現在国民の3人に１人が“がん”で亡くなり、近い将来2人に1人ががんで亡くなると予想される時代を迎えている。“がん”の原因は細胞の増殖を司る遺伝子の異常に基づくが、その異常のもととなる原因は極めて多様と考えられている。“がん”は恐竜にもあったことが化石から判明しており、多細胞細胞には避けられない疾病である。がんの原因を最初に示唆したのは有能なロンドンの病院に勤務していたパーシバール・ポット外科医師の最初の職業癌の報告であった。煙突掃除人に特有の陰嚢皮膚癌を正確な観察力によって原因は煙突のススであることを指摘した。化学発がんの画期的な第一歩の研究といえる。ススへの暴露を極力さけること、身体を清潔に保つことによって職業癌としての陰嚢癌が姿を消した。これはがんの最初の一次予防の成功例でしょう。その後、世界で最初の人工的な化学物質によるがんの誘発が山際勝三郎と市川厚一の偉業によりなされたのを皮切りに、各種の職業癌や発がん物質が発見され、発がん物質の化学構造に基づいた分類や発がんメカニズムの解明に向けての研究が推進された。多くの発がん物質は代謝活性化を必要とし、生体細胞のDNAを修飾すること、その活性化酵素と解毒酵素のバランスや酵素活性の強さなど発がん標的性とともに発がん性の種差、性差、系統差などに現れること、発がんに関わる内因性と外因性の大きな2つの要因が関わっていること、自然界にも多くの発がん物質が存在することなどが、明らかとなった。動物に対して発がん性が必ずしもヒトに対して当てはまらないなど発がん性リスク評価にも重要な進展がなされた。多種の化学物質相互作用が発がんにも当てはまることも明らかになっている。発がん過程は多段階からなり、それぞれに関わる化学物質の特徴も明らかにされてきた。本講演では化学発がん物質発見の歴史から化学発がん過程について最新の知見を織り交ぜて講演したい。

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Drug-Induced Liver Injury (DILI) represents a major problem in drug development. The clinical signature of DILI is broad (acute or chronic; hepatocellular, cholestatic or mixed) and the detection in clinical trials is mainly based on routine lab findings. Cases meeting Hy's law criteria identifies a potentially serious problem. The mechanisms of the pathogenesis of DILI remain a challenging issue. Although exposure to reactive drug metabolites is usually a prerequisite, downstream stress responses, cell death mechanisms and the immune system have emerged as critical determinants of DILI. In the case of “direct” toxicity, acetaminophen (APAP) has received the most attention and highlights the importance of signal transduction, programmed necrosis, and the role of mitochondrial dysfunction. Knowledge gained from recent studies of APAP from our laboratory has implicated sustained JNK activation in a type of programmed necrosis. Interaction of P-JNK with a protein in the outer membrane called Sab is required for sustained JNK activation. Inhibition of JNK or silencing the expression of Sab prevents APAP induced necrosis in vitro and in vivo without altering APAP metabolism (GSH depletion). Further these two approaches prevent massive apoptosis in the TNF/galactosamine model underscoring the general importance of JNK activation and interaction with mitochondrial Sab in hepatotoxicity. The hypothesis consistent with both models is that mitochondria made vulnerable by APAP or TNF produce enhanced ROS production when JNK interacts with Sab. ROS then lead to sustained JNK activation and ultimately cell death. In the case of idiosyncratic DILI, several examples of striking HLA associations point to the important role of the adaptive immune system in mediating injury. Recent genetic studies have shown increased risk with certain HLA markers in studies of flucloxacillin, ticlopidine, ximelagatran, lumiracoxib, amoxicillin and clavulanic acid, and lapatanib. However, GWAS studies conducted by the U.S. Drug-Induced Liver Injury Network of a large population of cases of DILI from various causes have not shown strong or reproducible associations. These findings leave us with two issues concerning idiosyncratic DILI: (1) In those with HLA risk factors, only a small percentage of cases actually develop DILI; what else determines the development of DILI in these cases? (2) concerning drugs with negative GWAS data, are genetic factors still involved (rare variants or multiple common polymorphisms)? In conclusion, considerable progress in predicting and understanding the mechanisms of DILI have been made recently, but there remains much to be learned.

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2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) and related compounds elicit a broad spectrum of species-specific effects. Hepatic steatosis is a classic response following exposure to TCDD characterized by increases in lipid accumulation, hepatocellular vacuolization, inflammation, and serum free fatty acids. Many of these effects resemble characteristics of metabolic syndrome (MetS), a multi-factorial disease that includes dyslipidemia, obesity, and can progress into non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and , and diabetes. We have systematically integrated omic data from genome-wide chromatin immunoprecipitation (ChIPchip), microarray and metabolomic studies with complementary histopathology, and comparative analysis of in vivo and in vitro human, mice and rat models, as well as bioinformatic approaches to further elucidate the mechanisms involved in aryl hydrocarbon receptor (AhR)-mediated hepatic steatosis in female C57BL/6 mice. Our results suggest that TCDD induces hepatic steatosis due to alterations in lipid transport and metabolism that increase fat uptake and inhibit beta oxidation. Lipidomic and gene expression analyses also suggests that there is increased uptake of dietary fatty acids and regulation of fatty acid metabolism that alters saturated, mono-, and poly-unsaturated fatty acid ratios resulting in hepatoxicity. The integration of ChIP-chip data with the genomewide computational identification of dioxin response elements (DREs) is consistent with AhR-AhR nuclear translocator (ARNT)- mediated regulation for many of these responses. However, ~50% of AhR enriched regions in our ChIP-chip data did not contain a DRE. Bioinformatic analyses with supporting microarray data suggest that the AhR interacts with DNA to regulate gene expression by dimerizing with other transcription factors to alter lipid metabolism and transport. Collectively, these results not only further elucidate the mechanisms involved in TCDD-induced steatosis, but also suggest that TCDD and related compounds may contribute to the development of MetS and its associated diseases by increasing hepatic fat accumulation.

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メタボロミクスは細胞内の代謝産物を網羅的に探索し、代謝経路や代謝調節機構、遺伝子やタンパク質と代謝物の相互作用などを解き明かそうとする方法論である。メタボロ－ム解析は、医薬、発酵、環境、エネルギー、農作物、食品などの産業分野でも革新的な解決策を与えることが期待される。 我々は、代謝物のほとんどが電荷を持っていることに着目し、イオン性化合物に対して、高分離能を有するキャピラリー電気泳動に質量分析計を接続したCE-MSによるメタボローム解析法を開発し、数千種類の代謝物の測定を可能にした[1-2]。 本法により、解熱鎮痛薬アセトアミノフェンをマウスに投与して惹起された急性肝炎時にグルタチオンの枯渇に伴い、肝臓および血中で急増する肝毒性オマーカー（オフタルミン酸）を発見し、その生合成経路を解明した[2]。さらに薬剤性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、肝細胞がん、非アルコール性肝炎など各種の肝臓疾患患者の血液測定によって、ヒトで特異的に上昇する新規の肝臓疾患スクリーニングマーカーを発見した。 がん研究では、がん患者から採取した正常とがん組織のメタボローム測定によって、ヒトのがん組織でも解糖系が亢進している（Warburg効果）ことを示した[3]。また大腸がん組織では、嫌気条件下で微生物や回虫が示す特殊な代謝を使ってATPを生成することを示す結果を得た。さらに唾液のメタボローム測定によって、膵臓がん、乳がんなどを迅速にスクリーニングする方法も開発した[4]。詳細を報告する。 参考文献 [1] Soga T, et al., J. Proteome Res. 2. 488, 2003. [2] Soga T, et al., J. Biol. Chem. 281, 16768 2006. [3] Hirayama A, et al. Cancer Res. 69, 4918, 2009. [4] Sugimoto M, et al. Metabolomics. 6, 78, 2010.

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　古来、毒物は権力の交替のツールとして使われてきた。有名なのは、クレオパトラ姉妹に関わる毒殺である。毒蛇に乳首を噛ませて、自殺した手法も有名である。ワインに毒物を混ぜられることもあり、コルクを空けるのを客の面前で行う習慣も、毒殺を防ぐためでもあった。
　サソリの毒とかコブラの毒とか、少量で大きな動物を死に至らしめる仕組みは、動物個体の生命維持機構を知る貴重な手がかりを与えてくれる。
　毒物生物学はともすると、薬剤の副作用を避ける方向に向かってしまったが、これは有用性を前に出した経済指向の故でもあろうが、生物個体の発生、進化、生命維持機構が窮極的には、思考能力を持った優れた人間という生物を地球上に存続せしめた不思議さを解く鍵の基本になっている。
　以前に、私は、白血病細胞を分化させて治療に導く研究を、数社の製薬会社の支援を得て行ったことがあった。マウスのFriend白血病細胞を分化させ、赤血球系細胞に導く物質の探索を行った。「味の素」と共同研究をし、フォリスタチンを見出したり、毒性があると薬剤としての開発がストップされたトリコスタリンAが後の細胞の分裂機構の研究に有用となったのは周知の事実である。
　近年、日本の野生マウス（モロシヌス）の近交系が樹立され、ヨーロッパ経由で米国で樹立された近交系との交配で、一部染色体を交換したコンソミックマウス系が、モロシヌス由来のSNPを用いて同定可能となった。ある10個位の遺伝子を含んだ部分は、病態の発生の様相のスクリーニングに有用となった。例えば、脂肪の沈着を皮下から内臓周囲に変える遺伝子なども明らかにされつつある。このような系への化学物質による影響の解析は、今後、多方面で有用となろう。
　この様に毒性生物学は、実に広い将来を持っている、生物の深奥を教えてくれる研究領域と信ずる。
　研究者諸君は、広い世界観の上に、更に研究を発展させてもらいたい。

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医薬品分野においては、科学技術の進歩にともなって生じる発明や技術革新の成果は、そのままでは国民に享受されない。イノベーションの成果を医薬品や医療機器として社会受容するためには、企業や大学が自らの研究開発力を高める努力をするだけではなく、その結果生まれてきた新技術が適切に社会に提供されるような制度整備が必要であり、またその新技術がどの程度の臨床および経済効果を生むのかを適正に評価する方法論（ヘルステクノロジーアセスメント; HTA）が必須である。しかしながら、日本では、臨床疫学研究の成果によって実施される医療であるEBM（Evidence-based medicine）については相応の進展、理解があるものの、比較効用研究（comparative effectiveness research）などの手法を利用した経済評価ではずいぶん立ち遅れている。また、臨床研究の成果を最大限に活かすための IND制度導入などの整備も遅れているといわざるをえない。日本の科学技術や先進性が、社会保障の中で適切に評価されていないことを産業界としてどのように考えるのか、またどのように解決していくのかは、日本の医薬品・医療産業の浮沈にかかわるテーマでもある。本講演では、臨床研究制度の諸問題に加えて、ヘルステクノロジーアセスメントとは何か、そして医薬品経済評価の手法について概説する。

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Chemicals are able to cause various types of allergic disease. Those of greatest importance in the context of toxicology and occupational medicine are skin sensitization resulting in allergic contact dermatitis, and sensitization of the resporatory tract associated with asthma and rhinitis. There is a need to understand the mechanisms through which allergic sensitization to chemicals is acquired and, based on an appreciation of relevant cell;ular and molecular processes, to develop tools for accurate assessments of human health hazards and risks. The two forms of chemical allergy mentioned above provide toxicologists with different challenges. Allergic contact dermatitis is the commonest manifestation of immunotoxicity in humans, and it is clear that many hundreds of chemicals have the potential to cause skin sensitization. There are methods available that support the identification and characterization of skin sensitization hazards and the development of accurate risk assessments. Currently, however, those approaches are based on in vivo models and the challenge now is to develop robust and reliable alternative approaches that will eventually obviate the need for animals. Chemical respiratory allergy poses different problems because in this case there are not yet available widely accepted methods for hazard identification. In this presentation recent developments in chemical allergy will be described with reference to the relationship between clinical disease, cellular and molecular mechanisms, and approaches to toxicological evaluation.

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我々はこれまで、新しい分子イメージングの手法、中でもナノ形態学の手法を開発し医学生理学上の問題に応用することで解決してきた（ビデオ顕微鏡相関電顕法Setou et al., Science 2000,　GFP蛍光細胞内観察 Setou et., Nature 2002, ナノ微粒子による可視化Taira et al., e-J.Surf.Sci. Nanotech. 2007, Moritake et al., J.Nanosci.Nanotech.2007,位相差電子顕微鏡による観察Setou et al., Medical Molecular Morphology 2006）。
　ポストゲノム時代においては、これら通常のDNA, RNA, 蛋白質の可視化はもとより、翻訳後修飾や脂質や糖鎖も含めたプロテオーム、メタボロームの解析（Ikegami et al., PNAS2007, Yao et al., Cell 2007, Konishi and Setou., Nature Neuroscience 2009, Ikegami and Setou FEBS Lett 2009, Kimura et al., JBC 2010, Ikegami et al., PNAS2010）も重要である。さらにはメタボロームの時間的空間的変化すなわち多次元メタボロミクスを知ることが重要であると考えられている。
そこで、私たちは島津製作所等と共同で、質量分析を用いた顕微鏡法、高解像度Imaging Mass Spectrometry (質量顕微鏡)を開発している。現在、質量顕微鏡法を用いて、疾患モデルマウスやヒト病理標本の解析を行い、メタボローム動態の可視化に挑んでいる。（Shimma et al., Surf.Int.Anal 2006, Sugiura et al., Anal.Chem 2006, Shimma et al., J.Chrom B 2007, Hayasaka et al., RCM 2008, Shimma et al., Anal Chem 2008, Taira et al.,　Anal Chem 2008, Sugiura et al., Plos One 2008, Ageta et al., MMM 2009, Zaima et al., J.Oleo Sci 2009, Sugiura et al., JLR 2009, Shrivas et al., Anal Chem 2010, Inoue et al., JASMS 2010, Hayasaka et al., JASMS2010, Koizumi et al., Neuroscience 2010, Morita et al., Cancer Sci 2010）。
本講演では我々の質量顕微鏡法の原理とトキシコロジー応用の可能性について発表議論したい。
参考文献
「質量顕微鏡法：イメージングマススペクトロメトリー実験プロトコール」　シュプリンガー社　瀬藤光利　編　2008
Imaging Mass Spectrometry　シュプリンガー社　瀬藤光利　編　2010

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The International Union of Toxicology (IUTOX) has had a long history of collaboration with its member societies. The Japanese Society of Toxicology (JSOT) has played a prominent role in Asia, promoting cooperation and progress in toxicology among its members in AsiaTox. A new Executive Committee for IUTOX was elected for 2010-2013, and one of its major goals is to enhance the formation of new toxicology societies in developing countries around the world. We believe that JSOT and AsiaTox can be important partners with IUTOX in that initiative. IUTOX believes that the recognition of toxicologists (with minimal requirements) through a Global Directory in cooperation with its member societies can foster the identity and development of the discipline of toxicology on a world-wide basis.
After establishing a Global Directory of toxicologists, IUTOX plans to work with its member societies to promote the harmonization of standards for senior toxicologists of the existing certifying bodies—DJST, ERT, DABT, and ATS.
These endeavors will require the cooperation, patience, and hard work of all involved to secure the greater professional recognition of toxicologists on a world-wide basis.
IUTOX will continue to support International Congresses, such as CTDC’s and ICT’s, to facilitate the exchange of scientific information among its member toxicologists and will continue to expand its support of activities and workshops in developing countries to provide opportunities for scientists to learn more about risk assessment and other topics in toxicology.

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　安全性バイオマーカー探索を目的とする産学官の共同研究であるトキシコゲノミクス・インフォマティクスプロジェクトでは，約150の薬剤投与による肝，腎毒性データ及び遺伝子発現データ，血漿等のサンプルを蓄積してきた．これらの研究成果にマイクロRNA(miRNA）を組み合わせることにより，有用な安全性バイオマーカー探索を試みている．
　アセトアミノフェン(APAP）を投与したマウス血漿のmiRNAマイクロアレイ解析から，miR-122等の増加が報告され(PNAS． 2009 106, 4402-4407），血漿中miRNAが毒性バイオマーカーとして有用である可能性が示された。miRNAには臓器特異性の高いものが多く，ヒトと実験動物においても比較的配列が保存されており，測定も技術の進展により容易になった．このため，非侵襲的に採取できる血漿に含まれる各臓器由来のmiRNAは，ヒトへの外挿性にも優れた毒性バイオマーカーへの応用が期待できる．
　我々は血漿中miRNAを臨床試験における急性毒性バイオマーカーとして応用することを目的に，検討を進めている．本研究では，まず肝障害に伴った血漿中miR-122の増加について，ラットでの再現性及び用量相関性を確認した．APAP及びTGPデータベースより肝障害が顕著な数種の化合物について，ラット(Crl:CD (SD)IGS；12週齢）で投与後24時間までの経時的なサンプリングを行い，血漿中miR-122，血液生化学及び肝病理組織学的検査を行った．いずれの化合物においても，投与後9から24時間において肝障害が確認され，miR-122量は対照群の数百倍が検出された．肝障害の認められていない動物のmiR-122量は安定しており，急性肝障害バイオマーカーとしての有用性が検証された． 　現在，それぞれの臓器で重複なく特異性が担保された，毒性バイオマーカーに理想的なmiRNAを選定するため，ラットにおけるmiRNAの臓器分布に関するデータを採取しているが，今回はその取り組みについても合わせて紹介したい．

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精子形成は、特異的な細胞分裂を起こし、細胞形態は劇的に変化する。これらの制御においては、インプリントされた遺伝的、エピジェネティック的な制御によって厳密に制御されている。近年、遺伝子発現制御に重要な役割を果たすと考えられる非翻訳型RNAが発見され、精子形成においては、特定の種のmicroRNA(miRNA)や精巣特異的に発現するpiRNAが重要であると報告されてきた。本研究では、精巣毒性を惹起するエチレングリコールモノメチルエーテル（EGME)を50及び2000mg/kgをラットに経口単回投与し、投与後6及び24時間における病理組織学的変化とmiRNA発現の変化をmiRNAマイクロアレイ及び定量PCR法にて解析した。さらに、EGMEによって変動したmiRNAのターゲットをTargetScan及びPicTarにて予測し、特定のmRNAについて発現量を定量した。EGME 50mg/kg投与群では、病理組織学的変化及びmiRNA発現に変化はなかった。EGME 2000 mg/kg投与群では、投与後6時間に精母細胞の変性・壊死がみられ、24時間後にはさらにセルトリ細胞の空胞化がみられた。miRNAマイクロアレイ解析および定量PCRの結果、6時間後にmiR-760-5pの増加、24時間後にmiR-134、miR-320及びmiR-188-5pの増加、miR-92aとmiR-449aの減少がみられた。これらの遺伝子のターゲットには、エピジェネティック制御に関連する遺伝子が多くみられ、ヒストン構造の制御に関わるhigh mobility group AT-hook 2 発現の増加やヒストン脱アセチル化に関与するhistone deacethylase 4発現の減少が確認された。これらのことから、EGMEによる精巣毒性には、miRNAによるエピジェネティック関連遺伝子の制御との関連性が示唆された。

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　薬の体内動態の制御に大きな寄与を占める薬物代謝酵素やトランスポーターの発現制御に関して、転写因子や核内レセプターを介した転写調節機構の情報がかなり蓄積されてきた。しかし、蛋白質発現量とmRNA発現量との間に相関関係が認められないことがあり、転写後調節の関与が示唆される。そのメカニズムの１つとして、microRNAが薬物代謝酵素、トランスポーターおよび核内受容体の発現制御に関与することが明らかになった。生体外異物の解毒や内因性化合物の生合成の制御にも関わるmicroRNAの役割について演者らの研究成果を中心に概説する。 　microRNAの発現は、病態によって変動するだけでなく、様々な化学物質、環境汚染物質、薬物などの曝露によって変動することが示されている。microRNAは、RNAポリメラーゼIIによってprimary miRNAに転写された後、プロセッシングを受けて、precursor miRNAを経てmature miRNAへと成熟する。しかし、microRNAの発現変動の機構に関しては不明な点が多い。演者らは、microRNAの発現変動における転写・転写後レベルにおける調節の関与、またmRNAの発現変動との関係について明らかにすることを目的として、様々な薬物代謝酵素やトランスポーターの発現を制御する核内レセプターpregnane X receptorのリガンドであるリファンピシンをヒト初代培養肝細胞に処置し、microRNAの発現変動とmRNAの発現変動を網羅的に解析した。得られた結果について考察を加えて紹介する。 　また、microRNAは血中に安定に存在し、癌や糖尿病などの病態を反映するバイオマーカーとしての有用性が注目されてきている。演者らは、健常人における血中microRNAの発現における個人差および個人内変動について解析し、興味深い知見を得たため、そのデータについても紹介したい。

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全長約2メートルの巨大な分子であるゲノムDNAが、直径約10マイクロメートルの細胞核にどのように収納されているかは、細胞の機能発現にとって大きな問題である。実際に、クロマチンの細胞核内での配置は、組織、遺伝子により異なっている。また細胞核には、ゲノムDNA以外にも、PMLボディ、Cajalボディなどのいわゆる核ボディが存在する。これらの機能には不明な点があるものの、その数、大きさ、配置は細胞核機能と関連している。これら位置や配置などの形態学的差異だけでなく、クロマチンや核ボディーを構成する因子の動的振る舞いも、細胞核機能を理解する上で非常に重要である。このような細胞核の構築すなわち細胞核構造に関する知見は、近年の解析技術の進歩と共に、急速に蓄積されつつあり、エピジェネティクスに加えて遺伝情報制御の新たな観点として注目されている。我々は、これまで神経細胞の分化、成熟の過程および成熟ニューロンでの機能発現時における細胞核構造を解析してきた。遺伝子座の核内配置については、隣接する遺伝子座をクロスリンクした後マイクロアレイで探索するCircular chromosome conformation capture (4C)法や、新生RNAに対するfluorescence in situ hybridization (FISH)や遺伝子座に対するDNA FISH法を用いて、異なる遺伝子座同士の会合や核膜への局在などの観点から解析している。また、クロマチン構成因子の動的な振る舞いに関しては、Fluorescence recovery after photobleach (FRAP)法や、塩抽出法を行っている。本シンポジウムでは、細胞核構造の解析技術を紹介しつつ、その技術を用いた我々の最近の研究成果を提示するとともに、細胞核構造の解析の意義について考察したい。

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神経幹細胞は自己複製能をもつと同時に、神経系の主要な細胞種、ニューロンとグリア細胞（アストロサイト及びオリゴデンドロサイト）への多分化能をもった細胞である。この神経幹細胞の増殖・分化は、サイトカインなどの細胞外因子とDNAメチル化やアセチル化などのヒストン化学修飾を含むエピジェネティクス機構との協調作用で制御されることが明らかとなっている。バルプロ酸は抗てんかん薬として長らく使用されている薬剤であるが、最近ヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）阻害活性を持つことが報告された。我々はこれまでに、バルプロ酸のHDAC阻害活性により神経幹細胞の増殖やグリア細胞への分化が抑制されること及びニューロンへの分化が促進されることを報告している。また、この作用を利用して、抗てんかん薬としての作用以外にも脊髄損傷治療における有用性も示してきた。しかしバルプロ酸には良い作用ばかりではなく、本講演では、マウスが胎仔期にバルプロ酸に暴露されると神経幹細胞の分化が撹乱され、脳構造及び遅発性行動異常が引き起こされる可能性を見出したので報告したい。

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化学物質の影響が持続し、発達後に顕在化する現象のメカニズムの一つとして、エピジェネティクスが注目されている。エピジェネティクスは、ゲノムDNAがヒストンに巻き付いて出来るクロマチンへの後天的な修飾による転写制御機構であるが、修飾の実体、修飾を制御するタンパク質、修飾を読み取り転写制御を実行するタンパク質など、基本機構が急速に解明され続けている。一方で、ゲノム情報発現を制御する別の因子である、タンパク質をコードしないnon-coding RNA、特にmicroRNAが脚光を浴びているが、その発現調節にもエピジェネティクスが関与していること、逆にmicroRNAがエピジェネティクス制御を調節する現象も見出されて来ている。本発表では、エピジェネティクス制御に化学物質が関わり生体影響を及ぼす現象を、広く「エピジェネティック毒性」と定義し、その特性や解析方法を総括し、エピジェネティクスとmicroRNAの相互制御について紹介したい。

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《開催主旨》
医薬品のライフサイクル全体を通じたリスクマネジメント，とりわけヒトでの安全性に関しては，臨床および非臨床安全性専門家が連携してリスク低減化に取り組むことが極めて有意義と考えられる．
JSOT2007において，はじめて臨床・安全性等の幅広い分野からの参加を得て，非臨床・臨床ジョイントディスカッション（JD）が実現し，その後トキシコロジストも「ファーマコビジランス」を学ぶ機会が必要との学術年会長の意向により，具体事例を取り上げる「シンポジウム：ファーマコビジランス」が実現した．企業にとって具体事例は機密情報であるが，それらの安全性情報はヒトでのリスク低減化に役立つ貴重な情報となることから，事例提供・共有化システム構築へ向けて「具体事例でのJD」を継続して行く必要がある．
昨年の肝障害に続き，３回目のJDとなる本学会では，規制当局，JAPhMedに加え，新たに臨床学術分野との連携を得て，リスクマネジメントの最前線の取り組みであるトランスレーショナル・セーフティー（バイオマーカー）に関して，国内外の事例を紹介する．具体的には，1)昨年のキシメラガトランの肝毒性の事例で紹介されたシステムバイオロジーの結果を踏まえた，臨床での肝障害リスク因子の検証（国内）2）トランスレーショナルセーフティー部門の専門家による心毒性の具体事例の紹介．心臓関係の副作用リスクの読み取りに関するJD．3)規制当局とのコミュニケーション/リスクの解釈に関する海外具体事例．4)トランスレーショナルセーフティーに関する国内規制当局の視点の紹介　などを予定している．これらのテーマを通じて非臨床及び臨床安全性の専門家が緊密に連携し，医薬品のリスク低減，安全性の確保のための問題を提起し，解決法を提示することを目指す．

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薬剤性肝障害は薬物療法を受ける患者においても、新薬の開発においても最も重要な問題の一つである。薬剤性肝障害に感受性の高い患者を予め選択する事ができれば、薬物療法や、新薬の開発において、大変有用であると考えられる。現在までに、遺伝学的、薬物動態学的アプローチなどが検討されているが、臨床上、充分に有用な手段は解明されていない。
近年、メタボノミクスを用いたAnderssonらによる報告から、血漿ピルビン酸濃度が、薬剤性肝障害の予知もしくは、肝障害の早期発見に有用である可能性が示唆された。
彼らの報告によると、血清ピルビン酸濃度が低い患者において、抗凝固剤であるXimelagatranによる薬剤性肝障害の発現が多い事、またin vitroの実験により本剤による肝細胞障害がピルビン酸濃度の減少により顕著になったことから、臨床における肝障害の早期発見マーカーの可能性が示唆された。
ピルビン酸は解糖系の終末産物であるとともに、アラニンを通じてアミノ酸代謝と関連し、また、オキザロ酢酸(OAA)のTCAサイクルへの代謝や脂肪酸代謝などに関係する。したがって,ピルビン酸の血中濃度は栄養状態、各種臓器(とくに筋肉,肝臓)の代謝状態などに影響される。
薬剤性肝障害の原因は、投与される薬剤により様々と考えられるが、今回、我々はこのピルビン酸に注目し、薬剤性肝障害との関連性および早期発見マーカーとしての可能性についての検討を計画している。
ピルビン酸は比較的不安定な物質であるため、薬剤性肝障害と血漿ピルビン酸濃度の関連についての臨床研究を進めるにあたり、予備的研究として、採血方法や測定方法が血漿ピルビン酸濃度の測定結果に与える影響について検討した。さらに現在、臨床試験においてピルビン酸測定するとともに、当法人内の医療施設において発現した薬剤性肝障害においてもプロスペクティブな観察を行う予定である。

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Adverse effects on the cardiovascular system (CVS) are amongst the most common reasons for attrition during drug discovery, development & post-marketing. This highlights the need for pre-clinical strategies that predict the effect of drugs on CVS function in man. In response to attrition resulting from drug-induced QT interval prolongation, sequential in silico-in vitro-in vivo pre-clinical strategies have evolved that aim to predict the outcome of the “Thorough QT/QTc Study”. Owing to the widespread nature of the QT problem, sufficient data are emerging that provide estimates of the predictive value of the pre-clinical results. Although pre-clinical strategies also aim to predict drug-induced changes in other CVS end-points (e.g. blood pressure; heart rate; contractility; PR & QRS intervals), quantitative information on the predictive value of these pre-clinical data are relatively rare. Providing that a high priority is given to assessing translation of these end-points, there is no reason why a better understanding cannot gradually be achieved. Whether current pre-clinical studies can predict CVS risk in “outcome trials”, such as those recently recommended for type II diabetes drugs, is a significant and potentially intractable challenge, however. Case studies will be used to illustrate these perspectives.

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Safety assessment in early drug development relies heavily on in vitro and animal experiments. The outcome of these experiments should guide which kinds of side effects in humans can be expected. When drug development progresses in human clinical trials, progressively human safety data are becoming visible and can overrule animal data. In this context, bridging biomarkers as indicators for tissue damage in animals and that can be monitored in humans are gaining importance. There is a need for good understanding between the toxicologists and human safety specialists about the predictivity and validity of such biomarkers in terms of them being early indicators of tissue damage or just being associated with tissue damage as such or being potentially only a remote part of a pathway not important for the disease as such. Further, based on animal studies, safety concerns may emerge, for which no good surrogate markers exist. These are eg associated with aspects of covalent binging of drugs or their metabolites to proteins, processes of tumor development, genotoxicity and reproductive toxicity. In these areas of little caches of applying surrogate biomarkers or monitoring in the clinical context, it is important for the toxicologist to provide enhanced understanding of the mechanism of action in animal or in vitro studies to judge human relevance with little chances only to validate the risk assessment in the human context. In such latter cases, an enhanced effort of understanding between clinical and non-clinical safety scientists is needed. The presentation will include a few cases to illustrate this.

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　医薬品の開発においてはバイオマーカーを利用する機会が多く、安全性指標としてのバイオマーカーは開発初期において特に重要である。古くから広い意味での生理学的バイオマーカーが利用されてきたが、近年、分子生物学的技術の発達とNIHの研究グループから公表されたバイオマーカーの定義（1998年）により、その扱いが大きく変わった。
総合機構（PMDA）では、医薬品におけるゲノム薬理学、バイオマーカーの利用に関する一般的な考え方、個別品目の評価とは関係しないデータの評価や解釈について、指導及び助言を行う相談区分を設け、2009年4月からファーマコゲノミクス・バイオマーカー相談を実施している。今回のシンポジウムでは、安全性予測試験コンソーシアム（Predictive Safety Testing Consortium: PSTC）からPMDAに申し込まれた薬剤誘発性急性腎障害の新規バイオマーカーに係るファーマコゲノミクス・バイオマーカー相談の内容及びその評価について紹介する。また、実際に臨床で利用されているいくつかのバイオマーカーについて、非臨床試験との関連性について検討した結果を報告する予定である。

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レポーター遺伝子アッセイは分子生物学領域において遺伝子の転写制御メカニズムの解析の目的で広く用いられてきた手法である。近年では内分泌攪乱物質問題とともに、ホルモン活性を有する化学物質のスクリーニング手法として注目され、我が国ではエストロゲン受容体やアンドロゲン受容体を介するアゴニスト/アンタゴニスト作用検出系の開発、検証が精力的に進められ、その一部は既にOECDガイドラインとして登録されるに至っている。内分泌かく乱化学物質の重要な作用点はステロイドホルモン受容体や甲状腺ホルモン受容体などの核内受容体を介したシグナル伝達への影響であり、遺伝子の発現調節の解析手段として繁用されているレポーター遺伝子アッセイの手法は核内受容体を介したシグナル伝達のかく乱の検出手段に応用することが可能であり、大量の化学物質のホルモン様活性の強度を効率的に推定し、上位試験実施のための優先順位付けなどに利用することが出来る。本邦で開発されOECDガイドラインとなったTG455はエストロゲン応答配列の下流にルシフェラーゼ遺伝子を連結したコンストラクトとヒトエストロゲンレセプター発現コンストラクトを安定的に組み込んだHeLa細胞を用いる方法であり、エストロゲン受容体アゴニスト及びアンタゴニストの検出が可能である。また、AR EcoScreen細胞を用いたアンドロゲンアゴニスト/アンタゴニスト検出系も現在、OECDガイドライン化に向けたバリデーションが実施されている。更に、変異型lox配列とCre酵素による組換え反応を利用して、トランスジーンをゲノム上の決まった位置に挿入することにより効率的にレポーター遺伝子アッセイ用の安定形質細胞を構築する方法を紹介する。

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動物実験禁止という世界的な流れの中、化学物質の有害性を評価する代替法として、発光培養細胞技術の開発が進められている。特にNEDOプロジェクト「高機能簡易型有害性評価手法の開発 / 培養細胞を用いた有害性評価手法の開発」において、複数の遺伝子発現を同時に評価できるマルチレポータアッセイ技術を導入した化学物質評価発光細胞の開発が進められた。従来、ルシフェラーゼレポータアッセイは１乃至２の基質に対するルシフェラーゼレポータ遺伝子ベクターを作製、評価細胞に導入し、個々の発光の強さにより有害性を評価した。しかしマルチレポータアッセイ技術は甲虫ルシフェリン1つに対し、異なる発光色の甲虫ルシフェラーゼ遺伝子を用いることで、発光色の違いによって複数の遺伝子発現を同時に評価できる方法である。これによって、例えば、免疫毒性評価細胞Jurkat細胞ではG3PDH（赤色）を内部コントロールにIL-2（緑色）とIFNγ（橙色）の遺伝子発現量の変化を解析でき、発光色の変化のアルゴリズムを解析することによって化学物質の毒性の質と量を、ハイスループットに評価できることになった。しかしながら、このような新規の化学物質の有害性を評価できるシステムがその普及・促進にあたり、有害性評価結果の信頼性を保証する仕組みの導入が不可避である。我々は誰が、どこで、いつ、評価発光細胞を用いても同じ結果を出すために、国際的な標準化の推進が必要と考えている。そこで我々は標準化に必要な要素として、評価細胞の維持管理、プロトコールの妥当性や測定の信頼性の確保などを重視、国際標準化事業を開始した。特に、異なるメーカーの測定装置でも如何に光を測定し信頼度を確保するのかを重要なポイントとした。本特別企画では、我々が開発した化学物質評価用発光細胞のポテンシャルとその標準化のストラテジーについて現状報告する。

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医薬品、農薬、一般化学品などの有用な化学物質の開発において、多くの場合、その安全性評価には実験動物を用いた毒性試験が必要である。しかし、近年、動物福祉の観点から、動物実験代替法としてin vitro毒性試験の開発が積極的に進められている。また、毒性機構の解明研究から毒性標的分子が明らかとなり、その標的分子を用いたin vitro毒性評価系を化合物の選別に利用する動きも進んでいる。 In vitro毒性試験において、試験のソースとして多くの培養細胞、特に株化細胞が用いられてきた。株価細胞は株特有の安定した性質を維持しており、半永久的な維持培養や遺伝子導入等の操作が比較的容易であるなどの利点がある。しかし、大半の株化細胞は正常組織由来の細胞とは異なる性質を持ち、in vitro毒性試験においても生体の影響を正確に反映する正常細胞の使用が望まれている。正常細胞のソースとしては初代培養細胞などが使用されているが、動物から適宜調製する必要性やヒト細胞の入手が困難であるなどの欠点がある。そのような状況下、近年、初期胚由来の正常な培養細胞である胚性幹細胞（ES細胞）が注目されてきた。ES細胞は、試験管内で無限に増殖可能で、体を構成する様々な種類の細胞へ分化し得る「多能性」を有する受精卵由来の正常細胞である。また、近年話題のiPS細胞は、分化細胞から人工的に作られた（ES細胞に類似した）多能性細胞である。特に、ヒトES/iPS細胞は、ヒト正常組織細胞のソースとして非常に有用であり、再生医療への応用だけでなく、安全性・薬効評価研究などへの活用が期待されている。そこで、本演題ではES/iPS細胞を用いたin vitro毒性試験の可能性について、１）分化細胞を用いた試験、２）分化過程を利用した発生毒性代替法試験に関して、種差の検討も含めて現状および我々の取り組みを紹介したい。

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欧米の影響を受け、日本でも動物実験代替法（以下、代替法と記す）のニーズが社会的にも、経済的にも増している。動物実験の３R(削減、苦痛の軽減、置き換え)を促進することには、総論として賛成される方が多いが、各論となると種々の問題点が挙げられ、その必要性に苦言を呈する方が多い。特に、安全性評価の方法となると、一つの代替法のみで評価はできず、物性、構造活性相関や代替法の組み合わせで評価せざるを得ない。しかも、現在主流である局所毒性試験（眼刺激性、皮膚腐食性、皮膚刺激性）の代替ならばともかく、より複雑な反復投与を伴う毒性試験への利用となると、生体がブラックボックスであることもあり、何を指標とするかでさえ、絞り込めていない。本来、代替法とは作用機構が明確な方法を用いて、再現性や正確性が認められたものを行政が用いることになるが、本当に今のスタイルを続けるだけで作用機構が多岐に渡る反復投与を伴う毒性試験の代替にはどれくらいの経費と時間が必要か予想さえできないと考える。 そのような状況の中、最近、代替法という言葉自体が適切なのか疑問を感じている。まず、in vivo試験との比較、それと一致することを重視するという発想でよいのか。in vivoとの比較でin vitro試験の善し悪しを判断するのでなく、発想を転換して、従来のトキシコロジーの枠を超えたin vitro トキシコロジーを発展させられないか。その鍵は、反復適用を経時的に捕えたトキシコゲノミックスのデータ解析による作用機構の解析であると考える。具体的には、A⇒B⇒Cという生成物を追うことにより、最終的な毒性指標（生産物）でなく、初期に挙動を示す遺伝子の定量的な解析により、遺伝子を絞り込むことと考える。毒性物質に曝露された生体のブラックボックスを解明するという姿勢ことが、in vitro トキシコロジーの発展につながり、結果的には新しい動物実験に頼らない試験法の開発につながると考えている。

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リトコール酸(LCA)を実験動物に処置すると胆汁うっ滞型の肝障害を誘起することより、LCAは肝障害モデルとして汎用されている。我々はLCA誘発性肝障害の機序解析の過程で胆汁中に排泄されるリン脂質の低下と胆汁うっ滞型肝障害の関連を考え、リン脂質に加えその生成に関与するトリグリセリド、遊離脂肪酸の代謝がLCA誘発性肝障害のバイオマーカーとなるのではないかと考え研究を進めた。毒性発現初期のバイオマーカーを検索するためLCA投与の経時的解析を行ない、既知の毒性パラメーター（ALT, ALP）と肝内の脂質（リン脂質、トリグリセリド、遊離脂肪酸）レベル、脂質代謝関連遺伝子発現レベルの関連を解析した。雌性C57BL/6Nマウスに0.4%LCAを混餌で３、５，９日投与したところALTは５日目で、ALPは９日目で初めて有意に増加した。肝内脂質レベルについては遊離脂肪酸とトリグリセリドは３日目で、リン脂質は５日目で有意に減少した。このことより障害の生じる前段階から肝内の遊離脂肪酸とトリグリセリドが、それに引き続きリン脂質が低下することが示唆された。マイクロアレイ等による脂質代謝関連遺伝子発現解析により投与３日目において脂肪酸、リン脂質合成に関与する遺伝子の多くで有意な発現低下が認められた。ALTの上昇が認められる投与５日目においては脂肪酸、リン脂質合成系に加え脂肪酸ω酸化系遺伝子で顕著な発現低下が、さらに脂肪酸β酸化系遺伝子でも発現の減少が認められた。９日目ではこれらの遺伝子発現のさらなる減少が認められた。核内受容体pregnane X receptor (PXR)のアゴニストpregnenolone 16α-carbonitrile (PCN)投与はマウスのLCA誘発性肝障害を軽減する。PCN投与は肝臓の脂肪酸合成系遺伝子の発現、脂肪酸合成活性を亢進し、脂肪酸β酸化系遺伝子発現を低下させて肝内脂質レベルを増加させた。これらの結果よりLCA誘発性肝障害と肝内脂質レベルの間に密接な関連があることが示唆され、脂肪酸の合成、分解(β酸化、ω酸化)系がLCA誘発性肝障害の初期マーカーとなる可能性が示された。

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【目的】22塩基程度のnon-coding RNAであるmicroRNAs (miRNAs) は血中に安定的に存在し、癌や糖尿病などの病態を反映するバイオマーカーとなり得ることで注目を集めている。我々は、様々な肝障害モデルラットを用いた検討により、miRNAsが肝障害の病型を区別し、診断に利用可能な高感度バイオマーカーとなることを明らかにし、昨年の年会にて報告した。本研究では、様々なタイプの肝障害患者を対象として血中miRNAsの発現プロファイルを解析し、ヒトにおいても血中miRNAsが病型を区別できるバイオマーカーとなり得るか明らかにすることを目的とした。 【方法】B型肝炎、C型肝炎、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎および薬物性肝障害 (肝細胞障害型および胆汁うっ滞型) の患者血清よりRNAを精製し、TaqMan microRNA array (667 miRNAs) を用いてmiRNAsの発現量を網羅的に解析した。 【結果および考察】血中miRNAs発現の階層的クラスタリング解析の結果、薬物性肝障害とそれ以外の肝障害でそれぞれ発現プロファイルが大きく区分された。さらにウイルス性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎と、それぞれの疾患ごとに分類され、各肝障害に特徴的に高値または低値を示すmiRNAが存在することを明らかにした。従って、血中miRNAsはヒトにおいても肝障害の検出および病型の分類に利用可能なバイオマーカーとなることが示された。さらに、肝障害患者と肝障害モデルラットの血中miRNAs発現変動の比較により、薬物性肝障害によって同様の発現変動を示す共通のmiRNAを見出した。従って、血中miRNAsは臨床診断のみならず、医薬品開発における臨床試験および非臨床試験での肝障害の検知にも利用できる可能性が考えられた。

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【目的】近年、尿、血液あるいは組織に含まれる内因性代謝物濃度を網羅的に測定する手法であるメタボローム解析が普及しており、低侵襲性サンプルにおける新規毒性診断／予測バイオマーカー獲得の可能性が期待されている。今回、gentamicin腎障害モデルラットの尿、血液、肝および腎のメタボローム解析を行った。
【方法】9週齢の雄性F344ラットに腎毒性物質gentamicin（0、30、90 mg/kg/day）を7日間皮下投与し、症状観察、体重測定、尿、血液および組織学的検査に加え、UHPLC/MS/MSおよびGC/MS法を用いた尿、血漿、肝および腎のメタボローム解析（Metabolon社）を行った。
【結果・考察】30 mg/kg/day以上で赤色尿や腎尿細管の変性がみられ、90 mg/kg/dayでは尿細管の壊死および再生、肝臓グリコーゲン減少、AST上昇ならびにTG減少が認められた。メタボローム解析では、各サンプルでそれぞれ400個以上の代謝物が測定され、そのうち約半数が同定された。さらに、有意な濃度変動を示す代謝物が30 mg/kg/dayでそれぞれ30個以上、90 mg/kg/dayでは100個以上みられ、この中には未同定物質も多いことから、新規腎バイオマーカー候補が含まれる可能性も考えられる。また、90 mg/kg/dayにおける同定代謝物プロファイル分析から、アミノ酸および炭水化物の尿中濃度増加と腎中濃度減少より腎尿細管再吸収の低下、遊離脂肪酸の血中濃度増加と肝中濃度減少ならびに3-hydroxybutyrateの血中濃度増加傾向より脂肪酸β酸化の亢進が示唆された。さらに、腎中では組織障害や細胞膜リモデリングに関連する複数の代謝物に有意な変動が認められ、これらは組織学的な尿細管壊死および再生を反映していると考えられた。生体内における現象を包括的に捉えることのできるメタボローム解析は従来にないアプローチであり、毒性発現メカニズム解明およびそれに続くバイオマーカー獲得に向けた活用が今後一層期待される。

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【目的】バセドウ病をはじめとする甲状腺疾患において肝機能検査が高値となる例が多い一方で、抗甲状腺薬による重篤な肝障害が報告されている。トランスアミナーゼはどちらの場合にも異常値を示し、これまで両者を鑑別できるマーカーは存在しなかった。今回、血清中オルニチンカルバミルトランスフェラーゼ（OCT）の抗甲状腺薬誘発肝障害における有用性を、動物モデルを用いて検討した。【方法】雄性Wistarラットに甲状腺ホルモンT3（0.1mg/kg）を10日間皮下投与した甲状腺機能亢進症モデル、プロピルチオウラシル(250mg/kg)、あるいはメチマゾール(200mg/kg)を7日間経口投与した薬剤誘発肝障害モデルについて、血清中および肝臓組織中のOCTおよびトランスアミナーゼを測定した。両モデルの肝障害を病理組織検査により評価した。【結果】甲状腺機能亢進症モデルにおいて、血清中トランスアミナーゼは上昇したが、OCTは変動しなかった。肝臓組織中のトランスアミナーゼは有意に上昇しており、血清中濃度と有意な相関が確認された。病理検査では軽度のびまん性過形成が確認された以外に異常はみられなかった。薬剤誘発肝障害モデルにおいては、血清OCTはいずれの薬剤でも２倍以上に有意に上昇したが、血清中トランスアミナーゼはわずかに上昇するか、逆に低下していた。肝臓組織中のトランスアミナーゼは薬剤により変動がみられたが、OCTは変動しなかった。病理検査では、中程度の脂肪変性と部分的な細胞壊死等が確認された。【考察】トランスアミナーゼは甲状腺ホルモン異常や薬剤投与により肝臓組織中濃度が変動し、血清中濃度に影響していた。一方、OCTは甲状腺ホルモン異常や薬剤投与による肝臓組織中の変動がみられず、肝障害時のみ血清中濃度が上昇したことから、薬剤誘発肝臓障害マーカーとして優れていることが示された。

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システムバイオロジーの一つの応用としてのシステムトキシコロジーは、毒性の影響評価を、システム論的に理解する領域である。この際に、大規模データを利用するアプローチや詳細な分子機構の理解を積み上げる方法などいろいろなアプローチが考えられる。しかし、最終的には、両者の利点を統合することが必要である。同時に、詳細な分子機構の理解を、大規模化する事は新たなチャレンジであると考えている。大規模データで、いろいろな解析ができたとしても最終的に、どうして毒性があるのかなどを説明できる必要があるからである。本講演では、大規模データと詳細な分子機構を使ったアプローチの融合や、大規模知識集約のアプローチなどに関しての我々の試みを議論する。ここでは、各種ソフトウエアプラットフォーム、標準化、知識集約への手法や、背後にあるシステム論的な理解の方法を取り上げる。

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大規模トキシコゲノミクスデータベースを用いた肝・腎毒性の安全性バイオマーカー探索を主目的とした官民共同のトキシコゲノミクス・インフォマティクスプロジェクトは，これから総まとめの時期を迎える．平成19年度より始まった研究活動の中から，多くのバイオマーカー候補が創出され，プロジェクト内の評価基準に従って評価されてきた．これらバイオマーカー創出のアプローチを大別すると，従来の毒性表現型に基づくものと，既知のメカニズムに基づくものに分けられる．表現型に基づくアプローチとは，従来の毒性表現型を遺伝子によって再定義したものと言い換えられる．メカニズムに基づくアプローチとは，毒性発現メカニズムを遺伝子発現変動との関連で説明し，その中から毒性を特徴付ける変化の組み合わせを絞り込むものと言い換えられる．どちらのアプローチを選択するにしても，バイオマーカーを特定するためのオールマイティな手法は無く，一長一短がある．毒性表現型に基づくアプローチの場合は，毒性試験で得られた病理所見等を基にして評価データを選択し，インフォマティクスにより毒性表現型と相関して変動する遺伝子発現を抽出することになる．当アプローチにおいては，毒性発現と遺伝子発現変動の関連についての説明が比較的容易ではあるが，通常は複数の生体変化が同時並行的に発生するので，目的とする表現型に対応する遺伝子発現変動の絞り込みに工夫が必要となる．メカニズムに基づくアプローチの場合は，毒性発現メカニズムとして解明されたパスウェイに係る遺伝子を設定し，大規模トキシコゲノミクスデータベース情報との照らし合わせにより，パスウェイ上で特徴的に変動する遺伝子発現を特定することになる．当アプローチにおいては，特定した遺伝子の生体反応との関連性を説明することが容易であるが，まだ解明されていないパスウェイ上にある遺伝子発現変化が全く考慮されていない．本講演では，上記のアプローチによるバイオマーカー探索の事例および本プロジェクトで最近取り入れられ始めたトキシコゲノミクスとメタボロミクスを融合したバイオマーカー探索についても紹介する．

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実験動物、あるいはin vitro評価系により医薬品候補化合物のリスク評価を実施することは、臨床試験に参加する治験者の安全性を担保する目的の他、開発の成功確率向上、さらには開発費用の効率化にも極めて重要である。大規模データ解析技術であるトキシコゲノミクス（遺伝子発現解析）、トキシコプロテオミクス（タンパク質発現解析）あるいはトキシコメタボノミクス（内因性代謝物質解析）は、リスク評価に最適な新規毒性バイオマーカーの選択に有効な手法であり、毒性発現機作、あるいは化合物の構造に特徴的なバイオマーカーの変動について数多くの報告がある。オミクス技術により得られたデータからの適切なバイオマーカ抽出には、これらの膨大なデータを統合的に解析するためのソフトウェア（アルゴリズム）開発が必須となる。内製でのシステム開発の他、毒性バイオマーカー探索に適切なシステムも市販されるようになり、非臨床毒性試験に用いるバイオマーカー探索の他、ヒトへの外挿性向上への貢献も期待される。本シンポジウムではこれらのオミクス技術を用いた毒性バイオマーカー探索に関する現状と将来像について概説する。

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　　より高感度で迅速な毒性評価を実現するために、まず、定量RT-PCRやマイクロアレイなどの網羅的な遺伝子発現解析技術に、細胞１個あたりのmRNA発現量を絶対量として測定するPercellome手法（特許4415079）を組み合わせた。更に、それを用いての高精度かつ大規模なトキシコゲノミクスデータベースを生成する際に、投与する化学物質の用量と投与後の時間経過を一括して3次元曲面にて評価する方法を採用した。これまでに、100種類超の化学物質についてのマウスにおける生体影響のトランスクリプトームをAffymetrix GeneChip MOE430 2を用いて高精度に測定し、データベース化（Percellomeデータベース）した。
　　化学物質の毒性評価においては、所見の網羅性（見落としがない事）が要求され、その中では「有意な反応がない」ことも検出しなければならない。この要件を満たしつつマイクロアレイによる大量のデータを高精度かつ効率よく解析するために、独自のマイクロアレイデータ補正技術(特許出願済）や候補遺伝子抽出技術（RSort）、化学物質間での用量・時間を考慮した遺伝子発現反応比較解析ソフトウエア（Percellome Explorer）等を開発した。これらを利用した毒性評価の試験運用を既に開始しており、病理所見を中心とした動物実験では見いだせなかった情報を得つつある。
　本発表では、Percellomeデータベースを利用した解析の実際を紹介する。

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　　医薬品の開発には多額のコストと長期の開発期間が必要である。ヒトゲノム配列の解読以降、ゲノム情報を創薬へ応用し、画期的な新薬開発や創薬効率の向上に繋げるべく様々な努力がなされている。しかし、2000年以降、研究費は年々増大するものの、薬事規制当局に承認申請された医薬品の数は日米欧ともに年々減少する傾向にある。その原因は様々であるが、中でも非臨床と臨床のギャップによる臨床試験での成功確率の低さが大きな問題となっている。そこには種差の問題が大きく立ちはだかり、動物試験において有効性や安全性に関する十分な検討を行なったにも関わらず、臨床試験において十分な有効性・安全性が担保出来ず開発が中止されるケースが多々あり、如何にして成功確率を高めることが出来るかが課題の一つである。また、製薬企業にとっては革新的な医薬品を生み出しうる新規の創薬ターゲットを確保し、新たな医薬品を生み出していくことも重要な課題である。
　　京都大学／山中教授によって見いだされたiPS細胞は、リプログラム因子の利用により、成人の体細胞から多能性を有する幹細胞を誘導する画期的な技術である。その最大の特徴は由来する細胞のゲノム情報をそのまま利用できる点にある。この特徴を利用し、患者由来のiPS細胞を用いた疾患メカニズムの研究による新規医薬品ターゲット分子の提示や、誘導されたヒトの心筋細胞や肝臓細胞を創薬の早い段階で利用することによって成功確率を高めることなど、創薬支援ツールとして多面的な利用に繋げていくことが大きく期待されている。しかし、誘導された分化細胞をどのように利用していくのか、分化細胞が示す性質が臨床とどの程度相関しているのか、また、既存の評価体系の中でどのように位置付け、より予測性が高く効率的な評価体系へと刷新していくのかなど、実際に創薬支援技術として応用していくためには、解決すべき様々な課題がある。
　　本講演では、NEDOで進めているヒトiPS等多能性幹細胞の創薬応用に向けた取り組み事例を中心に紹介をしつつ、当該技術が創薬支援・毒性検査技術をどのように革新していくのか、その将来展望について述べたい。

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心毒性、特に催不整脈作用が薬物開発の妨げとなっていることは周知の事実である。多くの薬物ターゲットがhERGチャネルであることから、hERGをHEK細胞株に異所性に発現させたhERG/HEK細胞を用いた薬物安全性評価システムなどが利用されている。ところが、一定の割合で偽陽性・偽陰性が起こり薬物安全性評価系のさらなる改善が望まれる。hERG/HEKを用いた薬物安全性評価システムの主な問題点は
(1) 現行のアプローチは、hERGの抑制によるQT間隔の延長をターゲットとしている。ところが、QT間隔を延長しない薬物でも催不整脈作用を有し、またQT間隔の短縮と不整脈発現との関連（QT短縮症候群）も注目されている。臨床では、不整脈発現予測に、TWA(T-wave alternans)、QT dispersion, Tp-Te(Tpeak-Tend)dispersionなど再分極の時間的・空間的バラツキの重要性が指摘されていることから、hERG抑制により生み出される再分極の時間的・空間的バラツキが催不整脈に密接にかかわることが示唆される；
(2) 1990年代にI群薬を使い行われた心筋梗塞後の期外収縮を抑制することによる心臓突然死の予防効果を予測するCAST STUDYが行われた。同研究で、I群薬の催不整脈作用により研究が途中で終了されたことから、再分極に対する作用だけが薬物による催不整脈の原因ではないこと、心臓ストレス環境下で催不整脈作用が増強することがあること；
などが考えられる。そこで、これらを念頭に入れたシステムを開発することにより、薬物安全性評価システムの精度を向上できる可能性がある。そこで、今回は上記の問題点とこれに対して我々が取っているアプローチについて議論する。

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致死性不整脈につながる薬剤性心室再分極遅延作用の評価には、ICH S7Bガイドラインで定められたコアバッテリー試験としてin vitro IKr電流阻害および非げっ歯類を用いたin vivo心電図評価試験が必須となっている。しかしながら、これらは薬剤のイオンチャネルに対する直接的かつ短期的な阻害作用評価系であり、近年注目されているチャネルの細胞膜への移行（トラフィッキング）阻害に関しては、現有のin vitro評価系では培養細胞あるいは組織・臓器が数時間～数日間に及ぶ長期測定に耐えられないこと、in vivo評価系では高用量の長期連投に伴う多大なリソースを必要とすること等問題が多く、一般的には評価されていないのが現状である。
近年、ES、iPSなどの胚性幹細胞から分化させたヒト由来心筋細胞の再分極遅延評価系への応用が進んでいる。現在最も開発の進んでいる評価系であるfield potential (FP)計測系は非侵襲的実験系であり、薬剤の長時間曝露の影響も評価しうると考えられる。さらに本評価系は、ヒト由来組織を用いるため「種差の壁」を克服し他の非臨床試験に対してヒトへの外挿性の点で優位であること、in vitro評価系であることから必要検体量も少なく、初期スクリーニング系として運用可能であること等利点が多い。そこで我々は、東京医科歯科大・安田研究室でNEDOプロジェクトの一環として開発が進められているオンチップ・セロミクス培養計測系を用い、IKr/ hERGチャネルトラフィッキング阻害作用評価系の確立を目指している。今回、同一標本から数日間、薬剤の曝露下で経時的にFPを測定し、IKr/ hERGチャネルトラフィッキング阻害作用が検出可能であること、さらにhERG導入CHO細胞を用いた結果（Skakura et al. 2009）とは異なる興味ある知見が得られたので報告する。

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　ヒトES細胞やヒトiPS細胞は、肝臓をはじめとするあらゆる組織細胞に分化することから、薬物の毒性スクリーニング系や再生医療等への応用が期待されている。しかしながら、従来の液性因子（増殖因子やサイトカイン等）による分化誘導法では、ヒトES／iPS細胞から肝細胞への分化効率が極めて低いこと、さらに得られた細胞も薬物代謝酵素の活性が低い未成熟な肝細胞であることが課題となっている。我々は、一過性に効率良く目的遺伝子を発現させることが可能なアデノウイルスベクターの特徴を最大限に生かして、ヒトES／iPS 細胞から肝細胞への分化過程において、肝臓の発生に重要な遺伝子を、分化の適切な時期に導入することにより、肝細胞への分化効率を比較的に高めることに成功した。即ち、ヒトES／iPS細胞由来の中内胚葉系細胞や内胚葉系細胞へSOX17遺伝子やHEX遺伝子を導入することにより、従来法と比較し肝幹細胞への分化誘導効率が飛躍的に向上した。さらに、SOX17遺伝子やHEX遺伝子を導入することにより得られた肝幹細胞を肝分化に適したHGF等の液性因子を用いて培養したところ、薬物代謝活性能などにおいて胎児期肝臓に相当した機能性のある肝細胞を分化誘導することができた。また、他の機能遺伝子の導入と組み合わせることにより、さらに高い薬物代謝活性能を有する肝細胞の分化誘導に成功し、薬物代謝活性の遺伝子発現レベルは初代培養ヒト肝細胞と匹敵するレベルであった。本講演では、我々が取り組んでいるヒトES／iPS細胞から肝細胞への分化誘導法の開発に関する研究について紹介する。

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薬物依存は薬物の中枢神経作用により形成されることから、薬物依存性試験では、中枢神経作用を有する薬物が対象となる。薬物依存性試験のガイドライン/通知としては、日本の厚生省の薬麻第113号（1975年）、欧州のEMEAガイドライン（2006年）、及び米国FDAドラフトガイダンス（2010年）が発表されているほか、ICH M3(R2)ガイダンス（2009年）にも薬物乱用能に関する非臨床試験法が記載されている。これらの指針では、初めに様々なデータから被験物質の中枢神経作用プロフィールを明らかにし、その結果から薬物依存性に関する詳細な非臨床試験が必要な場合は、精神依存性と身体依存性に関する試験を行うとされている。精神依存性に関しては、薬物自己投与試験、条件づけ場所嗜好性試験、薬物弁別試験などの実施が推奨されている。薬物自己投与試験では、動物がレバースイッチを押すと動物の静脈内に慢性留置されているカテーテルを介して一定量の薬液が注入される条件で被験物質の強化効果を調べる。アカゲザルでは、これまでヒトが乱用した多くの薬物や化学物質のほとんどで強化効果を検出できることが知られている。条件づけ場所嗜好性試験では、被験物質又は媒体を投与した動物を白色又は黒色の箱内に一定時間閉じ込めて薬物効果を環境に条件づけし、次に、2つの箱に自由に移動できるようにしてそれぞれの箱内の自発的滞在時間を比較し、薬物の報酬効果を調べる。薬物弁別試験では、被験物質による内部感覚変化について既知の依存性薬物との類似性を調べる。また、身体依存性に関しては、被験物質の反復投与後に休薬し、退薬症候を観察する試験法が推奨されている。一方、臨床試験については米国ドラフトガイダンスに詳しく記載されており、精神依存性に関しては、主として質問紙法による自覚効果の検索を行うほか、ヒトにおける薬物弁別試験及び自己投与試験も紹介されている。

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依存性物質に対する摂取欲求を適切に制御することは、薬物依存をはじめとする様々な物質使用障害の治療や予防において中心的課題である。実際、アルコール依存においてはアセトアルデヒドの代謝を抑制する断酒剤が用いられており、禁煙補助薬としてはニコチンによる報酬効果発現を制御するニコチニックアセチルコリン受容体α₄β₂サブユニット部分作動薬が用いられている。一方、覚せい剤、オピオイド、幻覚剤などの多くの依存性物質に対する摂取欲求のメカニズムには不明な点が多く、少なくとも本邦ではこれらの摂取欲求を抑制する治療薬は認められていない。演者らは、摂取欲求を抑制する治療薬の探索を進めており、G蛋白質活性型内向き整流性カリウム（GIRK, Kir3）チャネルに注目している。GIRKチャネルは、Gi/o型のG蛋白質と共役する受容体のシグナル伝達におけるエフェクターの一つである。つまり、オピオイド受容体やD₂タイプのドーパミン受容体などが活性化するとGIRKチャネルが開口し、細胞膜が過分極になり細胞の活動性が抑えられる。このようにGIRKチャネルが様々な依存性物質の作用機序と関係していることから、GIRKチャネルを抑制することで依存性物質への嗜好性を減弱させる可能性が考えられた。そこで演者らはGIRKチャネルを阻害する薬物を広く探索し、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（SSRI）であるフルオキセチンとパロキセチンにはGIRKチャネル阻害能が認められるが、SSRIであるフルボキサミンには認められないことを見出した。また、薬物条件付け場所嗜好性試験を用いてマウスのメタンフェタミン嗜好性に対するこれらのSSRIの効果を調べたところ、フルオキセチンとパロキセチンにはメタンフェタミン嗜好性を減弱させる効果が認められ、フルボキサミンには認められなかった。GIRKチャネルは依存性物質に対する摂取欲求を制御する重要な分子であり、薬物依存の治療標的としても注目すべき分子であると考えられる。

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乱用性薬物の“自己”投与がヒトでの基本的摂取形態である事を念頭におけば、動物を用いての薬物依存に関わる研究戦略として、薬物自己投与実験法がより妥当性の高い方法と言える。この薬物自己投与実験法は、(1)薬物摂取行動の獲得過程、(2)薬物を生理食塩液に切り替えての消去／退薬過程および(3)退薬時での薬物探索行動の再燃過程に分けられる。一方、臨床上の“渇望”誘発要因としては、(1)アルコールや興奮薬等の興奮作用を有する薬物の少量再摂取、(2)薬物摂取時の場所・状況等の視覚的・聴覚的刺激（薬物関連刺激）および(3)重篤な精神的・身体的ストレス負荷の3つが考えられている。ヒトで乱用される薬物はラットでの薬物自己投与行動が成立し、上記の3つの“渇望”誘発要因によりいずれも生理食塩液自己投与下でのレバー押し行動（薬物探索行動）が誘発される。このレバー押し行動は臨床上の“薬物探索行動”を彷彿させる事から、“渇望”の動物モデルとされている。薬物探索行動の発現機構は、薬物の報酬効果のそれに類似しているのか、また３つの“渇望“誘発要因は同一の神経機構を介しているのか－等が興味の持たれる点である。脳内局所破壊法ならびに脳内薬物微量注入法により、薬物探索行動の脳内責任部位は、薬物摂取行動／報酬効果のそれとは異なる事が示唆されている。また薬物探索行動に関与する神経系としてドパミンおよびグルタミン酸神経系を中心に検討されてきたが、誘発要因によって異なる事も明らかにされている。一方、内因性カンナビノイドの脳内報酬系への関与も指摘されている。近年、依存性薬物の渇望発現にはカンナビノイドCB1受容体の活性化が重要な役割を演じている事が明らかにされ、薬物依存症の治療薬開発への新しいシードとなる可能性がある。今後は “渇望”のモデル動物での情動や認知機能の変容にも焦点を当てた多面的なアプローチが必要である。

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現在、米国を中心に処方薬乱用が問題になっており、その上位を締めているのが鎮痛薬である。一方、モルヒネ等のオピオイド鎮痛薬は本邦においてもWHO方式がん疼痛治療法に従い広く用いられているが、その使用量は先進諸国の中で最も低い状態にある。この原因はモルヒネなどの医療用麻薬に対する誤解のためと考えられる。そこで、鎮痛薬に焦点を当て、疼痛下のオピオイド鎮痛薬の報酬効果を中心に紹介する。演者らはホルマリンやカラゲニンをラットの足蹠に投与して炎症性疼痛モデルを作製した。この疼痛モデルを用いて、モルヒネ等のオピオイド鎮痛薬の報酬効果が有意に抑制されることを明らかにした。さらに、この抑制機構にκオピオイド神経系が関与し、炎症性疼痛下におけるモルヒネの精神依存の形成抑制はκ受容体拮抗薬の前処置により消失した。さらに、中脳辺縁ドパミン神経系の投射先である側坐核におけるモルヒネ誘発ドパミン遊離亢進は炎症性疼痛下で有意に抑制され、この抑制もκ受容体拮抗薬の前処置により消失した。したがって、炎症性疼痛下ではκオピオイド神経系が亢進され、その結果モルヒネの精神依存の形成が抑制されることを示唆した。次に、マウスおよびラットの坐骨神経を半分強く結紮して神経障害性疼痛モデルを作製した。この神経障害性疼痛モデルを用いて、モルヒネ等のオピオイド鎮痛薬の精神依存を同様に検討したところ、いずれのオピオイド鎮痛薬による報酬効果の形成も有意に抑制された。この抑制機構は炎症性疼痛と異なり、主に中脳辺縁ドパミン神経系の起始核において内因性βエンドルフィンが過剰に遊離されるため、腹側被蓋野に分布するμオピオイド受容体の機能低下が誘発されることに起因することを明らかにした。以上のことから、がん疼痛治療にモルヒネなどのオピオイド鎮痛薬を適正に使用すれば依存性が問題になることは殆どないと考えられる。

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覚せい剤、ヘロインなどの依存性薬物の他、酒や煙草などの嗜好品を含む種々の物質の慢性摂取により薬物依存が生じる。これらの依存性物質はそれぞれの標的分子に作用し、最終的には中脳辺縁系ドーパミン作動性神経系を中心とする脳内報酬系を活性化し、薬物乱用の引き金となる報酬・強化効果を示す。また、薬物依存の形成とともに精神機能障害（薬に対する渇望、精神病様障害など）が生じ、断薬してもその再発・再燃脆弱性は長期間維持される。依存性物質による精神機能障害には前頭葉皮質が重要な役割を果たしており、薬物依存にはシナプスの構造あるいは機能的変化を伴うシナプス可塑性が関与している。この依存性物質によるシナプス可塑性には神経栄養因子やサイトカイン、プロテアーゼなどの種々の生体分子が関与しており、これら内因性薬物依存修飾因子は、依存形成に促進的なpro-addictive factorと抑制的なanti-addictive factorに大別される。Pro-addictive factorの一つである組織プラスミノーゲン活性化因子は依存性薬物により側坐核で誘導され、プラスミンを介してドーパミン神経伝達を増強する。一方、anti-addictive factorであるTNF-αはドーパミントランスポーターを活性化してドーパミン神経伝達に抑制的に作用する。さらに、glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) 遺伝子変異マウスを用いた薬物自己投与試験ならびに薬物探索行動の再発試験により、GDNFがメタンフェタミンに対する依存形成と再発脆弱性に関与していることが明らかになっている。内因性薬物依存修飾因子の動態とその機能解析が薬物依存の病態生理の理解と治療法の開発に重要である。

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The Health and Environmental Sciences Institute (HESI) is the global branch of the International Life Sciences Institute (ILSI) whose mission is to stimulate and support scientific research and educational programs that contribute to the identification and resolution of health and environmental issues of concern to the public, scientific community, government agencies, and industry. HESI’s programs bring together scientists from around the world from academia, industry, regulatory agencies, and other governmental institutions to address and reach consensus on scientific questions that have the potential to be resolved through creative application of intellectual and financial resources. This “tripartite” approach forms the core of every HESI scientific endeavor. As a non-profit organization, HESI provides a unique, objective forum for initiating dialogue among scientists with different perspectives and expertise. Industry members provide primary financial support for HESI programs, but HESI also receives financial and in-kind support from a variety of U.S. and international government agencies.

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Human exposure to DNA-damaging agents is an important health issue because it has the potential to cause adverse health consequences. In vitro assays are key elements of the battery of genotoxicity assays. During the past 15 years, accumulated evidence has shown that a large number of the mammalian in vitro positive findings were not confirmed in in vivo genotoxicity and/or carcinogenicity studies, raising the question of their relevance to human. The mission of the In Vitro Genetic Toxicity (IVGT) Testing Project Committee of ILSI Health and Environmental Sciences Institute (HESI), is to improve the scientific basis for interpretation of in vitro genetic toxicology data for purposes of more accurate human risk assessment. It is increasingly accepted that positive results should not be considered in isolation, and that weight of evidence and mode of action approaches should be preferred. To this aim, IVGT Committee 1) elaborates recommendations for follow-up testing strategies, 2) considers how quantitative data can be used to extrapolate from in vitro to in vivo exposures and from rodent to human risk assessment, 3) supports the improvement of existing assays, and 4) facilitates the evaluation and development of new technologies and approaches that would improve the prediction of effects in humans. Scientists from 15-20 industrial companies, as well as academic institutes and regulatory authorities are involved in this effort that could lead to innovation in risk assessment.

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これまでの遺伝毒性試験は、発がん可能性のある化学物質をできるだけ広範囲にスクリーニングするため、その検出感度の向上による遺伝毒性ハザードの同定に焦点が当てられてきた。しかしながら、このストラテジーは、ヒトに対するリスクとは無関係と思われる陽性反応を多くもたらす結果となり、そのわずかな遺伝毒性の真偽を巡り規制が進まないことがしばしば起こる。そのため現在では、遺伝毒性においてもハザードからリスクへの転換が求められている。このパラダイムシフトはICH（医薬品規制調和国際会議）ガイドラインに強く反映されている。たとえばICH-S2（遺伝毒性試験）ではin vitro哺乳類細胞を用いた遺伝毒性試験では非生理的条件下で起こりうる擬陽性を避けるため最高用量の低減化、毒性条件の緩和等が行われた。一般に、リスク評価には暴露評価と共に、ハザードの同定（Hazard identification）が必要とされるが、遺伝毒性で重要なのはハザードの同定ではなく、ハザードの特徴付け（Hazard Characterization）である。このためには１）Weight of Evidence (WOE); 試験結果の生物学的妥当性、２）Mode of Action (MOA)；ヒトに対する遺伝毒性ハザードの妥当性、３）Genotoxic Mechanism；発がんへの関与の妥当性、４）Quantitative Analysis；定量的評価の４点から遺伝毒性試験結果の評価および、試験ストラテジーの構築をする必要がある。HESI-IVGTプロジェクトではこのHazard Characterizationに必要な要因を明らかにし、改良、開発を行うことにより、真の遺伝毒性リスク評価を行うことを目的としている。

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　遺伝毒性発がん物質には閾値がないとの仮説に基づいて発がんリスク評価がなされている。我々はこれが正しいかどうかを検証するために、ラット肝発がん中期検索法を用いて、種々の遺伝毒性発がん物質の低用量発がん性を"Weights of evidence"の観点から検討してきた。
　食肉や魚の焼け焦げに含まれているヘテロサイクリックアミンの一つであるMeIQxを様々の用量で16週間経口投与した結果、肝前がん病変の指標であるglutathione S-transferase placental form (GST-P)陽性細胞巣の発生は0.001～l ppmでは増加せず、10 および100 ppmで増加を示した。また、lacI遺伝子導入トランスジェニックラット、すなわちBigBlueラットにMeIQxを上述の用量で投与したところ、10 ppm以上で変異頻度の増加を、100 ppmでGST-P陽性細胞巣の増加を認めた。これらの結果より、MeIQx の肝発がん性およびin vivo変異原性に無作用量の存在が明らかとなった。また、ヘテロサイクリックアミンであるIQおよびニトロソ化合物であるDENの肝発がん性においてもMeIQxと同様に無作用量が認められた。
　さらに、MelQxとDENとの低用量複合投与によるラット肝発がん性を検討した。DENの投与量を0.01 ppm（単独での無作用量）と一定にし、MeIQxの投与量を0.01から100 ppmまでかえた実験では、GST-P陽性細胞巣の発生は複合投与してもDENを併用投与しないのと同様、MeIQx 1 ppm（単独での無作用量）までは無処置群と変化なく、10 ppm以上で増加を示した。なお、各用量のMelQx投与群におけるGST-P陽性細胞巣の発生にDEN投与の有無による変動は認められなかった。また、MeIQxおよびDENの両者の投与量をかえた実験では、GST-P陽性細胞巣の発生は無作用量の両者の複合投与群では無処置群と差はなかったが、発がん用量の複合投与群では増加が認められた。このように、低用量の遺伝毒性発がん物質の複合投与においても無作用量の存在することが判明した。 　以上より、遺伝毒性発がん物質には閾値、少なくとも実際的な閾値があると結論される。これらの結果が、発がんリスクアセスメントに有用な情報となり、リスクマネジメントに大いに役立つことが期待される。

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Improving Existing Assaysは2010年のIn Vitro Genotoxicity Testing (IVGT)プロジェクト年会で設置されたばかりの新規ワーキンググループである。2009年に開催された第5回の「遺伝毒性試験に関する国際ワークショップ(IWGT)」にて、in vitro試験で頻発するfalse positiveを低減するための下記のような方策を継続議論する目的で、本ワーキンググループは企画された。
１．使用細胞種：p53機能の重要性を確認するために、ヒトリンパ芽球細胞であるTK6（正常p53）とWIL2-NS（変異p53）を用いて、non-DNA-reactive化合物の小核誘発性を比較。さらに、p53の変異が報告されているマウスリンフォーマ細胞L5178Yと比べることで、ヒト細胞とげっ歯類細胞の差異を確認。
２．細胞株の入手：入手経緯が明らかで継代数が少ない細胞の凍結保存を調査。
３．最高処理濃度：現行の10 mMからの低減を討議。
４．細胞毒性指標：in vitro試験における適切な細胞毒性指標の推奨。
５．代謝活性化系：ヒト肝S9利用可能性に関して、文献検索を含めた現状調査。
６．新規細胞：AHH-1やFE1等の利用可能性を論議。
本発表では、2011年4月のIVGT年会で議論された内容および本ワーキンググループの活動を紹介する。

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遺伝毒性評価の分野においては，”ハザード同定”を主眼とした定性的な評価が長年用いられてきた．HESI IVGTの"Quantitative Subgroup"では，従来の定性的評価から定量的な遺伝毒性リスク評価への移行を目指し，遺伝毒性試験の用量反応データを中心としたリレイショナルデータベースの開発を開始している．このデータベースを遺伝毒性の定量的リスク評価に関する議論の科学的土台とし，データ収集と用量反応データの解析を通じて，下記の課題に取り組もうというものである．1) 遺伝毒性試験の用量反応データの解析における基本パラメーターおよび標準的解析方法の検討 2) DNA反応性を有する遺伝毒性物質の用量反応性に閾値がないとする仮定の妥当性 3) ”遺伝毒性の懸念” threshold of genotoxic concern (TGC)について閾値を設定することの妥当性．これらQuantitative Subgroupの取り組みについて紹介する．さらに，遺伝毒性における定量的評価の試みの一環として，暴露量に着目した染色体異常検出のためのin vitro試験とin vivo試験の相関解析の結果を紹介する．興味深いことに，in vitroにおける暴露量（最小陽性用量）と in vivoにおける暴露量には比較的良好な相関がみられた．この結果は，in vitroの遺伝毒性試験の用量反応データが，生体における遺伝毒性リスク評価において定量的な情報を提供する可能性を示すものと考えられた．

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　　哺乳類実験動物を用いた毒性試験の分野では、神経毒性の検出法に永らく末梢神経を主対象とした機能観察試験バッテリー（所謂FOB試験）を充ててきた経緯から、農薬を含む神経作動性化学物質（Neuroactive Xenobiotics;　NX）の神経影響は急性毒性であるとの認識が浸透してきていた。
　　他方、1981年のウィーゼル・ヒューベルの視覚野機能に関するノーベル生理学・医学賞等で発生・発達期の脳は神経シグナルをその形成と成熟に活用している事が明らかにされながら、毒性学的にはこの様な見地からの遅発性中枢性毒性の評価法の開発が進んでいなかった。我々は、NXによる神経シグナルかく乱が脳の高次構造、高次機能に慢性・遅発性の影響を与える、との仮説に基づき、急性症状の殆ど現れない量のNXを胎生、幼若、或いは成熟期マウスに単回暴露したのち遅発性に情動認知行動の逸脱が誘発されることを、それに対応する物的証拠（海馬等の微細構造、タンパク、mRNA発現の変化）とともに確認している（NXとしてアセフェート（コリンエステラーゼ阻害）の他、ドーモイ酸（グルタミン酸系）、トリアゾラム（GABA系）等についても確認済み）。
　　これらの結果から、人に於いても有機リン系殺虫剤等により慢性・遅発性中枢影響が誘発される蓋然性を考察していたところ、黒岩幸雄先生からサリン被曝の症候として、五年間のカルテ保存期間を超えての再診被害者が存在するとの紹介を頂き、早速、本シンポジウムを企画したものである。サリンによる遅発性の神経毒性に関しての詳細な臨床情報をその分野のエキスパートからご教示頂けることは、今後の遅発性中枢神経毒性研究の進展にとって大変有意義である。本シンポジウムが契機となって、毒性学にとって救急医療の現場との密な連絡、日本中毒学会等を含む幅広い臨床領域との連携が重要である、ということが再認識される事を望むものである。

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　世界から戦争がなくならない限り、通常兵器の発達とともに使われるNBCといわれる核、生物、化学兵器などは密かに新しいものが造られていくものである。特に化学兵器に関しては、本日のシンポジウムで取り上げられるように、神経毒ガスサリンが極微量でヒトを殺傷し、しかも長年にわたって回復し難い神経に対する後遺症を残すことが分かってきた。日本のみならず、世界をも震撼させた地下鉄サリン事件の多くの被曝者が、現在でも多彩な神経症状に苦しんでおられる事実がある。サリンは、一般の研究者では管理や取り扱いが困難で、現在ではサリンを用いてヒトに対する作用を研究発表した例は皆無である。従って、世界中の多くの研究者は、日本で行われた医療処置や治療にあたった医療チームからの情報を入手したいと思うのも無理からぬことである。いずれにしても、サリン被曝者の診断と治療に関して、現在まで蓄積されてきた内容が、本シンポジウムで初めて明らかにされる。特にヒトにおける遅延性神経毒性について、現在まで明らかにされている例が紹介される。さらに、アセチルコリンエステラーゼを標的とする有機リン系化合物の遅延性神経毒性としての発達障害、認知・行動障害などの発現に関する話題も提供される。これらの話題を通して、神経系に作用する化学物質の急性あるいは慢性的な曝露による遅延性の神経毒性に関する理解が深まることであろう。

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【はじめに】1995年3月20日朝、発生した地下鉄サリン事件では死者13名、傷病者6000名を超えるテロ事件であった。当院では当日だけで640名、その後1週間で1200名以上の傷病者が来院した。初期に見られた中毒症状も次第に軽減し、消失するものと思われたが、1年以上を経過しても症状の残存する事例を多数経験したので、継続的に症状の追跡調査を開始した。
【方法】事件後5年間は、当院を初診した被害者にアンケート用紙を郵送して記入後返信してもらった。6年以降は同様に被害者のケアを行なっていたNPO法人リカバリーサポートセンター（RSC）とともに調査を行ない、希望者には検診を実施した。症状アンケートは事件後、被害者の訴えの多かった33種類の症状について重症度を1〜5までのリカートスケールを用いた。なお重症度の3〜5と回答したものを「症状あり」とした。
【結果】後遺症と認定されている眼症状、PTSDをはじめとする精神症状以外での身体症状では、「体がだるい」1年後7.3％、5年後16.0％、10年後43.4％、「体が疲れやすい」は1年後11.9％、5年後23.1％、10年後56.3％、「頭痛」は1年後8.6％、5年後12.5％、10年後44.7％、「下痢をしやすい」は1年後1.0％、5年後11.9％、10年後18.6％。なお、アンケート調査開始時には項目になかった症状のうち「手足のしびれ」は13年後の時点で49.8％と実に半数近くが症状を訴えていた。また受傷時未成年であった被害者への小児科による追跡調査では身体症状は遅発的に発生しており、精神健康度、不安尺度ともに正常域であった。
【考察】多くの身体症状で経年的に訴える頻度が増加していたことは、年齢の変化以外にアンケート回答者の特異性などの因子も関連していると思われるが、有機リン系毒物の遅発的障害に関しても否定できない。

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