Sex preselection by use of X- and Y- chromosome bearing spermatozoa has been recognized to be more efficient. A flow cytometric sperm sorting based on the difference of their DNA content is the best method for separation of X- and Y-sperm. To date, the flow cytometrically sorted sperm has been involved in the production of sex preselected offspring by surgical intratubal insemination, in vitro fertilization and embryo transfer and intracytoplasmic sperm injection. At first, flow cytometer was modified for DNA confirmation and sorting of sperm with high resolution. Especially, the beveled insertion tube could regulate orientation of flat-shaped sperm head. The forward fluorescent detector was essential for measuring DNA contents of sperm. Recently, the high-speed sperm sorting with the orienting nozzle resulted in production of 90% purity of X- and Y-sperm at rate of 6 million sperm per hour. This application can enable to accomplish more conventional technology for both artificial insemination and cryopreservation of X- or Y-sperm in farm animals.

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ヤギにおけるホルモン処理後の排卵率および胚の回収と胚の発生を調べた.発情を非同期化ヤギでは繁殖季節にかかわらず,FSH連続およびPMSG単独処理は非処理より2∼3倍の排卵を誘起した.一方,胚の回収率はFSHとPMSG処理間で異なったが,平均黄体数は同様であった.処理ヤギでの胚の発生では,交尾後6∼8日後で桑実期胚が回収され,8∼10日後に胚盤胞期胚が得られた.これらの結果から,ホルモンで排卵誘起処理したヤギで繁殖期にかかわらず正常胚が得られることがわかった.

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卵細胞質内精子注入法(ICSI)の際の卵細胞膜穿破様式と卵の生存率,受精,分割率,ICSI前の卵の形態学的評価との関連性を検討した.ニードル先端の鋭利性による影響を除外するために,先端が平坦なニードルを使用できるピエゾマイクロマニピュレーターを用いてICSIを行った.ニードルによって卵細胞膜が穿破される様式を細胞膜の伸展性から4タイプに分類した.ICSIを行う成熟卵の約8%は卵細胞膜の伸展性が不良(type A)で,それらの50%はcytolysisを起こした.しかし,生存卵に対しての受精率,受精卵に対しての分割胚率に有意差がなかった.卵内に空胞が認められる不良卵と穿破様式との間にも関連性が認められなかった.

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哺乳動物の卵子は多層の卵丘細胞に覆われている.卵丘細胞と卵子間のギャップジャンクションが閉鎖すると卵子は第2減数分裂中期へと減数分裂を進行する.このギャップジャンクションの閉鎖にはギャップジャンクション構成因子であるConnexin-43のリン酸化が関与している.そこで本研究では,卵丘細胞のConnexin-43のリン酸化の卵子のcAMP量,MAP kinase活性,核相の進行に対する影響について検討した.24時間培養したCOCsにおける卵丘細胞のConnexin-43は脱リン酸型が多く存在したが,培養32時間以降の卵丘細胞ではリン酸型のバンドが著しく濃くなった.次に,24時間培養したCOCsをPI 3-kinase抑制剤(LY294002)あるいはPKC抑制剤(Calphostin C)を添加した培地でさらに24時間培養し,Connexin-43のリン酸化を抑制した.その結果,これらの卵子はcAMP量の有意な増加とMAP kinase活性の著しい低下,第一減数分裂中期での減数分裂停止が観察された.以上の結果から,ブタ卵子の第一減数分裂中期以降への減数分裂進行時において,卵丘細胞卵子間のギャップ結合が閉鎖すると卵丘細胞から卵子へ移行するcAMP量が減少し,卵子内のcAMP量が低下する結果,MAP kinaseが活性化し第2減数分裂中期へと減数分裂が進行することが推察された.

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我々は,全自動核移植システムの要素技術として,核移植作業,その中でも特に脱核作業の際に必要となる卵細胞の回転操作を自動化する機構を開発した.この機構は微小物体の操作に優れている静電気力を利用している.静電気力による現象(electrorotation,dielectrophoresis)を起こすことによって,マウス卵細胞を約60deg/sの速度で回転させることができ,また回転方向を反転させることも可能であった.この操作は通常の培養液中(HTF,CZB)で行うことが出来る.また,静電気力による回転が卵細胞の受精能·発生能に与える影響を確認するため,静電気力によって回転させた卵細胞に対してIVFと核移植を行った.その結果,静電気力で回転させた卵細胞の受精能·発生能は通常の卵細胞と同様であった.したがって,静電気力による回転は卵細胞の受精能·発生能に影響を与えないと言える.

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ウシ体外受精において出現する染色体異常胚の一因を明らかにするために,卵胞内卵子の体外成熟時間に注目し,極端に成熟時間を短縮した卵子を体外受精に供し,作出された胚の染色体分析を行った.卵胞内卵子を卵丘細胞と12または26時間体外で共培養した後,体外受精に供し,媒精48時間後に分割した胚を10時間ビンブラスチン処理し,染色体標本を作製した.媒精48時間後に26時間区では83%が8-16細胞期であったが,12時間区では75.8%の胚が2-4細胞で発生の遅れが見られた.12時間区における染色体異常の出現率は,66.7%であり,26時間区の27.8%より有意に高かった.観察された染色体異常は,半数体,多倍体,倍数性のモザイクであった.これらの異常は,その性染色体の分析結果と統計結果より,未熟な卵子への精子侵入によって引き起こされたものと推察され,未熟な卵子では卵細胞膜や透明帯の形成や機能が不十分なためと考えられた.

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牛卵母細胞体外成熟での透明帯遺伝子発現に及ぼすFSHおよびLHの影響をRNase protection assayで調べた。その結果,ホルモン処理区ではいずれも体外成熟5および15時間後の卵母細胞で透明帯遺伝子発現に影響が認められなかった。しかしながら,FSH区で卵核胞崩壊と減数分裂中期II誘起に有意な抑制が見られた.これらの結果から,FSHとLHは牛卵母細胞での透明帯遺伝子発現に関係がなく,この遺伝子発現はすくなくとも牛では卵母細胞の核成熟とは関連がないことが示唆された.

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ランドレース種経産豚13頭をA群(5頭),B群(4頭)およびC(4頭)の3群に分け,緬山羊用膣内留置型プロジェステロン(P₄)製剤(CIDR-G)を1個または2個7日間挿入し,除去後の発情誘起の検討を行った.その結果,CIDR-Gを2個挿入し除去後PGF_2α(クロプロステノール,0.2625 mg)を陰部に投与したA群では3∼5日以内に5頭(100%)が,1個挿入したC群では2∼4日以内に4頭(100%)の発情を確認した.一方,CIDR-G2個挿入し除去後PGF_2α無投与のB群では,除去後3日目に4頭中1頭(25%)のみで発情が確認された.P₄濃度は,A群およびC群共にCIDR-G挿入後5日目にかけて上昇していた.5日目のP₄濃度は,挿入前の値と比較して有意に上昇していた(p<0.05).CIDR-Gの挿入個数によるP₄濃度の差は認められなかった.このことから,CIDR-Gを経産豚の発情誘起に応用する場合,CIDR-Gを7日間留置し,除去後PGF_2αを投与することで,高率に発情が発現する可能性が示唆された.

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我々は,pMGN(-4k)LacZ-neo遺伝子導入胚性幹(ES)細胞亜株OM3を用いて,キメラマウス胎子を作出し,導入遺伝子発現を解析した.胎子日齢11-13日目(E11-13)では,導入遺伝子を発現する胎児は観察されなかった.E14では,回収された正常な11胎子の内の3胎子で導入遺伝子の発現が認められた.これらのキメラマウス胎子において,導入遺伝子発現領域は,側頭部,頸部から尾部に至る体幹部,および四肢で,広範囲に認められた.組織化学的分析によって,骨格筋特異的な導入遺伝子の発現パターンが観察された.これらの結果は,OM3細胞が,マウス骨格筋形成,および,骨格筋に関する再生医学的基礎技術の開発のための,骨格筋特異的細胞マーカーとして有効であることを示している.

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スナネズミにおける受精卵の経時的変化についてはほとんど報告されていない.そこで本研究では,スナネズミ受精卵の経時的変化を調べた.過排卵処理した雌スナネズミをhCG投与後雄と同居させ,妊娠雌をhCG投与後16,19,20時間目に屠殺した.屠殺後,受精卵の雌雄前核及び精子尾部の存在を確認した.その結果,雌雄前核の割合は,hCG投与後16時間目では24.5%,19時間目では58.9%,22時間目では67.9%と時間毎に増加を示した.精子尾部の割合では,hCG投与後16時間目では85.0%,19時間目では58.0%,22時間目では28.0%と時間毎に減少を示した.

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