本実験は，ラット初期胚の発達に及ぼす4つの異なった体細胞の影響を調べた．卵子はWistar-Imamichiラットより採卵した．ラット4および8細胞期卵子と顆粒層，卵管，子宮，腎臓の各細胞の単層との共培養を行った．培養液はTCM-199に10％仔ウシ血清，乳酸とピルビン酸を加えたm199FCSを用いた．8細胞期から桑実胚および胚盤胞への発達は，顆粒層，卵管，子宮細胞との共培養で各々98.6，95.6，94.1％とm199FCSのみ，腎細胞の77.6，73.7％より有意に発達した．同様に4細胞からの発達は，顆粒層，卵管，子宮，腎各細胞，およびm199FCSのみは，各々32.0，30.7，29.3，0.7，2.7％であった．８細胞期から脱出胚盤胞への発達は卵管，子宮細胞ならびにコンディション液で各々21.2，19.0，2.1％であった．卵管および子宮細胞との共培養は，より卓越していることが明らかになった．184個の1細胞期の卵子と卵管細胞との共培養で，44個の桑実胚，胚盤胞に発達した．

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本実験は，ラット胚盤胞の発達に及ぼすエストラジオール-17β（E₂）とプロジェステロン（P₄）の影響を調べた．ラット8細胞期卵子とラット子宮上皮（UE）細胞との5日間共培養下にE₂およびまたはP₄を添加した．卵子はWistar-Imamichiラットから採卵した．UE細胞は採卵と同時に，m199FCS液で洗浄後，4穴培養皿で培養した．UE細胞が70～80％単層に成長後，卵子と共培養に供した．卵子は採卵，選抜後，4つの濃度のステロイド下でランダムに培養した．卵子の観察は24時間毎に行った．脱出胚盤胞ならびに透明帯脱出後の胚盤胞は，E₂濃度3.5×10^-5，10^-4 M，とP₄濃度3.5×10^-4，10^-5，10^-6 Mで有意に高まった（p＜0.05）．E₂（3.5×10^-5 M）とP₄（3.5×10^-6，10 ^-5，10^-4 M）との組み合わせ透明帯脱出後の胚盤胞が高まった（p＜0.05）．これらの結果から，ラット卵子と子宮上皮細胞との共培養において，卵巣ホルモンが胚盤胞形成後の発育に影響を及ぼしていることが判った．

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ウシの体外受精培地（BO液）におけるカフェイン添加（2.5 mM)が，4種雄個体由来の凍結・融解精子の運動性と，それらの精子を用いてIVFする場合の胚発生に及ぼす影響について検討した．6時間の培養の間，0.5時間毎に精子の運動性を観察した結果，カフェイン添加した区では，いずれの個体においても運動性の増加は認められなかった．一方，媒精後3日目に2から16細胞期に達する胚の割合は，カフェインを添加する場合，1個体のものが他の3個体のものに比べて有意に低い値を示した（P＜0.05）．また，この値は同一個体でカフェインを添加しなかった区に対しても，有意に低いものであった（P＜0.05）．以上の結果から，受精培地（BO液）へのカフェイン添加は，凍結・融解したウシ精子の運動性を刺激しないものと考えられた．また，カフェインは体外における精子の受精能獲得誘起には必ずしも必要ではないものと思われた．

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グルコース（Glu）とリン酸塩（Pi）を含む培地で培養すると，ハムスター胚は2細胞期で発生を停止し，第二卵割を完了できないことが知られている．GluとPiの存在で，発生阻害がどのように生じるかは明らかでない．本研究では，5％非働化子牛血清加M199で2細胞期に発生停止させたハムスター胚のATP含量を測定し，GluとPiの含まない培養液（HECM3）で2細胞期から胚盤胞期へ体外発生するハムスター胚のATP含量と比較した．胚のATP量は，ATP依存性ルシフェリンールシフェラーゼ生物発光法によって測定した．平均ATP含量±標準誤差は，2細胞期で44.5±7.4 fmol/embryo，4細胞期で13.1±1.2 fmol/embryo，8細胞期で72.3±21.0 fmol/embryo，胚盤胞期で22.7±6.6 fmol/embryoであった．4細胞期と胚盤胞期で，8細胞期と比べ，ATP含量に有意な減少が認められた（P＜0.05）．一方，GluとPiを含む培養液（M199）で，2細胞期に発生停止させた胚の平均ATP含量±標準誤差は，98.3±17.1 fmol/embryoで，体外で発生を継続している胚のATP含量よりも有意に（P＜0.05）高い濃度を示した．このことは，ハムスター2細胞期胚の発生停止は，部分的には，このATP高値，すなわち，チトクローム活性やATP合成能の低下が関与するものと考えられた．

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体外成熟したウシ未受精卵子を種々の耐凍剤を用いて超低温保存し，融解後，体外受精に供し，その受精能および第一分割期における染色体異常の出現率を調べた．融解後に形態的に正常な卵子の割合は，0.8 M PROH＋0.8 M DMSO区において56.0％であり，他の区より有意に高かった（P＜0.05）．体外受精48時間後，2細胞期以上へ分割した胚の割合は，0.8 M PROH＋0.8 M DMSO区と1.6 M PROH＋0.2 M sucrose区においては他の区と比べ有意に高い（P＜0.05）という結果であった．第一分割期の染色体標本を分析した結果，すべての凍結区において多倍体の高い出現率が得られたが，対照区と比べ有意な差は見られなかった．また，超低温保存後融解した卵子において構造的異常を示す染色体の出現率も増加しなかった．以上の結果から，0.8 M PROHと0.8 M DMSOを混合した耐凍剤は，体外成熟したウシ未受精卵子の超低温保存において有効であると考えられる．

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本研究ではブタ体外成熟・体外受精卵の体外発生過程における成長因子レセプター（ErbB3，bFGF-R，IGF-I-R，PDGF-Rα）遺伝子発現状況について逆転写（RT）-PCR法を用いて検討した．食肉センター採取の卵巣卵胞より回収したブタ未成熟卵を体外成熟，体外受精および体外発生させた．媒精後10時間（前核初期），20時間（前核後期），36時間（2～4細胞期），84時間（8～16細胞期），144時間（拡張胚盤胞）および168時間（拡張胚盤胞～脱殻胚盤胞）の卵よりmRNAを抽出，RT-PCRに供し，電気泳動後，各遺伝子シグナルの検出状況を調べた．その結果，IGF-I-R，bFGFおよびPDGF-Ra遺伝子発現は発生過程を通じて観察されたが，EGFレセプターサブファミリーの一員であるErbB3遺伝子発現は前核初期段階で検出されず，前核後期以後に初めて観察された．以上の結果より，体外発生過程において，ブタ体外成熟・体外受精卵は成長因子レセプター遺伝子を発現しており, それぞれ特徴的な発現パターンを示すことがわかった．

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体内ならびに体外成熟中のウシ卵丘細胞-卵母細胞複合体の表面微細構造を走査型電子顕微鏡により比較した．また，卵母細胞の直径の変化についても検討した．体内成熟卵は過剰排卵処理した雌ウシからhCG投与後0，12，24時間後に，超音波ガイド法により2 mm以上のすべての卵胞から回収した（それぞれ85，38，39個）．体外成熟卵は屠場卵巣から回収された卵母細胞を0，12，24時間体外培養して得た（それぞれ188，138，228個）．未成熟卵は緊密に配列した顆粒層細胞に囲まれていた．体外培養24時間後に，体内成熟卵に比べ（44％），より多くの体外成熟卵（100％）が顆粒層細胞の膨化を示した．しかし，体内成熟卵の顆粒層細胞の膨化の程度は体外成熟卵のそれに比べ顕著であった．透明帯は成熟のステージや成熟方法に関わらず繊維性のメッシュ構造を示した．未成熟卵の細胞膜には，大型の舌状突起の分布が見られ，これらは成熟に伴い徐々に微絨毛の分布パターンに変化した．成熟12時間後では，体内成熟卵に比べ（11％），より多くの体外成熟卵（100％）の細胞表面が舌状突起の分布パターンから微絨毛の分布パターンへ変化していた（p＜0.05）．卵母細胞の直径は成熟培養中に徐々に減少した．すなわち，0，12ならびに24時間後で，それぞれ127±1，122±1，116±1 μmであった．一方，体内成熟卵ではそれぞれ121±2，129±2，101±1 μmであった．以上の結果から，hCG投与後の体内卵子成熟は体外培養による体外成熟に比べ緩やかに進行する傾向がうかがわれた．しかし，成熟開始24時間後では，体外成熟卵に比べ体内成熟卵において，より顕著で完全な顆粒層細胞の膨化と卵母細胞の直径の劇的な変化が観察された．

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と畜場由来のウシ卵巣の中から成熟した黄体が存在する27頭（対）の卵巣を用いて個体別に体外受精を行い胚の発育について検討した．また，個体別の黄体の直径・重量・小卵胞数（2～5 mm）を測定し，直径6 mm以上の大卵胞（優性卵胞）数およびその卵胞液量を測定後，卵胞液中のエストラジオール値（E₂）とプロジェステロン値（P₄）をRIAにより測定した．体外受精には小卵胞から得られた卵母細胞を用いた．黄体の直径は平均23.3±2.7 mm，重量は平均4.7±1.0 g，小卵胞数は平均44.4±19.6であった．1頭の卵巣には1.6±0.6個の大卵胞があり直径は平均10.7±2.5 mm，卵胞液量は平均1.2±0.6 mlであった．E₂とP₄の結果により，E₂が50 ng/ml以上でE₂/P₄が1以上の卵胞が存在するウシをE₂活性期（E₂-A-dom），E₂が50 ng/ml以下でE₂/P₄が1以上の卵胞が存在するウシをE₂中程度の活性期（E₂-dom），E₂-A-domとE₂-domのどちらもが存在しないウシをE2不活性期（P₄-dom）と判定した．その結果，27頭の卵巣はE₂-A-dom 12頭，E₂-dom 6頭，P₄-dom 9頭に分けられた．これらE₂-A-dom，E₂-dom，P₄-domの3群における平均小卵胞数，平均卵母細胞数，平均卵割率，平均胚盤胞率に有意差はみられなかった（P＞0.05）．また，それぞれの群の中においても依然として個体間に大きな差がみられた．以上の成績から，ウシにおいて優性卵胞内のE₂とP₄は小卵胞内の卵子の質に影響を及ぼさないことが明らかとなった．

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ブタ卵丘細胞卵子複合体（COCs）を24時間基本培地で培養した後，一部のCOCsの卵丘細胞を除去し（裸化卵子，DOs），これらのCOCsとDOsをPI 3-kinaseの特異的阻害剤（ワルトマニン，LY294002）を添加した培地でさらに24時間培養した．COCsとDOsのいずれにおいても，10^-8，10^-7Mのワルトマニン，及び5.0×10^-5M LY294002がM I卵率を有意に上昇させ，M II卵率を有意に減少させた．しかし，DOsのM II卵率におけるPI 3-kinase阻害剤添加区と無添加区（対照区）間の差は，COCsにおける差に比べて著しく小さかった．また，卵丘細胞の膨潤はPI 3-kinase阻害剤により有意に抑制された．これらのことから，卵丘細胞内のPI 3-kinase活性が，M I以降への減数分裂の進行を制御していること及び卵丘細胞の膨潤を促進させていることが推定された．

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遺伝子欠損マウスを用いて精子の凍結保存を試みた．Et1^tm1CskおよびGK^tm1Cskの両側の精巣上体尾部を100μlの凍結保存液（18％ラフィノースおよび3％スキムミルク）内で砕屑することによって精子懸濁液を作製した．ウシ人工授精用ストローに充填した精子懸濁液は，液体窒素ガス中で10分間冷却した後，液体窒素に浸漬した．融解は摂氏30度の水中で行い，1μlの融解精子懸濁液を200μlの培養液で希釈した後，1.5時間のプレインキュベートを行った．次いで，卵子を精子懸濁液に加えることによって体外受精を行った．Et1^tm1CskおよびGK^tm1Cskの受精率は71％および77％であり，移植後の産仔への発生率は，それぞれ32％および65％であった．得られた産仔には，メンデルの法則にしたがって変異遺伝子が伝達されていた．これらの成績は，遺伝子欠損マウスの維持管理において，本精子凍結保存法が，胚の保存法に代替し得ることを示している．

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ヒトT-細胞白血病ウィルスのLTR領域のRU5配列により増強させたマウスphosphoglycerate kinaseプロモーター（PGK-RU5）およびマウス胚性幹細胞ウィルスプロモーター（MESV-RU5）の活性をSV40およびCMVプロモーターと比較した．これらのプロモーター配列に接続したLacZ遺伝子をマウス前核期卵に注入し，これらの胚での発現をX-gal染色により検出した．hCG投与後96時間における桑実期胚への発生率はプロモーター間で差はなかったが，形態的に正常と思われる桑実期胚のLacZ遺伝子の発現はMESV-RU5を用いた場合，他のプロモーターより有意に低くなった．経時的なX-gal染色ではPGK-RU5およびCMVを連結したLacZ遺伝子の発現は2-細胞期でも50％以上の胚で検出可能であり，その後もほぼ同じ割合で推移した．一方，2-細胞期でのSV40およびMESV-RU5のプロモーター活性はPGK-RU5およびCMVよりも有意に低かった．MESV-RU5のプロモーター活性はその後も低い割合にとどまり，染色強度も弱かったが，SV40のプロモーター活性はその後上昇し，桑実期胚ではPGK-RU5およびCMVとほぼ等しい活性を示した．LacZ遺伝子が発現している胚の染色パターンおよび強度は，用いたプロモーターにかかわらず様々であったが，形態的に正常と思われる胚では退行卵や発生停止胚よりもモザイクパターンが多く，染色強度も弱い傾向にあった．

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透明帯を応用した安全な避妊ワクチンの開発のためには，抗透明帯自己抗体を誘導することのできる，B細胞エピトープを見出すことが必要である．本研究では，ウサギZPA蛋白の18アミノ酸（CTYILDPEKLTLRVPYKA）からなるペプチドを化学的に合成し，これをジフテリアトキソイド（DT）に結合して同種のウサギに免疫し，自己抗体の産生を試みた．このペプチドのアミノ酸配列は受精阻害モノクローナル抗体により認識されるものである．免疫は抗原蛋白量500 μgを完全フロインドアジュバントとともに，ウサギの足蹠および背部数ヵ所に皮内注射した．対照として，DTのみを同様にウサギに免疫した．異種動物への免疫として，マウスを用いた．ウサギ，マウス両抗血清ともに免疫に用いたペプチドのみならず，天然のウサギ透明帯にも反応した．免疫組織学的検討から，免疫したウサギでは抗体が in vivoにおいて透明帯に結合していることが証明された．以上の結果より，ウサギ透明帯蛋白の合成ペプチドは，ウサギ自身の透明帯と反応する自己抗体を誘導できる抗原となり得ることが明らかになった．

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ハムスターを用いて体外受精の受精成績におよぼすprogesteroneの拮抗物質，RU486（Mifepristone）の影響について検討した．媒精メディウム中にRU486を1，5，10，20，40および60 μMを含む6つの試験区を設けた．RU486を含まない対照区における受精率は97.3％であった．RU486を1 μM添加した試験区の受精率は94.6％で対照区と差は認められなかった．一方，5 μM以上の試験区ではRU486の濃度依存的に受精率は低下し，60 μM添加区では56.3％にまで低下した（P＜0.001）．以上のように，progesteroneの拮抗物質であるRU486は濃度依存的にハムスターの体外受精を阻害することを明らかにした．

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自然発情周期で妊娠したラットの着床前後における子宮粘膜上皮のEGFレセプターの変動を検討したところ，レセプター量は妊娠3日目から7日目までは上昇する傾向をしめした．また，EGFレセプター・タンパクは着床後に顕著に増加した．一方，下垂体を腎被膜下に移植した場合，着床数は有為に増加したが，妊娠7日目のEGFレセプター量は僅かに上昇しただけであった．これに対し，PMSGとhCGで処理した場合，EGFレセプター量は著しく減少した．これらの結果から，EGFレセプター量は着床前後で変動し，さらにそのタンパク量は着床後に大きく変動するが，それは初期胚と子宮内膜上皮細胞との結合状況によって変化することが明らかとなった．

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