Positron Emitting Tracer Imaging System (PETIS)は、植物個体に与えたポジトロン放出核種の体内分布を非侵襲的かつ経時的に定量性よく観測できる装置である。最大の特長は、オートラジオグラフィーなどの手法と異なり動画像データが得られる点にある。これにより植物における物質輸送の動態を視覚的に理解することが容易になり、近年、様々な研究に利用されている。
本研究では、土壌および食糧の汚染が社会問題となっているカドミウムについて、植物体内における吸収・輸送・蓄積の挙動を動画像として可視化し、その動態を解析した。ポジトロン放出トレーサとして¹⁰⁷Cd（半減期6.5時間）をイオンビーム照射および化学分離によって調製し、供試した。播種後4週のイネにトレーサを水耕液から経根吸収させつつ、根の基部から地上部にかけてイメージングを36時間行なった。その結果、生きた植物体内のカドミウム移行の様子を動画像として得た。さらに、植物体の特定部位におけるトレーサ量の経時変化曲線（time-activity curve）を動画像データから抽出し、水耕液中のトレーサ量の推移曲線との関係について動態モデルを適用して解析した。その結果、水耕液から地上部の特定部位に至る吸収・輸送の速度などの生理的パラメータの推定値を得ることに成功した。

抄録全体を表示

ソルガムは乾燥など劣悪な生育環境でも健全に生育する食用・飼料用作物である。この植物はバイオマスが大きいこと、収穫が容易であることなどから、カドミウム（Cd）汚染土壌の修復のための供試植物として近年注目されている。ソルガムによるCd汚染土壌の浄化の実用化には植物が根から吸収したCdを地上部に効率的に移行させる必要がある。本研究では、ソルガムにおけるCdの地上部への輸送機構の解明を目指し、様々な品種（4品種）のソルガムを用いて、そのCd吸収・移行特性を調べた。また、Cdの吸収・移行特性が異なる2つの品種を用いて、PETIS (positron emitting tracer imaging system) 法により、植物体内におけるCdの移行の差異をリアルタイムで可視化することを試みた。
異なる4品種のソルガムを約1ヶ月間水耕栽培し、0.1µMの濃度でCd処理を行った。今回の栽培条件は各品種の生育量に影響を及ぼさなかった。一方、各品種のCd蓄積量には最大で約3倍の差が見られた。これらの植物から、導管液を採取し、導管液中のCd濃度を調べたところ、その濃度にも地上におけるCdの蓄積量に応じた差異が存在することが確認できた。本研究の結果より、ソルガムでは地上部に高濃度のCdを蓄積する品種は導管を通じてのCdの輸送が低蓄積品種に比べて、積極的に行われていることが確認できた。

抄録全体を表示

モリブデン(Mo)は植物の必須元素であるが、真核生物におけるMo輸送の分子機構は明らかにされていない。MOT1はシロイヌナズナのCol-0とLerの葉のMo濃度差に基づく遺伝解析により単離した原因遺伝子である。MOT1にT-DNAが挿入された変異株のMo濃度は野生型株よりも低く、MOT1-GFP融合タンパク質を発現させたタマネギ表皮細胞では細胞の外縁部にGFPの蛍光が観察される。本研究では、シロイヌナズナのMo輸送体と推定されるMOT1の機能解析を行った。
mot1変異株をMo欠乏条件下で栽培すると、野生型株よりも強く地上部の生育が抑制された。この際、野生型株ではMOT1 mRNAの蓄積が誘導されていた。これより、Moの利用が制限された環境での効率的な生育にMOT1が必須であることが示唆された。MOT1を酵母で発現させたところ、細胞内Mo濃度の上昇がみられた。また、この際の細胞内Mo濃度を概算すると細胞外よりも高かった。これより、MOT1は濃度勾配に逆らってMoを輸送する活性を持つことが示唆された。mot1変異株のMo濃度は根よりも地上部でより低下していた。MOT1遺伝子のプロモーター制御下でGUSを発現する形質転換体を観察したところ、根の内鞘と地上部の葉柄・葉脈・雄ずいおよびさやでGUSの染色が観察された。MOT1は根から地上部へのMo輸送に関与するトランスポーターと考えられる。

抄録全体を表示

BOR1はシロイヌナズナより単離された排出型ホウ素トランスポーターであり、根の導管へのホウ素の積み込みに働く。これまで、シロイヌナズナゲノムに存在する6つのBOR1相同遺伝子のうち、BOR2が低ホウ素栄養条件下での根の細胞伸長に重要であることを示した。今回は、BOR3、BOR4、BOR5に注目し、これらが異なる細胞特異的発現パターンをもつ排出型ホウ素トランスポーターであることを報告する。まず、RT-PCRを行ったところ、根と地上部の双方でBOR3-5のmRNAの蓄積が検出された。各遺伝子のプロモーター制御下でGUSを発現する形質転換体を観察したところ、BOR3は根の皮層細胞と孔辺細胞、トライコームに、BOR4は根の内皮細胞に、BOR5は根の中心柱と葉のトライコームに、強くGUS染色が認められた。次に、BOR3-5を酵母で発現させたところ、菌体内ホウ素濃度の低下が見られた。これよりBOR3-5がBOR1と同様にホウ素の細胞外への排出能を持つことが示唆された。最後に、各遺伝子のT-DNA挿入株を用いて生理解析を行った。一重挿入株では野生型株との違いは認められなかったが、bor1-3/bor2-1/bor3-1の三重挿入株ではbor1-3/bor2-1の二重挿入株と比較して、低ホウ素欠乏条件下でのみ、より深刻な根の生育抑制が観察された。BOR3が根の伸長においてBOR1-2の補助的な役割を持つと考察している。

抄録全体を表示

イネにおけるホウ素輸送能を明らかにする目的で、イネの遺伝子群の解析を行っている。第46回日本植物生理学会年会で、シロイヌナズナのBOR1に最も高い相同性を示すOsBOR3は、BOR1同様ホウ素排出能を持つトランスポーターであり、ホウ素欠乏条件下でのイネの生育に必要であることを発表した。本発表では新しく得られた知見について述べる。
OsBOR3の遺伝子破壊株は、野生型株と比較して、ホウ素欠乏条件下での生育が阻害される。この生育阻害が、植物体のホウ素含量の低下に起因するものであるかを明らかにするために、ホウ素通常条件、及び欠乏条件下での植物体内のホウ素含量を測定した。遺伝子破壊株の新鮮重当たりのホウ素含量を野生型のものと比較した場合は、両者間での差異は認められなかった。しかし、植物体当たりのホウ素含量は、ホウ素欠乏条件下で遺伝子破壊株の方が野生型より低くなる傾向が見られた。これは、OsBOR3がホウ素の土壌から地上部への輸送に関与することを示唆している。
また、OsBOR3の発現の組織特異性を詳しく解析するため、OsBOR3プロモーター:GUSのコンストラクトを導入したイネの根を観察したところ、根端では主に外皮に、分化の進んだ部分では外皮と内皮の両方に発現が見られた。OsBOR3の局在は根の発育段階によって異なっており、その生理的な役割も根の発達に従って変化するものと考えている。

抄録全体を表示

低リン酸環境におかれた植物は、さまざまな生理反応によりリン欠乏に対処することが知られている。中でも老化器官（ソース）から若年器官（シンク）へのリン酸転流は、リン酸欠乏に対する重要な適応機構の一つである。しかし、これまでのところ、その機構の詳細は未知の部分が多い。そこで、分子レベルにおけるリン酸転流機構の解析を目標に、モデル植物であるシロイヌナズナを材料として、リン酸転流現象の生理機構と転流に関与する遺伝子の探索を行った。
私たちは、シロイヌナズナにおけるリン酸転流現象を確認するため、リン酸濃度の異なる水耕培地で生育させた植物体について、葉組織中のリン酸含量変化、個体内のリン酸分配を解析しソース葉とシンク葉を決定した。それぞれの葉から単離したRNAを用いて、マイクロアレイによる発現解析を行い、リン酸転流への特異的関与が示唆される遺伝子を複数見いだした（2004年度年会）。その後、再度マイクロアレイ解析を行い、リン酸転流に関与する遺伝子の探索を進めるとともに、リアルタイムPCRを用いて個々の遺伝子の発現量を確認中である。さらに、発現変化が見られた遺伝子について、T-DNA挿入変異体を用いた生理解析から、リン酸転流への特異的関与の可能性を検討中なので、それらについて報告する。

抄録全体を表示

我々はこれまで、水トレーサー（[¹⁵O]water）とポジトロン検出器（BGO）を用いることにより、植物茎中おいてμlオーダーの水を定量的に追跡できる系を構築した。そして、ダイズ茎中の水動態を調べた結果、植物に取り込まれた水は導管中を輸送される過程において、導管外の水（茎組織に存在していた水）と交換を繰り返しながら上部へと輸送されていることが明らかになった。
そこで、今回は、水交換の機構を明らかにするため、蒸散流速度に対する漏出（交換）量への影響や、その交換効率を調べた。具体的には、播種から3週間目のダイズの根を切除し、茎より水トレーサーを加え、その取り込みを2点に設置したポジトロン検出器によりそれぞれ計測・定量した。その結果、導管輸送中に周辺組織と交換される水の割合は湿度が80 %（蒸散量は0.0084 g/cm²/h）の場合10～16%と高く、湿度が55%（蒸散量は0.014 g/cm²/h）の場合5～9%と低かった。しかしながら、実際に交換されている水量は蒸散速度によらずほぼ一定であることが明らかになった。現在、生育段階による交換量への影響や、また³H水とIPを用いることによりオートラジオグラフィーによる漏出部位（分布）を調べている。

抄録全体を表示

植物にとって光は重要な情報源であり、発芽や花成などさまざまな生理応答に関わっている。花成に重要な光受容体としてフィトクロムとクリプトクロムが知られているが、これらが実際にどの器官／組織で光を受容し花成を制御しているかは不明であった。これまでに、我々はシロイヌナズナにおいてフィトクロムBは子葉の葉肉細胞で花芽形成を制御していることを明らかにした（Endo et al., 2005）。
我々は今回、クリプトクロム2（cry2）がどこで働き花成を制御しているのかを明らかにした。器官／組織特異的な発現が知られているプロモーターにCRY2-GFP融合遺伝子をつないだコンストラクトを作成し、cry2欠損変異体に形質転換した。また比較のため、CRY2-GFPを内在性プロモーターで発現させる形質転換体も作出した。これらの植物でcry2-GFPタンパク質の発現パターンと花芽形成を調べた結果、維管束でcry2-GFPを発現させた場合にのみcry2欠損変異体の遅咲き表現型は相補され、葉肉、茎頂、表皮、根でcry2-GFPを発現させた場合では表現型の相補は観察されないことが分かった。また組織レベルでの遺伝子発現を調べた結果から、維管束のcry2は花成制御に重要な遺伝子の一つであるFLOWERING LOCUS Tの発現制御を介して、細胞自律的に働いていることが示唆された。

抄録全体を表示

青色光受容体CRYPTOCHROME (CRY)は高等植物において、胚軸伸長、色素合成、概日リズム制御、花成制御等、さまざまな生理反応に関与することが知られている。長日植物シロイヌナズナにおける解析より、cry1, cry2は概日時計の同調だけでなく、CONSTANS (CO) 遺伝子の転写後制御を介して花成促進的に機能することが知られている。我々は、短日植物の花成制御におけるCRYの役割を明らかにする目的で、絶対的短日植物であるアサガオ（Pharbitis nil cv. Violet）からPnCRY1, PnCRY2を単離し、解析した。PnCRY1, PnCRY2のC末端領域に特異的な抗体を作製し、タンパク質レベルでの発現変動を解析した結果、PnCRY1はタンパク質レベルでも日周変動を示すこと、さらに、PnCRY1, PnCRY2共に青色光依存的な光分解を受けることが明らかとなった。シロイヌナズナではcry2のみが日周変動性や青色光依存的な光分解を示すことから、植物種間でcryタンパク質の光安定性が異なることが示唆された。機能解析を目的として作出したPnCRY1, PnCRY2の35S過剰発現体は、白色光下において胚軸および茎の伸長抑制を示した。これら遺伝子のRNAi発現抑制体を用いた解析結果と合わせ、アサガオにおけるPnCRYsの光周性花成制御機構への関与を考察する。

抄録全体を表示

シロイヌナズナにおいて、FTは既知の花成制御経路の最も下流に位置する遺伝子の一つであり、様々な花成制御の情報が統合される。FT蛋白質はPEBP/RKIPファミリーに属しており、多くの植物種において相同分子種と思われる遺伝子が同定されている。しかし、その生化学的な機能は未だ不明である。近年、我々は遺伝学的解析によりFTは別の花成制御因子FDと相互依存的に機能することを示した。FD蛋白質はbZIP型転写因子で、FTと酵母細胞内及びin vitroにおいて蛋白質間相互作用をする。FTは子葉および葉の維管束で発現し、FDは茎頂で発現する。FDプロモーターを用いてFTを茎頂で発現させたところ、FTの機能喪失変異を相補することが出来た。これらの結果から、FTの機能部位は茎頂であると考えられる。FT、FDそれぞれについてEGFPとの機能的融合蛋白質を作製したところ、FTは核と細胞質の両方、FDは核に局在した。そこで、BiFC(bimolecular fluorescent complementation)法を用いてFTとFDの相互作用をタバコ表皮で観察したところ、両者が共局在する核で相互作用を示す蛍光が検出された。また、35S::FT-GR形質転換体を作製したところ、dexamethasone処理により花成が促進された。これらの結果から、FTは核内でFDと相互作用して下流の遺伝子の発現を制御している可能性が示唆された。

抄録全体を表示

絶対的短日植物であるアサガオは、たった1回の誘導暗期 (16h)によって花成が誘導され、花成誘導に十分な花成誘導物質は、一回の誘導暗期中に葉で生産されて、茎頂に移動すると考えられる。近年、シロイヌナズナやイネの研究から、FTの花成における重要性が示されてきた。我々は、アサガオにおいて、子葉および茎頂の各々で花成誘導特異的に発現する2種のFT相同遺伝子PnFT LEAF-TYPE (PnFTL)とPnFT APICAL-TYPE (PnFTA)の解析を行った。PnFTLの発現は、子葉において誘導暗期中に急激の増加し、誘導暗期開始16時間後にピークを示した。一方、PnFTAの発現は、子葉におけるPnFTLの発現のピークの後に、茎頂において確認された。また、PnFTLおよびPnFTAの発現は、光中断によって抑制された。さらに、RNAiによって各々の発現を抑制したところ、一回の誘導暗期による花成誘導が完全に抑制された。また、PnFTLを過剰発現することにより、花芽がカルスから直接形成された。以上の結果は、一回の誘導暗期によるアサガオの花成誘導におけるFT遺伝子の重要性、さらには、茎頂におけるFT遺伝子の機能の可能性を示唆した。

抄録全体を表示

TSF遺伝子は、花成経路統合遺伝子FTとの高い相同性から花成制御に関与する可能性が高い。
我々は、TSFはCOによる転写制御を受け光周期に依存した日周変動を示すこと、tsf変異がft変異体の遅咲き表現型を昂進することを明らかにした。さらに、TSF過剰発現体の日長によらない早咲き表現型はfd変異によって抑圧されること、TSFとFDが酵母細胞内で相互作用することから、TSFの花成促進能に FD機能が必要であることが示唆された。また、TSFおよびFTはともにSOC1の発現に対して影響を与えた。これらの結果から、TSFは主として光周期依存経路でFTと同様の分子機構で花成時期決定に機能すると考えられる。光周期のみならず、TSFの発現はFT同様にFLCの機能を介して春化経路および自律経路の制御下にあることも判明した。したがって、TSFはFTと冗長的に機能する花成経路統合遺伝子であると考えられる。上流からの制御を受けてTSF遺伝子もまた維管束篩部組織で発現していたことから、両遺伝子による花成制御経路の統合の場は維管束篩部であることが示唆された。一方で、TSFとFTの発現領域が完全に一致しないこと、TSF過剰発現体の早咲き表現型を優性のfwa変異は抑圧しないことなどから、両遺伝子には機能分化が存在している可能性がある。
Yamaguchi et al. (2005) Plant Cell Physiol.46: 1175-1189

抄録全体を表示

シロイヌナズナの優性花成遅延変異体fwaでは、プロモーター領域のDNAメチル化の低下により、GL2型ホメオボックス遺伝子FWAが異所発現している。FWA遺伝子の異所発現によって、何らかの機構で本来の制御機構が撹乱され、花成が阻害されると推測される。これまでに我々は、異所的に発現したFWA蛋白質がFT蛋白質との相互作用により花成を阻害することを示した。それ以外の機構による可能性として、FWA蛋白質が他の遺伝子の転写制御を介して花成を阻害する可能性について今回新たに検討した。エピアレルのfwa変異体及びFWA過剰発現体を用いたマイクロアレイ解析の結果、いずれもFWAを過剰発現するこれらの背景で共通に発現が変化している遺伝子の存在は確認できなかった。このことから、FWA蛋白質の異所発現によって引き起こされる花成遅延は、FWA蛋白質の制御標的となり得る遺伝子の誤発現による可能性は低く、主としてFT蛋白質との相互作用によるものと考えられる。
これらを踏まえて、我々はFWA蛋白質をFT蛋白質の阻害因子として利用し、FT 蛋白質の作用部位の検討をおこなっている。FWA蛋白質を特定の組織で発現させ、花成への影響を調べた。これらの結果について報告したい。

抄録全体を表示

光周性花成は植物が日長の変化により花成誘導が制御される現象であり、最近のシロイヌナズナを用いた研究から、光周性花成経路は外環境からの光シグナルと内在性の概日時計によって制御されていることが示唆され、その分子機構や関連諸因子(COやFTなど)に関して多くに知見が蓄積されつつある。我々は、TOC1/PRR1を含む5種類の擬似レスポンスレギュレーター（PRR3、PRR5、PRR7、PRR9）が時計中心振動体近傍で重要な働きを担い、各種prr欠損変異体が花成制御に関しても顕著な表現型を示すことを報告してきた。今回はこれらprr多重変異体を用いて、光周性花成制御経路で働く重要な下流因子であるCOやFTの発現に与える影響を解析した。また、花成に大きな影響を与えることが知られている赤色光受容体PHYB遺伝子との多重欠損株も作成し、光シグナル伝達と光周性花成制御経路におけるPRR因子の位置付けに関して解析した。さらに、prr変異体は花成に関する表現型に加えて、花茎の高さや太さに関して顕著な表現型が観察された（高い背丈と太い茎）。これらの結果を基に、PRR因子の時計関連機能に関して、特に植物の花成制御だけでなく植物形態制御との関連にも焦点を当てて考察する。

抄録全体を表示

概日リズムは植物に昼夜変化を予期させる機構で、内因性の概日時計によって制御されており、この時計の中心振動体の機構はCCA1/LHY、ELF4、GI、LUX(PCL1)、PRR1(TOC1)そしてPRR9/PRR7/PRR5といった因子間でのフィードバックから成立する。このように時計中心の理解は進んでいるが、時計中心から出力系への働きかけ方などはよく分かっていない。そこで我々は時計変異体prr9/prr7/prr5をもちいてマイクロアレイ解析を行った。
18日間、連続明の条件で生育させた野生株とprr9/prr7/prr5変異株を地上部3時間毎にサンプリングした。このとき見かけ上の概日リズムは停止しており、どの時点での遺伝子発現も定量的に同じであり、この条件でprr9/ppr7/prr5で発現上昇した遺伝子を網羅的に取得した。これら遺伝子は逆にPRR5過剰発現体では抑制されており、またPRR5らは、これら遺伝子のプロモーター活性の抑制効果を示した。さら明暗条件で再検出すると、これら遺伝子は概日リズムに制御されており、明け方から昼にかけて発現ピークを示した。この位相はPRR5らが発現する時間である。つまりPRR5らは、中心振動体の一部でもあるが、網羅的な朝位相の遺伝子発現の抑制をするという直接的な時計の出力として機能すると考えられた。

抄録全体を表示

高等植物には概日リズム（時計）により制御される数多くの高次生理現象が観察されている（葉の開閉、光周性花成制御）。このような背景から、最近になりモデル植物シロイヌナズナにおける時計研究が急速に進展し、主に遺伝学的な解析から多くの時計関連因子が同定・報告されてきた（Myb型転写因子CCA1やLHY など）。また、我々が報告したTOC1/PRR1を含む擬似レスポンスレギュレーターPRR因子群（PRR3、PRR5、PRR7、PRR9）も中心振動体構成因子の最有力候補である。事実今までに、各PRRファミリー因子の構成的発現植物体・機能欠損変異体に関する包括的な解析から、各PRR因子が個性的でかつ協調的な機能を発揮して中心振動体近傍で機能していることを示唆してきた。しかし、最も肝心なPRRタンパク質の分子機能は不明であり、またタンパク質レベルでの安定性やリズム変動に関しての解析は手つかずであった。これらの問題にアプローチするため、今回はエピトープタグを付けたPRR1やPRR9タンパク質を発現する形質転換植物体を確立した。これらを用いて、PRR因子のタンパク質レベルでのリズムを直接検出・解析した。さらに、PRRタンパク質の安定性に影響を及ぼす生育条件（光シグナルなど）に関しても解析した。これらの結果をまとめながら、TAP法を用いた時計複合体単離の可能性に関しても考察する。

抄録全体を表示

最近になり、シロイヌナズナの概日時計分子機構に関する多くの知見が蓄積してきた。我々も、シロイヌナズナには5種類の時計関連擬似レスポンスレギュレーター（PRR1/TOC1、PRR3、PRR5、PRR7、PRR9）が存在し、それぞれがTOC1/PRR1を含む中心振動体近傍で重要な働きをしていることを報告してきた。これらPRR因子群は特徴的な共通構造を持っており、擬似レシーバードメインに加えてC末端には開花制御因子COにも保存されているCCTモチーフが存在する。しかし、その分子機能に関しては、核に局在して働くこと以外には全く知見がない。この問題にアプローチするために、今回は以前に作成したPRR1やPRR5の過剰発現体に加えて、擬似レシーバードメイン、それ以外のCCTモチーフを含む領域、CCTモチーフ領域のみなど各種推定機能ドメインを過剰発現する形質転換体を作成した。これらの形質転換体が示す時計関連表現型（時計制御遺伝子の転写リズム、開花時期制御、胚軸伸長の光感受性など）を比較解析した。その結果、各機能ドメインの過剰発現体がそれぞれ特徴的な表現型を示すことが明らかとなった。これらの結果をまとめながら、各PRR因子の構造と機能に関して時計機能との関連で考察する。

抄録全体を表示

最近の研究から、シロイヌナズナ時計関連因子群に関して多くの知見が蓄積しつつある。概日リズムを生み出す機構として、Myb型転写因子であるCCA1・LHY、および擬似レスポンスレギュレターであるTOC1/PRR1が転写フィードバックループを形成することで中心振動体を形成していると考えられている。我々は、TOC1/PRR1に加え他の擬似レスポンスレギュレーターPRR因子(PRR3, PRR5, PRR7, PRR9)も中心振動体の構成因子として重要な働きをしていることを提唱してきた。また、シロイヌナズナにおいてはZTL、ELF3/4、GI、LUXといった多くの時計関連因子が同定・解析されている。これらを基盤として高等植物における概日時計の普遍的機構を理解するには、別の基軸モデル植物を用いてシロイヌナズナで同定された時計関連因子のオルソログが普遍的に存在するか否かを確認し、その機能を比較解析することが有効であると考えられる。このような観点から、本研究ではシロイヌナズナと並んで全ゲノム配列が公開されているモデル単子葉植物であるイネを基軸として時計関連因子の普遍性に関して包括的に比較解析した。その結果イネに見いだされたOsPRR1、OsCCA1、OsZTLオルソログなどのシロイヌナズナを用いた機能解析の結果などもまとめながら、高等植物における概日時計機構の普遍性に関して考察する。

抄録全体を表示

クロロフィル合成（緑化）経路において、プロトクロロフィリド(Pchlide)からクロロフィリドへの反応は光依存的に進行する。しかし、この反応過程は活性酸素の発生を伴うため、特に黄化芽生えにおけるPchlideの生合成は厳密に制御されていることが知られている。しかし、その制御分子機構は不明な点が多い。これと関連して、最近フィトクロム結合性bHLH型転写因子であるPIL5 (PIF1)がシロイヌナズナにおけるPchlide生合成の負の制御因子であることが報告された。一方我々は、PIL5が時計関連因子PRR1/TOC1と相互作用するbHLHサブファミリー（PIF3、PIF4、PIL6などを含む）の一員であることを報告している。そこで、本研究では光形態形成時におけるクロロフィル合成制御（緑化過程）と概日リズム（時計機構）との関連に関して検討した。その結果、各種の時連関連因子(CCA1、TOC1、PRRs)の過剰発現体および欠損変異体では黄化子葉の光依存的緑化率が野生株と比較して大きく変動することが明らかになった。これらの表現型とpif3やpil5変異体が示す緑化に関する表現型には明確な遺伝的関連性（エピスタシス）が認められた。これらの結果を基に、光形態形成における光情報伝達と概日時計機構との関連性に関して、PILファミリーbHLH転写因子群の役割を中心に考察する。

抄録全体を表示

概日時計を持つシアノバクテリア、Synechococcus elongatus PCC 7942は時計中枢遺伝子kaiABCをコードする。これらはシアノバクテリアの概日時計の自励振動体として機能する一方、自身の転写-翻訳フィードバックループを介して、ゲノム上の全遺伝子に概日振動をあたえると推測されてきた。事実、これまでのluxABレポーターを用いた遺伝子発現解析では、概日振動を示さない遺伝子がひとつも見つかっていない。そこで本研究ではゲノム上にコードされる全遺伝子が自励振動体からどのように概日情報を獲得するかを検証した。まず、マイクロアレイ解析で、シアノバクテリアの全mRNAの発現挙動を確認したところ、全ての遺伝子がmRNAの蓄積レベルで振動しているわけではなく、全体の約30%のみが転写レベルで発現振動を示すことが明らかになった。また転写レベルで概日発現を行なわない遺伝子は、KaiCタンパク質によるネガティブフィードバック制御を受けないことも明らかになった。これらの事実はレポーター遺伝子の発現振幅が、遺伝子発現過程の複数の段階で付与されていることを示し、シアノバクテリアのグローバルな概日遺伝子発現が主に転写後段階および、翻訳段階に依存することを強く示唆した。以上の結果から、概日時計の出力系における新たなモデルを提唱する。

抄録全体を表示

To determine essential nuclear-genes for chloroplast development, we systematically analyzed albino or pale green Arabidopsis thaliana mutants by using a two-component transposon system based on the Ac/Ds element of maize as mutagen.
In this meeting, we present phenotypes of the apg4 mutant, and discuss functions of the APG4 gene in chloroplast development. The apg4 mutant has white cotyledons and yellow or green variegated true leaves, fertility. We showed that apg4 has Ds inserted in promoter region of ribosome binding factor (RBFA) homologue. The mRNA expression of RBFA was not detected in apg4 by RT-PCR analysis. White cotyledons had abnormal plastids that lacked internal membrane's structures and highly vacuolated. But, their true leaves had normal plastids contained developed lamella structure and abnormal ones. Moreover, we found that the APG4 is involved in the processing of the pre-rRNA to form the mature 23S and 4.5S rRNAs.

抄録全体を表示

virescent-1 (v₁) はイネ低温感受性葉緑体形成不全突然変異株である。これまでの解析から、V₁遺伝子は葉の発生分化初期に特異的に機能していると考えられる。ポジショナルクローニングの結果、V₁タンパクは葉緑体局在型の新規のタンパク質をコードしていることが示唆された。抗体を用いた解析から、V₁タンパク質は約32kDaの分子量を持ち、発生初期の特定のステージ（P4）の葉で一過的に多量の蓄積が見られるが、成熟葉ではほとんど蓄積しないことがわかった。v₁ 変異株においてV₁遺伝子の機能を阻害すると、同ステージで引き起こされる葉緑体の転写・翻訳装置の発現が不可逆的に阻害され、その後の葉緑体分化プロセスがストップする。これらの結果は、P4の段階で特異的に発現し、葉緑体の転写翻訳能を活性化する新規のメカニズムが存在し、それらにV₁タンパク質が関与していることを示す。

抄録全体を表示

単量体GTPaseのObgスーパーファミリーに属するObgは，真性細菌から酵母、植物、脊椎動物にまで広く保存されている。多くの細菌でObgは増殖に必須な遺伝子であり、リボソーム成熟過程に関与していることが指摘されている。しかし植物を含め高等真核生物のObgについては殆ど研究されていない。一般に原核生物が一つのObgを持つのに対し、真核生物は複数のObgホモログを持つことから、真核生物のObgはそれぞれ異なったオルガネラで機能している可能性が考えられる。我々はシロイヌナズナのObgホモログを2つ見いだし，AtObg1，AtObg2と名付けた。AtObg1には細菌Obgと比較して約220アミノ酸のN末端伸長配列があり，局在予測は葉緑体である。GFP融合タンパク質を用いた一過的発現解析でAtObg1が葉緑体に局在することを我々は既に報告している（2004年度植物生理学会年会）。今回新たにAtObg1とGFPの融合タンパク質を強制発現する形質転換植物を作製し，AtObg1の細胞内局在を詳細に検討した。その結果，葉や根および花器官の全ての細胞でAtObg1は色素体に局在しており，核やミトコンドリアへの局在は認められなかった。一方、AtOBG1ノックアウト変異体は胚致死の表現型を示した。これらの結果は，AtObg1が葉緑体のリボソーム機能に重要な役割を果たしている可能性を示唆する。

抄録全体を表示

プラスチド（色素体）には核とは異なる独自のDNAが存在し，DNA結合蛋白質と共に核様体を形成している。核様体の構造や蛋白質組成の変化は，プラスチドDNAの転写や複製制御に重要であると考えられる。しかしながら，プラスチド核様体を構成する蛋白質群の詳細は未だ明らかににされていない。本研究では，シロイヌナズナのゲノム情報を基に，プラスチド核様体を構成する新規蛋白質を探索した。その結果，代表的な細胞内局在プログラムの全てにより，プラスチド局在が予測された蛋白質として，SWIBドメインをもった低分子蛋白質(PSWIB)を見出した。SWIBドメインは，細胞核のクロマチンリモデリングに関わるSWI/SNF複合体のサブユニット（BAF60/BAP60）に保存された機能未知のドメイン構造である。PSWIBとGFPとの融合蛋白質を一過的に発現させたところ，葉緑体において顆粒状の緑色蛍光が確認された。安定な形質転換体でも同様の局在が見られ，そのパターンはDAPIによるプラスチドDNAの染色像と一致した。これらの結果は，PSWIBがプラスチド核様体に関連した蛋白質であることを示唆している。さらに，PSWIB-GFPを過剰発現させた植物体では，pale greenやアルビノの表現型が見られた。現在，さらなる機能解析を進めており，それらの結果も併せて報告する。

抄録全体を表示

プラスチドDNAは多くのタンパク質とともに核様体と呼ばれる複合体を形成している。エンドウとダイズの単離プラスチド核様体の主要な構成タンパク質として亜硫酸還元酵素(SiR)が同定され，in vitro転写系においてSiRが転写を抑制することが明らかになった。SiRはフェレドキシンから電子供与を受け亜硫酸塩を硫化水素に還元する酵素で，従来プラスチドストロマに存在すると考えられてきた。単離エンドウ葉緑体を抗SiR抗体で免疫蛍光染色したところ，SiRが葉緑体内で核様体に局在することが確認された。エンドウSiRの組換えタンパク質を大腸菌発現系を用いて調製し，吸光スペクトルからホロ型酵素を得た。この組換えSiRを用いて，ゲルシフトアッセイによる解析を行った。タンパク質濃度に依存して複数のシフトしたバンドが検出され，これはDNAに結合しているSiR分子の数を反映したものと考えられた。見かけ上の解離定数は40 bp二本鎖DNAで～25 nM，20 bp二本鎖DNAで ～225 nMであった。一本鎖DNAをプローブとした場合でもバンドのシフトが確認された。また，通常の二本鎖DNAとPoly(dI-dC)に強い競合が見られた。これらの結果から，SiRは配列非特異的にプラスチドゲノム全体に結合することが示唆され、これが転写抑制に関与すると考えられた。

抄録全体を表示

近年、大腸菌などの原核生物では、核様体の分配と細胞分裂が密接に関わっていることが明らかになってきている。即ち核様体が複製され、その分配が正しく行われないと、細胞分裂も正しく行われない。一方、植物における色素体の分裂と核様体の分配についての知見はほとんどない。そこで本研究では、植物における色素体の分裂と核様体の分配について調べることにした。色素体核様体を可視化する手法として、PENDタンパク質のDNA結合ドメインを含むN末端側とGFPとの融合タンパク質を発現するシロイヌナズナ形質転換体を作出した。PEND-GFP融合タンパク質は主に色素体核様体に局在し、従来DNA結合性蛍光色素を用いて、固定した植物材料においてしか観察されていなかった色素体核様体を、選択的に生きたまま観察することに成功した。通常の核様体は小さい粒子として存在するが、色素体分裂中の核様体は繊維状になっていた。真核生物の細胞分裂時における染色体分配と同様に、色素体分裂と共役して働く核様体分配装置が存在することが示唆された。さらに、シアニジオシゾンでも核様体は分裂中の葉緑体にまたがって繋がるように観察されることから、藻類から高等植物に至るまで類似の核様体分配装置があると考えられる。

抄録全体を表示

我々はタバコ培養細胞BY-2からバクテリアのDNA ポリメラーゼ Iと相同なタンパク質をコードする遺伝子を二つ（NtpolI-like 1およびNtpolI-like 2）単離した。両遺伝子産物のアミノ酸配列を比較すると、全長に亘って97.2%相同であり、複二倍体であるNicotiana tabacumの祖先種にそれぞれ由来するorthologueであると推測された。また、トランジットペプチドの領域については100%一致しており、コンピュータプログラムによる予測では色素体への局在が予想された。しかし、NtpolI-like2タンパク質に対する抗体を用いたウエスタン解析およびNtpolI-like1/2のトランジットペプチドとGFPの融合タンパク質の一過的発現により細胞内局在を観察した結果、NtpolI-like1/2タンパク質は色素体だけではなく、ミトコンドリアにも輸送されることが示唆された。この結果は、植物のミトコンドリアと色素体のDNA複製が同一の酵素によって行なわれている可能性を示している。現在、NtpolI-like1/2遺伝子産物以外にオルガネラ局在型DNAポリメラーゼが存在する可能性や、両オルガネラに存在するDNA ポリメラーゼの異同について、タバコ培養細胞BY-2から単離した色素体核およびミトコンドリア核を用いた生化学的検討を進めている。

抄録全体を表示

植物細胞では細胞核、葉緑体、ミトコンドリアそれぞれのゲノム間でクロストーク機構が働きながら遺伝子発現が行われ、個体機能を統御していると考えられている。これらの転写系のうちミトコンドリアではT7ファージ型RNAポリメラーゼ（NEP）が機能し、葉緑体ではNEPに加え原始ラン藻由来の真正細菌型RNAポリメラーゼ（PEP）が機能している。シロイヌナズナのNEPには、ミトコンドリア局在性のRpoT;1（RpoTm）、葉緑体局在性のRpoT;3（RpoTp）と、ミトコンドリアと葉緑体に両局在するかどうか議論が分かれるRpoT;2（RpoTmp）の3種類がある。我々はオルガネラ発達過程やストレス応答を転写ネットワークの面から捉え、RpoT;2が葉緑体とミトコンドリア両方の転写や機能に関与していないかどうかを欠失変異株を用いて解析した。この遺伝子の変異株については昨年、独のグループから報告がなされているが（Baba et al., Plant Cell 2004）、なおその分子機能と役割については不明な点が多い。我々はRpoT;2の機能的重要性が発芽初期段階や各種環境刺激等で顕在化するのではないかと考え、ノザン解析、QPCR、マイクロアレイ解析、光合成活性測定等で調べた。その結果、RpoT;2欠損が少なくとも複数の葉緑体コード遺伝子の発現や光合成活性に有意な影響を与えることを見いだした。またRpoT;2変異によって多面的影響を受ける核コード遺伝子候補も抽出したので報告する。

抄録全体を表示

細胞壁の主成分であるセルロースの合成は大量に栄養源を消費する植物独自の代謝である。大量のセルロース合成のために植物のミトコンドリアは細胞質、細胞膜での代謝と呼応して効率よい基礎炭素代謝を司る必要があると思われる。しかしミトコンドリア機能とセルロース合成の関連性を示した研究例は殆どなかった。
我々はセルロース合成機構を探るため、セルロース合成阻害剤による根端の形態変化がおきにくい変異体(css1) を単離し解析してきた。この変異体はセルロース合成阻害剤に対する応答性のみならず、アミノ酸代謝（アラニンの蓄積）、脂質代謝、糖感受性、セルロースとデンプンの蓄積量に変化が見られた。この変異体の原因遺伝子はAt-nMat1a (グループIIイントロンのマチュレース(mat-R)と相同性のある核遺伝子)と判明した。ミトコンドリアNAD4のスプライシングがこの変異体では異常であることもわかった。ショ糖合成酵素は細胞質で糖代謝に関わるだけでなく、細胞膜に結合しセルロース合成にも関与する重要な酵素である。我々の分析から、この変異体でのミトコンドリア機能の低下が何らかの経路を通じて細胞質に局在するショ糖合成酵素の割合を高め、それによりセルロースの蓄積量が減少することが示唆された。

抄録全体を表示

1989年に植物ミトコンドリアのRNAエディティングが発見されて以来多くの研究がなされてきたが、現在でもRNAエディティング部位識別に係わるシス配列、ガイド配列（シス及びトランス、DNA or RNA）、トランス因子（タンパク質）、デアミナーゼは確定されていない。このRNAエディティングの分子装置についての知見を得るため我々はRNAエディティング部位の比較解析を進めている。
我々はタバコミトコンドリアのDNA塩基配列を決定し、36種類のタンパク質、3種類のrRNA、そして、21種類のtRNAをコードする遺伝子があることを報告した（2005年）。その基盤情報を基にRT-PCR法で36種類のタンパク質遺伝子のRNAエディティング部位519箇所を決定した。そして、RNAエディティング部位の決められているタバコ、シロイヌナズナ、イネ、ナタネの29遺伝子について塩基配列をマルチプルアライメントし、780箇所のRNAエディティング部位をマークした。その結果、4種の植物で共通な部位は170箇所（22％）しかなく、303部位（39％）は種固有であった。これらの結果から、
●陸上植物が多様化した後、それぞれの系統ごとに独自にRNAエディティング部位を獲得固定した。
●トランス因子は多数のRNAエディティング部位をまとめて識別する。
●そのトランス因子も植物系統ごとに独自に進化した。
と推定した。

抄録全体を表示

FtsHはAAAモチーフを持つ膜局在型のメタロプロテアーゼである。植物では葉緑体チラコイド膜とミトコンドリア内膜に存在し、酵母及び動物のミトコンドリアでは内膜の内側（matrix）と外側（intermembrane space）にプロテアーゼ活性部位を配向させたホモログが知られており、それぞれm-AAA、i-AAAプロテアーゼと呼ばれる。シロイヌナズナゲノム内には12個のFtsHをコードする遺伝子が存在し、GFPトランジェントアッセイではこれらのうち9つのFtsHが葉緑体に局在し、その他はミトコンドリアに局在することが明らかになっている。さらに最近、この中の1つFtsH11がミトコンドリア、葉緑体の両方に局在することも明らかになった。よってミトコンドリアには4種のFtsH (FtsH3, 4, 10, 11)が局在し、FtsH3及び10がm-AAA、FtsH4及び11がi-AAAとして内膜に存在することがわかった。ミトコンドリアFtsHはProhibitinと呼ばれるタンパク質と相互作用し複合体を形成する。今回は、これらミトコンドリア型FtsHをコードする遺伝子のT-DNA挿入変異体のホモ接合体を単離し、4種類のFtsH遺伝子全ての組み合わせで二重突然変異体を作成した。得られた個体の形質及びFtsHタンパク質の蓄積についてもあわせて報告する。

抄録全体を表示

Randolphらはクラミドモナスの呼吸欠損株に対して、野生株から調製した線状ミトコンドリアゲノムを丸ごとパーティクルガンで撃ち込むことにより呼吸能を回復した株を得ている。しかし、続報がなく、人工的なDNA-constructの導入について成功例の報告はない。我々は、野生型のCOB遺伝子、COXI遺伝子を持つ形質転換用DNA construct を作製した。これを利用して、ゲノム左端及びCOB遺伝子の欠損、COB遺伝子内、COXI遺伝子内に点突然変異を持つ5種の呼吸欠損株について形質転換を試みた。その結果，形質転換が可能な株とそうでない株があることが判明した。呼吸能を回復した元株は、ミトコンドリアゲノムの左末端からCOB遺伝子の途中のどこかまでを欠損している呼吸欠損株に限られ、形質転換体が得られない元株は塩基置換あるいは、フレームシフトによる呼吸能欠損株であった。このことは、末端を欠いたゲノムを持つミトコンドリアでは、その修復のために高い相同組み換え活性が誘導されているが、安定したゲノムを持つ株では、その活性が低いために形質転換体が得られないことを示唆している。またPCR解析の結果，初期には様々な部位で相同組み換えを起こした非野性型ゲノムが存在し，2次的な組み換えを経て野生型ゲノムが構築されることがわかった。これまでオルガネラの形質転換が成功していない生物種でも、組み換え活性を誘導できれば、外来遺伝子を導入できる可能性を示唆している。

抄録全体を表示

パープルホスファターゼ(purple acid phosphatase)は、プロティンホスファターゼ(type 1, type 2B) が含まれるホスホエステラーゼファミリーに属し、基質特異性が広く、多くの種類のホスホモノエステルを脱リン酸化することが知られている。リン酸の取り込み・輸送をはじめとする様々な役割が推察されているが、我々はタバコ培養細胞から細胞壁構築に関わっているパープルホスファターゼ遺伝子(NtPAP12)をクローニングした。このNtPAP12は、酵素学的特性からホスホチロシンホスファターゼであると考えられる。
パープルホスファターゼ(NtPAP12)をタバコプロトプラストの細胞壁再生培地に添加するとセルロースの蓄積が活性化され、NtPAP12を過剰発現するタバコ細胞はセルロース含量が増加した。そこで、NtPAP12の基質となるリン酸化タンパク質の探索を試みた。ターゲットの探索は、形質転換体と野性株との比較で行った。細胞膜、細胞壁および培地からそれぞれタンパク質を分画し、二次元電気泳動によって網羅的に解析した。その結果、培地中のリン酸化タンパク質に差異が認められた。

抄録全体を表示

UDP-D-ガラクツロン酸はペクチンに含まれるガラクツロン酸の供与体であるが、市販されておらず、高効率な合成法が求められている。UDP-ガラクツロン酸ピロホスホリラーゼはUDP-ガラクツロン酸合成のsalvage経路の最終反応に関わるが、精製も遺伝子クローニングもされていない。エンドウ豆由来UDP糖ピロホスホリラーゼは幅広い基質特異性を持ち、UDP-Glc, UDP-Gal, UDP-GlcUA, UDP-Xyl, UDP-Araを生成する。そこで本酵素のUDPガラクツロン酸ピロホスホリラーゼ活性を検討し、UDPガラクツロン酸の合成への応用を探った。
大腸菌で発現させたUDP糖ピロホスホリラーゼは、ガラクツロン酸1-リン酸とUTP存在下で、UDP-ガラクツロン酸とピロリン酸を生成し、本酵素がUDP-ガラクツロン酸ピロホスホリラーゼ活性を持つことが示された。この反応は可逆的で、UDP-ガラクツロン酸合成反応の平衡定数は0.24であった。この活性の至適pHは6、ガラクツロン酸-1-リン酸、UTP、UDP-ガラクツロン酸、ピロリン酸に対するK_m値はそれぞれ2.3 mM、1.2 mM、0.70 mM、1.3 mMと求められた。この反応は、無機ピロホスファターゼ存在下では、UDP-ガラクツロン酸が優先的に生成した（収率91%）。このように、本酵素を用いたこれまでにない効率的なUDP-ガラクツロン酸の合成法が確立できた。

抄録全体を表示

高等植物では糖ヌクレオチドは、デノボ経路とサルベイジ経路で合成され、多糖類合成における基質として利用される。UDP-糖ピロフォスフォリラーゼは様々な糖1-リン酸を各種UDP-糖に変換する酵素で、サルベイジ経路において各種UDP-糖の産生に関与している。今回、我々はシロイヌナズナのゲノム情報を利用して、シロイヌナズナのUDP-糖ピロフォスフォリラーゼ、AtUSPを同定し、その生理機能を明らかにした。AtUSPは614アミノ酸からなるタンパク質で、既に我々が報告したエンドウのUDP-糖ピロフォスフォリラーゼ（PsUSP）と77％の相同性を示した。AtUSPは、シロイヌナズナの芽生え、ロゼット葉、花などで発現しており、特に葉の維管束組織、花粉で強く発現していた。大腸菌で発現させた組換えAtUSPは、PsUSP同様に糖1-リン酸に幅広く作用し、UDP-Glc、UDP-Gal、UDP-GlcA、UDP-Xyl、UDP-L-Araといった各種UDP-糖を合成した。T-DNA挿入によりAtUSP遺伝子が破壊されたusp変異体では、花粉が生殖機能を完全に喪失していた。これらの結果から、AtUSP遺伝子によるUDP-糖の合成が、花粉の発達または発芽に不可欠であることが示された。現在、細胞内の糖ヌクレオチド代謝の変化、細胞壁多糖類の変化についても解析している。

抄録全体を表示

ペクチンは双子葉植物の主要な細胞壁多糖の一つである。我々はペクチンの側鎖をなすβ-1,4-ガラクタンの生合成機構に着目し、その合成に関わるガラクトース転移酵素 (GalT) の解析 (Planta, 2004)、および酵素タンパク質の精製に取り組んできた。今回は、ガラクタン鎖長の伸長反応を部分精製酵素を用いて調べた。
ダイズの実生から調製した粗顆粒画分を界面活性剤で処理してGalTを可溶化し、イオン交換クロマトグラフィーによって得た部分精製酵素標品を反応に用いた。糖鎖伸長反応は、2-アミノベンズアミド(AB)により蛍光標識したβ-1,4-Gal₇ (Gal₇-AB) を受容体として行った。粗顆粒画分を酵素源とした場合は、受容体の重合度は7から11までしか伸長しなかったが、部分精製酵素による反応では、時間とともに鎖長が伸び続け、重合度は34に達した。次に、重合度4から11までのAB化ガラクトオリゴ糖を用いて受容体の重合度と糖転移活性の関係を調べた。重合度が4から7と大きくなるにつれ転移活性は上昇したが、重合度8～11の受容体に対する活性は重合度7のものに比べて低くなり、ほぼ一定の値を示した。

抄録全体を表示

アラビノガラクタン－プロテイン(AGP)は高等植物に広く存在する細胞表層プロテオグリカンであり、植物の生長・分化と密接な関係があることが示唆されている。しかしながら、AGPの糖鎖に作用する酵素の研究は非常に少なく、主鎖である1，3－ガラクタン部分に作用する酵素はクローニングさえなされていなかった。最近、発表者らは担子菌の一種であるPhanerochaete属より初めてエキソ－β－1，3－ガラクタナーゼ遺伝子をクローニングすることに成功し、その類似配列が植物に存在することを見いだした。本研究ではシロイヌナズナに見いだされた2種類のエキソ－β－1，3－ガラクタナーゼ様配列の機能解析を行うことを目的としている。これらの遺伝子を用いて酵母菌Pichia pastorisを形質転換し、組換え酵素として発現させたところ、両組換えタンパク質共に、β－1，3－ガラクタンを加水分解することが明らかとなった。現在、酵素の詳細な生化学的解析および本遺伝子の分子生物学的解析を行っている。

抄録全体を表示

アラビノースはラムノガラクツロナン I, アラビノガラクタン、アラビノキシランなどの細胞壁多糖類に含まれる主要な構成糖である。これらの多糖類ではアラビノースは大部分アラビノフラノースとして存在する。しかし、アラビノピラノースがいくつかの植物アラビナンから少量検出されている。アラビノースを含む糖鎖のin vitro合成研究ではUDP-アラビノースが糖供与体として使用されているが、受容体や酵素生成物の解析は不完全である。 そこで、UDP-アラビノピラノース(UDP-Arap )とUDP-アラビノフラノース(UDP-Araf)を糖供与体として使用したアラビナン合成に関係するアラビノース転移酵素反応について検討した。
UDP-Arap, 蛍光標識したアラビノオリゴ糖、マングマメミクロソーム画分を反応させると、1つのアラビノピラノース(Arap)がオリゴ糖の非還元末端のO-3位に結合したアラビノオリゴ糖が生成した。UDP-Arafを用いると、上述したArapが結合したアラビノオリゴ糖の他に、アラビノフラノースが非還元末端のO-5位に結合した(1→5)-アラビノオリゴ糖が生成した。

抄録全体を表示

(1-5)-α-L-アラビナンはアラビノフラノース(Araf)から構成され、主にラムノガラクツロナンIの側鎖として存在する植物細胞壁多糖である。我々は(1-5)-α-L-アラビナンの生合成について明らかにするために、Araf転移酵素の活性について検討した。
暗所で育てたヤエナリ上胚軸の伸長部位から、スクロース密度勾配法によりゴルジ膜画分を調製した。調製したゴルジ膜画分に糖供与体としてUDP-Arafおよび受容体として2-アミノベンズアミド（2-AB）化したアラビノオリゴ糖を加え(1-5)-α-L-アラビナン合成を行った。酵素生成物のLC-MS解析より、ペントース残基が付加されたオリゴ糖が生成していることが明らかとなった。酵素生成物はアラビノフラノシダーゼで分解されたことから、転移したアラビノースはArafであることが示された。また、NMR解析より生成物はα-(1-5)結合したアラビナンであると同定した。これらの結果より、ゴルジ膜に存在するAraf転移酵素によりUDP-Arafから (1-5)-α-L-アラビナンが合成されることが明らかとなった。

抄録全体を表示

キシログルカンエンドトランスグルコシラーゼ（XET）は、細胞壁中のキシログルカン分子を繋ぎ換える転移反応を触媒する酵素であり、細胞壁の構築や再編に関与すると考えられている。本研究では、成長しているエンドウ上胚軸に存在するXETアイソザイムについて、それぞれの酵素反応機構を網羅的に解析した。エンドウ上胚軸の酵素抽出液から、5つのXETアイソザイムが精製された。精製酵素のpI（および分子量）は、電気泳動において、それぞれ7.8 (31 kDa)、7.1 (29 kDa)、7.0 (31 kDa)、6.8 (29 kDa)および6.5 (29 kDa)であった。これらのアイソザイムの至適pHは、5.5-7.0の範囲であった。加水分解による還元力の増加を測定し活性を求めたところ、いずれの酵素もキシログルカンに対する加水分解活性は示さなかった。また、他のグルカンやキシラン等の多糖類には転移活性を示さなかった。ドナーとなる高分子キシログルカンとアクセプターとなるキシログルカンオリゴ糖を基質に用いて酵素反応速度論的に二基質反応機構を解析したところ、XETによる転移反応はピンポン機構ではなく、酵素が両基質と結合して、酵素・ドナー・アクセプター複合体を形成することにより転移反応を触媒するシークエンシャル機構で働くことが示された。

抄録全体を表示

キシログルカンエンドトランスグルコシラーゼ（XET）は2つの基質（アクセプターとドナー）と複合体を形成して、キシログルカン分子のつなぎ換えを行う細胞壁中の転移酵素である。エンドウ上胚軸細胞における抗体染色では、XET及びキシログルカンは主として異なるゴルジ体に局在し、一部のゴルジにおいて酵素と基質が共存することが示された。ミクロソーム画分に[¹⁴C]フコースを与えるとキシログルカンは標識化され、分子サイズ8.8 kDaと算出された。このゴルジのキシログルカンにXXXG（1 kDaのキシログルカンオリゴサッカライド）を与えても分子サイズは変化しないが、230 kDaのキシログルカンを与えると、8.8 kDa のものが110 kDaのものに変化することが認められた。このパルス・チェイス実験から、XETは8.8 kDaのキシログルカンをアクセプターとして、230kDaキシログルカンをドナーとして利用したことが推察される。以上の結果より、XETはゴルジでキシログルカンの非還元末端に結合して、酵素・アクセプター複合体を形成した後、細胞壁に組み込まれるメカニズムを我々は提唱する。

抄録全体を表示

植物を構成する各細胞にはそれぞれ固有の細胞壁が構築されている。エンド型キシログルカン転移酵素/加水分解酵素(XTH)はキシログルカン分子の繋ぎ換えや切断を触媒する酵素で、細胞壁の構築や再編成に重要な役割を果たすと考えられている。シロイヌナズナのXTHは33のメンバーからなり3つのクラスに分けられる。クラスIIIはキシログルカンの加水分解反応を触媒すると考えられているが、植物体での生理機能は未だ不明である。我々はクラスIIIに属する全ての遺伝子(AtXTH27,-28,-29,-30,-31,-32,-33)に着目し、発現と機能の解析を行った。xth27以外の突然変異体では顕著な表現型が確認できなかった。このことは、クラスIII遺伝子群の機能が互いに重複していることを示唆している。重複する機能を解明するため20通りの二重突然変異体を作成している。5つの遺伝子についてプロモーターGUS形質転換体の発現を解析したところ各遺伝子は組織特異性を示し、特定の組織では複数の遺伝子が共通に発現していた。XTH27、XTH28は共に葯で発現し、発現開始時期も一致した。XTH27とXTH28との二重突然変異体では果実長が野生型と比べて短くなることが明らかになった。

抄録全体を表示

合成オーキシン2,4-Dはイネ幼根切片で内鞘細胞から側根原基の形成を促進する。私達はこの過程で活性上昇するエンド-1,4-βグルカナーゼ（EGase）の基質特異性を解析し、本酵素がCM-セルロースやβ-1,3-1,4-グルカンだけでなくアラビノキシランのようなタイプII細胞壁の主要マトリクス多糖やグルコマンナンを分解する事を見い出した。本EGase遺伝子はGHファミリー9に属し、推定翻訳産物は全長約68 kDaで、精製物（51 kDa）よりC末が125残基長かった。このmRNAは、側根原基形成中の幼根で全RNA量1pg当たり数コピー存在し、側根原基に局在する事が発現解析より示された。ペプチド抗体を用いてウエスタンブロッテイングを行なった結果、51, 68, 110 kDaの3つのタンパクが検出された。51 kDaは緩衝液可溶性画分に多く、68 kDaと110 kDaの2つはミクロソーム画分に多かった。このうち、51と68 kDaは2,4-Dでタンパク量が増大したが、110 kDaの量は変化しなかった。2,4-D非存在下の側根形成過程では検出強度は弱いが、原基形成にともない51と68 kDaのタンパク量は増大し、つぎに側根が親組織の内皮を突き破り外へ出ていくにともなって、タンパク量が低下する傾向にあった。51 kDaのEGaseタンパクは68 kDaのC末側がプロセッシングを受けて生じたものと考えられた。

抄録全体を表示

木本植物の茎は、伸長成長停止後も木部にあて材を形成することで屈曲による姿勢制御をしている。双子葉植物は主に屈曲したい側に引張あて材を形成し、その強い引張の成長応力によって茎を曲げる。引張あて材の典型例では、木部繊維壁にセルロースに富んだリグニンを含まない二次壁層であるG層を形成する。通常の木部よりも強い引張の成長応力を、このG層が発生すると考えられている。引張あて材の形成や、応力発生のメカニズムに直接関与している酵素タンパク質を捉えることを目的に、引張あて材と通常木部の分化中および成熟木部から抽出されるタンパク質の2次元電気泳動像を比較し、引張あて材で発現量の増加しているシグナルをトリプシン消化後、LC/MS/MS・データベースサーチで同定した。一方、G層においてキシログルカンエンドトランスグルコシラーゼ（XET）活性が増大するにもかかわらず、その発現量はコントロールと同じレベルであった。そこで、XETsをPMF解析にかけたところ、アイソザイム間での差異が認められた。

抄録全体を表示

ホウ素(B)は高等植物の微量必須元素であり、その欠乏は成長や形態形成に著しい影響を及ぼす。演者はこれまでに低ホウ素条件下(5 μM)で成長可能なギンドロ培養細胞系(1/20-B) を確立し、B欠乏耐性機構について研究を行ってきた。その結果、1/20-B細胞のペクチンメチルエステラーゼ(PME)活性は十分なホウ素存在下(100 μM)で培養した細胞(1/1-B)よりも上昇しており、活性の上昇がB欠乏耐性に関与している可能性が示唆された。また、PME遺伝子の発現とホウ素欠乏耐性との関連を調べるためにPME遺伝子をクローニングしたところポプラのPME1遺伝子と高い相同性を持つことが示された。今回、1/1-B、及び1/20-BにおけるPME遺伝子の発現パターンを調べたので報告する。
PME遺伝子の発現はどちらの細胞でも継代後8日目に最大になっていた。しかし、1/1-Bでは発現時期が1～9日目なのに対して1/20-Bでは14日目まで発現が観察され、特に8～10日目は高い発現量を維持していた。この時期は伸長成長期にあたりホウ素欠乏は分裂成長よりも伸長成長に影響を及ぼすことが知られていることからこの遺伝子発現がホウ素欠乏耐性に関与していることが示唆された。また、PME活性が非常に高くなっていた2日目には遺伝子の発現が増大していないことからこの活性誘導には遺伝子の発現を伴わない調節機構があると考えられた。

抄録全体を表示

胚軸からの不定根形成を指標形質として単離したシロイヌナズナの温度感受性突然変異体lignescens（lig）は、制限温度下でリグニンの異常蓄積を示す点に特徴がある。本研究ではリグニン合成制御機構解明のためlig変異体の解析を行った。lig変異体は許容温度の18℃では正常に生育するが、制限温度の28℃では根の成長が著しく抑制された。リグニン定量の結果、28℃処理後2日目からリグニンの増加が示され、リグニン染色により根端付近でグアヤシルリグニンの異常蓄積が認められた。さらに、lig変異体におけるリグニン異常蓄積の分子機構に関する知見を得るため、リグニン合成関連遺伝子としてフェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードするAtPAL1、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼをコードするAtCAD-D、シンナモイルCoAリダクターゼをコードするAtCCR1とAtCCR2、及び数種のR2R3-MYB等の発現解析を行った。lig変異体を28℃で処理すると、AtPAL1、AtCAD-D、AtCCR2の発現が増加した。また、エチレン合成阻害剤のAVGで処理することによりlig変異体における28℃でのリグニンの異常蓄積が抑制された。一方、染色体マッピングと塩基配列解析により、lig変異体が未報告のセリン/スレオニンプロテインキナーゼ遺伝子にミスセンス突然変異をもつことが見いだされた。これらの結果から、リグニン合成制御におけるLIG遺伝子の役割について考察する。

抄録全体を表示

シロイヌナズナのSAMにおいては、CLAVATA（CLV）およびWUSCHEL（WUS）の細胞間コミュニケーションを介して互いの発現調節により、分裂組織の機能維持がなされている。しかしながら、これら遺伝子の転写制御の実体はまだ不明な点が多い。
我々はSAMの機能維持に関わる機構に着目し、シロイヌナズナのT-DNA挿入ラインから生育途中でSAMの機能が停止する劣性変異体（shoot-apical-meristem arrest 1：sha1）を単離した。shaでは第8葉まで正常な形成及び抽出が見られるが、それ以降の葉と花序は形成されなかった。その結果として、シュート形成が完全に停止した表現型を示した。第8葉形成時におけるshaのSAMドーム構造は帯化を呈し、新たな葉原基の形成は認められなかった。奇妙なことに機能が停止したSAMの周辺から異所的な分裂組織の形成が観察され、最終的には帯化した花序が形成された。またshaではCLV1、CLV2およびSTMの発現が正常であったのに対し、WUSおよびCLV3の発現が著しく抑制された。更にTAIL-PCR法を行った結果、T‐DNAの挿入箇所はRINGフィンガーモチーフをもった新規タンパク質（SHA）をコードする遺伝子の5’上流領域に確認され、shaではこの遺伝子の発現量の低下が確認された。以上の結果から、SHAタンパク質の機能はWUSの転写促進に関与するものと推測され、sha変異体ではWUSの発現異常によってSAMの機能異常が引き起こされたものと考えられた。

抄録全体を表示

植物のメリステムは，葉や花などの側生器官形成をはじめとして，その形態形成に重要な役割を果たしている．シロイヌナズナでは CLAVATA (CLV) シグナル伝達経路により，メリステムの維持制御が行われていることが知られている．一方，他の植物に関しては，どのような遺伝的機構により，メリステムの維持が行われているのかはほとんど未解明のままである．私たちは，単子葉類のモデル植物であるイネを用いて，花分裂組織のサイズの増大により花器官数の増加を引き起こす floral organ number1 (fon1) および fon2 変異体を用いた解析を行ってきた．これまで，FON1 は CLV1 様のレセプターカイネースをコードしていること，FON2 は CLV3 様のシグナル性ペプチドをコードしていることを明らかにしてきた ( Suzaki et al. Development 131:5649-5657; 寿崎ら 第46回 日本植物生理学会年会 ).
今回は，イネとシロイヌナズナにおいて，FON2 を構成的に発現させた形質転換体を作出し，その表現型解析を行った．その結果，イネにおいては，シロイヌナズナと基本的には同じ遺伝的制御により，メリステムの維持制御が行われていることが明らかになった．一方，シロイヌナズナにおける FON2 構成的発現の結果は，FON2 が CLV3 と同じタンパク質機能を担っていることを示唆した．しかし，その一方で，イネにはシロイヌナズナとは異なるメリステム維持経路も存在することが示唆された．

抄録全体を表示

植物ホルモンの一つであるオーキシンは、器官形成過程で非常に重要な役割を果たす。オーキシンの排出を促進する膜タンパク質PIN-FORMED (PIN) は細胞膜上に極性をもって局在し、オーキシンを器官内で方向性をもって輸送する。これまでに、Ser/Thr kinaseであるPINOID (PID)がPINタンパク質の細胞内局在の極性を制御することで、器官の発達に先立ったオーキシンの蓄積を促進することが示唆されている。しかし、いまだその過程における分子機構についてよく分かっていない。
我々はすでにpid変異の表現型を増強するエンハンサー変異体の原因遺伝子として、器官形成に関わる因子MACCHI-BOU (MAB)を3つ同定している。今回、そのうちの2遺伝子座についてポジショナルクローニングに成功した。MAB1遺伝子はミトコンドリア型ピルビン酸脱水素酵素のE1βサブユニットを、MAB4遺伝子は青色光によるシグナル伝達に関与するNONPHOTOTROPIC HYPOCOTYL 3 (NPH3)に類似したタンパク質をそれぞれコードしていた。本発表では、器官形成過程におけるこれらMAB1およびMAB4遺伝子の解析結果について報告する。

抄録全体を表示

私たちは、植物の形態形成の基本機構を探るため、シロイヌナズナの器官再生を対象として、温度感受性変異体を用いた分子遺伝学的解析を進めている。rid3（root initiation defective 3）、rpd2（root primordium defective 2）、rgd3（root growth defective 3）は、不定根形成を指標形質として単離した温度感受性突然変異体である。これらの変異体は、脱分化や基本的な細胞増殖にはあまり温度感受性を示さないが、不定根形成に加えて不定芽形成に関しても顕著な温度感受性を示す。各変異の分裂組織形成への影響を検討するため、シュート再生過程において、茎頂分裂組織関連遺伝子の発現解析を行った。野生型のシュート再生過程では、不定芽の形態形成に先立ち、CUC1、CUC2、WUSの発現レベルが上昇したが、制限温度下で培養したrgd3ではCUC1、CUC2の発現が抑制された。これはrgd3における不定芽形成不全の原因の一つとなっている可能性がある。さらに、芽生えの表現型を調べた結果から、rgd3 変異は茎頂と根端の両方で分裂組織の構造維持にも強く影響することがわかった。
現在、各変異体の責任遺伝子を同定するため、精密染色体マッピングと塩基配列解析を行っている。RID3 については遺伝子を確定し、WD40リピートをもつ新奇タンパク質をコードすることを突き止めた。

抄録全体を表示