部分的に、pepr1/pepr2変異株では完全に抑制された。AtPEPR1とAtPEPR2を発現させたタバコ培養細胞を用いたAtpep1の結合／競合実験より、AtPEPR1はAtPep1-6を受容し、AtPEPR2はAtPep1とAtPep2を受容できることを明らかにした。

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本研究では、Ca²⁺感受性タンパク質エクオリンの遺伝子を導入しているタバコ培養細胞BY-2を用いて、植物の高浸透圧ストレス応答について解析を行った。タバコ培養細胞に対してNaCl、またはソルビトールによる高浸透圧処理を行ったところ、処理直後に活性酸素種（ROS）の生成が確認された。ROS除去剤を用いた解析から、生成されたROSは、一重項酸素であることが明らかとなった。さらに、阻害剤を用いた解析により、この一重項酸素の生成には、ペルオキシダーゼが関与することが示唆された。また、処理直後に生成される一重項酸素は、Ca²⁺チャネルを介した細胞外からのCa²⁺流入を誘導することが明らかとなった。両処理において、処理直後だけでなく遅延したROS生成がみられ、NADPHオキシダーゼを介したスーパーオキシド生成であることが示唆された。さらに、それぞれの処理により誘導される細胞死を指標にし、ROS除去剤、Ca²⁺キレーター、また様々な阻害剤を用いて浸透圧変化におけるROSとCa²⁺の役割について解析を行った。両処理において一重項酸素除去剤とCa²⁺キレーターが細胞死を増加させた。これらのことから、高浸透圧処理で生成される一重項酸素、および一重項酸素により誘導されるCa²⁺流入は高浸透圧ストレスの緩和に働く情報伝達の一部であることが示唆された。

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ラン藻や酵母においてヒスチジンキナーゼが浸透圧ストレスの受容に関与することが知られている。我々はこれまでにシロイヌナズナのヒスチジンキナーゼのうちAHK1が浸透圧ストレス応答を正に、サイトカイニンレセプターであるAHK2, AHK3が浸透圧ストレス応答を負に制御する因子であることを明らかにした。高等植物において普遍的にヒスチジンキナーゼが浸透圧ストレス応答に関与しているかどうか明らかにするために、本研究ではイネのヒスチジンキナーゼ遺伝子に着目し、浸透圧ストレス応答における役割について解析した。
ゲノムデータベース上で各AHKの相同遺伝子の探索を行ったところ、イネにはAHK1の相同遺伝子が存在しないこと、サイトカイニンレセプター相同遺伝子が4つ(OsHK3, OsHK4, OsHK5, OsHK6)存在していることが示された。OsHK3, OsHK4, OsHK5, OsHK6のORFを単離して、酵母変異体の相補実験を行った。その結果、この系でOsHK3, OsHK4, OsHK5, OsHK6がサイトカイニンレセプターとして機能し得ること、OsHK6がサイトカイニン依存的に浸透圧センサーとして機能し得ることが示された。現在、これらの遺伝子を過剰発現するイネ形質転換体のサイトカイニン応答およびストレス応答の解析を進めているので、これらの結果も合わせて報告する。

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We describe two Oryza sativa stress-related CCCH-type Zinc Finger protein genes (OsSCZF1 and OsSCZF2), involved in drought, salt and cold stress responses in rice. The expression of OsSCZF1 was induced by drought and NaCl treatments, whereas OsSCZF2 was induced by drought and cold. GFP localization analyses showed that OsSCZF1 seemed to move between the nucleus and cytoplasm, while OsSCZF2 was mainly localized in the nucleus. Transgenic plants over-expressing OsSCZF1 showed a lesion mimic phenotype upon maturity, had an increased expression of pathogenesis related genes and were sensitive to salicylic acid and insensitive to jasmonic acid. Transgenic plants over-expressing OsSCZF2 were short in height, exhibited reduced seed setting and improved tolerance to drought and cold stress. A number of biotic and abiotic stress related genes were up-regulated in OsSCZF2 over-expressing rice plants. These results demonstrate that OsSCZF1 and OsSCZF2 encode functional proteins involved in modulating stress tolerance in rice.

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プロテイン ホスファターゼ2C (PP2C) はプロテイン セリン/スレオニン ホスファターゼ ファミリーに属し、リン酸化カスケードのキーエンザイムとして機能する。植物のPP2Cは他の真核生物と比較して非常に大きなファミリーを構成している。シロイヌナズナのPP2Cは一部を除き、A～Jの10グループに分類される。このうちAグループのPP2Cは植物ホルモンの一つであるアブシジン酸 (ABA) のシグナル伝達経路の負の制御因子として知られており、種子の発芽やストレス応答など様々な生理現象に関与している。その一部のABI1等は、最近単離されたABA受容体であるPYR/PYLsと直接、相互作用することが報告されている。このようにAグループのPP2Cは比較的、解析が進んでいるが、他のグループのPP2Cについては遺伝学的・生化学的な解析がほとんどなされていない。
我々はシロイヌナズナのPP2Cのうち、AtPP2CF1と名付けたグループEに属しABA応答性を示すPP2C (At3G05640) の解析を行った。AtPP2CF1 の発現の組織特異性や細胞内局在の解析により、AtPP2CF1 は維管束、孔辺細胞あるいは根端で発現し、核と細胞質で機能していることが示唆された。現在、AtPP2CF1の酵素活性の解析を行っており、それについてもあわせて報告したい。

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グルタミン酸は動物の中枢神経系のシグナル伝達物質として、学習・記憶に深く関わっているが、植物においても20種のグルタミン酸受容体が存在し、様々な生理作用を司っており、気孔もグルタミン酸によって閉鎖が誘導されることは、前回の本会で報告した。
動物のグルタミン酸受容体においては、D-セリンがグルタミン酸のアゴニストとして働くことが知られており、同様な効果が気孔についてもあるかを調べたところ、D-セリンはグルタミン酸に対する相乗効果があることが明らかになった。また、数種のグルタミン酸受容体のT-DNAノックダウン系統について調べたところ、GLR1および3のノックダウン系統では気孔閉鎖について野生型と同じ表現型を示すが、GLR2.6ノックダウン系統ではABAによって気孔閉鎖はするがグルタミン酸による気孔閉鎖はせず、本受容体が気孔のグルタミン酸受容体として働いている可能性が示唆された。

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気孔は、植物葉表皮に存在する水蒸気や二酸化炭素の通路となる2個の孔辺細胞に囲まれた小さな孔で、乾燥・高濃度二酸化炭素・暗黒・菌の感染・植物ホルモンなどによって閉じるが、そのシグナル伝達経路については不明な点が多い。cGMPがニトロ化された新規化合物8‐ニトロcGMPが気孔閉鎖を誘導することを前回の本会で報告したが、本物質が植物細胞で生成されるか否かは不明であった。今回は免疫染色により孔辺細胞での生成の有無を調査したので報告する。
ABAおよびNOによりニトロcGMPの孔辺細胞での生成は誘導され、NO消去剤あるいはcGMP合成阻害剤により、その生成は阻害される。すなわち、ニトロcGMPは、NOおよびcGMP依存的に生成される。本物質は気孔閉鎖条件下で生成され気孔閉鎖を誘導することから、気孔シグナル分子であることが明らかになった。

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