細胞の不等分裂は体制確立に不可欠な過程と考えられる。植物の発生様式は分裂組織においてある細胞集団が未分化状態を維持しながら一方で別の細胞集団が分化し器官原基を形成することにより体制を築き上げていく。このように分裂組織を一生維持する点で後生動物と大きく異なっており、分裂組織に含まれる植物の幹細胞がどのように形成され、維持されているのかは後生動物と異なる分子機構を備えていると考えられているが、よくわかっていない。
ヒメツリガネゴケ原糸体は一列に細胞が並んだ組織であり、頂端に存在する幹細胞により作られる。この幹細胞由来のプロトプラストの最初の分裂は不等分裂であり、頂端幹細胞と分化細胞に分裂する。
我々はヒメツリガネゴケ一過性過剰発現系によりプロトプラスト再生に異常を引き起こす58遺伝子を報告している。これらの遺伝子群の中で幹細胞形成維持に関与している因子を特定するために相同組換えを利用し、各遺伝子のC末端側に蛍光タンパク質YFPを挿入した発現解析ラインを順次作成している。その結果、pphn36p08-citrine融合タンパク質が幹細胞で特に強く発現していることが認められた。この遺伝子は推定アミノ酸配列から植物特異的なVQドメインを持つ機能未知のタンパク質をコードしていることがわかった。現在pphn36p08の遺伝子破壊株を作成しており、発現解析ラインの結果と併せてその表現型を報告し、不等分裂における機能を考察したい。

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高等植物は発芽後、芽生えの頂端部にある茎頂分裂組織から地上部のすべての器官を新たに発生させる。茎頂分裂組織は胚発生過程で生じ、自ら未分化な状態を保ちながら新たな器官を作るための細胞を生み出す。シロイヌナズナの転写活性化因子をコードするCUP-SHAPED COTYLEDON1（CUC1）とCUC2は互いに重複しつつ、胚発生過程で茎頂分裂組織と子葉境界部の形成に重要な役割を果たす。つまり、それぞれの単独変異体ではほぼ正常な芽生えの表現型を示すが、cuc1 cuc2二重変異体では子葉が融合し、茎頂分裂組織を欠失する。一方、CUC1の異所的発現体（35S::CUC1）では子葉の表面に異所的な分裂組織が形成される。
我々はCUC1の下流で機能する遺伝子を同定するために、オリゴDNAマイクロアレイ法によるスクリーニングを行なった。まず、野生株とcuc1 cuc2株に関してCUC1発現初期段階である魚雷型胚由来のRNAを比較し、cuc1 cuc2二重変異体において発現が低下する遺伝子を選抜した。その結果、CUC1およびCUC2の下流候補遺伝子が新規に62個得られた。また、35S::CUC1の芽生えを用いたマイクロアレイ解析から、CUC1の異所的発現により発現が上昇する遺伝子を別に12個得た。現在これらのCUC1およびCUC2の下流候補遺伝子について、野生型胚における発現パターン及び、各候補遺伝子の発現に対するCUC1、CUC2の影響をReal Time-PCR法を用いて解析中であり、その結果を報告する。

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シロイヌナズナのCUP-SHAPED COTYLEDON1 (CUC1) とCUC2は機能的に重複した遺伝子で、胚発生における茎頂分裂組織(SAM)の形成を促進する。これらの遺伝子はこの過程でknox型ホメオボックス遺伝子であるSHOOT MERISTEMLESS (STM) の発現を正に制御する。また、これらは地上部の側生器官のうち子葉、がく片、雄ずいの境界部の形成および雌ずいにおけるreplumや隔壁の形成でも重要な役割を果たす。我々はマイクロアレイを用い、子葉でCUC1の過剰発現により発現が上昇する遺伝子の一つとしてPENNYWISE (PNY) を同定した。PNYタンパク質はBELL型ホメオドメインタンパク質ファミリーに属し、STMと結合してSAMの維持に機能することが報告されている。stm変異体においてもCUC1の過剰発現によるPNY遺伝子の発現上昇が起こることから、CUC1によるPNYの制御はSTMに依存しないことが示唆された。次にpny変異体の表現型を調べたところ、がく片のわずかな融合と、隔壁形成の部分的な阻害が観察された。さらに、cuc1 pnyおよびcuc2 pny二重変異体ではこれらの表現型が顕著に強まり、大部分の花のがく片と隔壁において強い異常が観察された。以上の結果からCUC1、CUC2およびPNYはがく片および隔壁の形成に協調的に機能していることが示唆された。

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多くの高等植物は、茎と主根からなる主軸とそれに付随する花、茎、葉、側根などの側生器官によって構成される。シロイヌナズナPUCHI遺伝子は、AP2/EREBP転写因子ファミリーに属するタンパク質をコードする。これまで我々は、PUCHIが主根と側根原基の境界部で発現し、側根基部における細胞増殖の抑制に働くことを明らかにした。今回我々は、PUCHIの地上部における機能解析を行った。シロイヌナズナの野生型の花には苞葉は形成されないが、puchi変異体では花柄の基部に托葉を伴う未熟な苞葉が異所的に形成されていた。同様の表現型はPUCHIタンパク質とEAR転写抑制ドメインとの融合タンパク質を発現する植物体でも観察された。よって、PUCHIは花柄基部での苞葉・托葉形成を抑制することが示唆された。PUCHIが花序分裂組織と花原基との境界部で発現していたことから、PUCHIは根だけでなく地上部でも主軸と側生器官との境界部で発現し、側生器官形成の発現を制御することがわかった。次に、PUCHIを含む長さの異なる複数のゲノム断片を用いてpuchiの相補性試験を行ったところ、花の表現型を相補するためには根の表現型を相補するよりも長いゲノム領域を必要とすることがわかった。このことから、PUCHIの発現制御に必要なcis領域は地上部と根とで一部異なることが示唆された。

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シロイヌナズナPRESSED FLOWER (PRS) 遺伝子は葉や花器官、花芽などの側生器官の原基の側部領域で特異的に発現しており、側部の形成に関与していることがわかっている。PRS の側部特異的な発現は、各器官の側部に特徴的な構造が形成される前からみられる (Matsumoto and Okada, 2001)。このことは、側生器官における側部領域の決定と分化が、側部に特徴的な構造が形成される前に始まっていることを示唆する。しかしながら、側生器官の側部領域を決定する機構や分化の初期過程についてはほとんどわかっていない。
この機構を明らかにする第一歩として、PRS について側部特異的な発現を制御する機構の解析を進めている。PRS の5’ 側上流2.3 kb の領域は側生器官の側部領域での発現に十分であった。この領域に側生器官の側部領域での発現を制御するシス因子が存在すると考えられるので、シス因子同定のため、プロモーター解析を行った。その結果、花芽と花器官、葉での発現に十分な領域(139 bp)、葉での発現に十分な領域(191 bp) がそれぞれ同定された。葉の側部領域での発現に十分な191 bp の領域について、その領域に含まれるシス制御配列を同定するために、5’ 末端及び3’ 末端を削ったコンストラクトを作製し、現在解析中である。

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植物の地上部の器官は茎頂分裂組織に由来しており、分裂組織の維持機構を解明することは形態形成を理解するうえで重要である。イネlonely guy（log）変異体は葉序の異常、花器官数の減少という表現型を示す。logの花分裂組織は扁平な構造になり、花器官分化が完了する前に分裂組織が退化してしまう。分裂組織マーカーであるOSH1の発現が弱まり、発現領域も狭まっていたこと、また細胞分裂マーカーであるHISTONE H4の発現している細胞数が減少していたことから、LOGは分裂組織の維持に働いていると考えられた。LOGは茎頂分裂組織先端の幹細胞と呼ばれる未分化細胞群とその周辺領域で発現しており、特にL1層で強く発現していた。このような発現パターンを示す遺伝子は他に報告がなく、LOGは分裂組織維持のための新規の生理活性物質に関わっている可能性がある。LOGはリジン脱炭酸酵素に相同性の高いタンパク質をコードするが、これまでタンパクの酵素活性測定、細胞内局在からはLOGの分子的機能に関する有益な情報は得られていない。興味深いことに、細胞分裂活性が低下しているlogでは内生サイトカイニン量が野生型に比べて顕著に増加しており、いくつかのサイトカイニン誘導遺伝子の発現も上昇していた。これはホルモンバランスの崩壊がlogの分裂組織退化に関わっているという1つの可能性を示唆するものである。

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セリン・スレオニンタンパク質リン酸化酵素をコードするシロイヌナズナPINOID(PID)遺伝子は、オーキシン極性輸送を制御する。pid 変異体では花序が棒状を示すことから、PID は腋芽形成に関わっていると考えられる。我々は、イネにおいて腋芽形成とオーキシンの関係を明らかにするため、イネPID相同遺伝子を単離し、その機能の解析を行っている。
イネゲノム中でPIDと相同性を持つ遺伝子を検索し、それらについてリン酸化酵素ドメインのアミノ酸配列をもとに系統樹を作成した。最も相同性の高い遺伝子はPIDと全長アミノ酸配列で54%の相同性を示し、これをOsPIDとした。RT-PCRによりOsPIDは茎頂と根で発現することがわかった。さらにin situ hybridization を行ったところ、OsPIDは葉腋すなわち腋芽を形成する領域で発現していた。OsPIDはプロモーター領域にオーキシン応答配列をもっており、その発現はオーキシンによって誘導された。さらに、OsPID過剰発現体では根が形成されなかった。この表現型はオーキシン存在下で育成した植物に類似していることから、過剰発現体はオーキシンに対する感受性が高くなっていると考えられた。以上の結果から、OsPIDはオーキシンシグナル伝達に関わっており、腋芽形成にも関わっていることが示唆された。

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我々はイネの頂芽優勢を制御する機構の分子レベルでの解明をめざし、5つの変異体d3、d10、d14、d17、d27 について解析している。5つの変異体はどれも分枝の増加と矮性という共通した表現型を示す。これまでにD3 はシロイヌナズナMAX2 のオーソログであることが明らかになっている（Ishikawa et al. 2005）。d10 の原因遺伝子D10 は、カロテノイド切断酵素をコードするシロイヌナズナMAX4 のオーソログであった。シロイヌナズナmax2、max4 変異体はどちらも分枝の増加と矮性を示す。従って、イネとシロイヌナズナの間で頂芽優勢の制御機構は保存されていると考えられた。d3～d27 でD10 の発現解析を行った結果、すべての変異体で発現が上昇していた。従って、D10 の発現にはフィードバックによる制御が働いており、D3～D27 はこの制御に関与していると考えられた。またイネではTCPドメインを持つ転写因子であるFC1 （OsTB1 ）が頂芽優勢の制御に関わることが知られている。FC1 とD3～D27 の関係を調べるため、d3～d27 でFC1 の発現解析を行った。その結果、d3～d27 ではFC1 は正常に発現していた。またfc1 においてD10 のフィードバック制御は正常に働いていた。以上より、イネの分枝制御においてはD3～D27 とFC1 が独立に働いていることがわかった。

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本研究では、乾燥に耐性のあるラン色細菌Nostoc commune と、耐性のないラン色細菌Synechocystis sp. PCC6803を用い、乾燥時の光化学系 II（PS II）反応中心活性失活の意味について詳しい検討を行った。N. commune は世界中に広く分布する陸生ラン色細菌で、比較的丈夫なゼラチン質の中に糸状体が大量に埋もれる形で集合体を形成し、高い乾燥耐性を有することが知られている。
N. commune を高張のソルビトール溶液に浸すことで脱水処理を行うと、光合成の失活と平行して、PS II反応中心活性が失活する。一方、Synechocystis PCC6803では 、光合成活性が失活してもPS II反応中心活性は一定のレベルに維持されていた。そこで、種々の濃度のソルビトール溶液で処理したサンプルについて、強光、及び高温ストレスが与える影響について PAM 法を用いて検討した。その結果、Synechocystis PCC6803は、脱水によって高温、強光ストレスへの耐性が低下し、細胞が重大なダメージを被るが、N. commune は脱水・乾燥することにより、強光及び高温に対する耐性が上昇するという結果を得た。
これは、光合成が停止した後もPS II反応中心活性が、残存することによる光阻害の発生が原因であると考えられる。

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私たちは、斑入り突然変異体var2を用いて植物が斑入りになる機構を調べている。var2の原因遺伝子は葉緑体局在型ATP依存性メタロプロテアーゼFtsH2をコードしており、チラコイド膜で光障害を受けた光化学系タンパク質の修復機構（特に光化学系II反応中心D1タンパク質の分解）に関与する。したがって、白色セクターの出現はこの光障害に起因すると予想される。光化学系における光障害タンパク質の分解は非常に重要であり、分解による修復が滞ると電子伝達も阻害を受け活性酸素 (ROS) が発生すると考えられる。そこで今回は斑入りの葉を用いてROSの検出と斑入りとの関係を調べた。通常の栽培条件で育成したColumbia, var2, 及びサプレッサーsv2.52の葉を superoxideと反応するNBT、H₂O₂存在下でperoxidaseと反応するDABにより組織染色したところ、var2の緑色セクターにおいて特異的ROSが検出された。NBTでは葉緑体特異的な局在も観察され、高レベルのROSは蛋白質修復の欠損による光阻害作用に起因すると考えられた。また、エバンスブルー染色では白色組織は完全には染色されず、細胞死を起こしているのではないことも示唆された。斑入り形成にはROSの閾値が存在することが予想されるため、現在、細胞内におけるROSの定量と斑入りパターンの解析を進めている。

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Intense and excessive (high) light can cause damage to chloroplasts through the generation of reactive oxygen species.
We examined the effects of high light induced oxidative stress on the chlorophyll biosynthesis pathway in etiolated and green (14 h-illuminated) cucumber cotyledons. When etiolated cotyledons were exposed to high light (1500-1600 µE/m²/s), the chlorophyll biosynthesis was completely stopped whereas in green cotyledons the chlorophyll biosynthesis rate was decreased. At an early stage of this treatment i.e. within first 2 h, we observed the accumulation of small amount of protoporphyrin IX in etiolated cotyledons. ALA synthesizing activities were also decreased in both etiolated and green cotyledons. This inhibitory effect was greater in etiolated than in green cotyledons and increased with duration of treatment. High light can have adverse effects on plant growth during early developing stages; therefore we will discuss whether high light mediated regulation of chlorophyll biosynthesis contributes for this effect.

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樹木は永年性植物であるため、長期にわたるストレスへの様々な耐性機構を発達させていると考えられる。遺伝情報を担うDNAは、化学物質や活性酸素分子種、放射線等により塩基損傷や切断を受ける。動物等では、損傷したDNAは複数の修復機構により修復されることが報告されている。本研究では、樹木におけるDNA修復関連遺伝子の発現特性を解明するために、ガンマ線照射後のポプラ（Populus nigra var. italica）の葉からRNAを抽出し、RT-PCRサザン法により発現解析を行った。ポプラの苗木にガンマ線を照射した場合、10-20Gy（20時間の総吸収線量）ではほとんど成長に影響は無く、50-100Gyで成長阻害が見られ、150-300Gyで照射後4-10週間にほとんどの個体が枯死する。相同組換え修復に関与するRad51、および非相同末端結合修復に関与するDNA ligase IV、Ku70およびXRCC4は、50-300Gyのガンマ線照射により、線量依存的に遺伝子発現が誘導され、発現時間も線量に依存した。一方、グアニンの酸化的損傷によって生成する8-オキソグアニンの塩基除去修復に関与するOGG1は、ガンマ線照射により一過的に遺伝子発現が減少した後、再び上昇した。これは、機能の異なるDNA修復関連遺伝子の発現特性が多岐にわたることを示唆している。

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常緑針葉樹は、冬季の厳しい低温下に於いても葉を保持している。越冬下では光合成色素により吸収された光エネルギーの消費が極めて少ないため、細胞に致死的傷害を与える活性酸素が葉緑体内で発生し易い。この傷害を軽減するため、越冬中の常緑針葉樹は成長期とは異なる葉緑体を形成することにより冬季の光ストレスを回避していると考えられるが、その詳細な機構は未だ明らかでない。本研究では、分子生物学的アプローチにより針葉樹の越冬機構を明らかにする目的で、野外に生育するイチイ（Taxus cuspidata）から夏季及び冬季に針葉を採取し、作製したcDNAライブラリーから無作為に3.000クローンを選抜し、5‘末端からその塩基配列を決定した。EST塩基配列情報とタンパク質データベースを用いて、得られた遺伝子産物の機能予測を行ったところ、冬季（12月）の針葉から得られた約3割のESTが early light-induced proteins (ELIPs)と相同性を示した。ストレス関連遺伝子のみに限定すると、ELIPs遺伝子はその約8割を占めていた。ELIPs遺伝子をコードするESTが多量に同定される傾向は2003年、2004年に採取したイチイ冬季葉の双方で見いだされた。一方、夏季（7, 8月）の針葉で同定されたESTではELIPsは検出されなかった。以上の結果をもとに、樹木の越冬戦略の多様性に関して議論を行う予定である。

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【目的】細胞質のリンゴ酸脱水素酵素 (MDH_cyt)は、チオレドキシンアフィニティー・クロマトグラフィーによって捕捉され、チオレドキシンの新規の標的タンパク質であることが示唆れている。そこで、MDH_cytが実際にチオレドキシンと相互作用し、その活性が酵素の酸化還元反応の状態によって調節されるかどうかを生化学的に解析した。【結果】MDH_cytの組換え体タンパク質を大腸菌で発現させ、活性を保持した酵素を得た。低濃度のCuCl₂存在下で完全に酸化させると、酵素活性が完全に失われた。この活性は、酵素をチオレドキシンと低濃度のDTTでインキュベートすることで容易に回復した。また、MDH_cytの酸化還元に依存した活性制御は、二量体形成と関係することがわかった。制御に関係するシステインを同定するために、分子内の6個のシステインをそれぞれセリンに置換した変異体を作成し、その酸化還元応答を調べた。さらに、ペプチドマッピングによって分子内(分子間）に形成されるジスルフィド結合を同定した。以上の一連の実験により、MDH_cytが新規のチオール酵素であることが生化学的に確認された。

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生体内で還元調節を仲介する分子の一つであるチオレドキシンは、分子量1万2千の小さなタンパク質で、他の酵素のジスルフィド結合を還元することで活性を制御する。これまでに、チオレドキシン変異体の固定化担体を用いたスクリーニング法を、高等植物の葉緑体や細胞質タンパク質に適用することで、チオレドキシンにより調節される分子が次々と明らかにされている。
そこで、本研究では膜輸送体やレセプターといった細胞機能に重要な分子を含む膜画分に着目し、チオレドキシンにより調節を受ける膜タンパク質分子を探索した。さらに、得られた分子の還元調節機構を生化学的に解析することで、チオレドキシンによる活性制御に共通の仕組みを見出すとともに、その生理的役割を明らかにすることを目指す。
具体的には、シロイヌナズナ培養細胞から調製したポストミトコンドリア画分を界面活性剤で可溶化し、チオレドキシン変異体固定化担体カラムに供与してスクリーニングを行った。捕捉された標的膜タンパク質の候補は、MALDI-TOF/TOF MSを用いた質量分析、N末端アミノ酸シーケンシング、種々の膜タンパク質に対する抗体を用いた免疫ブロッティングにより分子種を同定した。今回は、スクリーニングにより、どのような膜タンパク質分子が捕捉されたかを報告し、これらの分子が還元調節を受ける生理的意義を考察する。

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高等植物の葉緑体ストロマでは、葉緑体内の還元状態に応じて活性調節される一群のタンパク質が存在し、チオール酵素として知られている。葉緑体ストロマに存在する2種類のチオレドキシン(f型とm型）は、光化学系から供給される還元力を利用して標的タンパク質であるこれらチオール酵素分子のジスルフィド結合の還元を行い、その活性を調節する役割を担っている。私たちは、標的タンパク質を網羅的に研究することで、葉緑体ストロマのチオレドキシンにはこれまで考えられていたよりも多くの標的タンパク質が存在し、チオレドキシンがそれらの酸化還元調節を行っていることを明らかにしてきた。
本研究では、葉緑体内でチラコイド膜によってストロマとは隔てられているチラコイド内腔側の酸化還元システムを明らかにするため、チラコイド膜に結合し活性部位を内腔側に持っているチオレドキシン様タンパク質HCF164に注目した。まず、私たちが開発したチオレドキシン変異体を用いた標的タンパク質の網羅的捕捉法を用いて、HCF164の標的タンパク質同定を行い、標的タンパク質の酸化還元機構の生化学的な解析を行った。さらに、HCF164への還元力供給源についても検討したので、それらの結果について報告し、HCF164の内腔における役割について考察する。

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Mg-キラターゼはクロロフィル合成の第一段階であるポルフィリン環へのMg²⁺の配位を触媒する酵素であり、CHLI, CHLD, CHLHの3つのサブユニットから構成される。Mg-キラターゼの反応にはCHLIによるATP加水分解が必要であり、反応の律速段階であることが知られている。一昨年の本大会で、我々はシロイヌナズナのCHLI1のATPase活性がチオレドキシン（Trx）存在下でDTT濃度依存的にレドックス調節されることを報告した。
そこで、NADPHとNADPH-チオレドキシン還元酵素を用いて還元したチオレドキシンによるCHLI1のレドックス制御について解析したところ、CHLI1のSH基修飾試薬AMSによるバンドシフトが観察され、ATPase活性もチオレドキシンによりレドックス制御されることが明らかとなった。さらに、in vivoにおけるCHLIのレドックス状態を調べたところ、暗所下では酸化状態で存在するのに対して、明所下では還元状態で存在していることが確認された。CHLI1の4つのシステイン残基それぞれに変異を導入し、レドックス制御への関与を現在詳細に解析している。

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植物のオゾン（O₃）に対する応答のモデル植物としてO₃感受性タバコ系統Bel-W3とO₃耐性系統Bel-Bが広く用いられているが、両系統間でO₃に対する感受性の差が生じるメカニズムには未だ不明な点が多い。本研究では、Bel-B、Bel-W3両系統由来の懸濁培養細胞を調製し、Ca²⁺感受性発光タンパク質エクオリンの遺伝子を導入した。まず、懸濁細胞にO₃を暴露させ、エバンスブルー染色により両系統の死亡率を調べた。その結果、Bel-B細胞と比較してBel-W3細胞の方が高い死亡率を示し、細胞の状態でもO₃感受性の差が存在する事を確認した。また、活性酸素種のスカベンジャー存在下でO₃を暴露させると、Bel-W3細胞の死亡率が低下したことからO₃により派生した活性酸素種がBel-W3細胞において細胞死を誘導していると考えられる。次に酸化刺激と還元刺激を両系統の細胞に処理し細胞質Ca²⁺濃度変化を調べた。特に還元刺激としてシステインを処理すると、Bel-W3細胞のみに急激で顕著な細胞質Ca²⁺濃度上昇がみられた。Ca²⁺チャネル阻害剤の効果からシステイン応答性の細胞質Ca²⁺濃度上昇には、酸化ストレスに応答することが知られる電圧依存性Ca²⁺チャネルTPC1の関与が示唆された。このシステイン応答性細胞質Ca²⁺濃度上昇は、僅かながら他のタバコ系統BY-2とイネの培養細胞においても確認できた。

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環境変化に応答して細胞内のレドックス状態が変化し、それに伴って花成や抽だいといった生長生理が調節されているが、植物においてはそうしたレドックス状態の変化を認識する機構について不明な点が多い。我々は一般的にチロシンフォスファターゼが酸化条件下で失活しやすい性質に着目し、レドックス状態の変化を感知し伝達する因子の候補と考え、シロイヌナズナのチロシンフォスファターゼ（AtPTP1）の機能について解析した。AtPTP1はゲノム中に唯一存在する典型的なチロシンフォスファターゼである。このT-DNA挿入変異体は野生型に比べて生長が速く、早咲き性を示した。野生型の種子は過酸化水素処理することでその花成が促進されたが、変異体の場合ほとんど促進を受けず、過酸化水素処理した野生型の花成とほぼ同程度であった。チロシンフォスファターゼが過酸化水素で失活することを考えあわせると、AtPTP1は過酸化水素シグナルの下流で生長を抑制的に制御していることが示唆された。

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我々はこれまでにシロイヌナズナ培養細胞でグルタチオン結合タンパク質を同定した (Ito et al., 2003)。本研究では、その1つ葉緑体型フルクト－ス－1，6－ビスリン酸アルドラーゼ（FBA）のグルタチオンによる制御について調べた。シロイヌナズナのゲノムには3遺伝子がコードされ、グルタチオン結合性FBAをFBA1、他の2つをFBA2, FBA3と名づけた。組換えFBA1の活性は強いpH依存性を示し、ストロマ内のpH変化に適応していた。明条件に相当するpH 8での活性は、暗条件に相当するpH 7での2倍であった。この依存性はグルタチオン(GSH)により強められ、pH 7とpH 8の活性比は5倍だった。 一方、組換えFBA2とFBA3では、このような制御は認められなかった。カルビン回路はチオレドキシン (Trx) により活性化されるが、ジチオスレイトールやTrxは3つの FBA活性を阻害した。GSHにより再活性化されるのは、唯一、 pH 8においてFBA1だけであり、再活性化はGSHとの結合に依存していた。シロイヌナズナから単離した葉緑体のFBA活性は、FBA1と同様にpH、GSHにより制御された一方、FBA1のT-DNA挿入変異体から単離した葉緑体のFBA活性は、pH、GSHに対する依存性を失っていた。以上よりin vivoにおいてもFBA1は発現しており、グルタチオン化依存的な制御を受けていた。

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我々はこれまでにシロイヌナズナの根には、グルタチオン S-トランスフェラーゼ(GST)とグルタチオン(GSH)を介した重力応答システムが存在することを示した(潮見ら、日本植物生理学会2005年大会要旨)。
GSH量が重力応答に関与しているか調べるために実験を行った。GSH添加培地およびブチオニンスルホキシミン(BSO)添加培地において野生型植物の重力応答は濃度依存的に鈍化した。一方で、他のチオール還元剤であるジチオスレイトールの添加培地では重力応答に影響は見られなかった。また、GSH添加培地において見られる野生型植物の根における重力応答の鈍化が、H₂O₂誘導性GST遺伝子へのT-DNA挿入植物では見られなかった。以上のことから、根の重力応答はH₂O₂誘導性GSTを介したGSH依存的反応によって制御されていると示唆される。

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トリエン脂肪酸は植物生体膜の主要構成要素であるとともに、病傷害応答における中枢的シグナル因子であるジャスモン酸の合成前駆体として、重要な役割を担っている。ジャスモン酸の生合成酵素をコードする遺伝子の多くは、傷害によりその発現が転写レベルにおいて顕著に上昇する。また、ジャスモン酸によるフィードフォワード制御を受けており、傷害依存的なジャスモン酸の速やかな蓄積を可能としている。FAD7遺伝子はトリエン脂肪酸合成を触媒するω-3デサチュラーゼの葉緑体型アイソザイムをコードするが、このような発現応答性を示す代表的な遺伝子である。しかし、傷害によるこの遺伝子の発現応答は、きわめて局所的な被傷害組織に限られており、一般的なトランスクリプトミクス解析技法により、その制御を司る鍵因子を同定することは困難である。われわれはFAD7プロモーターとルシフェラーゼ遺伝子の融合遺伝子をシロイヌナズナに導入することにより、傷害にともなう局所的な遺伝子発現応答を非破壊的に検出することのできる実験系を構築した。この形質転換植物を母株としたM2集団をスクリーニングすることにより、傷害応答が増大した突然変異体を単離し、その原因遺伝子が新奇な膜結合型タンパク質をコードしていることを見出した。本発表ではこの知見に加え、ジャスモン酸およびそのシグナル関連因子と、得られた突然変異体とのエピスタシス解析の結果について報告する。

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サリチル酸（SA）は病害抵抗性において重要なシグナル物質である。SAの生合成経路には、安息香酸（BA）を前駆体とする経路が存在すると考えられているが、明らかにされていない。本学会2005年度年会において、BA経路に関わる変異体（bah1; benzoic acid hypersensitive 1）をアクチベーションタギングラインから単離したことを報告した。SA存在下と同様に、bah1変異体はBA存在下で生育阻害を受け、PR1遺伝子の発現がみられる。さらにbah1変異体では、BAを与えるとSA蓄積量が増加する。マイクロアレイ解析の結果、bah1変異体では、病害抵抗性に関与する遺伝子の発現がみられた。本発表では、BAからSAへの変換を触媒するP450をコードすると考えられる遺伝子の発現についても報告する。

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植物の免疫活性化は、防御関連遺伝子の発現のみならず細胞死を伴うことがある。この細胞死には、病原体の全身感染を抑制する働きがあり戦略的細胞死と考えられている。このような植物免疫機構の解明を目的とし、恒常的な細胞死形質を示すシロイヌナズナ突然変異体、cad1（constitutively activated cell death 1）変異体を単離した。この変異体の原因遺伝子（CAD1）は、MACPF（Membrane Attack Complex and Perforin）ドメインを含むタンパク質をコードし、植物免疫を負に制御する新規因子と結論した。（Plant Cell Physiol. 2005, 46: 902-912）。
本研究では、cad1変異体において恒常的な細胞死形質やサリチル酸（SA）の顕著な蓄積が観察されたことからSAのシグナル伝達に着目し、遺伝学的解析を試みた。抵抗性遺伝子のシグナル伝達に必要なリパーゼ様タンパク質が欠損したpad4-1変異体およびサリチル酸合成酵素が欠損したsid2-1変異体についてcad1-1変異体との二重変異体をそれぞれ作製した。両二重変異体ではcad1-1変異体においてみられる細胞死形質、矮化形質、老化の進行が顕著に抑制された。また、pad4-1 cad1-1二重変異体においてはcad1-1変異体で観察されるSID2遺伝子の恒常的な発現誘導が抑制されていた。このような結果から、CAD1遺伝子はPAD4遺伝子を抑制することでSAによる細胞死活性化機構を制御していると結論した。現在、これらの変異体を用いて詳細な解析を行っている。

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植物は病原体から身を守るために独自の生体防御反応を示す。我々は，イネ耐病性反応において低分子GタンパクOsRac1が病原菌に対する抵抗性反応を誘導する分子スイッチとして機能していることを明らかにしている。本研究ではOsRac1と直接相互作用する因子を同定するため，OsRac1 Affinity Chromatographyを行った。その結果， 7つのWD40リピートをもつReceptor for activated C-kinase 1 (RACK1)と相同性のあるRWD（Rice protein containing the WD-40 repeat）/OsRACK1を同定した。そこで，RWDの耐病性における機能解析を行った。RNAi発現抑制体は，カルスからの再生植物が得られず再分化直後の致死が観察された。一方，RWD過剰発現体は植物体として正常に生育し，病原性いもち病菌に対して強い抵抗性が観察された。加えて抵抗性反応のマーカーであるPBZ1は高発現していることがわかった。さらに，スフィンゴ脂質エリシター処理により，RWD過剰発現および発現抑制どちらの培養細胞においても活性酸素種の生成が全く観察されなかった。また，ヘテロ三量体Gタンパクαサブユニット変異体では，RWDタンパク質量が減少していることがわかった。以上のことから，RWD遺伝子は，Gタンパク質を介した抵抗性反応を誘導することが示唆された。現在，OsRac1とRWDとのin vivoでの相互作用をFRET解析により調べ，OsRac1との関わりおよび，RWDの耐病性における詳細な機能を解析中である。

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植物は、病原微生物に対して「植物免疫」と呼ばれる生体防御機構を備えており、病原微生物の侵入認識後、一過的な活性酸素種の生成、防御遺伝子群の発現制御等、様々な抵抗性反応を誘導する。我々はこれまで、低分子量Gタンパク質OsRac1が様々なエフェクターとの相互作用を介して、種々の抵抗性反応を誘導する重要な因子であることを明らかにしてきた。一方で、植物は抵抗性(R)遺伝子産物(タンパク質)による病原微生物の特異的認識によって抵抗性反応を発揮する。同定されたRタンパク質の多くがNB(nucleotide binding site)-LRR(leucine rich repeat)構造を持つことが明らかにされている。当研究室におけるアフィニティクロマトグラフィを用いた解析によるOsRac1との相互作用因子の探索から、NB-LRR型構造を有するタンパク質が数多く同定された。このことは、OsRac1がRタンパク質を介した病原体認識において機能していることを示唆する。本研究では、Rタンパク質とOsRac1との相互作用を詳細に解析するために、酵母two-hybrid法、in vitroのpull down assayによってRタンパク質に高く保存された構造であるNB領域とOsRac1との相互作用を確認した。現在、他のRタンパク質とOsRac1との相互作用解析をさらに進めている。

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レトロトランスポゾンTos17の挿入によりOsPti1a遺伝子の機能が欠損した変異体では、葉に擬似病斑が形成され、それに伴いPR遺伝子群の発現誘導、ファイトアレキシンの蓄積、および親和性いもち病菌に対して抵抗性が誘導される。また、OsPti1aを過剰発現させた形質転換イネでは、非親和性いもち病菌に対して抵抗性の減少がみられたことから、OsPti1aはイネにおいて耐病性シグナル伝達を負に制御していると考えられた。今回我々は、OsPti1aが抵抗性(R)遺伝子によって誘導される耐病性シグナル伝達に関与しているか調べるため、遺伝学的にさまざまな植物種でR遺伝子の機能発現に要求されるRAR1遺伝子との関係について解析した。ospti1a変異体においてOsRAR1遺伝子の発現を抑制した結果、擬似病斑の形成およびPR遺伝子群の発現誘導が顕著に抑制された。すなわち、OsPti1aはOsRAR1を介してR遺伝子により制御される耐病性シグナル伝達を負に制御している可能性が示唆された。また、トマトのLePti1をospti1a変異体に導入することにより、変異体で見られる一連の表現型が抑制された。これまでにLePti1は過敏感反応(HR)の誘導を正に制御していることが報告されている。しかしながら、イネにおいては、細胞死および耐病性シグナルを負に制御していると考えられることから、トマトとイネにおいては遺伝子の機能は保存されているが、耐病性シグナル伝達の分子機構は異なると考えられる。

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Mitogen-activated protein kinase (MAPK) cascadeは細胞に加えられる様々な刺激を下流に伝え、応答を引き起こす重要な因子として真核生物に広く保存されている。植物のMAPKで最も解析が進められているタバコSIPKは、傷害、病原体感染などで活性化され抵抗性反応を誘導すると考えられており、実際にストレス応答性のエチレン合成を引き起こす。イネはシロイヌナズナに一次構造上対応する多くのMAPKを持つが、その機能については多くが不明である。タバコSIPK、シロイヌナズナAtMPK6オルソログと想定されるOsMPK2はSIPK同様、エリシターによる急速な活性化が見られるが、サリチル酸による顕著な活性化は見られない。一方で、トランスポゾンTos17の挿入によりOsMPK2活性を完全に欠失した変異体は、野生型の培養細胞と比較して抵抗性関連の遺伝子発現が増加していた。また、この遺伝子発現はキチンオリゴマー、BTH処理によりさらに急激に増加した。このことから病原体に対する抵抗反応の過程において、OsMPK2はSIPKとは異なり抵抗性関連遺伝子の発現を負に制御すると考えられる。現在、OsMPK2とその上流リン酸化酵素と想定されるMAPKKについて、またAtMPK6の基質であるエチレン前駆体合成酵素のイネオルソログについて解析を行っている。

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イネ培養細胞にキチンエリシターを処理することにより、抗菌性二次代謝産物であるジテルペン型ファイトアレキシンが生産される。我々の研究グループは現在までにファイトアレキシン生合成に関与するジテルペン環化酵素遺伝子を6種全て単離しており、それらはいずれもエリシター処理後6時間から8時間を極大とする一過的な発現を示す。現在までにもイネ培養細胞のエリシター処理によるマイクロアレイ解析は行われているが、エリシター処理後2時間までのエリシター初期応答遺伝子の発現解析にとどまっていた。一般に植物の防御応答の中でファイトアレキシンの生産は比較的遅い応答であることが知られている。そこで、イネにおけるファイトアレキシン生産に関与する生合成酵素遺伝子およびそれらの発現を制御する発現制御因子の探索を目的として、エリシター処理後24時間までの培養細胞におけるエリシター応答性遺伝子の発現をマイクロアレイによって解析した。各遺伝子の発現プロファイルに基づくクラスター解析を行ったところ、ファイトアレキシンの生合成に関与する可能性が考えられる遺伝子や防御応答に関与することが予想される転写制御因子の遺伝子が、ファイトアレキシン生産に関与するジテルペン環化酵素遺伝子と同一のクラスターに存在することが分かった。

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植物は病原体の感染を受けると様々な抵抗性反応を示す。その一つとして抗菌性の低分子化合物であるファイトアレキシンの生産が知られている。イネにはゲラニルゲラニル二リン酸を前駆体とするジテルペン型ファイトアレキシンが14種存在しているが、我々はこれらの生合成に関与する遺伝子群の発現が、病原体の感染シグナルによって一過的に活性化されることを明らかにしてきた。今回はジテルペン型ファイトアレキシンの生合成経路の上流に位置しプラスチド特異的なイソペンテニル二リン酸生合成経路、メチルエリスリトールリン酸（MEP）経路で働くと予想される遺伝子群が、エリシター処理により転写レベルで活性化することを見出したので報告する。イネ培養細胞を用いてエリシター処理後の経時的マイクロアレイ解析を行ったところ、MEP経路に関与すると思われる全ての遺伝子がファイトアレキシン生合成遺伝子群と同様の誘導的な発現変動を示した。RT-PCRの結果、これらの遺伝子の発現はファイトアレキシン生合成遺伝子群の発現プロファイルとよく一致し、エリシター処理後6～8時間で発現の極大を示した。この結果は、病原体感染時のファイトアレキシン生産の誘導がその生合成遺伝子の転写活性化のみならず、生合成初期段階であるMEP経路の遺伝子の協調的な発現誘導により制御されていることを示唆している。

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我々はイネ植物体において、コール酸処理によってファイトアレキシン生産が誘導され、その中でもファイトカサン類が特異的に多量に生産されることを示した。しかし、コール酸によるファイトカサン類の特異的生産誘導機構については不明であった。そこで、本研究ではイネ培養細胞においてもコール酸によるファイトカサンの特異的生産誘導が見られるかどうかを調べるとともに、ファイトカサン生産に関与するジテルペン環化酵素遺伝子の発現に対するコール酸処理の影響についても追究し、コール酸によるファイトカサン特異的生産誘導機構について知見を得ることを試みた。イネ培養細胞をコール酸で処理し、培養液に分泌されるファイトアレキシンをLC-MS/MSで定量したところ、培養細胞においてもファイトカサン類を特異的に誘導することが確認された。また、ファイトカサン合成に関与するジテルペン環化酵素遺伝子OsCyc2、OsDTC1とモミラクトン合成に関与するOsCyc1、OsKS4の、コール酸処理時における発現量をqRT-PCRにより解析したところ、OsCyc2>>OsDTC1=OsKS4>OsCyc1の順であることが分かった。以上の結果、コール酸による特異的なファイトカサン類の生産誘導は、コール酸によるOsCyc2の特異的発現誘導がその原因の一つであることが強く示唆された。

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近年、動植物の防御応答を誘導する共通的な機構として、微生物固有の分子パターン（Pathogen-Associated Molecular Pattern; PAMPs）認識に基づく防御応答が注目されている。細菌鞭毛成分のフラジェリンや糸状菌細胞壁を構成するキチン、βグルカン断片などは代表的なPAMPsと考えられ、その認識・応答機構に関する研究が進められている。
一方、動物の先天性免疫において細菌由来のPAMPsとしての役割が注目されているリポ多糖（LPS）に関しては、いくつかの双子葉植物において過敏感反応抑制その他の活性が報告されているものの、単子葉植物に対する作用に関しては報告が無い。我々は昨年度の年会で、種々の細菌由来のLPSがイネ培養細胞の活性酸素応答、防御関連遺伝子発現などを誘導すること、またこの防御応答はプログラム細胞死を伴うことを報告した。一方、イネ培養細胞を低濃度のLPSで前処理しておくとその後のエリシター処理に対する防御応答の感受性が高まるという大変興味深い活性（priming/potentiation活性）も見いだされた。今回の発表ではLPSの示すこれら2つの生物活性についてさらに詳細に解析した結果およびこれらの活性に必要な構造要素、作用機構に関する検討結果を報告する。

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植物は病原菌の感染を認識すると、様々な抵抗性反応を示す。イネにおいても、キチンオリゴマーやセレブロシドなどのエリシターによって PR タンパク質やファイトアレキシンの生産などの様々な抵抗性反応が誘導されることが知られている。我々は、イネの EST に対するマイクロアレイ解析から、少なくとも2種類のキチンエリシター応答性 WRKY 型転写因子（OsWRKY53、OsWRKY71）が存在していることを明らかにしてきた。WRKY 型転写因子は、エリシター応答配列（W-box）に特異的に結合し、防御関連遺伝子の発現制御に重要な役割を果たすことが知られている。今回は、OsWRKY71 の標的遺伝子のスクリーニング結果について報告する。OsWRKY71 過剰発現株を用いたマイクロアレイ解析の結果、キチナーゼなどの PR タンパク質遺伝子や、WRKY 遺伝子の発現が活性化されていた。また、これらの遺伝子群は全てキチンエリシター応答性であり、発現の極大もOsWRKY71 より1～2時間遅れることが示された。さらに、これらの遺伝子群の5'上流域には、W-box が複数存在していた。以上の結果から、キチンエリシター誘導のシグナル伝達経路において、OsWRKY71 がこれらの遺伝子群の発現を正に制御している可能性が極めて高いことが示された。

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イモチ病菌由来のエリシターを処理したイネカルスは細胞死を引き起こす。その過程において、ROS生成や様々な防御遺伝子の発現が誘導される。我々はエリシターが植物細胞に与える影響を明らかにするために、代謝物の変動をキャピラリー電気泳動質量分析装置（CE/MS）を用いて調査した。エリシター処理によって抗酸化物質や遊離アミノ酸量が増加したのに対して、クエン酸や2－オキソグルタル酸などTCA 回路に関わる代謝物は著しく減少した。また、今回定量した代謝物の中で、γアミノ酪酸（GABA）は最も大きな増加を示したことから、 GABA経路に注目しGABAの合成・分解に関わる酵素活性を比較した。TCA回路から GABA経路への反応を触媒するアラニンアミノ基転移酵素、グルタミン酸脱水素酵素では、活性に変化は見られなかった。またグルタミン酸脱炭酸酵素ではエリシター処理から8時間後に活性の低下が確認された。しかしGABAアミノ基転移酵素（GABA－T）は、エリシター処理から4時間後に活性が激減した。エリシター処理による GABAの増加は、分解系の停止と推察され、細胞死との関係が示唆された。

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plant activatorとして知られるBTH は、アラビドプシスやタバコにおいて、全身獲得抵抗性 (SAR)に関与するサリチル酸 (SA) シグナル伝達経路を活性化することが知られている。一方、イネにおいては、SAシグナル伝達経路に関する知見は乏しい。我々はこれまでに、BTH処理イネのマイクロアレイ解析によって4種類のWRKY型転写因子を含む多数のBTH誘導性遺伝子を同定した。
BTH誘導性WRKY型転写因子の中の1つOsWRKY45 のRNAi抑制植物では、BTH誘導性いもち病抵抗性が失われていることがわかった。また、OsWRKY45過剰発現体（OsWRKY45-ox）ではいもち病抵抗性が顕著に向上していた。これらの結果から、OsWRKY45がBTHで誘導されるいもち病抵抗性において重要な働きをしていることが示された。OsWRKY45-ox植物では、グロース・チャンバー（GC）生育時にはPR1bおよびPR2が恒常的に発現しているのに対し、温室生育時にはこれらのPR遺伝子が発現していないことがわかった。また、GC生育時には生育が若干遅延するのに対し、温室生育時には生育はほぼ正常であった。これらの結果について、BTHの作用様式の特徴として考えられているpotentiationの観点から考察する。

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トマト（Solanaceae lycopersicum）における機能ゲノミクス研究を推進するために、現在国際コンソーシアム主導で行なわれているトマトゲノム解読プロジェクトと並行して、我々はトマト（矮性トマト、マイクロトム）の完全長cDNAクローンの取得および配列解読を行なっている。
病原微生物を接種したトマト葉および成熟中のトマト果実から、2つの完全長cDNAライブラリーが作製されている。現在のところ葉ライブラリーから37,632クローン、果実ライブラリーから9,794クローンの5‘端読みが完了している（2005年11月段階）。葉コンティグの30％および果実コンティグの25％が、シロイヌナズナに相同遺伝子を持たないトマト遺伝子由来であると推定された。トマト葉・果実コンティグの機能分布は、アラビドプシス全遺伝子の機能分布と若干異なっていた。特に、アラビドプシスに相同遺伝子の見られないトマトコンティグの機能分布は、「キナーゼ」「DNA/RNA結合」「タンパク質結合」といったカテゴリーに属するものの割合が、全トマトコンティグでの分布と比較して多くなっていた。この結果は、遺伝子の種類により多様化の程度が異なっていることを示していると思われる。完全長クローン情報はMiBASE（http://www.kazusa.or.jp/jsol/microtom/）から公開している。

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