果実の液胞は糖や有機酸などを高濃度に蓄積する巨大なオルガネラである．液胞膜のプロトンポンプが果実の肥大成長や物質蓄積に対して持つ役割を明らかにするために，果実特異的な発現を示すトマトの2A11プロモーター下で液胞型プロトンATPase（V-ATPase）の Aサブユニット遺伝子をアンチセンス方向で導入した形質転換トマトを作出した．実験には矮性のトマト品種（マイクロトム）を用い，アグロバクテリウム法によって形質転換を行った．
Aサブユニットアンチセンス導入系統の果実では，GUS導入系統や非形質転換体と比べてAサブユニットmRNAの蓄積が低下した．一方，葉でのmRNAの蓄積には変化が見られなかったため，2A11プロモーターの効果が果実に限定されていることが示された．Aサブユニットアンチセンス導入系統の植物体では植物体自体の成長に変化は見られなかったが, 果実の新鮮重と種子数の著しい減少がみられた. これらの結果はAサブユニットのmRNA蓄積と対応していると考えられた．また，Aサブユニットアンチセンス導入系統の果実では，グルコースとフルクトースの濃度に変化が見られなかったが，スクロース濃度が増加した．これらの結果からV-ATPaseの発現は果実の肥大成長だけでなく，種子形成や果実の糖組成にも影響を与えることが示された．

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我々の研究室では、シロイヌナズナの培養細胞からintact液胞を単離することにより、純度の高い液胞膜を精製することに成功している。さらにこの液胞膜を用いて質量分析を行なうことで、液胞膜に存在すると思われるタンパク質の網羅的な解析を行ってきた。同定したタンパク質の中には液胞膜タンパク質としてすでに知られている以外に未知の膜貫通タンパク質も含まれていた。液胞の生理機能から液胞膜にはさまざまな輸送体の存在が考えられるが、分子レベルでの確認をなされているものは少ない。そこで、我々は特にリン酸代謝に関連する輸送体タンパク質の同定を目指し、得られた膜タンパク質の中から、リン酸欠乏応答遺伝子が持つ特異的な配列をプロモーター領域に含むものを選び出し、さらに詳しい解析を進めることにした。まず、実際にそれらのタンパク質が液胞膜に局在するかを確認するため、GFP融合タンパク質をシロイヌナズナの培養細胞に一過的に発現させることで、プロテオームデータの信頼度を検討した。次に、これらのタンパク質の機能解析を行なうため、形質転換やその後の解析実験が容易なタバコ培養細胞BY-2にGFPとの融合タンパク質を導入、または強制的にタンパク質を発現させることで、リン酸に対する応答を調べている。また、リン酸代謝異常を示す変異体から液胞を単離して、リン酸代謝機構との関連を検討しているので、それについても併せて報告する予定である。

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機械刺激受容チャネルは、高等植物において風などの物理刺激や倒伏時などに生じる重力刺激を受容するセンサーであると考えられている。Ca²⁺感受性発光タンパク質エクオリンの遺伝子を導入したシロイヌナズナにおいてこれらの機械刺激が一過的な細胞質Ca²⁺濃度([Ca²⁺]_c)上昇を引き起こすことや、エクオリン導入タバコ培養細胞において低浸透圧刺激に応答した[Ca²⁺]_c上昇が起こること等により、高等植物における機械刺激受容Ca²⁺チャネル(MSCC)の存在が明らかとされているが、その活性化機構及び生理的意義は未だ明らかでない。
MSCCの生理的機能として気孔開閉制御への関与も示唆されていることから、本研究ではソラマメ孔辺細胞プロトプラストを用いて形質膜状に存在するMSCCの電気生理学的解析を行った。cell-attachedパッチクランプ解析により伸展刺激に依存したチャネル活性化が検出され、内向きに高い活性を持つMSCCの存在が示唆された。また、whole-cellパッチクランプ解析に於いて、TNP処理による形質膜の変形が同様のMSCCを活性化する事、このチャネル活性がCa2+チャネルブロッカーにより有意に阻害されることを見出した。同様のチャネル活性を有するエクオリン導入シロイヌナズナ葉肉細胞プロトプラストを用いた[Ca²⁺]_c解析と併せて、高等植物MSCCの諸性質を検討する。

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熱ストレス条件下に存在する細胞では，ほとんどのmRNAからの翻訳が抑制されるが，heat shock protein(HSP)遺伝子など一部のmRNAからの翻訳は維持もしくは活性化される．この翻訳制御には5'非翻訳領域(5'-UTR)が重要な役割を果たしている．本研究では，熱ストレス条件下でも翻訳されるシロイヌナズナHsp90遺伝子の5'-UTRの解析を行った．シロイヌナズナ培養細胞T87を用いてポリソーム解析を行ったところ，熱ストレスによる細胞全体としてのポリソームの解離にも関わらず，Hsp90のmRNAはポリソーム画分に存在していた．この熱ストレス条件下における翻訳にはHsp90 5'-UTRの存在が十分条件となることを，in vitroで合成したm⁷Gキャップ構造を持つmRNAをT87プロトプラストに導入する一過性発現実験により明らかにした．熱ストレスにより通常のキャップ構造に依存した翻訳が阻害されると考えられているため，キャップ構造を持たないmRNA及びバイシストロニックなmRNAを用いた一過性発現実験を行い，Hsp90 5'UTRの特性をさらに詳細に解析した．その結果，Hsp90 5'-UTRを介したキャップ構造に依存しない翻訳が熱ストレスにより活性化されることが解った．以上の結果から，キャップ構造依存的な翻訳が阻害されると考えられる熱ストレス条件下においてもHsp90 mRNAが翻訳されるのは，5'-UTRに存在するIRES(Internal Ribosome Entry Site)を介した翻訳が温度依存的に活性化されるためと考えられる．

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【目的】植物において、ストレス応答や防御に関する多くの遺伝子が選択的スプライシングによる発現調節を受けている。これまでに我々は、シロイヌナズナにはスプライシング制御因子であるSRタンパク質ホモログが20種類存在し、その中でSR41aが強光に対して応答することを明らかにした。そこで本研究では、SR41aが制御するストレス応答性の選択的スプライシング制御機構の解明を試みた。
【方法・結果】RT-PCRによる解析の結果、SR41aには自身の選択的スプライシングにより5つの成熟型mRNAが存在し、うち2つのスプライシング産物が強光条件下において応答した。また、タバコ培養細胞BY-2プロトプラストを用いた一過的発現解析の結果、GFP融合SR41aタンパク質は核に局在していたことから、SR41aはスプライシング因子として機能していることが示唆された。そこで、SR41aの標的遺伝子を同定するためにSR41a過剰発現形質転換体およびKO変異体を用いて様々な遺伝子の発現レベルおよびスプライシングパターンの解析を試みた。その結果、SR41aKO変異体において他のSRタンパク質 (SR34bおよびSCL33) の発現量が減少していた。さらに現在ディファレンシャルディスプレイ法を用い、SR41aの標的遺伝子の同定を行っている。

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シロイヌナズナのシスタチオニン γ‐シンターゼ（CGS）はメチオニン生合成の鍵段階となる反応を触媒する酵素である。CGSはメチオニンの次の代謝産物であるS-アデノシルメチオニン（SAM）に応答して、自身のmRNAの安定性の段階で負に制御されている。CGSの第1エキソンがこの制御に必要十分な領域であり、翻訳中にその新生ポリペプチドが自身のmRNAにシスに働いてその安定性制御を行っていると考えられる。これまでCGSの制御機構を解析する手段として、小麦胚芽抽出液を用いた試験管内翻訳系を用いてきた。本研究では、シロイヌナズナのカルスからの抽出液を用いた試験管内翻訳系を確立し、遺伝子と相同な系での転写後制御機構の解析を目指した。シロイヌナズナ試験管内翻訳系を用いたレポーターアッセイによりCGS第1エキソンのSAMに対する応答が再現され、ウエスタン解析によってSAMに応答した翻訳停止産物も検出された。プライマー伸長法を用いた解析ではSAMに応答したmRNA分解中間体も検出され、シロイヌナズナ試験管内翻訳系でのCGS発現制御の再現に成功した。しかしながら、SAM添加に伴い非特異的な翻訳活性の低下が見られていた。そこで、さらにこの系を最適化するために条件検討を行った。その結果、CGS第1エキソンのSAM添加に対する応答の検出に最適な翻訳反応液の組成を決定した。

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シスタチオニン γ-シンターゼ（CGS）はメチオニン生合成の鍵段階を触媒する。AtCGS1遺伝子の発現は、メチオニンの代謝産物であるS-アデノシルメチオニン（SAM）に応答してmRNA安定性の段階で負に制御される。この制御にはAtCGS1第1エキソンのコード領域が必要十分で、この領域内の植物間で高度に保存された十数アミノ酸の配列（MTO1領域）が特に重要である。試験管内翻訳系を用いた解析によって、mRNA分解に先立ちMTO1領域の直後で翻訳が停止することが明らかになり、翻訳停止領域のTrp-93の重要性が示された。Trp-93は被子植物で保存されているがコケではアラニンであり異なっている。そこで本研究では、翻訳停止におけるTrp-93の重要性を検討するために、AtCGS1第1エキソンに対応するヒメツリガネゴケPpCGSの配列を持つRNAの翻訳制御について小麦胚芽抽出液の試験管内翻訳系を用いて解析した。その結果、PpCGSの配列では、翻訳停止産物とmRNA分解中間体の蓄積は少ないものの、SAM添加に応答したAtCGS1と同様の制御が働いていた。そして、翻訳停止領域のアラニンをトリプトファンに置換すると両者の蓄積量はAtCGS1程度まで増加した。このことから、Trp-93は翻訳停止を起こりやすくするが、翻訳停止には他の要素も必要であると示唆された。

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シスタチオニンγ-シンターゼ（CGS）はメチオニン生合成経路の鍵段階を触媒する酵素である。シロイヌナズナにおいてCGSをコードするCGS1遺伝子のmRNAは、メチオニンの代謝産物であるS-アデノシルメチオニン（SAM）に応答して分解が促進される。このmRNA分解制御はCGS1第1エキソンの翻訳中に起こり、第1エキソン内部に存在するシス領域（MTO1領域）のアミノ酸配列が重要である。またmRNA分解に先立ち、SAMに応答した翻訳の一時停止がMTO1領域直後で起こる。
小麦胚芽の試験管内翻訳系でこの制御は再現され、SAMに応答して5’側の欠けたmRNA分解中間体が複数種類蓄積する。プライマー伸長法による分解中間体5’末端の解析から、SAMに応答して停止したリボソームを先頭に複数個のリボソームが次々と連なって停止することが示唆された。これと合致して、連なったリボソームに対応すると考えられる複数種類の部分翻訳産物が検出された。これら部分翻訳産物の種類は翻訳効率の増加や反応時間の経過に伴って増加した。複数個のリボソームが連なって停止した後それぞれの5’側内部でmRNAの分解が起こると考えているが、この分解がエンドヌクレアーゼによるのかエキソヌクレアーゼによるのかについて解析を進めている。

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シロイヌナズナにおいてメチオニン生合成の鍵段階を触媒するシスタチオニン γ-シンターゼ（CGS）遺伝子の発現はメチオニンの次の代謝産物であるS-アデノシルメチオニン（SAM）に応答してmRNAの安定性の段階で負に制御されている。この制御は翻訳中に起こり、CGS新生ポリペプチドが関与する。この制御にはCGSの第1エキソンが必要十分な領域であり、この領域内の77-RRN CSNIGVAQIVAA-91という配列（MTO1領域）が特に重要であることが一過的発現系を用いた解析により明らかにされている。しかしながら、80番目のシステインと81番目のセリンをそれぞれアラニンに置換してもCol-0野生型と同様の応答が見られた。小麦胚芽抽出液を用いたIn vitro翻訳系でCGS第1エキソンを含むRNAを翻訳させると、SAM添加に応答してmRNAの分解に先立ってMTO1領域近傍で翻訳伸長が停止する。また、SAMはスルホニウム基にアデノシル基とメチル基が付加しているアミノ酸であり、このメチル基がエチル基に置換されているS-アデノシルエチオニン（SAE）もエフェクターとして働く。In vitro翻訳系を用いて80番目と81番目をさまざまなアミノ酸に置換してSAMやSAEに対する応答を検討した結果、これらがエフェクターと相互作用している可能性が示唆された。

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植物の葉緑体遺伝子発現において，転写後の翻訳の過程も非常に重要な役割を果たしていることが知られている．葉緑体の翻訳系はバクテリアのものと類似性の高い部分もあるが，バクテリアとは異なり，Shine-Dalgarno 様配列を持たない mRNA が多く存在する．それらの翻訳開始の促進にはトランス因子の関与が考えられているが，そのメカニズムは明らかとなってはいない．そこで，葉緑体における翻訳制御機構を解析するために，我々はまず，既存の葉緑体 in vitro 翻訳系の大幅な改良を行い，GFP の蛍光を利用した放射性同位元素を用いない検出法を構築した．その結果，反応液の電気泳動後数分以内に翻訳産物の検出が可能となった．また，新しい系は大腸菌由来の tRNA の添加を必要とせず，葉緑体本来の系に近いものとなった．次に，この新しい系を用いて十数種の葉緑体遺伝子の 5'UTR と融合させた GFP の翻訳効率を比較した．また，そのうちの数種について，GFPレベルの mRNA 濃度依存性，時間経過などを詳細に調べた．現在，翻訳開始に必要とされる葉緑体 mRNA 5'UTR 上のシス配列およびトランス因子について解析を行っており，その結果について報告する．

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一般的にコドン使用頻度は翻訳効率を反映していると考えられているため、ある遺伝子を異なる生物種で効率良く発現させるためには、導入遺伝子を宿主の生物種で高頻度に使用されているコドンに合わせて改変する必要がある。近年、葉緑体形質転換法を用いて葉緑体で外来遺伝子を発現させる試みがなされてきている。葉緑体遺伝子の発現調節は主として転写後の段階で制御されていること、また、葉緑体ゲノムに存在している30種のtRNA遺伝子中には、アラニンとプロリンの最も使用頻度の高いコドンに対応するtRNA遺伝子が存在しないことから、葉緑体ではゲノム情報を基にしたコドン使用頻度と実際の翻訳効率が異なっている可能性が非常に高い。そこで、本研究では、タバコ葉緑体in vitro翻訳系を用いて、葉緑体遺伝子のコドン使用頻度がどの程度翻訳効率を反映しているのかについて解析を行った。

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オーキシンの極性輸送は、胚発生におけるパターン形成や胚発生以降の形態形成において、その体制を制御する上で重要な役割を果たすことが示唆されている。シロイヌナズナでは、オーキシンの極性輸送に関連した変異体とその原因遺伝子が多数同定されており、その機構の解明も進みつつある。一方で、変異体が飽和しつつあり、新規因子の同定が減速しつつあるのもまた現状である。
我々は、イネにおいて、オーキシン極性輸送が減少し、根、シュート、花器官など多面的な異常を示す突然変異体fish bone (fib)の解析を通じて、イネの体制とオーキシン極性輸送の関係、さらには、オーキシン極性輸送の制御機構の解明を目指し研究を行っている。
FISH BONE遺伝子は、新規のタンパクをコードしており、これまでにシロイヌナズナで同定されているオーキシン極性輸送関連因子とは全く別の新規因子であった。FIB様の遺伝子は、シロイヌナズナには3つ（AtFIB1～3）存在し、それぞれ単独変異体では表現型が観察されないが、多重変異体では、オーキシン極性輸送の低下を伴う様々な表現型が観察される。
イネおよびシロイヌナズナのfish bone変異体の解析を通じて、FISH BONE遺伝子のオーキシン極性輸送における機能について考察したい。

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シロイヌナズナのオーキシン非感受性突然変異体の原因遺伝子MSG2/IAA19の屈性反応における役割を明らかにするために、その発現パターンをMSG2 promoter::GUS導入株を用いて調べた。シロイヌナズナの4日齢黄化芽生えに0.06 umol/m²/sの青色光を当ててGUS染色を行ったところ、刺激開始前は83%が胚軸組織で均一に染色しているのに対し、刺激時間の経過に伴い、偏差的染色を示す芽生えの割合が屈曲角度とともに増加した。このような偏差的染色を示す芽生えは刺激開始24時間後で58%を占め、その横断切片を観察すると、表皮と皮層を中心に屈曲の内側より外側が強く染色される偏差的染色が見られた。屈地性の場合は、90度の刺激では染色の変化が少なく、偏差的染色の観察が難しかったため、135度の刺激を与えた。その結果、屈光性と同様の傾向が重力刺激でも得られたが、屈光性ほど顕著ではなく、24時間後に偏差的染色を示した芽生えは49%であった。また、刺激を加えなかった場合と比較することにより、偏差的な染色は屈曲部の内側で染色が減少することにより生じたと考えられる。同様の実験をDR5::GUS導入株でも行ったが、偏差的染色は得られたものの、その割合はMSG2 promoter::GUS導入株と比べはるかに少なく、刺激開始24時間後で1％の芽生えでしか偏差的染色は観察されなかった。

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シロイヌナズナのオーキシン非感受性突然変異体massugu2（msg2/iaa19）は、成体での表現型異常はほとんど見られないが、野生型と比べて稔性が低下する。しかし人工的に自家受粉させると正常に種をつける。そこで、花器官の成長を観察したところ、野生型の花では開花直前に雄蘂が雌蘂より急速に伸長するようになる結果、葯が雌蘂の柱頭を追い越し、その時受粉を成立させているのに対し、msg2では雌蘂を追い越す雄蘂がほとんど見られなかった。つまり、msg2の稔性低下は花粉や胚珠の異常によるものではなく、雄蘂と雌蘂の伸長のタイミングが合わないために受粉機会が減少することが主な原因になっていると思われる。雄蘂は花糸の伸長によって伸びる。花糸の表皮細胞列の細胞数を数えたところ、野生型、msg2共に、花糸の長さにかかわらず細胞数はほぼ一定であったので（野生型：26.7±1.7、msg2：26.3±1.5）、細胞数の増加ではなくて、個々の細胞の伸長によって花糸が伸びることがわかった。さらに、花におけるMSG2の発現を調べるためMSG2 promoter::GUS株でGUS活性を観察したところ、花でのMSG2プロモーター活性は伸長が加速され始めた後の雄蘂の花糸でのみ見られた。このことから、MSG2が受粉にかかわる花糸の細胞伸長の制御に関与していることが示唆された。

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高等植物における花茎重力屈性の分子機構を解析するために、我々は花茎重力屈性異常変異体shoot gravitropism（sgr）を単離してきた。シロイヌナズナの花茎を水平方向に倒して重力刺激を与えると、約90分で90度の屈曲を示す。これに対し、新規に単離された劣性の変異体であるsgr9変異体は重力刺激後8時間経過しても約50度の屈曲にとどまり、鉛直方向までの屈曲は観察されなかった。また、形態上は側枝が横方向に伸長する以外に目立った異常は認められなかった。シロイヌナズナの花茎においては内皮細胞が重力感受細胞である。内皮細胞内には10～20個程度のアミロプラストがあるが、野生型ではほぼ全てが重力方向に沈降しており、平衡石として機能すると考えられている。一方、sgr9には、野生型と同様に沈降したアミロプラストだけを含む内皮細胞の他に、沈降していないアミロプラストを1～数個含む内皮細胞が相当数存在していた。このようにsgr9は重力屈性反応においても、アミロプラストの沈降においても、これまでに単離、解析されてきたsgr変異体とは性質を異にするものであり、花茎重力屈性のメカニズムを解明する上で非常に興味深い変異体であると考えられる。現在、sgr9変異体の原因遺伝子の同定、および解析を進めている。

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IAA-アミノ酸複合体（IAA-aa）は IAA のホメオスタシスにおいて重要な役割を担っており、IAA ホメオスタシスの解明には IAA-aa 合成酵素を阻害することによってその不活性化ルートを遮断することが有効であると考えられる。最近、オーキシン早期誘導遺伝子である GH3 が IAA-aa 合成活性を持つことが報告された。シロイヌナズナでは複数の GH3 が IAA-aa 合成活性を示すことから、各 GH3 遺伝子での機能重複が予想される。そのため、特定の GH3 遺伝子を標的とした遺伝学的手法では IAA-aa 合成を完全に止めることは困難で、化学的にその系を阻害する化合物が有効であると考えられる。そこで、我々は、GH3 がホタルルシフェラーゼスーパーファミリーに属し、IAA をアデニル化する活性を持つことから、GH3 の反応機構を予想し、反応中間体アナログとなる、IAA の N-sulfamolyadenosine 誘導体（IAA-SA）ならびに、一連の天然および人工オーキシン類の SA 誘導体（NAA-SA，PAA-SA および 2,4-D-SA）を合成した。これらの阻害剤は IAA-aa 合成に関与する全ての GH3 を阻害できる可能性があり、IAA ホメオスタシス解明に有効な化学的ツールとなることが期待される。今回、GH3-5 および GH3-6 の酵素化学的解析を行い、各阻害剤の in vitro での阻害活性を検討したので報告する。

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オーキシン結合タンパク質1（ABP1）のC末端ペプチドがオーキシン様活性をもつことが知られていることから、オーキシンのシグナル伝達機構を解明するためには、このペプチドに対する受容体を明らかにすることが重要と思われる。そこで、親和架橋実験を行ったところ、トウモロコシ由来の2種の候補タンパク質が得られた。このうち、CBP1と名付けたタンパク質はGPIアンカーを介して原形質膜に局在するタンパク質であり、銅を含有するタンパク質であった。また、アラビドプシスSKU5およびSKS6、タバコNTP303などの細胞の極性と関連すると思われる伸長生長に関与するタンパク質と高いホモロジーが見られた。また、ABP1欠失変異が胚形成過程での特定の方向への細胞伸長を誘導しないことなどから、オーキシン誘導性の細胞肥大化応答の中で、細胞極性と関連する伸長生長にABP1－CBP1経路が重要な役割を担っている可能性を示唆している。

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われわれは，atvam3変異体（AtVAM3のペプチド挿入変異体および欠損変異体）においてミロシン細胞数が増大し，ミロシナーゼ（TGG）が大量蓄積されることを報告した．TGGはグルコシノレート（カラシ油配糖体）を分解し害虫に対する忌避物質を生成するチオグルコシダーゼであり，特徴的な異型細胞（ミロシン細胞）の液胞中に蓄積されている．ミロシン細胞は，野生型の葉では維管束周辺に点在していたが，atvam3変異体では葉全体にわたって連続的なネットワークを形成していた．免疫電顕において，atvam3変異体のTGGもミロシン細胞の液胞中に特異的に検出され，輸送異常は観察されなかった．atvam3変異体における液胞タンパク質の蓄積パターンを野生型植物と比較したところ，TGG以外のタンパク質（RD21，アリューレイン，2Sアルブミン，12Sグロブリン，γ-TIP）に変化は見られなかった．ペプチド挿入型AtVAM3の細胞内局在は正常なAtVAM3と一致し，液胞膜および液胞前区画で検出された．また，atvam3変異体においてもその局在は変化せず，液胞も正常に発達していた．酵母VAM3は液胞融合や液胞タンパク質の輸送に必須であることが報告されているが，AtVAM3は液胞融合およびTGGの液胞輸送には必須ではなく，秩序だった細胞分化という多細胞生物ならではの機能を持つことが示唆された．
Ueda et al. Plant Cell Physiol. (2005) in press

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高等植物において、葉は一定の空間的・時間的パターンにしたがって分化する。葉の分化パターンは植物のシュート構築における重要な要素であるが、その時間的パターンである葉間期（1枚の葉を分化する間隔）の制御機構はほとんど明らかになっていない。栄養成長期においてplastochron2 (pla2)変異体の葉は早く成熟し、短い葉間期を示す。また生殖生長期においてpla2は一次枝梗原基がシュートに転換するというヘテロクロニックな表現型を示す。PLA2は分裂酵母の減数分裂のマスタースイッチであるMEI2と高い相同性を持つRNA binding proteinをコードし、トウモロコシの、葉間期が短くなり、tasselがearに転換するTERMINAL EAR 1 (TE1)のオーソログであった。PLA2は栄養生長期の茎頂において、葉を分化する分裂組織ではなく、分化した若い葉原基で発現していたことから、PLA2の機能は葉の発生成熟速度を抑制することであると考えられる。また、pla1 pla2二重変異体は相乗的な表現型を示したことから、CYP78A11をコードするPLA1とPLA2は独立の経路で機能すると考えられる。これらの結果から、イネにおける葉間期制御モデルを提唱する。

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KNOX遺伝子は茎頂分裂組織（SAM）の形成・維持に重要な役割を果たしている。KNOX遺伝子はSAM特異的に発現しており、本来発現していない葉で異所発現すると葉の形態異常を引き起こす。従って、植物の正常な発生にはKNOX遺伝子のSAM特異的発現が必須である。イネのKNOX遺伝子OSH1のプロモーターは葉でも活性があり、また、OSH1 cDNAをイネに導入すると内在のOSH1が葉で異所的に発現することがわかった。これらのことは、OSH1がプロモーター領域だけでなくコード領域も含んだ複雑な発現制御を受けており、遺伝子のコピー数が増加するとその発現制御が破綻し、葉での異所的発現が引き起こされることを示している。そこで、その発現抑制に関わる遺伝子を同定するため、OSH1の過剰発現体と同様な表現型を示す突然変異体を選抜した。得られたonion突然変異体はOSH1過剰発現体の強い表現型に相当し、実際にOSH1が葉で発現していた。ONION遺伝子をマッピングしたところ、マップされた領域にはトウモロコシのROUGH SHEATH2やシロイヌナズナのASYMMETRIC LEAF1、ASYMMETRIC LEAF2等の既知のKNOX抑制遺伝子の相同遺伝子が存在せず、従ってONION遺伝子は新奇なKNOX抑制遺伝子と考えられた。現在、ONION候補遺伝子による相補実験を行っている。

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高等植物の胚発生は茎頂分裂組織、根端分裂組織、表皮、維管束など将来の植物体を構成するのに必要な器官や組織を発生し、植物の基本的な体制を作り出す過程である。この間、位置情報の確立、軸決定、器官・組織の分化といった多くの重要な現象が短い期間に凝縮して進行する。イネでは多数の胚発生致死突然変異体が単離されており、これらのプロセスに多くの遺伝子が関与すると予想されている。本研究では特に胚発生初期における器官分化機構を明らかにすることを目的とし、器官分化に欠損のあるイネ胚発生致死突然変異体から原因遺伝子の単離を試みた。イネのレトロトランスポゾンTos17による挿入変異系統から球状型、棍棒状型、シュート欠損型など25系統について、M3世代において遺伝子型を決定したM2世代のヘテロ型ならびに野生型の植物体を材料にTos17プローブにより連鎖解析を行った。その結果、球状型を示す突然変異体1系統において新規の転移によりコピー数の増加したTos17のバンドと遺伝子型が完全に連鎖していた。そこで、このTos17の近傍DNA断片を回収し塩基配列を決定したところ、遺伝子領域にTos17が挿入されていることが明らかになった。また、似た表現型を示す別の球状型変異体2系統についてもこの遺伝子領域中に変異を見出した。本発表ではこの遺伝子の予想される機能について報告する。

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不等分裂は、1つの細胞が異なる性質をもつ2種類の娘細胞に分裂する過程であり、それぞれの娘細胞に特定のmRNAやタンパク質が不均等に分布することがそれらの運命決定に重要な役割を果たしている。しかしながら、植物不等分裂においてどのようなタンパク質がどの段階で不均等分布をするのかについては、まだよくわかっていない。我々は植物不等分裂の分子機構解明をめざし、コケ植物ヒメツリガネゴケのプロトプラストの不等分裂系に注目し研究を進めている。これまでに、ヒメツリガネゴケ完全長cDNAの過剰発現によるプロトプラストからの原糸体再生異常を指標としたスクリーニングを行い、不等分裂関連候補遺伝子を58種類報告している。本年会ではこれら候補遺伝子産物が不等分裂の際にどのような局在変化を示すのか調べる事を目的とした。そこで、これら候補遺伝子に対して、遺伝子ターゲティングにより蛍光タンパク質YFPをノックインした形質転換体を作成し、内在性プロモーター制御下における候補遺伝子産物とYFPとの融合タンパク質の局在解析を行った。その結果、非幹細胞である原糸体細胞と比較して、原糸体頂端幹細胞あるいは茎葉体頂端幹細胞により偏って蓄積する遺伝子産物を複数同定することができた。それぞれの融合タンパク質の局在の様子を報告するとともに、特に幹細胞と非幹細胞で不均等分布した遺伝子産物について不等分裂との関わりについて考察したい。

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apyraseはNTPだけでなくNDPも加水分解する基質特異性が低い酵素で、Apy1とパラログのApy2がある。アラスカエンドウ黄化芽生え第一節間の細胞骨格画分にはAPY1の産物（apyrase1）が多量に存在しており、細胞内で多局在性を示す。そこで、芽生えの成長と分化におけるapyraseの役割を明らかにするため、発芽初期におけるAPY1の発現をウェスタンブロッティング、RT-PCRおよび免疫組織化学により解析した。APY1は浸水中は極わずか発現し、播種後16時間から発現量が組織全体で急激に増大し、根茎葉の器官形成が終わる62時間で最大量に達した。また、Apy2の発現もわずかながら検出された。吸水時から発現が高まる細胞骨格タンパク質遺伝子（ACT、TUB）とAPY1の発現を比較すると、APY1は発現直後から転写が始まり器官形成初期に転写が活発となる発芽後誘導遺伝子であり、芽生えの器官形成時期に重要な役割を果たしていることが示唆された。

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ムジナモは世界的に絶滅が危惧されている水生の食虫植物であり、輪生する二枚貝様の捕虫葉でミジンコなどの水生小動物を挟み込んで捕える。私たちの研究室では、in vitroでクローン増殖したムジナモを用い、特に消化・吸収に関わる腺毛の微細構造変化と機能発現についての研究を行ってきた。今回は主要な消化酵素であると考えられるプロテアーゼ活性の発現と分泌過程、それに関わる微細構造変化を明らかにすることを目的とした。
プロテアーゼ活性はゼラチンフィルムの分解により検出した。ミジンコを人為的に捕獲させた後、捕虫葉組織、または捕虫葉間の液を経時的に採取し、ゼラチンフィルム上に一定時間載せた後、組織をとり除き、アミドブラックで染色した。ミジンコ捕獲前にはプロテアーゼ活性は検出されなかったが、捕獲後2時間目には捕虫葉組織、捕虫葉間液の両方に強い活性が検出された。また捕虫葉抽出液と捕虫葉間液をNative-PAGE後ゼラチンフィルムに重ねて活性を検出したところ、捕獲後2時間目に捕虫葉抽出液、捕虫葉間液の双方にプロテアーゼ活性を示す複数のバンドが出現し、捕虫葉間液中では捕獲後6時間目にも同様の活性を示すバンドが検出された。一方透過電子顕微鏡観察により、捕獲後2時間目には消化腺毛細胞において極めてダイナミックな膜構造の変動が観察されることから、これらがプロテアーゼの合成と分泌に関与していることが示唆される。

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多細胞生物の器官の大きさは、器官に固有な機能が発揮される上で極めて重要な要素である。現在全く不明である器官サイズの決定機構を明らかにするため、我々は葉の形態形成における「補償作用」という現象に注目した研究を進めている。補償作用とは、葉原基における細胞増殖活性が低下し、器官を構成する細胞数が減少すると、個々の葉細胞が大型化する現象である。典型的な補償作用を示すシロイヌナズナのangustifolia3 (an3) 変異株では、葉の細胞数および細胞サイズがそれぞれ野生株の30%, 150% を示す。今回、細胞増殖活性と補償作用の誘導との関係を詳細に調べるため、アンチセンス法によりAN3 の発現を様々なレベルに低下させた形質転換植物の解析を行った。その結果、細胞数がある閾値を超えて大幅に減少してはじめて、補償作用が誘導されることが判明した。このような閾値の存在から、細胞数をモニターする未知の機構の存在が推定される。そこで次に、an3に他の変異を重ねることで、葉細胞数の回復が補償作用に与える効果を解析した。興味深いことに、葉原基の細胞増殖期間を延長する作用をもつgrandifolia1-D 変異と、葉縁部での細胞増殖を亢進させるjaw-D 変異では、an3 における補償作用に与える影響が大きく異なることが明らかになった。その他の補償作用を示す変異株についても同様の解析を行っており、その結果も合わせて葉の細胞数の認識機構について議論したい。

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補償作用とは、何らかの遺伝的異常により葉の細胞数が減少した時、細胞が大型化し、葉のサイズ低下を補償する現象である。このことは、葉の形成過程において、細胞増殖と細胞伸長の制御間に何らかの相互作用が存在することを示唆している。この補償作用の背景にある分子機構を明らかにするため、我々は補償作用を細胞数の減少による“誘導”過程と、細胞伸長の活性化という“応答”の過程とに分割し、それぞれの過程について発生遺伝学的解析を進めている。これまでに我々は、細胞数が特異的に減少した突然変異株oligocellulaを用いた解析から、補償作用の誘導には、閾値以下への細胞数の減少が必要であると報告してきた。しかしそれに応答する細胞伸長制御系の実態は不明である。そこで今回、応答過程に関わる遺伝子の同定を目的とした実験を行なった。まず、葉における細胞増殖は正常で細胞伸長のみが低下した突然変異株を、17系統単離した。次に、典型的な補償作用を示すangustifolia3変異株とこれらの突然変異株との二重変異株を作製し、解析した。興味深いことに、いくつかの変異については補償作用による過剰な細胞伸長が強く抑制された。従って、これら突然変異株の原因遺伝子は、補償作用にリンクした細胞伸長制御系で機能することが強く示唆される。本発表では以上のデータを基に、補償作用の誘導から応答に至る各過程の遺伝学的な解析結果を報告する。

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葉の形は葉軸に沿ったポーラー細胞の拡張およびその増殖によって決定されるとされている。しかしながら葉の形態形成においてポーラー細胞の増殖を制御する遺伝子は殆ど未知である。
我々はScheibleのアクチベーションタギングラインの中から幅広で丸みを帯びた葉を示す突然変異体mco1-Dを分離した。mco1-Dは丸葉の他に幼胚軸の伸長抑制、側根の増加などの表現型を示す。mco1-Dの表現型を示す変異体はPCR法によって全てヘテロ挿入体であることが確かめられた。mco1-DにおけるT-DNA挿入位置をプラスミドレスキュー法によって決定し、そのT-DNA挿入部位近傍の4つの遺伝子についてリアルタイムRT-PCR法を用いて発現量を測定した。その結果1つの遺伝子のみ発現がエンハンスされていることが分かった。この遺伝子はGMCオキシドレダクターゼファミリーのタンパク質をコードしており、フラビン結合性ドメインを有していることがTAIR（http://www.arabidopsis.org）のデータベースから判明した。
現在、我々はこの遺伝子の機能の解明について研究を進めている。

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シロイヌナズナの葉では向軸側（表側）と背軸側（裏側）とで細胞の形態や、気孔やトライコームの数が異なっていることが知られている。近年、いくつかの遺伝子が向軸側・背軸側の形成に関わることが明らかにされてきた。これらの遺伝子は葉を含む側生器官において向軸側もしくは背軸側に特異的に発現しており、それぞれの発現領域で細胞分化を促していると考えられている。向軸側や背軸側特異的な遺伝子の発現から、これらの遺伝子の発現に先立って、向背という極性が形成されていることが示唆される。しかし、この極性がどのような機構で形成されるかは分かっていない。
我々は向背の極性形成機構を明らかにするために、向軸側や背軸側特異的に発現している遺伝子の発現制御に関わっている新規の遺伝子を単離することを試みている。背軸側特異的に GFP を発現する FILp::GFP 形質転換植物を変異原処理して、GFP の発現様式が異常になる突然変異体を選抜した。得られた #1-63 突然変異体では GFP の発現が背軸側だけではなく向軸側でも検出できた。このことから、#1-63 は向軸側が背軸側化した突然変異体であると考えられた。#1-63 における 向軸側マーカーの発現様式の解析、#1-63の詳細な表現型の解析、及び、原因遺伝子のクローニングの途中経過についても合わせて報告したい。

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水生異型葉植物Ludwigia arcuata(アカバナ科)は可塑的な形態形成を示し、気中葉形成の途中でエチレンを添加すると、葉の基部が気中葉よりも細いさじ形の葉が形成される。これは葉の基部の横軸に並ぶ細胞数の増加が、エチレン添加によって抑制されたためである。このさじ形の葉と、ノーマルな気中葉の形成過程を比較すると、エチレン添加によって、葉身での細胞分裂の分布、方向、頻度に差が生じていた。このことは、同一形状の葉原基上で異なるパターンの細胞分裂が起こると、最終的に異なる葉形が誘導されることを意味する。本研究では、細胞分裂パターンがどのように葉形決定に関与するのかを解明するため、葉の形態形成の動的モデルの構築を目指した。このモデルは次の3条件を満たす。(1)細胞の隣接関係は維持される。(2)細胞分裂の分布、方向、頻度は実測値を忠実に再現できる。(3)細胞サイズは分裂前の状態に回復する。シミュレーションによって導かれた葉形と、実際の葉形を比較すると、葉身の側方向への成長は観察されたが、葉身での細胞分裂パターンだけでは葉の縦軸方向への成長を説明するには不十分であった。このことは、縦軸方向への成長は別の因子に依存している可能性を示唆している。モデルの詳細は次演者に譲り、細胞分裂の分布、方向、頻度の制御が葉形決定において果たす役割と、縦軸方向への成長を決定づける因子の候補について報告したい。

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細胞分裂と分裂後のサイズの回復をモデル化し、細胞分裂と葉の形態形成の動的モデルの構築を目指した。モデル構築に当たっては、1)葉の分裂組織では、細胞の大きさは一定に保たれる。2)細胞分裂によって半減した細胞サイズは分裂後に元のサイズに戻る。3)細胞は減少しない。4) 細胞の隣接関係は維持される。を仮定した。モデルに基づき、葉の形態形成の際の細胞分裂の頻度、分布、方向に関する情報を入力として、葉の形態を出力するコンピュータ・シミュレーションを実装した。本モデルが実植物の形態形成をどの程度説明できるかを検証するため、水中葉と気中葉で細胞分裂パターンと葉形が異なることが知られているL. arcuataの細胞分裂の実測データに基づくシミュレーションを行い、シミュレーション結果の水中葉、気中葉の違いを観察した。シミュレータの処理は細胞を質点とみなし、葉形に従い2次元に質点を並べることで葉を表した。分裂過程は、細胞を表す点列をボロノイ分割した後、ボロノイセルを分割することでモデル化した。伸張過程は隣接細胞間にバネがあると考え、運動方程式に従ったシミュレーションを行うことでモデル化した。シミュレータの結果として、実際の形状よりも横軸方向に長い葉形が得られた。実際の形態形成における生物学的制約をさらに探索し、モデルに追加して実装していく予定である。制約の候補として細胞形状を考えている。

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ASYMMETRIC LEAVES2 はN末に cysteine に富む C-motif(CX2CX6CX3C)、Conserved-glycine、及び leucine zipper 様配列からなる特徴的な約100アミノ酸の保存領域（AS2 ドメイン）をもつタンパク質をコードしており、正常な葉脈パターンの形成や葉の左右の協調的細胞分裂に必要であると考えられるが、その分子機構は解明されていない。as2 変異体は葉身の非対称な切れ込み、下向きカール、非対称かつシンプルな葉脈パターンなど、主には葉に多面的な異常が表れる変異体であり、その根には顕著な異常は見られないが、ProAS2 ::GUS 形質転換体を用いて AS2 の発現パターンを解析したところ、茎頂分裂組織と発達中の葉の向軸側表皮以外に、根においても GUS 染色が認められた。そこで AS2 過剰発現体における根を観察した。DEX誘導型のAS2-GR形質転換体を高濃度のDEX存在下で生育させた場合、全体的に著しい生育阻害が起こり正常な根が形成されずに枯死したため、より低濃度のDEX存在下で生育させたところ比較的正常に根が形成されることが確認された。現在DEX低濃度条件下で生育させたAS2-GR形質転換体の根を観察しており、これらの結果から根における AS2 の機能を考察する。

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根毛は極性が顕著にあらわれる細胞であり、その先端成長の機構には未だ不明な点が多く残されている。我々は劣性の根毛伸長欠損変異体を理研のシロイヌナズナDsトランスポゾン挿入変異ラインより分離した。この変異株、15-1096-1では、根毛の多くが先端成長初期で停止しており、先端ではバーストが観察された。この変異株ではDsトランスポゾンがグリコシルホスファチジルイノシトールアンカータンパク質をコードする遺伝子に挿入していた。遺伝学的な解析と塩基配列決定により、15-1096-1はこれまで原因遺伝子未知であったshaven3 (Parker et al., Plant Cell, 2000, 12, 1961-) のアリルであることがわかった。shv3変異体では根毛の伸長欠損以外に顕著な表現型が認められず、GUS遺伝子を用いたプロモーター解析によりSHV3遺伝子が根毛細胞において強く発現することが示されたことから、SHV3は特に根毛の先端成長に必要な遺伝子であると考えられる。SHV3タンパク質の生化学的機能は未知であるが、根毛先端がバーストを起こしやすいという表現型から細胞壁強度の調節に関わることが推測される。現在、先端成長に伴う細胞壁の変化に注目し、根毛形成におけるSHV3の詳細な機能解明を試みている。

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カタバミ（Oxaris corniculata L.）には、側枝が匍匐し水平重力屈性を示す個体や、側枝が木立ちし負の重力屈性を示す個体がある。また、多様な形態変異が存在し、伸長成長を続ける側枝や長い葉柄をもつ。
斜め上方に伸びた葉柄を葉身ごと切り出し、暗所で水平に置くと、葉柄は負の重力屈性を示した。また、1次元クリノスタット葉柄を取り付け、光源ごと回転させた場合、葉柄は、光源の方向へ屈曲した。このことから、カタバミの葉柄は、重力屈性および光屈性の両方の性質を備えていると考えられる。そこで、ナフチルフタルアミド酸を切り口から吸わせ、重力刺激や光刺激を与えた。その結果、葉柄は重力屈性や光屈性を示さなくなった。このことから葉柄の屈曲反応には、オーキシンの極性輸送が関係していることが示唆された。
葉柄の縦断切片を作成し、葉柄の伸長や屈曲と細胞伸長との関係、また、屈曲部位とアミロプラストの分布との関係を調べた。細胞の伸長域は、葉腋から小葉に向かって移動し、結果的に葉柄全体が伸長する。やがて、伸長は停止し、個体内で長さがほぼ一定になる。葉柄の伸長が停止すると、屈曲部位から離層手前約5mmまでのアミロプラストは消失し、屈曲部位だけに残ると考えられる。

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根の重力に対する初期応答の異常なシロイヌナズナ突然変異体では重力屈性が完全に消失しないため，突然変異体のスクリーニング・遺伝解析のための効率的な形質評価が行えず，根の重力応答に関する遺伝学的解析が立ち後れていると考えられる．例えば，デンプンを合成できずアミロプラストが沈降しないpgm-1 (phosphoglucomutase-1) 突然突然変異体では，根の重力屈性は屈曲速度の低下にとどまる．この問題を克服するため，重力屈性と光屈性との干渉作用を利用した実験系に注目した．シロイヌナズナの根は正の重力屈性を示すとともに，負の光屈性を示す．野生型のシロイヌナズナの根では，下側から光を照射した場合，重力屈性が光屈性に比べて強く発現する結果，根は下方向に伸長する．一方，pgm-1突然変異体では，同じ条件下で，光屈性が発現し，根は水平方向に伸長する。したがって、本実験系を用いることにより、根の重力屈性の低下を高い感度で検出でき、新規のシロイヌナズナの根の重力屈性が異常な突然変異体の単離と、その遺伝学的解析が可能になると期待される。我々は，この重力屈性と光屈性との干渉作用を利用した実験系を用いて、現在までに、EMS処理で突然変異誘発した10万株のシロイヌナズナのM₂個体をスクリーニングし、根の重力屈性が異常になった44系統の突然変異体を単離したので，これを報告する．

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植物は重力方向の変化に応答して各組織を屈曲させる。本研究ではアズキ上胚軸を用いて屈曲を誘導する要因について検討した。重力屈性では表層微小管(cMT)の配向が変化することはよく知られている。しかし、cMTの配向変化は重力方向の変化によるものではなく、屈曲そのものによって生じる機械的なストレスによって制御されている可能性が示唆されている。そのため屈曲を引き起こす主な要因としてcMTの配向変化ではなく、細胞壁の性質に注目して研究を行なった。上胚軸を横にすることにより、重力刺激を与えた。重力に応答して屈曲している部分から表層部を切り出し、細胞壁の伸展性を測定した。その結果、下部（伸長促進）では伸展性が高くなっていることが分かった。支持体に固定し、曲がらないようにした上胚軸を用いて、同様の実験を行なった。その結果、屈曲が起これないにもかかわらず、下部では伸展性が上昇していることが分かった。このような試料では、表層微小管の配向変化は起こらないことが分かっている。以上の結果から、重力反応の初期における下部の伸展性の上昇は表層微小管以外の経路によって起こると結論される。

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植物の根は、土壌の硬さや石などの接触刺激を感知してよりよい環境を求めて成長する。障害物を避けて屈曲する現象は、接触屈性として知られているが、分子生物学的研究はほとんどされていない。そこで我々は、接触センサーやセンシングに関連する遺伝子を解明する目的で、シロイヌナズナの根を用いた硬軟認識検定法を開発した。即ち、濃度の異なるphytagel培地を上下二層に積層したのち、上層表面にシロイヌナズナを播種し、実生の根が上層から濃度の高い下層培地に到達したときに境界面で屈曲するか、あるいは下層を貫入するかどうかで硬軟認識の判定を行うものである。この硬軟認識検定法を用いて、T-DNA挿入種子4850系統から突然変異体の選抜を行ったところ、屈曲率が減少する2種の突然変異体 (weak touch response 1, 3 :wtr1, 3 ) を単離した。次いで両突然変異体を用いて、種々の表現型解析を行った。地上部の接触応答にエチレンの関与が示唆されているため、根の成長に対するエチレンの作用を調査したが、野生株と同様の成長を示した。また重力屈性も、正常であった。しかし、45度に傾けた寒天培地表面上で育成すると、wtr3 変異体では、野生株やwtr1 変異体と比べてコイル状の波形成長を示す個体が多く観察された。現在、さらなる表現型解析とマッピングを行っているので、その結果についても報告する。

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Rice is the most Al resistant species among small-grain cereal crops, but the mechanism underlying its high Al resistance is still poorly understood. In the present study, a gene which is associated with Al tolerance in rice was cloned and characterized using an Al-sensitive rice mutant (als1). Rough mapping shows that Als1 was localized on chromosome 6. Fine mapping resulted in identification of Als1. By comparing the sequence of Als1 between the wild type and the mutant, a 15 bp deletion was found in the mutant. Als1 consists of four exons and three introns, encoding a 291 amino acid protein that is predicted to be a putative ABC transporter. The expression of this gene is relatively higher in the roots than in the shoots in the absence of Al and the expression was up-regulated by Al in the root tips but not basal roots.

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オオムギはAl毒性に対して高い感受性を示す種であるが、Al耐性において大きな品種間差があることが知られている。また我々はオオムギのAl耐性能は根から分泌されるクエン酸の量と強い相関があることを報告している。この有機酸分泌機構を明らかにするためにAl耐性種のムラサキモチと感受性種のモレックスを用いたマイクロアレイによる網羅的な遺伝子発現解析を行った。解析に用いたRNAは0または5μMのAl処理を6時間行った根端1cmから抽出し、検出にはaffymetrix Barley1 genechipを用いた。Alにより2倍以上の発現誘導を示した遺伝子はムラサキモチ、モレックスでそれぞれ149、211遺伝子であり、また1/2以下に減少した遺伝子はそれぞれ90、122遺伝子であった。誘導された遺伝子の多くはストレス応答に関与しており、ムラサキモチではタンパク質分解の関連遺伝子の増加が、モレックスにおいてはABCトランスポーターの誘導が特徴的であった。有機酸代謝に関連した遺伝子の変動はモレックスにおいてイソクエン酸リアーゼの増加が認められたのみであった。またムラサキモチにおいてはAlにより誘導される輸送体タンパク質は認められなかったが、複数の輸送体タンパク質がモレックスに対し恒常的に高い発現を示していた。現在これらの遺伝子のAlによる発現誘導について詳細な解析を進めている。

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In an effort to understand the molecular mechanisms of an Al-induced malate efflux from Brassica napus, we isolated two Al-induced cDNAs named BnALMT1 and BnALMT2. Analysis of expression pattern showed that the transcript of the genes is accumulated in response to Al treatment. This was observed after 2 h Al treatment. However, exposure to Al for longer than 4 h did not further increase gene expression. Transcript accumulation in P-sufficient plants increased with increasing Al concentration up to 100 μM whereas in P-deficient plants expression did not increase above 50 μM Al. Furthermore, these genes were expressed exclusively in the roots. Over-expression of BnALMT1 and BnALMT2 in cultured tobacco cells (Nicotiana tabacum L. nonchlorophyllic) significantly induced malate efflux in the presence of 100 μM Al. Other lanthanides (La, Er and Yb) could only slightly induce malate efflux, indicating that the transporter is primarily activated by Al.

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新規のAl耐性植物を単離し、その耐性機構を解明することを目的として、16,000株のArabidopsis enhancer tagging lineから耐性株をスクリーニングして#355-2を得た。この耐性株では染色体上へのタグの挿入により、その近傍の2つの遺伝子（F9E105とF9E10.6）の発現量が野生株に比べて高まっていた。形質転換植物での感受性試験の結果、機能が未知であるF9E10.5遺伝子が耐性に関与することが示唆された。また、その発現量はAlストレスによって変動することはなく、根と地上部での発現量に違いはなかった。ところで、#355-2株は野生株に比べて短い根毛（約30 %）を有する上、根からのAl吸収が著しく抑制されていた。さらにコントロール株に比べて#355-2株では、根毛中のAl蓄積量や脂質過酸化物の集積量が低い。また、F9E10.5遺伝子高発現転換株では、短根毛が生じる頻度が高い。さらに3つの短根毛突然変異株についてAl感受性試験を行ったところ、どれもコントロール株に比べて耐性を示した。
これらの結果から、1）根毛も根端同様にAl毒性を受け易い部位である。2）#355-2株ではF9E10.5遺伝子の過剰発現により根毛の生育が抑えられ、その結果、根毛からのAl吸収が抑制されて耐性となると思われる。

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AtGST11 is one of GST gene family that was induced by various stresses. Precise response mechanism of AtGST11 gene at transcriptional level during Al stress is now investigated in this study. A cDNA library was constructed from Arabidopsis treated with 0.1 mM Al and cloned in T7 phage dispay library. Phage lysate was hybridized with biotynelated AtGST11 promoter. This DNA/protein complex was captured using streptavidin paramagnetic particles. Fifty plaques were selected to determine the insert by PCR amplification followed by DNA sequencing. Ten plaques were determined to contain the desired inserts. Homology search against several databases revealed that one of these (#43) is a transcription factor HD-Zip encoded by ATHB6 gene which has known to be up-regulated to various abiotic stresses. This putative transcription factor is being confirmed by gel-shift assay. The existence of other proteins may as well suggest the transcription of AtGST11 involving complex factors acting as regulators.

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赤・近赤外光受容体であるフィトクロムは、約1200残基の巨大分子である。フィトクロム内の約650残基からなるN末端ドメインは光のセンシング及びシグナル伝達に関与し、約550残基からなるC末端ドメインはフィトクロムの二量体化及び核移行に関与する。このようにフィトクロムは一つの分子内で多様な機能を有する事から、我々はフィトクロムの機能・分子メカニズムをより詳細に調べる事を目的として、個々のドメインの構造・機能解析を行ってきた。
これまでの溶液NMR法を用いた研究から、フィトクロムC末端ドメインに存在するPAS1ドメインの構造が明らかとなった。得られた構造から、機能欠損型ミスセンス変異の集中する領域(Quail-box)がPAS1ドメインのβ-シートに存在し、β-シート表面上にフィトクロムに共通して保存された残基がクラスターを形成する事が明らかとなった。またこのβ-シート表面を介して二量体を形成する事が示唆された。さらに、フィトクロムB, C (phyB, C)においてPAS1を含む領域が二量体を形成するのに対してphyAのPAS1ドメインは二量体を形成しない事から、このPAS1ドメインがタイプI及びタイプIIフィトクロムの機能の違いに関与していると考えられる。会場ではPAS1ドメインに加えてN末端・C末端ドメイン中の他の構造ドメインの解析結果についても報告したい。

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イネには3種類のフィトクロム分子種（phyA, phyB, phyC）が存在する。イネにおけるフィトクロムの機能を明らかにする目的で、すべてのフィトクロム突然変異体を単離し、さらにそれらを交配して2重、3重突然変異体を作製した。それらの形質を比較・解析することにより、各フィトクロム分子種の独自の機能や相互作用に関する様々な知見が得られた。まず、イネではphyAがphyBと同様に赤色光受容体としても機能し、Red/FRによるLhcb遺伝子の可逆的な発現誘導・抑制にも係わることが明らかになった。さらに、phyAは、phyB及びphyCと相互作用することにより、日長変化に伴う開花時期の調節にも重要な役割を果たしていることが分かった。

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ホウライシダで発見されたフィトクロム3（PHY3）は、N末端側が赤色光受容体フィトクロムの光受容部位、C末端側が青色光受容体フォトトロピン全長で構成されるキメラ光受容体である。PHY3には赤色光を受容する発色団フィトクロモビリン1分子と青色光を受容する発色団FMN2分子が結合することが、組換えタンパク質を用いたin vitro実験系で示されており、吸収波長域を異にする2種3分子の発色団が光受容体1分子内に共存するという、これまでにない発色団構成をとっている。これらの知見から、PHY3は1分子で赤色光受容体と青色光受容体の機能を併せ持つことが予測されている。これまでにPHY3が葉緑体光集合反応の赤色光受容体として機能することを明らかにしてきたが、青色光受容体としての生理機能の有無については不明であった。そこで、アラビドプシス(phot1-5/phot2-1)にホウライシダPHY3を導入した形質転換植物体を用いて機能解析を行った。胚軸の光屈性を指標として光生理反応を調べた結果、赤色光および青色光どちらの光照射によっても光屈性が誘導されることが示され、PHY3が赤色光だけでなく青色光の受容体としての機能を有していることが明らかになった。現在、PHY3の機能アミノ酸に部位突然変異を導入した変異PHY3導入アラビドプシスを用いて表現型解析を進めており、これらの結果も併せて報告する予定である。

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光受容体フィトクロムは、植物の様々な光応答を制御している。短日植物であるイネのフィトクロム欠損変異体se5は、赤色光下での幼葉鞘伸長を示し、また短日長日のいずれの条件においても花芽形成を促進するが、その直接の下流にあるシグナル伝達経路はわかっていない。シロイヌナズナにおいてはフィトクロムと直接結合するbHLH型転写因子のphytochrome interacting factor (PIF)ファミリーが、発芽、葉緑素生合成および花芽形成等のフィトクロム依存的な生理反応に重要な役割を果たしていることが知られている。そこで、私たちはイネのPIFファミリーに着目し、ゲノム情報から10個のイネPIF類似遺伝子を同定した。シロイヌナズナのPIFは、N末端のフィトクロム結合部位(APB)、C末端側にbHLHを持つことが知られているが、イネには7個の同じドメイン構造を持つ遺伝子があり、加えて、APBしかない持たないタイプのPIF類似遺伝子が3個あることがわかった。これらのイネPIF類似遺伝子の発現を定量RT-PCRにより測定した。その結果、播種後2週間の幼植物でいずれの遺伝子も発現が確認でき、またその中には日周期変動や光応答のパターンが野生型se5で異なるパターンを示すもの等があった。これらの結果は、イネPIF類似遺伝子の発現にフィトクロム信号伝達系が関与している事を示唆している。

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イネの環境ストレス応答機構は、シロイヌナズナと比べ未解明の部分が多く残されている。我々は、イネ22kマイクロアレイ解析によりイネの環境ストレス応答性遺伝子を数多く見出した。本研究ではそれらの内、乾燥ストレスによって発現量が著しく減少し、シロイヌナズナのPhytochrome Interacting Factor (PIF) ファミリーと相同性が高いbHLH型転写因子の遺伝子に着目し、OsPIF1と名付け解析をおこなっている。これまでに、OsPIF1遺伝子の非ストレス条件下での明期における発現上昇が乾燥ストレス処理によって消失すること、OsPIF1過剰発現シロイヌナズナでは成長促進と乾燥ストレス耐性の低下が見られること、リプレッションドメインを利用したOsPIF1機能欠損シロイヌナズナでは成長遅延と乾燥ストレス耐性の向上が認められることを示してきた。これらの結果はOsPIF1が乾燥ストレス応答機構においてイネの成長を制御している重要な因子である可能性を示唆している。そこで、OsPIF1過剰発現イネ、機能欠損イネを作製し解析をおこなった。非ストレス条件下でのOsPIF1過剰発現イネの表現型として、節間伸長の促進による稈長の伸長と籾の長粒化が観察された。一方OsPIF1機能欠損イネでは、節間伸長の抑制による稈長の減少と籾の短粒化が認められた。さらにOsPIF1形質転換シロイヌナズナ及びイネを用いてマイクロアレイ解析をおこない、標的遺伝子の同定を試みている。

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これまでにシロイヌナズナの根において、遠赤色光（FR）に応答する複数の遺伝子が同定されている。そのうちアクアポリン遺伝子TIP2;2は、暗順応処理で発現が増加し、その後のFR照射により一過的に発現が減少する。また逆に、pathogenesis-related protein 1 (PR1)の遺伝子は、暗順応処理で発現が抑制され、FR照射で誘導される。これらのFR応答が、植物体の地上部（シュート）または地下部（根）のどちらで光が受容されて引き起こされるのかを特定するために、野生型株やフィトクロム突然変異体を用いて、シュートや根のいずれかにFR照射をして発現解析を行った。その結果、シュートから根に輸送された何らかのシグナルが、FRに応答したTIP2;2 mRNAの減少に関与することが示唆された。一方でPR1 mRNAの増加は、根の細胞が直接FRを受容することによって引き起こされると考えられた。これらの知見を元に、植物体を通って根に届いた光の役割について考察する。

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植物は主に3種の光受容体、フィトクロム（phy）、クリプトクロム（cry）、フォトトロピン（phot）を介して光を感知する。光応答の一つとして、青色光によるフォトトロピンを介した胚軸屈曲が知られるが、赤色光によるフィトクロムを介したランダムな方向への胚軸屈曲も存在する。我々は、赤色光照射によって胚軸屈曲が促進されるシロイヌナズナの突然変異体flabbyを単離した。ファインマッピングの結果、この遺伝子は動物の多剤耐性に関わるABCトランスポーター遺伝子のホモログ PGP19/ MDR1であった。PGP19はオーキシンの極性輸送阻害剤NPAの標的の一つであり、オーキシンの輸送を制御していると考えられている。作成した phyA phyB flabby三重変異体は、赤色光による胚軸屈曲を示さなかった。胚軸のオーキシン極性輸送活性は赤色光照射により減少し、胚軸中PGP19の蓄積は赤色光照射によりフィトクロム依存的に減少する。これらのことは、活性化したフィトクロムによる、PGP19を介した胚軸屈曲制御を示唆している。flabbyは、青色光に対し光屈性を示すが、 phot1 phot2 flabby三重変異体は、青色光照射によりランダムな方向への胚軸屈曲を示した。また、胚軸中PGP19の蓄積は青色光照射によりクリプトクロム依存的に減少していた。以上より、フィトクロムとおそらくクリプトクロムはPGP19の負の制御を介して、胚軸屈曲を促進するものと考えられた。

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RSG は、ジベレリン（GA）内生量を制御する bZIP 型転写因子である。RSGの機能が抑制された形質転換タバコは、GA内生量が低下し、矮化した表現型を示した。全6種の GA 生合成酵素遺伝子の発現量を解析した。その結果、RSG は NtKO を標的遺伝子としてGA生合成を制御する事が明らかとなった。
GA内生量の低下した形質転換タバコにおいて GA3-oxidase (Nty2) 遺伝子は、発現量の増加が認められたが、 GA20-oxidase（Ntc12）遺伝子は、発現量の増加が認められなかった。また、RSG-GFP タンパク質を用いた解析から、RSG はGA 内生量の低下にともない核に蓄積し、GA の投与により速やかに核から細胞質に移行する事が明らかとなった。これらの結果から、RSGは、GAによる Ntc12 遺伝子のフィードバック制御に関与する可能性が考えられた。
さらに、 Ntc12 プロモーターの下流に GUS 遺伝子を組み込んだ形質転換植物を作製し、フィードバック制御に必要なシス領域を探索した結果、フィードバック制御に必要なシス領域 200 bp が明らかになった。更に、ゲルシフト法によりそのシス領域中にRSG の結合配列を見出した。RSG結合配列に点突然変異を導入した Ntc12 プロモーターはGAによるフィードバック制御を受けなくなった。以上より、RSGのNtc12遺伝子のフィードバック制御への関与が示唆された。

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ジベレリン（GA）は高等植物の発芽や伸長成長を制御する植物ホルモンで、その内生量調節機構の解明は植物の形態形成の分子機構を理解する上で重要である。植物は GA 内生量の変動を自ら感知し、GA 生合成や分解に関わる酵素遺伝子の発現を協調的に変化する事で GA 内生量を一定の範囲内に維持する機構を備えている。GA 生合成経路の最終段階で働く GA 3-酸化酵素遺伝子は内生 GA 量に応じて転写レベルでフィードバック制御を受けることが知られている。我々は現在までにGA 3-酸化酵素遺伝子の GA によるフィードバック制御機構の解明を目的とし、シロイヌナズナの主要な GA 3-酸化酵素遺伝子 AtGA3ox1 のプロモーター解析を行った。その結果、GA に負に応答するシス領域の決定と、そのシス領域に特異的に結合する転写因子として AT-hook モチーフを持つタンパク質 AGF1 を同定した。AGF1の転写は GA 内生量の影響を受けないので、GA に依存した転写後または翻訳後の AGF1 機能制御機構が存在すると考えられた。そこで AGF1 と特異的に相互作用するタンパク質を酵母 two-hybrid 法により探索した結果、Zn フィンガー型転写因子 ZAF1 が単離された。プルダウン法により AGF1 と ZAF1 のin vitroでの特異的結合を証明した。現在 ZAF1 の機能解析を行っている。

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