硫黄は植物の生存に必須な多量元素であり、その供給量及び同化能は植物の生育や発達に大きく影響する。硫黄栄養が不足すると、植物体内では硫黄同化系で働く酵素遺伝子群の発現が上昇し、この現象により硫黄欠乏下（-S）での効率的な硫黄同化、ひいては植物の生存が可能になると考えられている。しかしながら硫黄栄養の変化から遺伝子発現変化に至る分子機構についてはほとんど知られていない。そこで本研究では硫黄栄養応答変異体の単離、解析を試みた。硫酸イオントランスポーターSULTR1;2のプロモーター制御下にGFPを発現する形質転換植物では、-SによりGFPが蓄積する。この植物にEMS処理したM2種子を用いて、-SでGFPの蓄積が起こらない変異体 slim1（sulfur limitation1）を単離した。原因遺伝子SLIM1は、その配列から転写因子としての機能が示唆された。GFPをレポーターとした解析から、SLIM1は維管束で発現しており、細胞内では核に局在することが示された。また、slim1と野生株を比較したマイクロアレイ解析から、-S応答性遺伝子群のほとんどがSLIM1の制御下にあることが明らかとなった。slim1は-Sでの生育が低下する。興味深いことにSLIM1過剰発現体では-Sでの生育が上昇した。これらの結果から、SLIM1は-S応答の包括的な制御因子であり、硫黄栄養が制限要因となる場合には遺伝子発現の制御を介して成長を正に制御する因子であることが明らかとなった。

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ホウ素過剰あるいはホウ素欠乏に1日間晒したシロイヌナズナの根及びロゼット葉を試料としてマイクロアレイ解析を行った。個々の遺伝子についてホウ素過剰による発現誘導の度合いとホウ素欠乏による発現誘導の度合いを比較したところ、全体として二つのストレスによる誘導には正の相関が認められた。一方で、どちらかのストレスに特異的に発現誘導を受ける遺伝子も見付かった。根においてはAt5g64170などがホウ素過剰特異的に、NIP5;1などがホウ素欠乏特異的に発現誘導を受けていた。ロゼット葉においてはAtPT2などがホウ素過剰特異的に、At3g11340などがホウ素欠乏特異的に発現誘導を受けていた。また、グルコシノレート合成経路の遺伝子の発現がホウ素過剰に晒した根において減少し、クロロフィル合成経路、カルビン・サイクル、グリオキシル酸経路の遺伝子の発現がホウ素過剰のロゼット葉で減少していた。さらに、セネッセンスや防御応答に関係した遺伝子（WRKY6他15個）の発現が主にロゼット葉で誘導されていた。ホウ素ストレスにより発現が誘導される転写因子も見付かっており、これらの遺伝子がホウ素ストレスに晒されたシロイヌナズナの生育をどのように助けるのかという点に注目してさらに解析を進めている。

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リンは植物の生長に必須の養分である。植物はリンが欠乏すると、植物体内の全リン蓄積量の約3割を占めるリン脂質を減少させ、これに伴い糖脂質の一種であるジガラクトシルジアシルグリセロール(DGDG)などのリンを含まない脂質を増加させ、根の細胞膜などを質的に転換していることが報告されている。これまで、糖脂質生合成系がリン欠乏時に活性化されることは報告されてきたが、その前段階であるリン脂質の分解と糖脂質合成の基質であるジアシルグリセロール(DAG)の供給については不明であった。本研究では、主要膜脂質であるホスファチジルコリン(PC)等を分解してDAGを与える新規のホスホリパーゼC(NPC)ファミリーを真核生物で初めて単離し、その中からリン欠乏に応答する2つのアイソザイム、NPC4とNPC5を見出した。NPC4は細胞膜に局在しており、リン欠乏時に植物体で増加する総NPC活性のほとんどを担っていたが、npc4変異体でもDGDGの蓄積に変化はなかった。一方、NPC5はNPC活性自体は極めて低いものの、NPC4とは異なる細胞内局在を示し、npc5変異体ではリン欠乏時のDGDG蓄積が減少した。このことから、NPC4とNPC5はリン欠乏時にそれぞれ異なる機能を果たしていると考えられる。

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シロバナルーピンはリン欠乏条件下でブラシ状の特殊な形状の根「クラスター根」を増加させ、有機酸や酸性ホスファターゼ分泌などによるリン獲得能力が極めて強まることが知られている。しかし、他の栄養欠乏における応答は明らかではない。本研究では北海道大学の長期連用試験圃場から採取したリン欠乏(-P区)、窒素欠乏(-N区)、標準施肥(C区)土壌を用いてシロバナルーピンを根箱内で栽培し、-P区、-N区で形成されるクラスター根の機能を評価することを目的とした。
形成されたクラスター根の数は、-N区>-P区>C区であった。生育に大きな違いは認められなかったが、リン吸収量は-P区で最も小さかった。-N区では生育後期に多量の根粒が着生した結果、全窒素量は最も高くなった。
根圏土壌中のホスファターゼ活性は-P区の老化クラスター根で最も高く、-N区とC区では同じレベルだったことから、-N区でもクラスター根は誘導されるが、ホスファターゼ活性の誘導は低リン条件に特異的であることが示唆された。
全ての処理区において、土壌中の可給態窒素が減少し根粒が少ないときに根圏土壌中のペプチダーゼ活性が誘導された。このことから、有機態窒素の利用は根粒による窒素供給が活発になる前の段階で高まると考えられた。また、このペプチダーゼ活性はクラスター根と非クラスター根の間に違いがなかったことから、有機態窒素の利用はクラスター根に特異的ではないことが示された。

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植物の低リン適応に関わる遺伝子は、その多くが地上部のリンレベルが高いときには根部のリン濃度が低くても発現が抑制されることから、地上部からの長距離シグナルによる分子制御の存在が指摘されているが、その発現制御機構の詳細は不明のままである。演者らはこれまでに、低リン条件で育つイネにおいて強く発現が誘導される機能未知遺伝子OsPI1を単離した。低リン条件で迅速に発現が誘導されるOsPI1は低リン適応で重要な役割を果たしていると考えられる。本研究は、OsPI1の発現様式を詳しく調査することを目的とした。リン欠乏条件で水耕栽培したイネを用いて、再びリンを与える再施与実験と、根を半分に分けてその一方にリンを与える根分け実験を行い、経時的に地上部と根部に分けて採取して全リン濃度、無機リン酸濃度、OsPI1発現量を分析した。再施与実験ではリンは速やかに吸収され、それに伴いOsPI1発現量も減少した。根分け実験では、リンを与えた根ではリンは速やかに吸収され、地上部のリン濃度が徐々に増加するのに伴って、これらの器官におけるOsPI1発現量が減少した。一方、リンを与えなかった根では12時間以内に有意な無機リン・全リン濃度の増加は認められず、OsPI1の発現量も高いレベルに維持された。これらの結果から、OsPI1は地上部からの長距離シグナルによる発現制御だけでなく、局所的なリンレベルによる発現制御も受けることが示唆された。

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これまでに、ゼニゴケ(Marchantia polymorpha L.)の懸濁培養細胞を高濃度のショ糖を含む培地で前培養すると乾燥処理後に高い生存率が維持されることを明らかにした。このとき糖は細胞内に蓄積し、細胞の乾燥に対して保護的に作用していると考えられる。糖のほかにも、ストレス応答タンパク質の関与が予想される。そこで、高濃度の糖を含む培地で前培養を行った時に合成されるタンパク質の細胞の乾燥耐性への関与について調べた。
細胞をシリカゲル上で24時間乾燥すると含水量は0.1gH₂O/gDW以下まで低下する。このような細胞の生存率を再培養によって調べると、前培養なしでは0%だが、0.5Mショ糖培地で前培養すると約80%になった。ショ糖以外で培地の浸透圧を上げた場合、部分的に細胞の乾燥耐性が上昇した。細胞を0.5M糖培地で前培養すると熱安定性タンパク質の発現パターンが変化したが、前培養培地の浸透圧変化に応答して新たにタンパク質合成が起きたためと考えられる。シクロヘキシミドを0.5M糖培地に加えて前培養を行うと、24時間乾燥後の細胞の生存率はほぼ0%だったが、4時間乾燥（0.15gH₂O/gDW以上）では約80%であった。このことから、ゼニゴケ培養細胞の乾燥耐性の増大にはショ糖が大きな役割を持つが、前培養時に合成されるタンパク質も細胞の乾燥耐性増大に関与していることが示唆された。

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我々は蘚苔類の乾燥耐性機構を調べるため、異なる水環境に生育する数種の蘚苔類を用いて水分含量変化に伴う光合成諸活性の変化を調べてきた。その結果、乾燥耐性種は乾燥により光合成活性が失われた際、光化学系II反応中心(PSIIRC)活性も失われること、一方非乾燥耐性種は、光合成活性が失われた後もしばらくPSIIRC活性が残っていることが明らかになった。乾燥時PSIIRCを停止させることは光合成系の保護に重要であり、耐性種はPSIIRCを失活させることで光阻害を防いでいるといえる。しかしSorbitol溶液を用い、細胞の脱水レベルを調節した場合、乾燥耐性種においても光合成活性が失われているにもかかわらずPSIIRC活性が残っている状態が存在した。この状態で強光の影響を調べたところ、暗所に置くだけでは解消されない非光化学的消光(NPQ)が起こり、PSIIは実質的に失活していることが判明した。
このNPQについてさらに調べたところ、蘚苔類のNPQには2成分あり、キサントフィルサイクルによらないNPQが存在することが判明した。また、非耐性種では半乾燥状態でNPQが阻害されたが、耐性種ではNPQが働くことが分かった。このキサントフィルサイクルによらないNPQは乾燥時に重要なものではないかと考えられる。本学会ではこのNPQの性質について詳しく報告する。

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植物の根は土壌水分環境の影響を直接的に受けるため、地上部とは異なった独自の乾燥ストレス耐性機構を有していると考えられる。そこで本研究では、乾燥ストレスに優れた耐性能を示す野生種スイカ（Citrullus lanatus sp. No101117-1）の根における乾燥ストレス応答タンパク質をプロテオーム解析により網羅的に同定し、本植物の乾燥ストレス応答機構について考察した。
強光・乾燥ストレス（700 μmol photons/m²/s，35℃，潅水停止）を付与した野生種スイカの根から、可溶性タンパク質を抽出し、二次元電気泳動により分離した。その結果、約1500個のタンパク質スポットが検出され、その中で乾燥ストレス付与1日目（初期増加型）および3日目（後期増加型）で強度が顕著に増加したスポットが、それぞれ37個、42個認められた。また、ストレスにより減少したスポットは14個検出された。LC-MS/MSによる解析の結果、初期増加型には様々な代謝関連タンパク質（29.7%）や2つのRan GTPaseを含めた細胞分裂制御/形態形成関連因子（13.5%）が、後期増加型にはヒートショックタンパク質（28.6%）、抗酸化関連タンパク質（14.3%）、プロテアーゼ（9.5%）などが含まれていた。以上の結果より、野生種スイカの根は乾燥ストレスの程度に依存してストレス回避および防御機構を機能させて誘導していることが示唆された。

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強光・乾燥ストレスに対して高い耐性能を有する野生種スイカ（Citrullus lanatus sp. No101117-1）の根には、優れたストレス回避/防御機構が存在すると考えられる。我々は、野生スイカの根のプロテオーム解析の結果から、細胞分裂制御に関与するRan GTPase (CLRAN) の蓄積量が乾燥ストレス初期に増加することを明らかにした。そこで本研究では、乾燥ストレス下での野生種スイカの根の発達制御機構およびCLRANがその機構に果たす役割について検討した。
野生種スイカの根の伸長率は、通常条件下（200 μmol photons/m²/s, 35℃, 一日一回潅水）よりも乾燥ストレス条件（潅水停止）下において増加していた。また、野生種スイカは、乾燥ストレス下では栽培種スイカと比較して2倍以上アブシジン酸（ABA）を蓄積していたが、主根伸長および側根形成共にABAに対して低感受性であった。また、CLRANは主に根端の分裂および伸長領域で発現し、根端での発現量が乾燥ストレスにより約1.5倍に増加した。さらに、CLRAN過剰発現シロイヌナズナの根において、ABA感受性低下が認められた。以上の結果から、野生種スイカは乾燥ストレス回避のための根の生長促進機構を有しており、CLRANがその制御に関与することが示唆された。

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砂漠環境に自生する野生スイカは、乾燥強光下で活性酸素ヒドロキシルラジカル消去能に優れた新規適合溶質シトルリンを葉内に30mMも高蓄積する。しかしながら、その合成の制御機構は全く明らかにされていない。そこでシトルリン蓄積機構を解明するために、乾燥強光時のシトルリン代謝経路を担う11種の酵素の挙動ならびにシトルリン合成の窒素源について解析した。
まず、シトルリン代謝を担う11種の酵素活性を測定したところ、経路の初発および第2段階を担う、N-acetylglutamate synthaseとN-acetylglutamate kinase、シトルリンの基質であるカルバモイルリン酸を生合成するcarbamoyl phosphate synthetaseが乾燥によりそれぞれ約7、7、3倍に活性が増加していた。また、シトルリン分解酵素であるArgininosuccinate synthaseの活性が5分の1に低下していた。一方、その他の生合成酵素の活性は乾燥前後で変化がなかった。
次に、シトルリン合成の窒素供給源として可溶性タンパク質の約5割を占めるRuBisoCOに注目し、乾燥強光に伴い主に下位葉において含有量が低下することを見出した。
以上のことから野生スイカは、乾燥強光時にRubisCOを分解しシトルリン生合成に再利用していると考えられ、窒素代謝を巧妙に制御し耐性を獲得していると考えられる。

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乾燥耐性能を持つ陸生ラン藻は、土壌改善に貢献する重要な役割を持つ生物として注目を集めつつあるが、ラン藻の乾燥耐性メカニズムは未解明な部分が多い。我々はこれまでにAnabaena sp. PCC 7120における乾燥時の遺伝子発現について網羅的に解析してきた。しかしながら、耐乾性の獲得には、乾燥ストレス時のダメージを回復していく再水和過程も重要であると考えられる。
そこで再水和時のDNA microarray解析を行った。その結果、再水和により多数の遺伝子の発現量が増加することを見出した。その中で我々はcAMPにより活性化される転写因子ancrpBに着目した。再水和時には一過的に細胞内cAMP濃度が増加した。また、ancrpB破壊株は野性株に比べ再水和時の酸素発生活性の回復が鈍く、AnCrpBが乾燥からの回復過程において重要な役割を果たしていることが示唆された。本発表では、乾燥・再水和過程における遺伝子発現プロファイル、また、再水和過程におけるcAMPシグナリングについて議論する。

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近年、SCF複合型ユビキチンリガーゼによるタンパク質分解系が、植物の生命現象の様々なステップにおいて重要な役割を果たしていることが明らかになってきた。F-boxタンパク質は、SCF複合型ユビキチンリガーゼのサブユニットの1つであり、標的タンパク質を認識している。シロイヌナズナゲノムには、700近くのF-boxタンパク質をコードする遺伝子の存在が報告されている。しかしながら、乾燥ストレス及び乾燥ストレスからの回復過程で応答するF-boxタンパク質に関する研究はこれまで報告されていなかった。
最近、我々はマイクロアレイ解析により、乾燥または低温ストレスで発現誘導されるF-boxタンパク質の遺伝子を4個 (SIF1～4; Stress-Inducible F-box Protein)、乾燥または低温ストレスからの回復過程で発現誘導されるF-boxタンパク質の遺伝子を5個 （RIF1～5; Recovery-Inducible F-box Protein）同定した。このうち、SIF1遺伝子について発現・機能解析を起こったところ、SIF1遺伝子は、乾燥、塩、ABA処理で発現誘導される事、及びSIF1遺伝子の破壊株は高浸透圧ストレスに対して高感受性を示すことがわかった。以上の結果より、SIF1遺伝子の破壊株は、シロイヌナズナのストレス耐性獲得にとって不要なタンパク質の分解に機能していることが示唆された。

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イネにはNACドメインを持つタンパク質が50種類以上の存在し、それらはNACドメインの相同性から11のサブグループ（グループA～K）に分けられた。マイクロアレイ実験から、グループAに含まれる6種類のNAC遺伝子のうち、OsNAC6を含む5種類のNAC遺伝子は、乾燥・塩・低温誘導性が強いことが示された。さらに、ノーザン解析やプロモーター:GUSを導入したイネを用いた実験から、OsNAC6はアブシジン酸（ABA）、ジャスモン酸（JA）、傷によっても誘導されることが明らかになった。酵母を用いた実験から、OsNAC6には転写活性化能があることが示された。また、タマネギ表皮細胞にOsNAC6-sGFP融合遺伝子を導入する実験から、OsNAC6は核に局在することが示された。OsNAC6を過剰発現したシロイヌズナでは植物体のサイズが小さくなり、下偏成長した葉が多数形成された。OsNAC6を過剰発現したイネも著しく矮化した。また、過剰発現シロイヌナズナでも過剰発現イネでも、多くの環境ストレス誘導性遺伝子群や病害ストレス誘導性遺伝子群の発現レベルが上昇した。これらの結果は、OsNAC6が環境ストレスだけでなく病害ストレスに対しても機能する転写活性化因子であることを示唆する。

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植物ホルモンのアブシジン酸（ABA）は植物の気孔を閉鎖させ、乾燥条件下での植物体からの水分の損失を防いでいる。近年、気孔孔辺細胞でのABAシグナル伝達においてプロテインキナーゼやホスファターゼが重要な役割を担うことが示されているが、これまで孔辺細胞におけるABAに応答したリン酸化反応を詳細に解析した例は少ない。今回我々はソラマメ孔辺細胞においてABAに応答してリン酸化レベルの変動する蛋白質を、様々なリン酸化蛋白質と結合することが知られている14-3-3蛋白質をプローブに用いて検出した。その結果、複数の14-3-3結合蛋白質を見出したが、なかでも約61 kDaの可溶性蛋白質がABAに応答して14-3-3蛋白質と強く結合することがわかった。これは生理的な濃度のABAによって数分以内に起こる孔辺細胞に特異的な反応で、幅広いプロテインキナーゼを阻害するK-252aによって阻害された。さらに、ABAシグナル伝達の重要な2次メッセンジャーと考えられているreactive oxygen species (ROS)のH₂ O₂ やROS生成阻害剤は、ABAに依存する61 kDa蛋白質への14-3-3蛋白質の結合に影響しなかった。これらの結果から、61 kDa蛋白質はABAに応答してリン酸化され、ABAシグナル伝達においてROS生成の上流または別経路に関与していると考えられる。

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我々はアブシジン酸（ABA）シグナル伝達機構を解明する為に、シロイヌナズナABA誘導性受容体型キナーゼRPK1に着目し機能解析を進めている。RPK1のアンチセンス形質転換体および欠失変異体はABAによる種子休眠、根の伸長抑制、気孔閉鎖等に対しABA非感受性を示した。RPK1が様々なABA応答反応に関与し、重要なシグナル因子の一つとして機能することが示された。また、RPK1の細胞外LRRドメインの高発現体はABAの発芽速度の抑制効果に対し非感受性を示したことから、RPK1-LRRは植物体中でRPK1の機能に対しドミナントネガティブに機能することが示唆された。この結果から、RPK1-LRRがABAシグナルの感受に重要なドメインである事が示された。さらにRPK1-LRRの機能を解析する為に、RPK1-LRRとブラシノステロイド（BR）受容体BRI1キナーゼドメインとのキメラ受容体を植物体中で高発現体させその表現型を解析した結果、キメラ受容体の発現量と培地中に添加したABA濃度に相関してBRシグナル伝達系の抑制が高まることが示された¹⁾。次に、RPK1のC末端にヘマグルチニンタグを連結しCaMV35Sプロモーター制御下で高発現する形質転換体を作製しその植物に与える影響を解析した。得られた植物体は弱い生育抑制を示し、ABAによる根の伸長抑制、気孔閉鎖等に対しABA高感受性を示した。さらにRPK1高発現体の表現型について詳細な解析結果を報告する。
¹⁾ Osakabe et al., Plant Cell (2005) 17,1105-1119.

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シロイヌナズナのロイシンリッチリピート受容体様キナーゼ（LRR-RLK）であるRPK2は、ABAシグナル伝達を制御するRPK1（Osakabe et al. (2005) Plant Cell 17: 1105-19）のホモログである。RPK2遺伝子欠失変異株（rpk2-1及びrpk2-2）は雄性不稔となり、花茎はブッシュ状になって花とさやの数が増加した。rpk2の葯の表面ではリグニン化が正常に進行せず、葯の開裂が抑制されていた。葯の内部では減数分裂後にタペート細胞の異常な肥大が見られ、花粉が正常に成熟しなかった。またin situハイブリダイゼーション法により、RPK2遺伝子は野生株の若い葯のタペート細胞において発現していることが確認された。野生株とrpk2の花を用いたマイクロアレイ解析により、rpk2の中で発現が3倍以上抑制される255個の遺伝子を同定した。抑制された遺伝子の中には、リグニン合成系や細胞壁分解系の酵素をコードするものが多く含まれており、これらの働きが抑えられることでrpk2の葯の開裂が阻害されることが示唆された。また、RD20やLEAタンパク質といったABA応答や浸透圧ストレス耐性に関与する遺伝子もいくつか抑制されていた。これらのことから、RPK2は葯の発達に必須の受容体であることが明らかとなり、現在ABAやストレス応答における役割を解析している。

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アブシジン酸(ABA)は、種子登熟、気孔の閉鎖や環境ストレスに対する応答機構に関わることが知られている。我々はこれまでにABA高感受性を示すahg変異体(ABA hypersensitive germination)を単離し、解析を行ってきた。今回はahg1変異体の解析結果について報告する。
ahg1は、種子発芽においてABA、塩、浸透圧、糖に対し高感受性を示すが、植物体ではABA高感受性示さない。ahg1の種子休眠性を調べたところ、野生型に比べ種子休眠性が高まっていた。一方、ahg1植物体は乾燥ストレスに対し、野生型とほとんど変わらなかった。種子と浸透圧ストレス処理を行った植物体の内在性ABA量を測定したところ、乾燥？種子ではahg1は野生型に比べABA量が約1.3倍高いのに対し、浸透圧ストレス処理した植物体では野生型と大差がなかった。以上の結果から、AHG1は主に種子で機能することが予想された。
このahg1の原因遺伝子をマッピングにより同定したところ、新たなプロテインフォスファターゼ2C(PP2C)をコードすることが明らかとなった。我々は既に、種子で強い表現型を持つahg3の原因遺伝子が別のPP2CであるAtPP2CAをコードしていることを報告している。本発表では、AHG1とAHG3のABA応答における役割について議論する。

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我々はアブシジン酸(ABA)応答の分子機構を明らかにするため、ABA高感受性を示すahg変異体(ABA hypersensitive germination)を単離、解析を行っている。ahg2は種子発芽と植物体においてABA高感受性を示し、その原因遺伝子はpoly(A)-specific ribonuclease (AtPARN)をコードしていた。興味深いことに、ahg2植物体はいくつかのストレスやサリチル酸(SA)誘導性遺伝子の発現量が上昇し、種子発芽においてはSA高感受性を示した。また、ahg2植物体は小さく、恒常的な細胞死を示すなど形態的にも多様な表現型を有す。本研究では、ABAを介する環境ストレス応答とSAを介する病原ストレス応答におけるAHG2/AtPARNの役割について明らかにすることを目的としている。
今回、AHG2/AtPARNが病原ストレス応答においても役割を担っているかを明らかにするため、病原菌感染応答を調べた。ahg2はP. syringae pv. tomatoに対し抵抗性を示したが、B.cinereaには抵抗性を示さなかった。また、内在性SA量を調べたところ、野生型に比べ高く蓄積していることも明らかとなった。
以上のことから、ahg2変異は、これまで拮抗的に作用すると報告されていたABA応答とSAまたは病原ストレス応答が双方とも高感受性になっている特殊な変異株であると考えられる。このことから、AHG2/AtPARNはABA、浸透圧ストレスや病原ストレス応答に関与するある種の遺伝子のmRNAを特異的に分解していると考え、現在解析を行っている。

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MAP kinase cascadeは真核生物に広く保存されているシグナル伝達系の一つであり、高等植物においては環境ストレスや病原菌に対する適応に重要な役割を果たす事が報告されている。シロイヌナズナゲノム中には多数のMAPキナーゼファミリー遺伝子が存在する事が明らかとされているが、その詳細な生理応答機構は、一部を除いて解析が進んでいない。我々はMAPKKの一つであるMKK3に着目し、これまでに新規MAPキナーゼMKK3-MPK6カスケードを同定した。また活性型MKK3過剰発現植物体の表現型及びMKK3カスケードによる下流制御因子の解析から、MKK3-MPK6カスケードはMKK4-MPK6カスケードとは異なり、JAのシグナル伝達に関与する事を示唆してきた。mpk6遺伝子破壊変異体、MPK6過剰発現植物体を用いた解析から、MPK6が実際にJAにより活性化される事が明らかとなった。またmkk3遺伝子破壊変異体及びJA非感受性変異体coi1では、JAによるMPK6の活性化が低下していた。更にMKK3、MPK6過剰発現植物体はJAによる根の伸長阻害に非感受性を示し、mkk3、mpk6遺伝子破壊変異体は感受性を示した。以上の結果よりMKK3-MPK6カスケードはJAのシグナル伝達経路に関与する事が明確化された。JAシグナル伝達におけるMKK3-MPK6カスケードの生理学的機能について考察する。

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炭素数6のアルデヒド(C6)はシロイヌナズナに防御遺伝子の発現や抗菌物質の蓄積を誘導する。我々はC6による防御応答シグナル経路解明のため、jar1-1, etr1-1, npr1-1, およびpad2-1を用いてその応答様式を野生株と比較検討した。C6による防御遺伝子の誘導はjar1-1, pad2-1で大きく抑制されていたがetr1-1, npr1-1では変化なかった。また、C6によるカマレキシンの誘導はetr1-1, jar1-1では部分的にしか見られなかった一方、pad2-1ではほとんど見られなかった。灰色カビ病菌に対する抵抗性はetr1-1, jar1-1, npr1-1では増強されたが、pad2-1では誘導されていなかった。以上の結果、C6による防御応答誘導にはETR1, JAR1, およびPAD2を介したシグナル経路が同時に関与しているが、NPR1は関与しないことが明かとなった。

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The ontogenic change in photosynthetic activity of temperate seagrasses was assessed using pulse-amplitude modulated (PAM) fluorometer: Diving-PAM. Seeds of Zostera marina, Zostera asiatica and Zostera japonica were cultured in outdoor tanks. The effect of age on photosynthetic activity was determined by minimum fluorescence (F), maximum fluorescence (Fm'), variable fluorescence (&DeltaF), effective quantum yield (&Phi_PSII), electron-transport rate (ETR) and leaf absorptivity (AF). Leaf chlorophyll pigments (a, b, a+b & a:b) were also measured. Fluorescence yields, leaf absorbance and chlorophyll pigments increased with age.In contrast, the effective quantum yield (&Phi_PSII) and electron-transport rates (ETR) decreased with age. Highest effective quantum yield and electron-transport rates were observed in younger tissue than in older tissue. Z. japonica had the highest yield and electron-transport rates, hence, found to be productive. The results demonstrate that PAM fluorometry is indeed an effective technique in determining temporal changes in the photosynthetic activity of seagrasses over time.

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酸素発生型光合成電子伝達系では、アンテナタンパク質が関与する2つの光化学系の間で励起エネルギーを再分配するステート遷移という機構が機能する。光化学系I（PSI）がより励起されるステート1の状態では、アンテナ複合体（高等植物や緑藻ではLHCII）は光化学系II（PSII）と結合する。一方、 PSIIがより励起されるステート2の状態では、LHCIIはPSIへ移動し、PSIのアンテナとして機能すると考えられている。しかし、数多く存在するLHCIIの中で、この様なステート遷移の過程で移動するLHCIIの生化学的な解析はあまり進んでいない。本研究では、ステート1および2に固定した緑藻クラミドモナスの細胞からクロロフィルタンパクを分離する方法を確立し、さらにステート2に特異的に観察されるLHCIIを結合したPSI標品（PSI-LHCI/II超分子複合体）を見出した。この標品に含まれるLHCIIポリペプチドを質量分析および免疫学的手法により同定した結果，マイナーLHCIIとして知られるCP26とCP29、さらにメジャーLHCII TypeIIであることが分かった。以上の結果から、これら3種のLHCIIがステート遷移により移動し、PSIおよびPSIIコア複合体と比較的安定に結合し、他のメジャーLHCIIがPSIおよびPSIIコア複合体と結合するときの結合部位を形成していると考えられる。

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ステート遷移は、集光性アンテナタンパク質 (LHCII) を光化学系I (PSI) と光化学系II (PSII) の間で再分配することによる、高等植物と緑藻が持つ光環境適応機構の一つである。ステート遷移によるLHCIIの動的な変化を調べるためには、PSI-LHCI超複合体とPSII-LHCII超複合体の精製は必須である。しかし、そのようなステート遷移によるPSII側の変化はほとんど報告されていない。それはPSII-LHCII超複合体の精製が困難であることが要因であると考えられる。我々は、本研究で、PSIIコアアンテナタンパク質CP47にヒスチジンタグが導入された緑藻クラミドモナスの変異株を用いて、高度に精製されたPSII-LHCII超複合体をシングルステップにて得る手法を新たに確立した。この手法によってステート1とステート2状態の葉緑体より精製されたPSII-LHCII超複合体の性質について報告する。

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Plant photosynthesis is reliant on the dynamic assembly and stability of the four multisubunit complexes located in the thylakoid membranes, which work in unison to generate ATP and reducing equivalents required for the Calvin cycle reaction occurring in the stroma. The role of a number of stromal factors in the transcriptional, post-transcriptional and post-translational regulation of membrane complex assembly is well documented, but the contribution of lumenal factors to this process is relatively unknown. The thylakoid lumen has recently been found to containnearly 20 distinct immunophilins, the majority of which are FKBP-type immunophilins. We isolated Arabidopsis mutants lacking the AtFKBP20-2 isoform and show that they display a severe and specific defect in the content of the PSI complex, characterized by an alteration in the stoichiometry of core and antenna subunits. Recent evidence for the role of additional lumenal immunophilins in photosynthetic regulation will also be presented.

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葉緑体ATP合成酵素には、γサブユニット上に存在する2つのシステイン残基間のジスルフィド結合の形成・解離(酸化還元調節)、テントキシンに対する感受性など他種のATP合成酵素には見られない活性調節機構がある。また、内在性の阻害サブユニットであるεによってそのATP加水分解活性が強く阻害されることもよく知られている。我々は、これらの調節機構の詳細を明らかにするために、好熱性シアノバクテリア(Thermosynechococcus elongatus BP-1)由来FoF1のα3β3γ複合体およびこの複合体に葉緑体ATP合成酵素のγサブユニットの酸化還元調節領域を導入したキメラα3β3γ複合体の大量発現系を構築した。キメラα3β3γ複合体のATP加水分解活性は、葉緑体ATP合成酵素と同様に酸化還元応答を示した。さらに、このキメラα3β3γ複合体はテントキシン感受性も示した。葉緑体ATP合成酵素の活性調節と共通点が多いことから、このキメラα3β3γ複合体は活性調節機構の詳細を調べるための好適なツールである。また、α3β3γ複合体は、ATP加水分解に伴って回転子であるγサブユニットを回転させる分子モーターである。εサブユニットによりATP加水分解活性が阻害された時のγサブユニットの回転を1分子観察によって詳細に調べた結果も、あわせて報告する。

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光化学系IIにおいて過剰に吸収された光エネルギーは熱放散され、クロロフィル蛍光法によりnon-photochemical quenching（NPQ）として測定される。シロイヌナズナのNPQ においてPsbSが不可欠であることが知られているが、よりシンク能力の高い作物におけるPsbS、さらには、NPQの機能に関しては、不明の点が多くあった。本研究では、イネを材料とし、RNAi法によるpsbSの発現抑制を行ない、NPQのPsbS依存性の定量的解析を行うとともに、NPQの抑制により生じる過剰な光エネルギーの放散系の解明を目的として研究を行なっている。本年度は昨年度作製を報告したPsbS発現抑制形質転換T₁イネの解析結果について報告する。イネに存在する2つのpsbS遺伝子を共通して発現抑制するRNAiベクターを導入した形質転換体では、PsbSの発現の抑制とNPQの抑制が認められたが、PSIIの量子収率に関しては野性株と差異がないことが明らかとなった。さらにPSIIからの熱放散をアンテナからの熱放散と反応中心からの熱放散に分割し定量化した結果、NPQの抑制によって生じたはずの過剰の光エネルギーは、反応中心から熱放散している可能性が示唆された。現在、この新たなエネルギー放散機構について検討を試みている。

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酸素発生型光合成におけるNAD(P)H dehydrogenaseの役割、特にcyclic電子伝達系における役割が近年注目を集めている。しかしながら、いまだこの酵素は均一に精製されておらず、サブユニット組成に関して不明な部分が多い。そこで本研究では好熱性シアノバクテリアThermosynechococcus elongatusにおけるNAD(P)H dehydrogenaseのサブユニット組成解明を目的とした。Thermosynechococcus elongatusを強い酸化ストレス条件下（強光＋methyl viologen）に曝したところ、70 kDaと140 kDa のNAD(P)H dehydrogenase活性が誘導された。この結果はこれらのNAD(P)H dehydrogenaseが酸化ストレス条件下での適応メカニズムに関与していることを示唆しており、cyclic電子伝達系への関与を期待させる。これら酸化ストレスで誘導された活性タンパク質について、それぞれnative PAGEで活性染色によるバンドとタンパク染色によるバンドが一致するような標品にまで精製した。本年会ではこれらのNAD(P)H dehydrogenase について、それぞれ酵素学的性質およびサブユニット組成について報告したい。

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高等植物の葉緑体に存在するNAD(P)H dehydrogenase (NDH)複合体は、ミトコンドリアのcomplex Iのホモログであり、光化学系Iサイクリック電子伝達とchlororespirationに関わる。NDH複合体の11のサブユニットは葉緑体ゲノムに、3つのサブユニットは核ゲノムにコードされる。しかし、細菌のNDH複合体に存在する電子供与体に結合するサブユニット遺伝子は見つかっておらず、ラン藻を含め光合成生物のNDH複合体は、未知のサブユニットを持つと考えられている。シロイヌナズナCRR7はクロロフィル蛍光イメージングにより単離されたNDH活性を特異的に欠く突然変異株から同定された。crr7では、NDH複合体の蓄積が見られない。CRR7 (At5g39210)はプラスチド移行シグナル有する156アミノ酸からなるタンパク質をコードする。CRR7は、既知のモチーフを持たない新規の可溶性タンパク質で、チラコイド膜に局在する。CRR7はラン藻に存在するが、NDH複合体を持たないクラミドモナスには存在しない。さらにNDH複合体がCRR7の安定性に必須であるか調べる目的で、ndhBの発現が異常なcrr2-2においてCRR7の蓄積を調べた。その結果、NDH複合体の蓄積は、CRR7の安定化に必須であることが明らかになった。全ての結果は、CRR7が新規のNDH複合体のサブユニットであることを強く示唆している。

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葉緑体NDH複合体はミトコンドリアのNADH dehydrogenaseのホモログであり、光化学系Iサイクリック電子伝達に関わる。高等植物のNDH複合体は、これまでに14個のサブユニットが同定されている。しかしながら、これらの既知サブユニットに電子供与体結合部位は含まれておらず、NDH複合体への電子供与体も未だ不明である。シロイヌナズナcrr1（chlororespiratory reduction）は、NDH活性を欠く変異株としてクロロフィル蛍光イメージングで単離された。CRR1タンパク質は葉緑体輸送ペプチドとNAD(P)H結合モチーフを持つことから、NDH複合体の電子受容サブユニットである可能性がある。興味深いことに、CRR1はリジン生合成酵素であるDHPR（dihydrodipicolinate reductase）と相同性を有するが、DHPR活性は持たない。またDHPR遺伝子が全ての組織で発現するのに対し、CRR1は他のNDHサブユニット遺伝子同様に光合成組織でのみ発現する。現在CRR1がNDH複合体のサブユニットであることを生化学的に示す実験を行っている。

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昨年、3’ 8-ジビニルプロトクロロフィリドa 8-ビニルレダクターゼ（DVR）の同定によって、すべてのクロロフィルa合成に関わる酵素が決定した。
DVRはクロロフィルの8位のビニル基をエチル基に還元する酵素であり、その基質はジビニルプロトクロロフィリドaであると考えられている。しかし、この考えを支持する実験結果はあまりなく、DVRの基質がどのクロロフィル中間体なのかは不明である。そのため、クロロフィル合成経路を確定することができない。
我々はDVRの真の基質を明らかにし、クロロフィル合成経路を決定するため、以下の実験を行った。大腸菌で発現させたDVRタンパク質の活性をジビニル型のプロトクロロフィリドa、クロロフィリドa、b、クロロフィルa、bを用いて調べた結果、DVRはジビニルクロロフィリドaを基質としたとき、最も高い活性を示した。また、シロイヌナズナを用いたin vivoの実験でも、ジビニルプトロクロロフィリドに対するDVRの活性は低かった。
これらの結果は、DVRの基質はジビニルプロトクロロフィリドaではなく、ジビニルクロロフィリドaであることを示唆している。以上の結果から、我々は新しいクロロフィルa合成経路を提案する。また、本発表では、DVRの至適pH、至適温度、NADPH依存性についても報告する。

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光合成のクロロフィル代謝系において、クロロフィリドa オキシゲナーゼ(CAO)はクロロフィルaをクロロフィルbに転換する酵素として、重要な役割を果たしている。クロロフィルbの量はCAOの蓄積によって調節されているが、その制御機構はまだ明らかにされていない。今回、CAOの蓄積制御機構を明らかにするために以下の解析を行った。 CAOはA、B、Cの3つのドメインから構成されているが、A、Bドメインがその制御機構に関っていると考えられている。それらの配列を調べたところ、Bドメインにはどの植物でも高い親水性を持つ領域（PEST－like 配列）が存在することを見出した。これらの結果をもとにシロイナズナで、A,B,C各ドメインを削ったCAOやA、Bドメインにアミノ酸変異を導入したCAOにGFPを融合し、それらの強制発現株を作成した。作成した株のCAOタンパク質やクロロフィルa, b量を、共焦点顕微鏡やウエスタンブロット、HPLCで解析した。以上の解析から、BドメインはPEST－likeな配列はあるものの葉緑体内でCAOタンパク質の分解に必須ではないことがわかった。またAドメインへの変異導入株ではCAOの蓄積制御が効かない株が得られた。これらの結果から葉緑体内でのCAOの制御機構について議論したい。

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高等植物ではクロロフィルaは7-ヒドロキシメチルクロロフィルaを経てクロロフィルbに転換され、クロロフィルbは再び7-ヒドロキシメチルクロロフィルaを経てクロロフィルaに戻る。我々はこの転換系をクロロフィルサイクルと呼んでいる。
我々はクロロフィルサイクルに関与する酵素及び調節因子を同定することを目的としてシロイヌナズナのEMS処理株のうち、光合成色素が野生株と異なる蓄積をする変異株をスクリーニングした。その結果、7-ヒドロキシメチルクロロフィルaを蓄積する変異体を単離することができた。この変異体は3日間暗所で老化誘導を行うと野生型に比べて10倍以上の7-ヒドロキシメチルクロロフィルaが蓄積することがわかった。また老化誘導を行わなくても数倍以上の7-ヒドロキシメチルクロロフィルaが蓄積することがわかっている。またこの変異体は野生株と比べて植物体が小さく、葉は薄緑色で柔らかい。またこの変異は劣性であることもわかっている。
現在、マップベースクローニング法により原因遺伝子の単離を試みている。

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nyc1は老化時のクロロフィル分解が抑制された劣性突然変異である。nyc1ではChlaの分解は老化とともに進行するのに対し、Chlbの分解は強く抑制されていた。ただし、最終的に残存するChlaの量も野生型に比べて高く、ChlaとChlbはほぼ同量になった。老化過程においてnyc1ではRubisco large subunitやChla結合タンパク質の分解は野生型と変わらないのに対し、LHCIIの分解は老化の最終段階においても顕著に抑制されていた。また、HPLCを用いた解析によりnyc1ではクロロフィルだけではなくカロテノイドを含むLHCIIに強固に結合する色素の分解も抑制されていることが明らかとなった。以上の結果から、nyc1はクロロフィル分解の突然変異体というよりLHCII分解が抑制された突然変異体であると考えられた。マップベースクローニングによる原因遺伝子単離の結果、 NYC1はshort-chain dehydrogenase/reductaseをコードしていることが明らかになった。NYC1の基質は現在のところ明らかではないが、老化時のLHCII分解に際しLHCIIプロテアーゼに対し上位に働く因子の存在が示唆された。

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1996年にパラオ諸島の群生ホヤからChl dを主要色素として酸素発生型光合成を行う海洋原核藻類Acaryochloris marina (A. marina)が発見された。Chl dはChl bと同様に、Chl aの酸化によって生合成されると推定されているが、その詳細は未だ不明である。
最近我々は、プロテアーゼの一種パパインが含水アセトン中でChl aをChl dに変換することを偶然発見した。Chl a → Chl dなる変換では、Chl aの環のビニル基（-CH=CH₂）がC=C結合の切断という過酷な反応を伴ってフォルミル基（-CHO）になる必要がある。ところが、Chl aにはC=C結合が多数存在するため、通常の酸化方法ではこれらのC=C結合も開裂する恐れがある。したがって、パパインによるChl a → Chl d変換は非常に特異な反応といえる。
本研究では、パパインによるこの酸化反応の基質特異性を検討するため、Chl aの代わりに環1にフォルミル基を持つChl bと、Mgの外れたPhe aを用いて実験を行った。
その結果、パパインによるChl b → 3-formyl-Chl b変換およびPhe a → Phe d変換は非常に起こりにくいことを明らかにした。このことは、A.marinaにPhe dと3-formyl-Chl bが存在しないことと関係があるかもしれない。a型光合成からd型光合成への生物進化において、パパインのような酵素によるChl a → Chl dなる化学進化が起きたのだろうか。

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多くの光合成生物においてクロロフィルa の基本骨格クロリン環は、ポルフィリンD環がニトロゲナーゼと類似した光非依存型プロトクロロフィリド還元酵素によって還元されて形成される。バクテリオクロロフィルa は、クロリンB環がさらに還元されたバクテリオクロリン環を基本骨格とする。クロリンB環還元には、ニトロゲナーゼと類似性を示す3つの遺伝子bchX、bchY、bchZが関与することが遺伝子破壊株の形質から推察されているが、生化学的な同定には至っていない。今回、私たちは、Rhodobacter capsulatus からアフィニティタグを利用して精製したBchXとBchY-BchZをもちいてクロロフィリドa のB環還元の再構成を試みたので報告する。BchXとBchY-BchZを、クロロフィリドaを基質とし、ATPとATP再生系、ジチオナイトを含む反応液にて嫌気条件下で反応させた。その結果、クロロフィリド a が減少し、新たに730nm付近に吸収ピークをもつ色素が生成した。LC-MS解析で得られたこの色素の分子量616の値は、クロロフィリド a のB環が還元された色素3-ビニル-8-エチルバクテリオクロロフィリド a と一致した。この結果は、バクテリオクロロフィル生合成系では、ポルフィリンD環還元だけでなくその対面のB環の還元にもニトロゲナーゼ類似酵素が関与していることを示している。

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シアノバクテリアGloeobacter violaceusはチラコイド膜を持たず、酸素非発生型光合成細菌と同様に光化学系が細胞膜上に呼吸系と共存した生物である。また、分子系統解析の上では最も初期に分岐したシアノバクテリアとされ、原始的な形質を残した酸素発生型光合成生物と考えられている。
プロトクロロフィリド（Pchlide）還元酵素はポルフィリンD環を還元することによりクロロフィルの直接の前駆体クロロフィリドを生成する。このPchlide還元酵素として、光依存性酵素（LPOR）と光非依存性酵素（DPOR）が知られている。LPORはクロロフィル合成の光依存性を決定する重要な酵素として働いており、酸素発生型光合成生物のみに見られることから、シアノバクテリアが誕生した後に獲得した酵素であると考えられているが、その起源は明らかではない。本研究ではLPORの進化的知見を得ることを目的に、大腸菌に発現させたG. violaceusのLPORの酵素学的検定を行い、現在までに調べられたLPORの値と比較検討した。その結果、G. violaceusのLPORのPchlideに対するKm値はSynechocystis sp. PCC 6803のそれよりも一桁ほど低く、高等植物のLPORの値に近いことが分かった。このことは、始原シアノバクテリアが獲得したLPORのPchlideに対する親和性は高く、実質的に利用していたことが示唆される。

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高等植物、紅藻類、藍色細菌において、phytobilinはフィトクロムやフィコビリン蛋白質で光受容色素、光合成色素として用いられている。Phytobilinは、ヘムの代謝産物であるビリベルジンΙΧα (BV) からフェレドキシン依存性ビリン還元酵素 (FDBR) によって合成される。FDBRファミリーの一つであるPcyAは、BVにおけるテトラピロール環のD環のビニル基とA環を順番に2電子還元し、フィコシアノビリンを生成する。このことは、PcyAが何らかの方法でD環とA環を区別し、さらに還元の順序を制御していることを示す。
我々は、Synechocystis sp. PCC6803由来PcyAの大量発現系を確立し、PcyA-BV複合体の立体構造を分解能1.51 Å で決定した。これはFDBRファミリーにおける初めての立体構造である。得られた構造を基に、電子供与体であるフェレドキシンの結合部位やPcyAにおける基質認識、反応機構について考察を行った。さらに、他のFDBRに対してホモロジーモデリングを行い、それらに基づいて分子表面の特徴や活性残基を比較した。

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モデル植物の全ゲノム配列解読以後、ゲノム情報を用いたポストゲノム科学や他植物との比較ゲノム科学が急速に行われてきた。近年では代謝産物蓄積の分析（メタボロミクス）や遺伝子表現の包括的解析（トランスクリプトミクス）を通して、各データベースやバイオリソースを活用したファンクショナルゲノミクスのハイスループット化が課題の一つとなっている。すでに、演者らはPAP1 遺伝子が過剰発現したアントシアニン高蓄積変異株について、メタボロミクスおよびトランスクリプトミクスを行い、いくつかの未知遺伝子の機能を明らかにした⁽¹⁾。本研究では、その際に明らかとなったPAP1によって共発現制御される遺伝子セットについて、昨年公開されたシロイヌナズナの約800のマイクロアレイ実験から相関係数を算出した『ATTED』を用いて、代謝機能制御に関わる共発現遺伝子群を一挙に推定した。その結果、アントシアニン特異的遺伝子群、フラボノイド一般の関連遺伝子群、リグニン関連遺伝子群など、いくつかのクラスターが形成された。そのうち、機能が推定された標的遺伝子のT-DNA挿入による機能破壊型変異体について、UPLC-Q-TOF MSを用いた蓄積代謝物分析を行った。その結果、2つの糖転移酵素遺伝子と1つのデヒドラターゼ遺伝子について遺伝子機能から予測される代謝物変動が変異体において認められ、これらの未知遺伝子の機能が示唆された。
1. Tohge et al., Plant J. (2005) 42: 218-235

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ある生合成系に関与する遺伝子群は互いに協調的に発現していることが知られている。我々はこの特徴を利用した遺伝子共発現解析により未知のフラボノイド配糖化酵素遺伝子の機能同定を試みた。
シロイヌナズナにおいてフラボノイドは高次に配糖化されており、その構造から少なくとも8種類の配糖化酵素遺伝子の関与が推測されるが、そのうち4種類が同定されているにすぎない。シロイヌナズナには、119の配糖化酵素遺伝子が存在するが、配糖化は広範囲の二次代謝産物に見られる修飾系のため、その一次構造のみで機能を推定することは困難である。
我々は、公開データーベースATTEDを用いた共発現解析によりフラボノイド生合成系に強く相関の見られる配糖化酵素遺伝子を見いだした。その推定アミノ酸配列より、この遺伝子はフラボノイドの7位の配糖化に関与することが示唆された。複数の独立したT－DNA挿入変異体を分析したところ、7位のラムノシル化されたフラボノイドが検出できなかった。以上の結果から、この遺伝子はフラボノイド7ラムノシルトランスフェラーゼ（At7RhaT）をコードしていると考えられた。リアルタイムPCRによりAt7RhaT遺伝子発現産物は、つぼみで高い蓄積が見られ、この結果は、シロイヌナズナの各器官におけるフラボノイド分析の結果と矛盾しないものであった。

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チョウマメにおけるテルナチン類の生合成では，デルフィニジンB環のO-グルコシル基がアシル基転移酵素（3'AT及び5'AT）によりp-クマロイル化されると推定される．我々はアシル基供与体に1-O-アシルグルコースを用いて3'AT酵素活性を初めて検出した．精製した3'ATタンパク質はSDS-PAGEで31及び24kDaのバンドに分離し，二つのサブユニットからなるヘテロマーと考えられた．生化学的及び酵素化学的特性から，3'ATはセリンカルボキシペプチダーゼ様アシル基転移酵素（SCPL-AT）と考えられたので，花弁より同酵素遺伝子の候補となるcDNAを幾つかクローン化した．そのうちのCtAT1 cDNAが，トリプシン消化によって得られた31kDaサブユニットの2ペプチド，24kDaサブユニットの1ペプチドのアミノ酸配列と一致する推定アミノ酸配列を有し，二つのサブユニットをコードすると考えられた．また，CtAT1にはSCPLタンパク質の推定活性中心であるSer-His-Aspが保存されていた．さらにN末端にシグナル配列，そして24kDaサブユニットに糖鎖修飾されると推定されるAsnがあり，分泌タンパク質と考えられた．そこで，バキュロウイルス-昆虫細胞の系で組換えタンパク質を発現させて酵素活性を測定した．その結果，1-O-アシルグルコース：アントシアニン3'-O-グルコシド-O-アシル基転移酵素活性を有することが確認された．

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カーネーション（Dianthus caryophyllus ）においては古くから生化学的な研究が盛んに行われ、アントシアニン生合成酵素と遺伝子座の関係が明らかにされている。この中の遺伝子Sはアントシアニンの含有量の決定に関与する遺伝子座として見出されており、このS遺伝子の優劣により花の色の濃淡が変化することからも花色発現に重要な役割を果たしていると考えられている。本研究ではカーネーションの花色の濃淡に関与するS 遺伝子座に対応する遺伝子を同定することを目的とし、アントシアニンの液胞への輸送に関与することが示唆されている GST (Glutathione S-Transferase) 相同遺伝子を濃赤色カーネーションおよび淡色カーネーションから単離し、シークエンス解析およびパーティクルガンによる相補実験を行った。その結果、淡色のカーネーションからは濃赤色カーネーションから単離された DcGST4-1 とは異なる DcGST4 が 2 種 (DcGST4-2, DcGST4-3) 見出された。これらの 3種の DcGST4 をパーティクルガンにより淡色カーネーション花弁に導入すると、DcGST4-1 のみが濃赤スポットを形成した。以上の結果から DcGST4 の変異により淡色となることから、GST4 が S 遺伝子であることが示唆された。この研究は民間結集型アグリビジネス創出技術開発事業によって行われた。

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ナデシコ目ではアントシアニンが合成されず、その赤色はベタシアニンにより発色されている。我々は、ナデシコ目にはなぜアントシアニンが存在しないのかという問題に対し、アントシアニン合成に特異的な反応を触媒するDFR、ANSに注目し、解析を試みている。これまでに、ナデシコ目にもDFR、ANSが存在し、これらは酵素としての機能を保持しているが、種子以外ではほとんど発現がみられないことを明らかにしている。
そこで、ナデシコ目のDFR、ANSの転写調節機構を明らかにするため、シス領域の解析を行った。その結果、ホウレンソウのDFR、ANSのシス領域には、いくつかの転写因子結合配列が存在し、Yeast one-hybrid assayによりこれらのシス領域にはアントシアニン合成regulator (PhAN2, PhJAF13)が結合することが明らかになった。さらに、レポーター遺伝子（GFP, LUC）とのキメラ遺伝子を構築し、CaMV35S に連結したPhAN2, PhJAF13とともにPhytolacca americana 培養細胞に導入したところ、ホウレンソウのDFR、ANSプロモーターでは、アントシアニン合成植物のプロモーターと比べ転写の活性化が低かった。

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フラボノイド合成系は、周りの環境からのストレスや発達段階、器官の違いなど、さまざまな要因によってその発現が制御されている。フラボノイド合成系の遺伝子は、その基質の供給を担う一次代謝経路であるシキミ酸経路の遺伝子群と協調的に誘導されることから、両代謝経路は共通の転写制御機構によって調節されていることが予想される。
DAHP（3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phoshate）シンターゼをはじめとするシキミ酸経路の酵素遺伝子は、二次代謝経路の酵素遺伝子と同様に多重遺伝子族を形成し、菌感染や傷害に応答して転写が誘導されるが、転写調節の詳細に関しては不明な点が多い。我々は、これらの転写制御機構の統合的解析を行うために、マメ科のモデル植物であるミヤコグサ(Lotus japonicus accession Gifu B-129)におけるDAHPシンターゼ遺伝子とその上流領域の単離を試みた。PCRで増幅した断片の配列よりミヤコグサには少なくとも5つのDAHPシンターゼ遺伝子ホモログが存在することが示唆された。これらの遺伝子のエリシター処理や傷害に対する応答、器官特異的な発現について、現在、RT-PCRによる解析を行っている。

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イソフラバンvestitolはミヤコグサなどマメ科Lotus属植物のファイトアレキシンである．これまでにvestitol生合成系の酵素・遺伝子の殆ど全てが同定されたが，イソフラバン骨格の生合成機構は未知であった．リグナン合成系に見出される，プテロカルパンからイソフラバンへの変換と形式的に同等の反応を触媒する還元酵素のホモログをミヤコグサから得て，基質特異性を検討した．ミヤコグサESTデータベースからフェニルクマランベンジルエーテル還元酵素 (PCBER)様の2配列(PTR1, PTR2)を選抜した．PTR1とPTR2は，PCBERやイソフラボン還元酵素とアミノ酸レベルで60%の同一性を示した．大腸菌系で発現したPTR1とPTR2は，NADPH存在下で(-)-medicarpinからvestitolの変換を触媒した．一方，リグナンや2'-hydroxyformononetinを用いたアッセイでは生成物は見られなかった．以上より，PTR1とPTR2がプテロカルパン還元酵素活性を持つことがわかった．ミヤコグサ幼植物体ではPTR遺伝子は常に発現し，vestitol生合成のエリシターである還元型グルタチオン処理による発現誘導はみられなかった．今後，酵素反応の速度論的解析や，ミヤコグサ植物体や培養細胞での酵素活性と遺伝子発現の相関を検討し，PTRの植物細胞内での役割を明らかにする．

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花弁にカロテノイドを含有している淡黄色のペチュニアに様々なカロテノイド・キサントフィル合成遺伝子を導入することで、濃黄色から橙色の花色改変が可能である（2005年分子生物学会）。特に微生物(Agrobacterium aurantiacum)由来のケトラーゼ遺伝子(crtW)は色彩の変化が顕著であり遺伝子産物の発現を検出する上でも有用である。今回、我々は花弁の色素体の組織観察を進めたところ、白色のペチュニアでは白色体がわずかに観察されるのに対し、淡黄色ペチュニアでは花弁の脈(vein)近傍には葉緑体が存在し、それ以外では有色体が認められた。crtWを発現した橙色の花弁では、特に色素体の形態に変化は認められなかった。また、より濃橙色の花色を持つものを得る目的でcrtWに異なる葉緑体移行シグナルを付加したものを導入して形質転換体の花色を比較観察した。その結果、橙色の度合いは移行シグナルなし（着色なし）<<エンドウ・Rubisco小サブユニット<ペチュニア・fibrillin<アグロバクテリウム・イソペンテニルトランスフェラーゼの順であった。遺伝子発現効率や色素体移行能などの要因が考えられるが、ペチュニア花弁でのcrtW産物の発現には移行シグナル配列による相性が存在する。

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植物細胞は、成長に伴って巨大液胞を発達させるため、細胞質は細胞表層に薄い層として展開される。近年、蛍光色素および蛍光タンパク質による液胞膜の可視化が進み、液胞は単純な袋ではなく複雑な形態を示すことが明らかになってきた。植物細胞の細胞質には、一般的に微小管とアクチン繊維という二つの細胞骨格が展開されており、これらを破壊することで液胞の形態や運動に異常が生じることが報告されている。しかしながら、細胞の成長・分化と液胞の形態との関連については、未だに十分な知見が得られていない。そこで本研究では、細胞の成長・分化の解析に適したヒメツリガネゴケにおいて、蛍光色素およびGFP-AtVam3p融合遺伝子の導入によって、液胞膜を可視化した。その結果、原糸体の先端、細胞板の発達部位、密集した葉緑体などの周辺において、液胞膜が複雑に突出・陥入し、細胞質が液胞と入り組むように分布していることが明らかになった。また、細胞骨格阻害剤によって、このような液胞と細胞質の分布に異常が生じることが判明した。このような細胞骨格による液胞および原形質の分布制御と細胞の生長・分化との関わりを明らかにするために、ヒメツリガネゴケの高い再生能力を利用し、プロトプラストからの原糸体が分化、成長する過程について解析を進めており、その結果を併せて報告する予定である。

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気孔の開閉は気孔を取り囲む孔辺細胞への水分の出入りによる細胞体積の増減により生じる。孔辺細胞体積の大部分は巨大液胞が占めており、気孔開閉と液胞構造とその体積変化との関連が示唆されていたが、その詳細は未解明であった。そこで本研究では液胞構造を可視化したソラマメとシロイヌナズナの孔辺細胞を用い、気孔開閉時における液胞構造の動態と体積変化を解析した。まずソラマメの孔辺細胞の液胞内腔をBCECFで染色し、気孔開口時には孔辺細胞の外周に沿うように形成されていた平滑な液胞が、閉口時には多数のくびれ構造を生じ、連続した形状を保ったまま収縮する事を見出した。次にこの気孔閉口時の複雑な液胞構造を詳細に観察するために、GFP-AtVam3pを発現することで液胞膜を可視化したシロイヌナズナの形質転換体を用いた。気孔閉口時の経時的観察の結果、孔辺細胞の液胞構造は平滑な状態からシート状の陥入を生じ、やがて内腔にバルブ状構造を形成し複雑化することがわかった。この液胞構造変化は「複雑度」という指標を用いて数値的にも評価された。更に、我々が開発したソフトウェアREANTを用い、液胞膜の連続断面像から液胞の立体構築を行い、その体積と表面積とを算出した。その結果、気孔閉口時には液胞の体積は減少したが、その表面積はほとんど変化しなかったことから、液胞は陥入やバルブ状構造の形成により液胞膜を折りたたむことで素早く収縮する可能性が示唆された。

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液胞は高等植物の多くの細胞で生長にともなって体積を増し，やがて細胞体積の大半を占める巨大液胞へと発達する．このことから液胞は細胞の形の変化を伴う現象に深く関与すると考えられる．我々はこれまでに，液胞の観察系としてAtVam3pとGFPの融合タンパク質を発現するタバコBY-2形質転換細胞BY-GVを確立するとともに，立体再構築・解析ソフトウェアREANT (reconstructor and analyzer of three-dimensional structures) を開発し，液胞の立体構造解析を行なってきた．それにより，細胞分裂時に現れるTVM (tubular structure of vacuolar membrane) や，ミニプロトプラストからの巨大液胞再生過程で出現する網状液胞など，複雑な液胞構造の存在を明らかにしてきた．
本研究では，液胞構造の形成や発達の物理的な制御機構を検討することを目的として，液胞の動きの定量的解析を行なった．そのために，液胞膜の蛍光像や明視野像からの計測に適した動画像解析ソフトウェアを開発した．とくに離散ウェーブレット変換による周波数解析を応用することで，領域抽出などの前処理なしで高効率に液胞の動きを解析できるようになった．その結果，液胞の動きには，細胞周期の進行による時間的変化，細胞内での位置による空間的差異，液胞表層におけるアクチン繊維の局在との相関，といった時間的空間的な制御要因が存在することがわかった.

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青色光による気孔開口時には、孔辺細胞の細胞膜H⁺-ATPase活性上昇を介して膜電位が過分極し、過分極依存的にK⁺が流入する。一方、孔辺細胞には過分極依存性Ca²⁺チャネル活性が存在することが報告されている。しかし青色光により膜電位が過分極した際にCa²⁺チャネルが働いているかどうかは調べられていない。そこで、Ca²⁺結合性発光蛋白質エクオリンを導入したシロイヌナズナから調製した孔辺細胞プロトプラストで青色光による細胞内Ca²⁺濃度変化を測定し、過分極依存的なCa²⁺流入とK⁺チャネルとの関係を調べた。
細胞外Ca²⁺が1mM, K⁺が0.01 mM 以下では、青色光照射後約2分後をピークとするCa²⁺濃度上昇が見られた。このCa²⁺濃度上昇は、Ca²⁺チャネル阻害剤、Ca²⁺キレート剤で抑えられた。また、青色光による細胞膜H⁺-ATPase活性上昇のピークも光照射後約2分後であること、青色光による細胞膜H⁺-ATPase活性上昇がないphot1 phot2二重変異体ではCa²⁺濃度上昇は見られないことから、過分極に依存して細胞内へCa²⁺が流入していることが示唆された。一方、細胞外K⁺濃度が0.1 mM以上では、Ca²⁺濃度上昇は見られなかったが、K⁺チャネル阻害剤存在下では観察された。以上から、孔辺細胞には青色光照射下で過分極依存的にCa²⁺が細胞内に流入する活性はあるが、生理条件ではK⁺流入が優先していることが分かった。

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気孔は青色光に反応して開口するが、この時、青色光は孔辺細胞の青色光受容体フォトトロピンに受容され、細胞膜H⁺-ATPaseを活性化して気孔開口の駆動力を形成する。これまでの研究により、孔辺細胞の細胞膜H⁺-ATPaseはC末端スレオニン残基のリン酸化とリン酸化部位への14-3-3蛋白質の結合により活性化されることが明らかとなっているが、このリン酸化反応に関わるプロテインキナーゼやホスファターゼの特質は不明である。本研究では、ソラマメ孔辺細胞を材料として、細胞膜H⁺-ATPaseのin vitroでのリン酸化反応の解析を行った。その結果、細胞膜H⁺-ATPaseは単離したミクロゾーム画分においてATPに依存してリン酸化され、この反応はキナーゼ阻害剤K-252aに非感受性であった。また、脱リン酸化反応もミクロゾーム画分において観察され、この反応はEDTAにより阻害されることが明らかとなった。さらに、これらのリン酸化・脱リン酸化反応は、界面活性剤処理したミクロゾームにおいても観察されることから、プロテインキナーゼやホスファターゼは細胞膜H⁺-ATPaseと複合体を形成している可能性が示唆された。そこで、細胞膜H⁺-ATPase複合体について免疫沈降やゲル濾過による解析を行ったところ、細胞膜H⁺-ATPaseはいくつかの未知蛋白質と複合体を形成していることがわかった。

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