日本放射線影響学会大会講演要旨集
日本放射線影響学会第52回大会
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DNA切断と修復
  • 今道 祥二, 青沼 智一郎, 福田 健二, 奥林 学, 白石 智子, 東海 晃大, 伊藤 哲夫, 納冨 昭弘, 杉浦 紳之, 松本 義久
    セッションID: P1-13
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    Purpose: DNA double-strand breaks (DSBs) are considered the most critical determinant of the fate of the cells or organisms exposed to radiation. DSBs are mainly repaired through homologous recombination (HR) or non-homologous end-joining (NHEJ). DNA-PKcs and XRCC4 are thought to play central roles in NHEJ. The present study aimed to clarify the interrelationships between XRCC4, DNA-PK and ATM, which shows a structural similarity to DNA-PKcs.
    Methods: We used murine leukemia L5178Y-derived, XRCC4-deficient cell line M10 as a host and introduced empty pCMV10 vector (M10-CMV), normal XRCC4 cDNA (M10-XRCC4) and XRCC4 cDNA mutations on the phosphorylation sites by DNA-PK (M10-S2,3A). NU7026, a DNA-PK inhibitor, KU55933, an ATM inhibitor and wortmannin, inhibiting both of DNA-PK and ATM were added to culture media 1hr prior to irradiation at the concentration of 10microM. Nuclear reactor UTR-KINKI or X-ray generator were used as radiation source. Radiosensitivity was evaluated by colony forming ability in media containing 0.16% agarose.
    Results: None of the inhibitors altered the radiosensitivity of M10-CMV cells. On the other hand, all the agents enhanced the radiosensitivity of M10-XRCC4 and M1-S2,3A cells. However, the extent of radiosensitization was greater in M10-XRCC4 than M10-S2,3A and wortmamnnin was more effective than NU7026 and KU55933, which showed similar effects.
    Conclusions: These results collectively suggested that DNA-PK and ATM might complementarily regulate XRCC4 via phosphorylation in DSB repair. The existence of additional phosphorylation site(s) was also indicated.
  • SALEM Amir Mohamed Hussein, NAKANO Toshiaki, TAKUWA Minako, TERATO Hir ...
    セッションID: P1-14
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    Cells exposed to Ionizing radiation, UV light and some chemotherapeutic compounds are prone to the formation of DNA-protein crosslinks (DPCs) in their genome. DPCs are detrimental or even lethal to cells. Recently, we have shown that homologous recombination (HR) and nucleotide excision repair (NER) collaborate to tolerate or repair DPCs. Here we further characterized the repair and tolerance mechanisms of DPCs. We found that the damage tolerance mechanism involving HR and subsequent replication restart (RR) provides the most effective means of cell survival against DPCs. Translesion synthesis does not serve as an alternative damage tolerance mechanism for DPCs in cell survival. Elimination of DPCs from the genome primarily relies on NER, which provides a second and moderately effective means of cell survival against DPCs. Interestingly, Cho rather than UvrC seems to be an effective nuclease for the NER of DPCs. Independently of the repair of DPCs, DNA glycosylases mitigate azaC toxicity, presumably by removing 5-azacytosine or its degradation product from the chromosome. Finally, topA may have a role in the repair of FA-induced DPCs.
  • 野田 朝男, 大峰 秀夫, 平井 裕子, 児玉 喜明, 中村 典
    セッションID: P1-15
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    昨年度の学会では、in vitroで照射後1ヶ月以上培養を続けたヒト2倍体正常細胞において、修復できないDSBに起因すると思われる大きなH2AX/53BP1/ATM foci (IRIFs) が観察されることを報告した。このfociの形成には細胞の増殖活性は関与せず、serum starvationによりG0期とした場合でも、血清入り培地により対数増殖期とした細胞に照射した場合と同様な効率でfociが出現することを明らかとした。従ってアポトーシス抵抗性で長寿命の細胞において、NHEJやS期を介して行われるHRにて修復することができずに残った傷は細胞核内でかなり安定して保持されると考えられた。直せないdsb-fociの出現頻度と細胞の増殖能を指標とした生存率(clonogenic survival)の間には良い相関が見られたことから、これらの傷は細胞死の直接原因になっている可能性がある。修復不可能なdsb由来のfociとしていつまでも細胞に留まり続ける場合は、foci構成因子が通常の直せる傷によるfociとは異なるのではないかと考え、構成蛋白質の解析を行っている。
  • 小西 輝昭, 磯野 真由, 高橋 弘範, 北村 尚, 安田 仲宏, 檜枝 光太郎
    セッションID: P1-16
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    CHO-K1細胞とHeLa細胞を用いて、Braggピーク近傍のFeイオン(0.93 MeV u-1)を照射した。照射は、放斜線医学総合研究所HIMAC内にある中エネルギービーム(MEXP)照射室で行った。致死の主因であるDNA二本鎖切断(DSB)のマーカーと考えられるヒストンタンパク質H2AXのリン酸化(γ-H2AX)を指標に、免疫蛍光染色を行った。確認されたγ-H2AXの蛍光スポット数は細胞核面積と照射フルエンスから計算された平均ヒット数とほぼ一致したことから、イオン通過部位には必ずDSBが誘発されることを確認した。コロニー形成法を用いてFeイオンによる生存率曲線を取得し、致死の作用断面積(σ)を算出した。細胞核面積Aに対して、σはおよそσ/A=0.45程度であり細胞核あたり平均2.2個のイオンがヒットすると致死を誘発したことなる。同様に、C、N、O、Ne、Arイオンについても、最小でσ/Aは0.5を超えることはなかった。DNA二本鎖誘発率およびその修復についても、パルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)法を用いて測定した。その結果1イオン通過によって誘発されたDSB数は20個以上と算出された。そして、照射後6時間培養した試料についても、PFGE法を用いて断片化したDNA量を測定した結果、減少がみられなかったことから修復されていないことがわかった。つまり、細胞核にイオンが通過すると必ずDSBを誘発し、それは修復されない。しかし、致死には2個以上のイオンのヒットが必要という結果を得た。このことから、細胞核は致死に対する感受性が一様でない、または感受性領域が細胞核の約半分のサイズであることが考えられた。
  • 岡田 卓也, 菓子野 元郎, 田野 恵三, 渡邉 正己
    セッションID: P1-17
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    【背景・目的】
    これまでに、我々は、ビタミンCの放射線防護効果に関する研究をおこなってきた。その結果、ビタミンC処理は、放射線による細胞死や染色体異常誘導を抑制しないが突然変異や発がんの発生を効果的に抑制することを明らかにした (Koyama et al. Mutat Res 1998)。しかし、防護効果にこのような差が生ずる理由は明確ではない。そこで、今回、我々は、放射線によって誘導される代表的な損傷のDNA二重鎖切断生成に関してビタミンCが防護効果を示すか否かを調べた。
    【方法】
    本実験には、ヒト正常胎児線維芽様(HE17)細胞を用いた。コンフルエント状態にある細胞にビタミンC(5 mM)またはDMSO(2%) を2時間処理し、X線照射を行った。DNA二重鎖切断部位は、この部位に集積することが知られている53BP1の蛍光免疫染色で可視化した。照射1.8GyのX線を照射し、照射15分、2時間、24時間経過後に形成される核内の53BP1フォーカス数を数え、ビタミンC及びDMSOの処理によりフォーカス数が減少するか否かを検討した。各群200細胞あたりのフォーカス数を数え、その平均値により評価を行った。また同処理による生存率への影響を確認するため、コロニー形成法による生存率試験により、ビタミンCとDMSOの放射線防護効果を調べた。
    【結果】
    未照射群では、いずれの所定時間経過後においてもビタミンC及びDMSO処理による53BP1フォーカス形成への影響はなかった。照射群では、15分後で未処理:37.8個、ビタミンC処理:35.2個、DMSO処理:27.0個の53BP1フォーカスが観測され、照射2時間後では未処理:26.6個、ビタミンC処理:24.8個、DMSO処理:17.0個のフォーカス数を認めた。さらに、照射24時間後では、未処理:4.0個、ビタミンC処理:3.6個、DMSO処理:2.2個のフォーカス数であった。これらの結果は、DMSO処理ではX線照射による53BP1フォーカス形成が抑制されているのに対し、ビタミンC処理ではほとんど抑制されていないことを表している。このことは、DMSOはDNA二重鎖切断生成を抑制するのに対し、ビタミンCは抑制しないことを示唆している。コロニー形成法においても、DMSO処理による致死影響の軽減が見られたのに対し、ビタミンC処理では見られなかった。以上の結果は、ビタミンCがDNA二重鎖切断生成にほとんど影響せず、致死的損傷を軽減しないことを示唆している。
  • 高城 啓一, 畑下 昌範, 久米 恭, 塚田 晃代, 泉 雅子, 風間 祐介, 林 依子, 阿部 知子
    セッションID: P1-18
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    真核生物のゲノムDNAが二重鎖切断 (DSB) を受けたとき、切断部周囲のヒストン2A のサブタイプH2AXはATM、NBS1、DNA PKcs などのプロテインキナーゼによってリン酸化を受ける。したがって、γ-H2AX は核内に生じたDSB の位置と量の指標とすることができる。
    イオンビームの特徴は、エネルギー付与の局所性であり、特に重いイオンに関しては、トラックの周囲に局所的に大きなエネルギーを付与すると考えられている。そのようなビームが核に照射された場合、個々の粒子のトラックに沿ったDSBが生じると予想される。実際、我々を含む幾つかのグループが、重イオンビームを細胞に照射した場合、トラック構造を反映するようなγ-H2AXフォーカスが形成されるという報告を行っている。
    しかしながら、ビームが組織中を通過しエネルギーを失っていくにしたがって、形成されるγ-H2AX フォーカスの形態にいかなる変化を生じるかについては詳しい報告がない。そこで、本報告では培養細胞にプロトン、カーボン、アルゴンなどのビームを照射し、ビームが培養液や細胞中を通過しエネルギーを失うにしたがって、γ-H2AX フォーカスの形態に生じる変化について報告する。
  • 三浦 ゆり, 櫻井 洋子, 遠藤 玉夫
    セッションID: P1-19
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    [目的]タンパク質はリン酸化やアセチル化など様々な翻訳後修飾を受けるが、可逆的な翻訳後修飾のひとつに、O-結合型N-アセチルグルコサミン修飾 (O-GlcNAc化)がある。O-GlcNAc化は多くの核タンパク質や細胞質タンパク質に見られ、タンパク質の局在化、活性化、安定化など種々の機能制御に関与している。また、リン酸化部位などに多く見られることから、リン酸化を介した情報伝達においても重要な役割を担っていることが知られている。しかし、放射線照射により活性化され、種々のシグナル伝達因子をリン酸化するAtaxia-telangiectasia mutated (ATM)に関しては、O-GlcNAc化修飾による機能への影響は明らかではない。演者らは昨年の本学会において、初代培養神経細胞のATMがO-GlcNAc化されていることを明らかにした。そこで本研究では、ATMのO-GlcNAc化とその機能への影響について検討した。
    [方法] マウス胎児大脳皮質より初代培養した神経細胞及びHeLa細胞に5Gy X線を照射した。照射1時間後に細胞分画により核画分を分取し、抗ATM抗体や抗O-GlcNAc化抗体を用いた免疫沈降により、ATMのO-GlcNAc化や種々のタンパク質との相互作用について検討した。
    [結果と考察] 抗ATM抗体や抗O-GlcNAc抗体を用いて免疫沈降し、ウェスタンブロットによってATMがO-GlcNAc化されているかどうかを検討したところ、HeLa細胞のATMもO-GlcNAc化修飾を受けていることが明らかになった。また、抗O-GlcNAc抗体を用いて免疫沈降したところ、ATMに比べてリン酸化ATM(Ser1981)が検出されにくいことから、ATMのSer1981のリン酸化によりO-GlcNAc化修飾が減少する可能性が示唆された。
  • 坂下 奈津美, 田村 雄治, 山本 亮平, 松山 聡, 久保 喜平
    セッションID: P1-20
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    Base excision repair(BER)は、大腸菌から哺乳類に至る多くの生物で保存されている主要なDNA修復経路のひとつである。1ヌクレオチドのみを除去する経路は、Single-nucleotide BER(SN-BER)として知られている。我々は、メチル化塩基損傷やヒポキサンチンなど、プリン塩基に生じた様々な損傷を認識するmethylpurine- DNA glycosylase(MPG)に焦点を当て、ヒトのSN-BERにおけるタンパク質間の相互作用を研究してきた。これまでに、放射性同位体で標識したオリゴヌクレオチド基質を用いた活性試験により、SN-BER経路の下流の酵素が上流の酵素活性を上昇させることを明らかにした。例えば、AP endonuclease 1(APE1)はMPG活性を増強し、DNA PolymeraseβはAPE1活性とMPGの活性の両方を増強した。この活性の増強には、kcat値の増加が見られるため、下流の酵素の存在は反応産物からの解離を促進することが示唆された。また、X-ray repair cross complementing protein 1(XRCC1)は、多くのBER関連タンパク質との相互作用によってタンパク質の安定化に働いており、細胞内に存在するDNA ligase 3α(LIG3α)の約8割と複合体を形成して存在すると考えられている。そこで、組換えXRCC1を作成したところ、XRCC1単独存在下ではMPGのkcat/Kmが最大1.8倍に、APE1の切断活性は最大7.1倍に増加した。このことは、BERの初期段階から、多くのBER関連タンパク質による修復複合体が存在する可能性を示唆する。さらに、SN-BER各段階の活性変化を細かく解明するために、組換えLIG3αを作成し、Lig3α-XRCC1複合体がMPG活性、APE1活性に及ぼす作用を検討中である。
  • 奥田 洋三, 山本 亮平, 松山 聡, 竹中 重雄, 井出 博, 久保 喜平
    セッションID: P1-21
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    塩基除去修復 (BER) は損傷塩基を修復する主要機構の一つとして、様々な生物に保存されている。BERは、特異的なDNA glycosylaseにより損傷塩基が取り除かれ、脱塩基部位 (AP site) を生成する過程に始まる。次に、DNA polymeraseによるDNA合成を経て、DNA ligaseによるDNA鎖の連結で完了する。X-ray repair cross complementing protein 1 (XRCC1) は、DNA ligase IIIだけでなく複数のBER関連タンパク質と物理的に相互作用することが知られており、足場タンパク質としてBER全体に関係していると考えられている。そこで、我々はshRNAを用いてXRCC1 knockdown細胞を作成し、Methyl methanesulfonate (MMS) が誘発するアルキル化塩基損傷の修復動態の検討を行った。まず、psiRNA-hH1GFPzeo G2(InvivoGen)を用いて、ヒトXRCC1塩基配列(NCBI : NM 006297)を標的とするshRNAの発現プラスミドを作製した。作製したshRNA発現プラスミドをリポソーム系トランスフェクション試薬により、ヒト子宮頸癌由来HeLa RC355細胞へ導入し、zeocinによる選別を行った。Western blotting分析によりXRCC1タンパク質量を調べた結果、shRNA発現プラスミド導入細胞では、空ベクターを導入したcontrol細胞のそれの44%まで減少していることが明らかとなった。また、コロニー形成能を指標とするMMS感受性試験では、1.5 mMのMMS濃度でcontrolと比べ、有意な生存率の低下を認めた。さらに、AP siteの定量法であるARP法を用いて、XRCC1 knockdownがMethylpurine DNA glycosylase活性に与える影響を検討する予定である。
  • 傳田 有希, 藤森 良子, 山本 亮平, 松山 聡, 久保 喜平
    セッションID: P1-22
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    DNAは細胞内外の様々な因子によって常に損傷を受けており、多くの修復経路が存在するが、生理的条件下において生み出される塩基損傷の多くは、塩基除去修復(base excision repair; BER)によって修復される。BERは損傷特異的なDNA glycosylaseによって損傷塩基が除去され、脱塩基部位(apurinic/apyrimidinic site; AP site)を形成する過程に始まる。この過程は、それぞれpolymerase β(polβ)とFlap endonuclease 1(Fen1)が強く関与する、short-patch BER(SP-BER)とlong-patch BER(LP-BER)の二つの修復経路へと続く。我々は、DNAの塩基損傷、特にアルキル化損傷に対し、SP-BERとLP-BERがどのように選択されるかを明らかにする目的で、shRNA発現ベクターを用いたRNAi誘導プラスミドを構築し、マウス胎児線維芽細胞(mouse embryonic fibroblast; MEF)に導入し、両遺伝子をそれぞれknockdownした細胞を作製した。タンパク質レベルでのknockdown効率は、polβでは87%、Fen1では92%であった。この細胞に、DNA塩基にアルキル化損傷を引き起こすmethylmethanesulfonate(MMS)を処理し、細胞の生存率を調べたところ、polβ knockdown細胞の方がFen1 knockdown細胞よりも高いMMS感受性を示した。現在、polβ knockdownとFen1 knockdownがアルキル化損傷の修復にどのような影響を与えるかについてARP法を用いて検討し、アルキル化損傷の修復におけるSP-BERとLP-BERの寄与について解明を試みている。
  • 落合 泰史, 志村 勉, 桑原 義和, 山本 和生, 福本 学
    セッションID: P1-23
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    一般的な放射線治療では、正常組織への被ばく影響を軽減するため、分割照射が用いられている。我々はヒト肝がん細胞株HepG2と子宮頚部がん細胞株HeLaを用い、分割照射の放射線応答を解析した結果、0.5 GyのX線を12時間毎に31日間分割照射した細胞株(31分割細胞)では、細胞周期の進行を制御するサイクリン D1が過剰発現していることを明らかにした。サイクリン D1の過剰発現は31分割細胞を, さらに31日間照射を休止した細胞株(31分割-休止細胞)でも安定に維持された。興味深いことに、31分割-休止細胞では、DNA二重鎖切断(DSBs)の指標の一つであるH2AXのリン酸化(γ-H2AX)が観察され、DSBsを持っていることが示唆された。また、γ-H2AXのフォーカスを持つ細胞はDNA合成期の指標であるPCNAで染色されることから、DNA合成期にDSBsが誘導されることが示唆された。
    本研究では長期分割被ばくによるサイクリンD1過剰発現の生物影響について、特にDSBsの誘導に注目し、解析を行なった。31分割-休止細胞にサイクリンD1のsiRNAを導入し、発現を抑制した結果、γ-H2AX の減少が観察された。
    以上より、長期分割被ばくによるサイクリン D1の過剰発現はDNA合成期にDSBsを誘導することを明らかにした。サイクリン D1はがん遺伝子であり、多くの癌細胞で発現亢進が報告されている。サイクリン D1が過剰発現した細胞では、DSBsが形成されることから、ゲノム不安定性を誘導することが考えられる。
  • 藤本 浩子, 小松 賢志, 小林 純也
    セッションID: P1-24
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    DNA二重鎖切断(DSB)の修復には、非相同末端結合と相同組換え(Homologous Recombination:HR)の2つの経路がある。ナイミーヘン症候群(NBS)は放射線感受性やゲノム不安定性などの細胞表現型を示す遺伝病であるが、その原因遺伝子NBS1はDSBのHR修復に必須の因子であることが報告されている。またNBS1はMre11, Rad50と複合体(MRN複合体)を形成し、この複合体はDNA損傷の発見とシグナル伝達、そして修復に関わっている。一方、MRN複合体のパラログであるDeinococcus radiodurans SbcC/SbcD/Xrs2複合体もまた、DNA修復に広く関わっており、アルキル化剤感受性であることが知られている。この事はNBS細胞もアルキル化剤感受性であることを示唆している。
    今回、私はDNAアルキル化剤によるDNAダメージ応答にNBS1が機能するかを明らかにするために、マウスのNBS1ノックアウト細胞とこれにNBS1遺伝子を導入した相補細胞を用いて検討した。その結果DNAアルキル化剤methylmethanesulfonate(MMS)処理した細胞でDSB損傷認識タンパク質とされるリン酸化ヒストンH2AX(γH2AX)とNBS1がフォーカスを形成した。また上記と一致してコロニーアッセイでNBS細胞のMMS高感受性を確認した。これらの結果からNBS1はDNAアルキル化剤MMSによって生じるDNA損傷応答に機能していることが示唆された。現在この機構について解析を行っている。
  • 宇佐美 徳子, 小林 克己, 古澤 佳也, PORCEL Erika, LACOMBE Sandrine, REMITA Hynd, LE ...
    セッションID: P1-25
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    重金属はX線の吸収係数が大きいため、細胞に取り込ませたり、生体分子に結合させたりすることで、放射線作用を増感することができる。がん細胞に重金属を含む薬剤を取り込ませ、がんの放射線治療を効率良く行うアイディアが提唱されている。われわれは、 DNAに結合するプラチナ化合物 Chloroterpiridine platinum (PtTC)を用いて、重金属による放射線増感作用機構を解明する研究を続けている。これまでに、PtTCによる増感作用にはOHラジカルが関与していることがわかり、プラチナ原子より発生した2次電子により、周囲の水分子にラジカルが発生し、DNA損傷および細胞死を効率良く誘発していることが示唆された。
    放射線治療に応用するうえで、細胞内での重金属薬剤の存在形態を知ることは重要である。PtTCは生細胞内においても細胞死を増感させる効果を持つが、細胞内では核に取り込まれず、細胞質に存在することがわかった。最近われわれのグループではさらに効率の良い増感剤の候補として、重金属ナノ粒子について検討を開始した。金属ナノ粒子は、触媒材料や磁性材料などのナノマテリアルとして注目されているが、粒子表面の保護材分子によってその特性を制御することができるので、細胞への取り込みに有利なように改変できる可能性がある。
    γ線ラジオリシスにより作成したポリアクリル酸ナトリウム修飾プラチナナノ粒子を超純水中に分散させたものと、pBR322プラスミドDNA(東洋紡社製)水溶液を混合し、放射線医学総合研究所HIMACにおいて290MeV炭素線、および高エネルギー加速器研究機構フォトンファクトリーBL-27AにおいてプラチナM-III吸収端付近の単色軟X線(2649eVおよび2639eV)を照射した。照射後、アガロースゲル電気泳動法により、DNA一本鎖切断、二重鎖切断の生成効率を調べたところ、PtTCと同程度の増感効果を示した。また、プラチナナノ粒子自身によりDNAに切断を誘発することはなく、生体分子に対する毒性は低いことが確認された。詳細は現在解析中である。
  • 東田 みずき, 白石 一乗, 堀口 亮, 原 正之, 児玉 靖司
    セッションID: P1-26
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    【背景と目的】
    幹細胞は非対称分裂を行うと考えられているが、そのメカニズムの全容は明らかではない。本研究は、幹細胞は選択的染色体分配を行うことで非対称分裂を維持しているという可能性について、神経幹細胞を用いて検証するものである。私たちは、これまでブロモデオキシウリジン(BrdU)で新生DNA鎖をラベルする方法により、マウス脳由来ニューロスフェア形成細胞中には選択的染色体分配を行う細胞が約3%存在するという結果を得ている。そこで、本研究では神経幹細胞の存在割合を濃縮によって高くし、さらに細胞質分裂を止めた2核細胞を対象として選択的染色体分配について解析した。
    【材料と方法】
    ICRマウス胎児から線維芽細胞、また、胎児脳から神経幹細胞を含むニューロスフェア形成細胞を分離して培養系に移した。神経幹細胞を濃縮するために、フィコエリトリン(PE)コンジュゲート抗CD133抗体を用いて染色後、さらに磁性体粒子結合抗PE抗体を用いてCD133陽性細胞を磁性体化した。この磁性体化細胞を磁気カラムを用いて分取して神経幹細胞を濃縮した。次に選択的染色体分配を調べるために、細胞にBrdUを48時間取り込ませて新生DNA鎖をラベルした。その後BrdUを除去し、細胞質分裂阻害剤であるサイトカラシンB存在下で24時間培養して2核細胞を得た。細胞回収後、抗BrdU抗体を用いて蛍光染色し、選択的染色体分配を2核細胞について調べた。
    【結果と考察】
    2核細胞のうち、91%がBrdU陽性細胞であった。さらにBrdU陽性細胞は、2核とも陽性を示す細胞と1つの核だけが陽性を示す細胞の2種類に分類できた。このうち前者はランダムな染色体分配、また、後者は選択的染色体分配の結果を示しており、割合はそれぞれ81%、及び10%であった。一方、対照群であるマウス胎児線維芽細胞では、1つの核だけが陽性を示す2核細胞の割合は0.7%であった。以上の結果は、神経幹細胞において選択的染色体分配が行われているとする前回の結果を強く支持するものである。
  • 田辺 正輝, 鈴木 香那, 白石 一乗, 縄田 寿克, 押村 光雄, 児玉 靖司
    セッションID: P1-27
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    【目的と背景】
    本研究の目的は、放射線被ばくによるゲノム不安定化が如何にして子孫細胞に伝搬されるのか、そのメカニズムを明らかにすることにある。そのために本研究では、放射線によるゲノム不安定化は、ゲノムに刻印された被ばくの記憶を介した染色体間のクロストークによって間接的に放射線被ばくの影響が伝搬されるものであるという仮説について、染色体移入法を用いて実証する。
    【材料と方法】
    ヒト8番染色体を含むマウスA9細胞に4GyのX線を照射後、コルセミド48時間処理によって微小核を得た。微小核細胞を精製後、微小核融合法により被ばくヒト8番染色体をマウスm5S細胞に移入した。移入後20回以上分裂した微小核融合細胞における移入ヒト8番染色体の安定性を、染色体蛍光染色(WCP-FISH)法により解析した。さらに染色体不安定化を示した細胞においては、テロメアとサブテロメアの安定性についてFISH法を用いて調べた。
    【結果と考察】
    被ばくしていないヒト8番染色体を移入した微小核融合細胞では、染色体移入後のヒト染色体の構造異常は見られなかった。このことは染色体移入過程で染色体構造が不安定化することはないこと示している。4Gy被ばくヒト8番染色体を移入した7種の微小核融合細胞について移入染色体の安定性を調べたところ、6種類の染色体異常が高い(98%)割合で生じている細胞が1種みられた。そこでこの高い不安定性を示す細胞について、被ばく8番染色体とマウス染色体による転座の融合部をテロメアFISHで調べたところ、テロメア配列は残っていなかった。このことは、この転座はテロメア融合ではなく、切断端同士の再結合によって形成されたことを意味している。また、サブテロメアFISHによる解析では90%の細胞で短腕シグナルが消失していた。また、残る10%の細胞では、短腕と長腕シグナルがそれぞれ別々の染色体に転座していた。
    これらの結果は、非被ばく染色体と転座を形成しながら、さらに不安定化を加速させる被ばく染色体の性質を示している。
  • 中村 恭介, 加藤 晃弘, 坂本 修一, 小林 純也, 田内 広, 田代 聡, 小松 賢志
    セッションID: P1-28
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    DNA損傷により引き起こされるリン酸化、ユビキチン化などのヒストンH2AXの修飾はDNA修復において非常に重要である。これらの修飾はDNA二重鎖切断(DSB)後に数分の間に起こりNBS1などの相同組換え修復(HRR)に関連する因子の損傷部位への集積を促進する働きがある。しかしながら、H2AX-/-細胞でもHRRで中心的な働きを担うRAD51の局在は正常であることからH2AX以外のヒストン修飾がこの経路に関係していると考えられた。
    我々は電離放射線(IR)照射後にH2AXとは独立的にヒストンH2Bのユビキチン化が増加することを発見し、その修飾がHRR経路に重要であることを明らかにした。さらにRNF20はH2Bのユビキチン化におけるE3リガーゼであり、IR照射後に核内フォーカスを形成し、H2Bのユビキチン化を増加させることでDSB部位のresectionを促進し、ヒストンをクロマチン画分から遊離することに重要であることも明らかにした。驚くべきことに、RNF20の発現抑制、またはH2Bのユビキチン化部位の変異によりIR照射後のBRCA1、RAD51のフォーカス形成を阻害できた。これらの実験結果と一致するようにRNF20のノックダウン細胞ではIR照射後のRAD51のクロマチン画分への集積が減少し、SCneo コンストラクトを用いた実験によりHRR頻度の低下も確認された。さらにRNF20の発現を抑制した細胞では、野生型細胞と比較してマイトマイシンC、IRへの感受性を示した。
DNA修復酵素
  • 橋本 光正, 松井 理, 高田 尊信, 友杉 直久, 石垣 靖人, 岩淵 邦芳
    セッションID: P1-29
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    細胞への電離放射線の照射は、DNA二本鎖切断(double strand breaks: DSBs)を発生させる。真核細胞では、DSBsに応答して様々な蛋白質が誘導、活性化される。DSBsに対する応答において、毛細血管拡張性運動失調症(ataxia telangiectasia)の原因遺伝子産物であるリン酸化酵素ATMが中心的な役割を果たしている。ATMはリン酸化を介して、Nbs1、53BP1、p53など、DNA修復、細胞周期チェックポイント、アポトーシスに関わる数多くの標的蛋白質を活性化することが知られているが、ATMの標的蛋白質の中には、未同定のものが存在すると予想される。我々は、X線照射前後の蛋白質を2次元電気泳動で展開し、網羅的に解析することにより、未知のATM標的蛋白質を同定することを試みている。2次元電気泳動で展開した蛋白質はビニル膜に転移させた後、これまで報告されているリン酸化特異的抗体(自己リン酸化ATM、リン酸化Nbs1、リン酸化53BP1などに対する抗体)を用いてウエスタンブロットを行った。これまでに、X線照射後にのみ抗リン酸化ATM抗体に交差反応する蛋白質を1種見出しており、現在この蛋白質の同定を進めている。さらに最近、DSBsの発生に応答して様々の蛋白質がユビキチン化されることも明らかになってきていることから、抗ユビキチン化蛋白質に対する抗体を用いた解析も行っている。2次元電気泳動を用いたDNA二重鎖切断応答の解析結果について報告する。
  • 片渕 淳, 佐々 彰, GRUZ Petr, 藤本 浩文, 益谷 央豪, 花岡 文雄, 能美 健彦
    セッションID: P1-30
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    DNAの酸化と同様に、その前駆体であるヌクレオチドプール中のdNTPも酸化されうる。酸化dNTPはDNAポリメラーゼによってゲノムDNAに取り込まれうる。我々はこれまでに、酸化dNTPの取り込みにおけるYファミリーDNAポリメラーゼの関与を示唆してきた。本研究では、ヒトポリメラーゼκ (hPolκ)及びη (hPolη)の酸化ヌクレオチドの一つである8-oxo-dGTPの取り込みの特異性に影響を及ぼすアミノ酸について調べた。hPolκは、8-oxo-dGTPをdA、もしくはdCの向かいに11:1の割合で取り込む。ところが、hPolκのY112をアラニンへ置換すると、その比は1:1になった。Y112はrNTPの2'-OHの判別を行うことが示されていることから、8-oxo-dGTPがdAと対合するときに、糖部分に作用することによって8-oxo-dGTPがsyn型の分子構造を取るよう促し、dAとの対合を安定化させていると推測された。一方hPolηでは、hPolκのY112に対応するF18の置換はこの特異性に影響を与えなかった。しかし、Polηに特有のアミノ酸部位であるR61の置換した場合、野生型の8-oxo-dGTP取り込み活性の比がdA:dC = 660:1であるのに対し、R61Aでは63:1となり、さらにR61Kでは7:1となった。既報の酵母Polηの結晶構造を基に、活性部位に8-oxo-dGTPを挿入した分子構造モデルを作成したところ、8-oxo-dGTPがsyn型ではR61の影響を受けないが、anti型ではC8の酸素とR61の干渉により、8-oxo-dGTPの取り込みが阻害される可能性が示唆された。以上から、8-oxo-dGTPを取り込む際の特異性に重要な影響を与えるアミノ酸はhPolκとhPolηにおいてそれぞれ異なると考えられる。
  • 高瀬 信宏, 平山 亮一, 上野 瑞己, 古澤 佳也, 岡安 隆一, 村山 千恵子, 伊藤 敦
    セッションID: P1-31
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    【背景・目的】一般に重粒子線の作用機構では直接作用が重要で、間接作用の寄与は小さいとされている。しかし我々は、重粒子線照射細胞においても間接作用による代表的なDNA損傷、8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-OHdG)が有意に検出される事及び同一LETにおける粒子種による生成量の相異がある事から、高LETでも間接作用の寄与が無視できないことを明らかにした(2007年度本大会)。また細胞内8-OHdGの生成分布の観察に免疫染色が有効である事も報告した(2008年度本大会)。本研究では上記の粒子種による生成量の相異の原因を間接作用の粒子トラック近傍での広がりの観点から明らかにするため、8-OHdG生成分布のLET依存性とその検出限界を検討した。
    【材料・方法】ヒト肺癌由来細胞A549をカバーガラス上に培養し試料とした。放医研HIMACにより供給された炭素線(LET 13keV/μm)、鉄線(同440keV/μm)及び58kVpX線照射は8-OHdGの修復を抑制するため、2°C下で行った。線量は0.2~50Gyの範囲で照射した。試料は固定後、希塩酸により抗原賦活化処理し、FITC標識抗8-OH-Gua抗体(Kamiya Biomedical Co., USA)で染色した。また同時に陽性対照としてフェントン反応処理した試料を染色した。
    【結果・考察】炭素線照射された細胞内8-OHdGは5Gyにおいて有意に観察され、その生成分布は細胞核全域にわたり均一であった。同じくX線誘発された細胞内8-OHdGも均一な分布を示した。この両者に違いはなかった。一方、鉄線照射された細胞内8-OHdGは5Gyで有意に観察されたが、全体の蛍光強度は炭素及びX線に比べ弱く、また生成分布は若干不均一にもみえた。現在、炭素線と鉄線以外のLET条件についても検討を行っている。
  • 三家本 隆宏, 豊島 めぐみ, 習 陽, 本田 浩章, 濱崎 幹也, 楠 洋一郎, 神谷 研二
    セッションID: P1-32
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    放射線や化学物質はDNAに損傷を与え、点突然変異を誘発する。そして点突然変異の積み重ねは最終的に細胞のがん化を引き起こす可能性がある。点突然変異を誘発するものとして、近年DNA修復機構の1つである損傷乗り越え合成(TLS)が注目されている。TLSとは、DNA上の損傷部位で停止してしまったDNA合成ポリメラーゼに代わって、特別なポリメラーゼがDNA合成を続けることで細胞の危機的状態を回避する機構である。しかしTLSに関わるポリメラーゼは「誤りがちなポリメラーゼ」と呼ばれ、誤った合成を行ってしまうことがある。
    損傷乗越えポリメラーゼには様々な種類が存在する。我々はその中でも中心的な役割をすると考えられているRev1に焦点を当てて研究を行っている。Rev1はYファミリーに属するポリメラーゼの1つとして発見され、バクテリアからヒトまで広く保存されている。Rev1は損傷部位を鋳型にCの塩基を挿入し、脱塩基部位などを効率よく乗り越えることができるが、結果として間違った合成を行ってしまうことがある。そのため、Rev1を中心に機能するTLSは点突然変異を誘発すると考えられる。Rev1については生化学的研究を中心にその機能の解析が進められているが、個体レベルでの研究報告は少ない。
    本研究はRev1を過剰発現させたトランスジェニックマウスを用いて個体レベルで放射線応答にRev1がどの程度影響するのかを調べたものである。放射線応答の指標としてT細胞受容体変異頻度および末梢血微小核出現頻度を測定した。T細胞受容体は放射線などの障害因子に対して高感受性であり、わずかな放射線応答の違いでも測定できる。末梢血微小核は放射線特有の損傷であるDNA二本鎖切断に起因するもので、二本鎖切断の形成や修復に対するRev1の影響を調べた。どちらの実験系でもRev1過剰発現による放射線応答の違いがみられ、Rev1が放射線による突然変異形成の過程に影響していることが示された。また、微小核出現頻度の測定結果からDNA二本鎖切断に対する修復系や細胞周期の制御系への影響が示唆されたため、これらについても検証した。
  • 何 東偉, 小野 哲也
    セッションID: P1-33
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    Mismatch repair (MMR) is the major pathway to improve the fidelity of DNA replication by removing mispairs from newly synthesized DNA. Especially, Msh2 gene is one of the key genes of MMR system. Studies on mice deficient in MMR genes such as Msh2, Mlh1 and Pms2 have shown that they have high levels of spontaneous mutation and high incidence of cancer indicating a close relationship between mutation and cancer. These studies, however, were done on adult mice and never examined at an earlier stage of life. Since DNA replication starts soon after fertilization, we have wondered if the spontaneous mutation increases in early life when the MMR system does not work. Here, we studied mutational burdon in Msh2-KO mice at embryonic and young stage of life. Spontaneous mutation level was judged on lacZ transgene in MutaTM mice missing Msh2 gene. They were created by mating MutaTM and Msh2(+/-) mice. Mutations in Msh2(+/-) were elevated at 9.5 days embryo and increased further till newborn age. Mutation levels in spleen and liver at 2 months of age after birth were similar to the levels at newborn stage. In brain, on the other hand, the mutation level increased continuously in the same period. These age- and tissue-dependencies could be explained by difference in gene expression level of Msh2. Preliminary study on mRNA levels by qRT-PCR seemed to support the idea. We are also examining the malformation frequencies in Msh2-deficient mice. So far, we do not observe any increase, suggesting that high level of somatic mutation might be compatible with normal embryonic development.
  • 柳原 啓見, 森 俊雄, 立石 智, 小林 純也, 小松 賢志
    セッションID: P1-34
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    ナイミーヘン染色体不安定症候群 (NBS) は放射線高感受性、染色体不安定性、高発がん性を特徴とする常染色体劣性の遺伝病である。患者由来細胞は電離放射線に高感受性でありATMに異常を示すAtaxia Telangiectasia細胞とその細胞学的特徴の多くを共有している。NBSの原因遺伝子NBS1はATM依存的に放射線照射後の細胞周期チェックポイントや相同組換え修復(HR)に機能することが知られている。最近の研究により、NBS1はS期の非照射細胞の核内においてフォーカスを形成し、PCNAと共局在することからDNA複製フォーク部位において形成していると考えられている。しかしS期におけるNBS1の機能は不明である。そこでNbs1欠損マウス細胞を用い、紫外線損傷応答におけるNBS1の機能解析を行った。Nbs1欠損マウス細胞は、紫外線に感受性を示し、PCNAのユビキチン化やRad18、pol etaのフォーカス形成に異常を示した。さらにNBS1は紫外線によって誘発されるDNA損傷部位への集積がみられた。これらの結果から、NBS1は複製フォークに存在しHRだけでなく、Rad18を制御し損傷乗越え修復にも関与することにより紫外線損傷応答を促進している可能性が示唆された。
  • 小林 純也, 奥井 理予, CHEN David J, 小松 賢志
    セッションID: P1-35
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    Werner症候群は早老症、高発ガン性を示す常染色体劣性遺伝病として、その原因遺伝子はWRNと同定されている。WRNはゲノム安定性に寄与するRecQヘリカーゼファミリーに属する因子であり、Werner患者由来細胞が様々なDNA損傷に対して高感受性を示すことから、WRNタンパク質はDNA損傷応答で機能することが考えられるが、その詳細はいまだ明らかでない。そのため、我々は様々な種類のDNA損傷応答におけるWRNの役割について、検討を行った。
    多くのDNA損傷因子はDNA損傷部位でフォーカスを形成するが、WRNはγ線照射、カンプトテシン処理により、NBS1依存的にフォーカス形成するのが観察された。また、WRNはNBS1と直接結合することが免疫沈降法で確認され、その結合にはNBS1のFHAドメインを必要とし、WRNのATM依存的リン酸化にも重要であった。WRNタンパク質のDNA損傷依存的なフォーカス形成はG1期には見られず、S期にのみ観察され、S期に有意な修復経路である相同組換え(HR)に機能することが示唆された。しかし、WRNノックダウン細胞ではHR活性は正常レベルを示し、HRの初期過程であるRad51のフォーカス形成もγ線照射後に正常に見られ、WRNはHR修復過程において、必須な因子でないことが示唆された。S期損傷修復に関係した別の機構としては、損傷乗り越えDNA合成 (TLS)があり、その制御因子としてPCNAが知られていので、WRNとのインターラクションを検討すると、DNA損傷がないときには両者の結合が免疫沈降法で確認されたが、DNA損傷発生後には解離がみられ、PCNAのユビキチン化も見られた。また、Werner細胞では、恒常的にE3リガーゼであるRad18とPCNAとの結合及び、PCNAのユビキチン化が観察された。また、DNA損傷依存的なWRNからのPCNAの解離には、ATM/NBS1依存的なWRNのリン酸化・分解が寄与することも示唆された。これらの結果から、WRNはNBS1, ATMと協調することにより、TLSの制御に機能し、TLSを介しての発がんを抑制していることが示唆された。
  • 大原 麻希, 草間 裕介, 田内 広
    セッションID: P1-36
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    電離放射線感受性や細胞周期チェックポイント異常などを示す毛細血管拡張性運動失調症 (AT) に関連するATDC (ataxia telangiectasia group D complementing) 遺伝子は、ATグループD細胞の放射線感受性を相補することからクローニングされた。ATDCは様々な細胞系で異なる転写産物が検出されており、複雑な発現パターンを持つ。また、複数のがん細胞において過剰発現し、腫瘍の増殖関連遺伝子の転写調節に関与することも報告されている。ATDCタンパクにはDNA結合に機能するロイシンジッパーモチーフやジンクフィンガーモチーフなどが存在しているが、具体的な分子機能は明らかではない。我々はATDCタンパクの機能を明らかにするためにATDCの過剰発現または遺伝子ノックアウトからのアプローチを試みている。
    ニワトリDT40細胞を用い、ヒトATDCを過剰発現させて放射線感受性に対する効果を調べたところ、 野生型細胞には影響がなかった一方で、ATMノックアウト細胞では放射線感受性が部分的に相補された。このことから、ATDCはATMの下流でDNA損傷応答に関与している可能性が考えられた。そこで、ATM欠損下でのDNA損傷修復に対するATDCの関与を調べるために、相同組換えレポーターであるSCneoを導入したAT患者由来のヒト繊維芽細胞にATDCを過剰発現させてその効果を解析した。その結果、ヒトAT細胞においてもDT40のATMノックアウト細胞で確認されたようなATDCによる放射線感受性の部分的な相補は見られたが、SCneoレポーターによる部位特異的切断の相同組換え頻度に関しては、ATDC過剰発現による有意な効果が見られなかった。このことから、ATDCは相同組換え修復には直接関与していないと考えられた。さらに、DT40細胞のATDC+/-細胞では明らかな細胞増殖の遅延が見られたことから、ATDCが細胞増殖に関与している可能性が示唆される。
  • 秋山(張) 秋梅, 加藤 悠一, 真田 悠生, 浅井 翔太, 森永 浩伸, 中村 允耶, 橋口 一成
    セッションID: P1-37
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    ゲノムDNAは、種々の内的・外的要因によって絶えず損傷を受けている。多種多様なDNA損傷を除去し、細胞の生存とゲノムの安定性を維持するために、生物はいくつものDNA修復機構を備えている。これらの機構が破綻すると、細胞死の亢進、突然変異や染色体不安定化に伴う異常細胞の出現を促すことになり、癌や老化など個体全体の機能低下・異常を起こす。老化に関連した機能低下は、DNA中の損傷や突然変異の蓄積によって起こされると考えられている。DNA損傷のなかでも、活性酸素によって生じる酸化的塩基損傷は老化との関わりでとくに重要である。酸化ストレスや活性酸素と老化の関連はこれまでにも多くの指摘がなされてきた。しかし、どの生体分子の酸化が老化に関連するのか、どの分子が修復されれば老化の制御につながるのかはまだよく解明されていない。線虫C. elegansは、約千個の細胞からなる多細胞生物で、寿命は平均約25日であり、老化や発生の研究分野で優れたモデル生物として広く利用されている。本研究では、C.elagansを用い、DNA修復をはじめとするゲノム安定性維持に必要な遺伝子の探索とそれらの欠損変異の個体寿命への影響の解析によって、老化に関連する「酸化因子」がDNA塩基の酸化的損傷であることを解明する。しかし、DNA塩基の酸化的損傷に働く塩基除去修復(BER)に関与する酵素は線虫では未だほとんど同定されていない。本研究室で最近同定したUng-1(ウラシルDNAグリコシラーゼ)とNthの遺伝子の欠損変異株の性質、本学会で発表を予定しているAP endonucleaseなどのBER酵素の性質、さらにC.elegansにおける新規の酸化ストレス防御タンパク質(CeOXR)の機能と老化・細胞死制御との関連についての研究結果を合わせて報告する。
  • 山本 亮平, 松山 聡, 井出 博, 山本 和生, 久保 喜平
    セッションID: P1-38
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    恒常的に発生しているDNAピリミジンの酸化損傷は、腫瘍形成の原因となり、その多くはシングルヌクレオチド塩基除去修復(SN-BER)によって修復されると考えられている。SN-BERを開始する酸化ピリミジンDNAグリコシラーゼとして、哺乳類ではendonuclease IIIとendonuclease VIIIのそれぞれのホモログ(Nthl1とNeil1)が知られており、主要な酸化ピリミジン除去活性を担っていると考えられてきた。我々は、マウスの様々な臓器の核内に、1価性の新たな酸化ピリミジンDNAグリコシラーゼ活性の存在を発見した。臓器間の活性比較から、この活性は脾臓、胃、肺など臓器において高い比活性を示すことが明らかとなり、細胞増殖の盛んな細胞内で活発に働いている可能性が考えられた。転写が活発な核内においては、apurinic/apyrimidinic (AP)リアーゼ活性を付随するNthl1やNeil1よりも1価性活性の方が安全と考えられることから、マウスだけでなく他の哺乳類にも本活性が存在すると予想される。マウス、サル、ヒトのゲノムサイズは、それぞれ3.3X109、3.0X109、3.0X109塩基対と大きな違いはない。一方で、それぞれ寿命は3年、30年、90年と大きく異なり、また、寿命の長さに反比例して尿中に排泄されるチミングリコール量は減少すると報告されている(Adelman R. et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA)。寿命の長さによって修復機序は異なり、チミングリコール除去能に差があると考えられる。近年、獣医療の発展により十数年の寿命を持つようになったイヌには、ヒトと同様に多様な種類の腫瘍が報告されている。長い寿命を持つイヌのチミングリコール除去活性は、マウスのそれと比較して、低いことが予想される。今回我々は、イヌ肝臓内の1価性チミングリコールDNAグリコシラーゼの比活性を測定したところ、予想通り、マウスのそれより約33%少なかった。
突然変異ほか
  • 吉原 亮平, 長谷 純宏, 野澤 樹, 滝本 晃一, 鳴海 一成
    セッションID: P1-39
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    放射線は、突然変異育種における変異原として利用されている。しかし、その変異誘発効果を遺伝子レベルで明らかにした研究は、ほとんどない。本研究では、rpsL遺伝子導入シロイヌナズナに炭素イオンビーム(220-MeV C : LET=112 keV/μm)およびガンマ線を照射し、それらの変異誘発効果を遺伝子レベルで明らかにした。シロイヌナズナの乾燥種子に対して照射を行ったところ、220-MeV Cとガンマ線でともに、G:C to A:T transitionおよび >2bp deletion/insertionが主な変異として検出された。また、ガンマ線では、220-MeV Cに比べて−1または−2塩基フレームシフト変異が多い傾向が見られた。本研究結果から、ガンマ線は高等植物内で、220-MeV Cに比べて、サイズの小さな変異を誘発する可能性が示唆された。また、G:C to T:AやA:T to C:G transversionの頻度が上昇しなかったことから、放射線により誘発されるグアニン酸化体の変異誘発に対する寄与は、乾燥種子内では小さいと予測された。我々は、細胞の水分含量および分裂活性の高い実験材料を用いると、水の放射線分解によるラジカル生成やDNA複製時の酸化損傷の取り込みにより、DNA酸化損傷の変異誘発効果が評価できると考え、生育途中のシロイヌナズナ幼植物体にガンマ線照射し、変異解析を行った。ガンマ線により幼植物体内で誘発される変異は、乾燥種子のものと類似しており、G:C to T:AやA:T to C:G transversionの頻度は、上昇しなかった。このことから、高等植物では、放射線誘発変異スペクトルに他の生物種との違いがあることが示唆された。
  • 越 浩一, 山内 一己, 江刺 達也, 柿沼 志津子, 島田 義也, 立花 章
    セッションID: P1-40
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    マウスを用いた実験発がんの結果から、照射時年齢によって発がん頻度が異なることが報告されている。発がん過程には遺伝子突然変異が関与しているとされているため、発がんの照射時年齢依存性が生じる原因の一つとして、放射線誘発突然変異生成頻度が年齢によって異なるという可能性が考えられる。この点を明らかにするために、週齢の異なるマウスにX線を照射し、体細胞突然変異の頻度を検討した。突然変異頻度を検出するマーカーとして、アデニンフォスフォリボシルトランスフェラーゼ(APRT)をコードするAprt遺伝子を用いた。Aprt遺伝子はマウス8番染色体上にあるため、常染色体上の遺伝子に生じる突然変異を解析するのに適しているが、両方の対立遺伝子が正常ホモの場合にはAPRT欠損突然変異頻度は非常に低いため、一方の対立遺伝子を予め遺伝子破壊により機能を欠損させ、正常対立遺伝子を1個だけ持つヘテロ接合体を作成し、実験に用いた。このようなAprtヘテロ接合性マウスの1週齢あるいは7週齢の時にX線を照射し、照射後8週目に脾臓を摘出し、リンパ球を分離して、コンカナバリンAと組換えIL-2を加えた培地でTリンパ球を培養し、これに8アザアデニンを加えることによって、APRT欠損突然変異体を選択した。X線照射は、1Gy1回照射、4Gy1回照射、1Gy4回照射、で行った。また、雄と雌とを分けて解析し、性差についても検討した。突然変異頻度は、個々の照射条件によって少しずつ傾向が異なるため、一概に言えないが、1週齢で照射したマウスの方がX線照射によって突然変異頻度の明らかな上昇が観察され、7週齢照射マウスでは突然変異頻度の上昇はほとんど見られなかった。これらのことは、若齢期照射の方が放射線誘発突然変異生成に感受性が高いことを示唆しているものと考えられ、放射線誘発がんの年齢依存性に何らかの関与をしているのではないかと推測される。
  • 鶴岡 千鶴, 鈴木 雅雄, 劉 翠華, 古澤 佳也, 安西 和紀, 岡安 隆一
    セッションID: P1-41
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    【目的】高LET放射線における生物効果はX線やγ線の様な電磁波放射線に比べ大きく、生物学的効果比(RBE)は100~200 keV/µm付近で最大になると言われている。本研究では、X線及び鉄イオンにおけるhprt遺伝子座を標的とした突然変異誘発頻度及び、突然変異クローンにおけるhprt遺伝子座のエクソン領域での欠失のサイズを調べることにより、放射線の線質が異なることによる突然変異誘発の量的・質的の違いを明らかにすることを目的とした。
    【方法】ヒト胎児皮膚由来正常細胞に放射線医学総合研究所・重粒子線がん治療装置(HIMAC)で加速された500 MeV/n鉄イオン(LET:200~400 keV/µm)及びX線(200kV、20mA)を照射し、hprt遺伝子座を標的とした突然変異誘発頻度を6-チオグアニン耐性クローンを検出することにより算出した。また、誘発突然変異クローンを単離し、ゲノムDNAを抽出した後hprt遺伝子座の9エクソン領域を多重PCR法により増幅し、エクソン領域の欠失を調べた。
    【結果】X線に対するRBEは200~260 keV/µmの鉄イオンでは1以上だった。しかし300~400 keV/µmの高LET領域の鉄イオンではRBEは約1となりX線と同じ生物効果を示した。この結果より、LETの増加と共に突然変異誘発頻度はX線と同様になることが判った。また、X線(1.5~2.4Gy)と260 keV/µmの鉄イオン(0.2~0.8Gy)に対するhprt遺伝子座のエクソン領域の欠失のおこり具合は、鉄イオンにより誘発した突然変異の約70%が9エクソン領域全てに欠失をおこしているtotal deletionだったのに対し、X線で誘発した突然変異は9エクソン領域のうち一つまたはそれ以上のエクソンが一カ所だけ欠失しているpartial deletionの割合が約70%を占めた。以上の結果より、突然変異誘発頻度が同程度であっても、放射線の線質が異なると突然変異を誘発するDNAレベルの損傷に質的な違いが生じていることが明確に示された。
  • 縄田 寿克, 田野 恵三, 久郷 裕之, 押村 光雄, 渡邉 正己
    セッションID: P1-42
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    染色体異数化(染色体数の異常)は90%の固形癌、75%の造血系腫瘍において生じており、100年前からがんの共通した特徴として認識されていた。がんにおける染色体異数化の役割について1世紀近く議論がされつづけているが、染色体異数化が発がんの原因なのか、結果なのかは未だ明らかとなっていない。そこで我々は発がん過程における染色体異数化の役割を調べることとした。
    本研究では、2倍体細胞を人工的に染色体異数化した細胞を用いて、自然発生、中心体異常、染色体分配関連遺伝子異常、その他どんな現象が原因にせよ、最終的に生じる「染色体の異数化」が細胞の形質にどのような影響をもたらすのかを調べた。そこでまず初めに、2倍体細胞である不死化ヒト間葉系幹細胞に染色体導入技術によって人工的に特定の染色体を異数化した細胞を用いて、突然変異率、足場非依存性増殖能、微小核生成頻度を調べた結果を報告する。また、有限寿命である胎児由来正常ヒト2倍体細胞に対しても、染色体導入技術によって人工的に特定の染色体を異数化することに成功した。この細胞においても不死化ヒト間葉系幹細胞と同様の試験をおこなった結果を報告したい。
  • 濱崎 幹也, 今井 一枝, 小山 和章, 林 奉権, 中地 敬, 楠 洋一郎
    セッションID: P1-43
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    【目的】放射線誘発ゲノム不安定性の原因のひとつに持続的な炎症(炎症性サイトカインレベルの上昇)が考えられている。本研究では、造血系における炎症とゲノム不安定性との関わりを生体内にて明らかにするため、長期的な持続炎症が生じる移植片対宿主病(GVHD)と、炎症誘発物質Poly(I:C)投与により惹起する急性炎症の二つのモデルを用い、マウス末梢血中の炎症性サイトカインや小核網状赤血球の頻度を調べた。
    【方法】(C57BL/6 x DBA/2) F1 (BDF1) および (BALB/c x C57BL/6) F1 (CBF1) に、親マウス の脾細胞とリンパ節細胞を尾静脈より移植してGVHDを誘導した。移植後40日目の末梢血中の小核網状赤血球頻度および炎症性サイトカインを、それぞれCD71/CD61/PI三重染色およびサイトカイン抗体ビーズアレイを用いたフローサイトメトリーにて測定した。またC57BL/6、BALB/c マウスに種々の量のPoly(I:C)投与による急性効果についても同様の測定を行った。
    【結果】BDF1ならびに CBF1に親マウスC57BL/6から移植を行った場合のGVHDにおいて、小核網状赤血球の頻度は、コントロールマウスに比べていずれも有意に高値を示した(それぞれp=0.001、p=0.015)。ところが、他の親マウスから移植を行った場合には、小核頻度の有意な増加は認められなかった。また、C57BL/6からの移植によるTNF-αレベルの上昇は他の親マウスからの移植に比べてより顕著であり、小核網状赤血球頻度と正の相関(それぞれr=0.48、r=0.67)を示した。Poly(I:C)投与により急性炎症を誘導したマウスでは、投与量に依存した炎症性サイトカイン、特にTNF-αレベル、および小核網状赤血球頻度の上昇が観察され、マウス系統による投与量依存性の差が確認された。
    【結論】本研究の結果、TNF-αレベルの上昇を伴う炎症がゲノム不安定性に関わるということが示唆された。またゲノム不安定性に対する炎症の効果には系統差があることも明らかになった。
  • 藤井 義大, 加藤 宝光, 岡安 隆一, 藤森 亮, 宮川 清
    セッションID: P1-44
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    BrdUやIdUなどのようなハロゲン化ピリミジンのX線における放射線増感効果に関しては多くの報告がなされてきたが、治療で使われて、難治性のがんに対しても良好な治療成績を残している炭素線や宇宙線の鉄線などのような高LET放射線におけるBrdUの効果についての報告はあまり多くない。そこで、今回私たちは重粒子線である炭素線と鉄線におけるBrdUの放射線増感効果をX線と比較して調べた。増感効果はBrdUを一周、二周取り込ませたG1期に同調したCHO細胞を用いて調べた。放射線照射後、細胞致死をコロニー形成法、DNA二本鎖切断生成、修復効率をγH2AX法で調べ、また染色体異常を観察した。その結果、BrdUの取り込みが多いほうが全ての場合、増感作用を導くが、LETが高くになるにしたがって、その増感効果は小さくなっていった。この結果から、ハロゲン化ピリミジンは、その取り込みによって、放射線照射の際、高LET放射線で作られるような複雑な損傷を作る可能性があると考えられ、すでに複雑な損傷が作られる高LET放射線では、その効果が小さいと考えられた。
  • 江口 清美, 宇佐美 徳子, 前澤 博, 小林 克己
    セッションID: P1-45
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    我々は、リンK殻共鳴内殻電離を生じるエネルギーのX線では通常のX線に比べて致死効果が高いこと、およびほ乳類細胞に生じる染色体切断が、細胞内で修復されにくいことを示すデータを得たことを受け、DNA二重鎖切断修復欠損細胞を用いて致死効果を調べたところ、相同組換え修復欠損、非相同末端結合修復欠損ともに野生株とほとんど差のない反応を示す結果を得て、第45回影響学会で報告した。内殻電離により修復されにくいDNA損傷ができるのであれば、もともと修復に欠損のある細胞では通常のX線の場合との致死効果の違いは正常細胞より小さくなるはずであり、実際に中性子線や重粒子線では差が小さくなると報告されている。そこで今年度はこのリンK殻内殻電離により生じるDNA2重鎖切断生成と修復を調べる目的でgamma-H2AXの量を測定した。
    KEK物構研・放射光BL-27AポートにおいてリンK殻共鳴エネルギー(2.153 keV)およびその低エネルギー側(2.146 keV)をL5178Y細胞に照射し、20分間37度Cで培養した後のgamma-H2AX量をフローサイトメトリーにて測定した。リンK殻共鳴エネルギー(2.153 keV)を照射した場合は低エネルギー側(2.146 keV)の約1.5倍のgamma-H2AXが存在した。これは致死効果における場合とほぼ同等の割合であった。
  • 大野 みずき, 作見 邦彦, 古市 正人, 續 輝久, 中別府 雄作
    セッションID: P1-46
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    生体への放射線照射により細胞内では様々な活性酸素種が生じることが知られている。活性酸素は種々の細胞成分を酸化することから、放射線障害の間接作用の主要な原因と考えられている。私たちは特に遺伝情報を担う核酸の酸化とその修復機構に注目して研究を行っている。これまでに私たちはグアニンの酸化体である8-オキソグアニン(8-oxoG)がほ乳類ゲノムにおいて塩基置換や染色体組換えの主要な原因であることを示唆する結果を得ている。今回は継世代的影響を明らかにする目的で、8-oxoG の修復に関与するマウスの3つの遺伝子(Ogg1, Mth1, Mutyh)の生殖細胞中での発現やそれらの欠損による影響を解析した。それぞれの遺伝子は精巣の減数分裂期の細胞で高い発現を示した。また、遺伝子欠損マウス由来の細胞では染色体数の異常や姉妹染分体の早期分離が見られた。さらに3つの遺伝子を全て欠損した変異マウス系統ではがんや遺伝性の先天性異常が多発したことから、8-oxoGの生殖細胞ゲノムへの蓄積が突然変異頻度を上昇させ、継世代変異の原因となることが示唆された。
  • 織田 康敬, 畑下 昌範, 畑中 彬良, 内田 博之, 沖 昌也
    セッションID: P1-47
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
    会議録・要旨集 フリー
    我々は出芽酵母 S. cerevisiaeをモデル生物として用い、二種類の異なる放射線による生体内への影響を解析した。放射線はカーボンビームとプロトンビームの二種類を、照射株には全遺伝子配列決定がされている S288C 株を用いた。放射線量と生存率の関係の解析を行ったところ、カーボンビームでは50Gy の照射で生存率が 10% 以下になり、プロトンビームでは300Gy の照射で生存率が 10% 以下になった。興味深いことに、カーボンビーム、プロトンビームともそれぞれ更に 2000Gy、1000Gy の高線量を照射しても、生存率が 0% にならず、ある一定量の線量を超えると生存率は低下せず、横ばい状態が続くことが明らかとなった。更に、2000Gy のカーボンビーム照射で生育した酵母株に、300Gy のカーボンビームを照射したところ、野性株に比べ生存率が8~10倍上昇し、これら生存率が上昇した酵母にもう一度照射すると更に生存率が上昇した。これらの結果より、高線量照射でも生育する酵母株は放射線耐性を獲得していることが示唆された。そこで、放射線耐性酵母の特異性の有無を解析するため、シングルコロニー分離を行い、個々の酵母株に関して同様の表現型が見られるか解析した。具体的には、増殖速度、高温感受性、低温感受性、 MMS、Bleomycin 等の様々な薬剤に対する感受性、顕微鏡観察による形態異常、チェックポイント異常による細胞周期の変化等を解析した。また、2次元電気泳動法による、発現タンパク質の違い、パルスフィールド電気泳動を用いた染色体の異常等も解析したので合わせて報告する。
  • 大嶌 麻妃子, 吉村 友希, 中野 敏彰, 井出 博
    セッションID: P1-48
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
    会議録・要旨集 フリー
    アルデヒド化合物は、ゲノムにDNA-タンパク質クロスリンク損傷(DPC)を高頻度に誘発することが知られている。また、同時にDNA鎖間や鎖内の架橋、DNA鎖切断、塩基修飾なども誘発することがin vitroおよびin vivo で示されている。しかしながら、これらの損傷がゲノムにどの程度誘発され、生じた損傷がそれぞれどの程度細胞致死に寄与しているかは明らかにされていない。本研究では、アルデヒド化合物が誘発するDNA損傷を定量・比較することにより、誘発された個々のタイプのDNA損傷がどの程度細胞の致死に寄与しているかを明らかにすることを目的とする。アルデヒド化合物としては、formaldehyde (FA), trans-2-pentenal (PEN), crotonaldehyde (CRA), glutaraldehyde (GA), acrolein (ACR), chloroacetaldehyde (CAA)を用いた。まず、HeLa細胞を用いて、アルデヒド化合物の致死効果を検討した。コロニー形成法を用いた生存率アッセイから、10%生存率を与える濃度は、FA (220μM), PEN (200μM), CRA (105μM), GA (22μM), ACR (17.5μM), CAA(10.5μM)であることが示された。個々のタイプのDNA損傷の細胞致死への寄与を調べるため、10%生存率を与える濃度でHeLa細胞を処理し、密度勾配超遠心法でゲノムDNAを精製した。DPC損傷は、ウェスタンブロット法で定量した。FA, PEN, GAは高い効率でDPC損傷を誘発したが、ACR, CRA, CAAのDPC損傷誘発効率は低かった。DNA鎖切断、鎖間架橋についても損傷を定量し、これらの結果についても合わせて報告する。
放射線治療・修飾
  • 須堯 綾, 辻 厚至, 須藤 仁美, 曽川 千鶴, 宮原 信幸, 小泉 満, 原田 良信, 佐賀 恒夫
    セッションID: P2-49
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    悪性中皮腫は、主にアスベストばく露に起因し中皮から発生する予後不良な腫瘍で、病理学的に上皮型(約60%)、肉腫型(約20%)、混合型(約20%)に分類される。患者数は少ないが、過去のアスベスト使用量の推移から、今後患者の増加が予測されている。中皮腫の治療は、手術、抗がん剤、放射線治療を組み合わせて行われているが、放射線治療の効果は低く、改善が求められている。重粒子線は、X線に比べ、生物効果が高く、腫瘍に線量を集中できるため、中皮腫治療への応用が期待される。そこで、中皮腫モデルマウスでの重粒子線の腫瘍抑制効果を検討するとともに、治療効果を早期に画像診断できるかどうか検討を行った。
    ヒト中皮腫細胞株をヌードマウスの大腿部皮下に移植し、上皮型と肉腫型のモデルマウスを作成し、炭素線(290MeV/u, 6-cm SOBP)を2-30GyまたはX線(200kVp, 20mA)を5-60Gy照射した。炭素線30GyおよびX線60Gy照射群では、上皮型、肉腫型ともに、照射2週間後まで腫瘍サイズは増加するが、その後縮小に転じ、約30日で完全に消失し、再増殖は観察されなかった。病理解析より、照射後7日程度から細胞死が観察され始め、14日後以降では、線維化が生じ、細胞密度が低下した。治療効果の早期画像診断の検討のために、炭素線30GyとX線60Gy照射後の3H-FLTと14C-FDGの腫瘍集積性の経時変化を検討した。上皮型では、重粒子線、X線ともにFLTの集積が照射3時間後と1日後で照射前に比べ低下した。肉腫型では、重粒子線ではFLTの取込はほとんど変化しなかったが、X線ではFLTの集積は3時間以降減少した。FDGの集積は、線質、腫瘍の組織型に関わらず治療効果とは相関しなかった。
    炭素線では、X線の半分の線量で治療効果が認められ、臨床への応用が期待される。治療効果の画像診断は、上皮型ではFLTによる早期診断の可能性が示されたが、肉腫型では、FLT、FDGともに正確な評価は困難であり、さらなる検討の必要性が示唆された。
  • 柴 宏博, 高橋 賢次, 細川 洋一郎, 柏倉 幾郎
    セッションID: P2-50
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    【目的】最近になって知られてきた細菌の働きの中に、細菌自身の密度を感知して菌外毒素を放出するクオラムセンシング (Quorum-Sensing) といわれる細菌間の情報伝達機構がある。この情報伝達機構は細菌自己誘導ホルモン様物質autoinducer (AI) によってコントロールされている。このメカニズムを利用して、AI阻害剤による細菌増殖制御研究は活発化してきている。一方で、AIを含めたこれら化合物のヒト細胞に対する作用の詳細は不明である。本研究では、合成された96種類の緑膿菌クオラムセンシングの撹乱化合物の新たな可能性を検討する目的で、ヒト口腔癌細胞SAS及びCa9-22に対する増殖抑制作用と放射線増感作用の可能性について検討した。
    【方法】緑膿菌クオラムセンシングの撹乱化合物は大塚化学より供与された。化合物の作用はヒト口腔癌細胞中の舌癌細胞(SAS)と歯肉癌細胞(Ca9-22)の液体培養及びPlasma clot法を用いて行った。放射線増感作用は化合物を添加したSAS及びCa9-22にX線照射(150kv 20mA 0.3 mmCu+ 0.5 mmAl)90~100 cGy/minの線量率で検討した。
    【結果と考察】実験に用いた96種類の化合物のうち、いくつかの化合物SAS及びCa9-22の増殖を有意に抑制した。50%抑制率(IC50)は、SASにおいて、1.5~3.5 μg/ml、Ca9-22において、2.2~5.4 μg/mlとなり、いずれの細胞に対しても同程度の抑制作用を示した。放射線増感作用について、SASに2GyのX線照射前抑制効果がある一種の化合物を1 μg/ml添加したところ、コントロールより20~35%の増感効果が認められた。現在化合物の構造活性相関及び増殖抑制の作用機構について、検討を進めている。
  • VIJAY K. Singh
    セッションID: P2-51
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
    会議録・要旨集 フリー
    Because of ongoing terrorist activity and dissemination of nuclear materials, the possibility of military or civilian personnel being exposed to ionizing radiation is a continuing threat. As yet, no drugs have been approved by the US Food and Drug Administration for treatment of hematopoietic or GI injury from penetrating ionizing radiation. Our research program aims to identify and develop pharmacological radiation countermeasures to prevent, mitigate, and treat the acute radiation syndrome. In light of the logistical realities of likely nuclear disaster scenarios, much of our current focus is on drug candidates with extremely low toxicity and ease of administration, suitable for use outside the clinic without physician supervision. Several promising radiation countermeasures are currently in various stages of development. Among the efficacious drugs, CBLB502 (truncated flagellin, a toll-like receptor-5 agonist and NF-kB activator), the steroid 5-AED (5-androstenediol), CBLB612 and CBLB613 (synthetic lipopeptides triggering activation of NF-kB through TLR2 receptor complexes), and tocopherol succinate showed radioprotection and radiomitigation activity in mice. 5-AED and CBLB502 were also tested in nonhuman primates (NHP) and found effective. We are investigating the ability of these countermeasures to modulate blood cytokine levels with the objective of identifying cytokines as biomarkers of drug efficacy against radiation damage. Mice and NHP serum/plasma samples from irradiated and drug treated animals were evaluated using multiplex Luminex for quantification of cytokine concentrations. Our results in mice indicate that all radioprotective compounds stimulated G-CSF production. CBLB502 and CBLB612 induced maximum levels of G-CSF within 2-8 h, while the effect of tocopherol succinate was maximal 24 h post-injection. In addition to G-CSF, 5-AED stimulated production of IL-6; CBLB613, CBLB612 and CBLB502 stimulated production of both IL-6 and KC (keratinocyte derived chemokine). The induced cytokine spectrum of CBLB502 and CBLB612 was tested in NHP and found to be very similar to that in mice. In both species, G-CSF, IL-6, and KC levels were correlated with drug dose. The CBLB502 dose dependence of cytokine levels coincided with CBLB502 dose-dependent radioprotection in mice. In conclusion, our results suggest that specific cytokines may serve as biomarkers for efficacy of radiation countermeasures, and may prove useful as a predictor of outcome.
  • 松田 尚樹, ハキム ルクマヌル, 三浦 美和, 里 あゆみ, 吉田 正博, 山内 基弘
    セッションID: P2-52
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    【背景と目的】
    放射線診療や緊急作業などの計画被ばく時における健康リスク低減のために用いることのできる、副作用が少なく局所投与が可能な放射線防護剤の探索を目的として、植物由来抗酸化物質のガンマ線に対する防護効果をヒト表皮細胞を用いて検討した。
    【材料と方法】
    抗酸化物質として、ラジカルの捕捉が期待できるフェノール基、またはカルボキシル基に隣接した二重結合を有する、Caffeic acid(CA)、 Rosmarinic acid(RA)、trans-Cinnamic acid(TCA)、Hydroxy phenyllactic acid(HPA)および p-Coumaric acid(PCA)を用いた。これらの化合物をヒト表皮由来HaCaT細胞の培養液に加え、ガンマ線(Cs-137、1Gy/min)を照射した後、コロニー形成、細胞内酸化状態(CM-H2DCFDAの酸化開裂による蛍光)、およびDNA損傷量(γH2A.Xおよび53BP1陽性フォーカス)を指標として放射線防護効果を検討した。
    【結果と考察】
    5種類の化合物のうち、RA(0.1-1μg/ml)、CA(0.1-1μg/ml)、およびTCA(1-10μg/ml)が4-8Gy照射後の細胞生存率を10%程度回復させた。これらの化合物は、γ線4Gy照射による細胞内酸化状態の上昇を、それぞれ約20%、40%、および30%抑制した。また、ガンマ線1Gy照射15分および6時間後のDNA損傷量も、RA、CA、TCAにより10%-50%の範囲で減少していた。なお、用いた濃度範囲ではいずれの抗酸化物質とも細胞毒性を示さなかった。以上の結果より、植物由来抗酸化物質のうちRA、CA、TCAにはマイルドな放射線防護効果があり、その機構には細胞内に生じた放射線誘導活性酸素種の除去によるDNA損傷の低減があることが裏付けられた。これらの化合物が、細胞内抗酸化分子、あるいはDNA損傷修復分子を積極的に活性化することができればさらに魅力的であり、この点は今後の検討課題である。
  • 横田 裕一郎, 舟山 知夫, 浜田 信行, 坂下 哲哉, 鈴木 芳代, 小林 泰彦
    セッションID: P2-53
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
    会議録・要旨集 フリー
    重イオンビームは線量集中性に優れており、放射線抵抗性のがん細胞にも効果が高いことから、がん治療の有効な手段として期待を集めている。その一方、重イオンビームと薬剤との併用による集学的治療についての研究は少ない。本研究では、がん分子標的治療の潜在的な候補として期待されているテロメラーゼの機能阻害に着目し、テロメラーゼ阻害剤であるMST-312と重イオンビームの併用効果を調べる。【方法】ヒト子宮頸癌由来細胞(HeLa)を照射7日前にシャーレに播き込み、照射3日前に培地を交換し、照射24時間前にMST-312を0-10 μMの最終濃度となるように添加した。炭素イオン(LETは110 keV/μm)あるいは60Coガンマ線を照射した後、細胞を回収し、MST-312非存在下で再播種した。照射から14日後に細胞を固定・染色し、50細胞以上からなるコロニーを生存細胞由来として計数した。【結果と考察】5 μMより高濃度のMST-312を処理したHeLa細胞はコロニーを形成できなかった。1 μMのMST-312の照射前処理により、HeLa細胞の生存率は照射単独群と比べて相加的に低下したが、その程度は、炭素線やガンマ線の線量に依存しなかった。このことから、MST-312と放射線は、それぞれ独立した機序で細胞の生存率を低下させている可能性が考えられた。HeLa細胞の生存率を10%に低下させるために必要な炭素線あるいはガンマ線の線量は、MST-312の併用により、それぞれ1.2 Gyから0.5 Gy、5.4 Gyから4.0 Gyに減らすことができた。今後は、阻害剤の処理と炭素線照射のタイミングを再検討し、がん細胞殺傷効果の相乗的な増強を目指したい。
  • 山下 剛範, 岩佐 正広, 石田 寅夫, 具 然和
    セッションID: P2-54
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
    会議録・要旨集 フリー
    【目的】放射線療法と化学療法は副作用が大きく、免疫力の低下により、死にいたる。本研究では、特に放射線のがん治療時の副作用に対する放射線防護剤としてEnterococcus Faecalis 2001(EF 2001)の有効成分であるβ-glucanの放射線や抗がん剤の防護の有無について実験を行った。
    【方法】200mg/kg-200mg/kgのEF 2001に2週間以上経口投与した。Scc-7がん細胞を右鼠けい部皮下に2×105cellを移植した。2週間後、腫瘍部に放射線6Gy分割照射し、腫瘍成長比と重量を測定することで抗腫瘍効果を測定した。各試料の投与は、実験終了まで行った。また、抗酸化活性も測定した。更に、C57BLマウスを用い、CD4, CD8およびCD16の解析を行なった。
    【結果】抗腫瘍効果ではEF 2001投与により腫瘍の成長が抑制された。抗酸化活性では、各試料投与により、抗酸化作用が確認された。投与群においてCD4, CD8およびCD16が増加した。また、2Gy放射線照射後を見ると、EF 2001投与群でのCD4およびCD8の大幅な増加が見られた。
    【結論】本研究により、EF 2001の有効成分であるβ-glucanによる放射線防護効果が示唆された。β-1,3D-glucan及びβ-1,6D-glucanによって細胞性免疫の活性や腸内免疫活性により、放射線防護作用が考えられる。従って、EF 2001を摂取することでガンの予防効果及び放射線がん治療における免疫増強効果や副作用防止に期待できる。
  • 中山 文明, 梅田 禎子, 萩原 亜紀子, 浅田 眞弘, 鈴木 理, 今村 亨, 明石 真言
    セッションID: P2-55
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    FGF1/FGF2キメラタンパク質を創生し(Imamura et al., Biochim Biophys Acta, 1995)、その至適化分子FGFCがFGF1よりも構造的に安定であることを示してきた。しかも、FGFCは、ヘパリンを加えない単独投与でも、FGF2よりずっと強力に上皮細胞を増殖させたので、in vivoでもより強力な生物学的な活性が期待された。今回、FGFCとFGF1の放射線小腸障害に対する放射線防護効果を比較検討した。方法は、FGFCとFGF1をそれぞれ、BALB/cマウス腹腔内に照射前または後24時間に投与し、8から12Gyのγ線照射後3.5日でクリプトの生存数を数えた。各FGFを照射前に10μgヘパリンと混合投与したところ、FGFCはFGF1よりも同様かわずかにクリプト生存を増加させたが、ヘパリンなしでは著明に増加させることに成功した。一方、照射後24時間で投与した場合、ヘパリンなしではFGF1はクリプト生存を増加させなかったが、FGFCは10、11、12Gy照射でそれを増加させた。このFGFC照射後投与では、クリプトにおけるBrdUの取り込みも増加し、クリプトの深さ、上皮細胞の分化も亢進していた。しかしながら、クリプトにおけるアポトーシスの抑制は、FGFCとFGF1ではほぼ同程度だった。以上の結果から、FGFCはヘパリンの添加なしに強力に上皮細胞の増殖を誘発することで放射線防護効果を発揮することが示され、放射線障害予防のみならず、放射線被ばく後の治療にも有用であることが示された。
  • 劉 翠華, 鈴木 雅雄, 鶴岡 千鶴, 野島 久美恵, 古澤 佳也
    セッションID: P2-56
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    【目的】悪性中皮腫とは、胸腔又は腹腔の内側を覆う膜に悪性がん細胞が形成される病気である。これは1870年にすでに確認され、1960年までには中皮腫とアスベストの関係が明確であることが指摘された。実際80%の中皮腫患者はアスベスト暴露歴や吸入などが原因とされている。潜伏期間は20~40年と言われており、1949年から1979年までアスベストは広範囲で使われていたため、これから悪性胸膜中皮腫患者さんの人数は年々増加し、2020年にはピークに達すると推測されている。悪性中皮腫の進行速度は速く 予後が大変悪い腫瘍の一種であり、生存期間は6~8ヶ月と非常に短い。我々は、ヒト悪性中皮腫細胞に対するX線及び重粒子線の放射線感受性を調べた。更に中皮腫細胞の放射線感受性と染色体数との相関関係について検討を行った。
    【材料と方法】公的な細胞バンクより入手した6種類のヒト悪性中皮腫細胞のM期染色体数を調べた。又はその6種類の中皮腫細胞にX線あるいは炭素線(13keV/µm、80keV/µm)を照射し、照射直後にコロニー法による生存率を調べた。
    【結果と考察】炭素線の二つLETのD10 値およびX線のD10 値をplotした結果はX線のD10値と低LETの炭素線のD10値を直線相関するが、高LETの炭素線のD10値とは指数相関になった。X線のD10値に従って高LETの炭素線のD10 値は緩やかに増加し、高LETの炭素線に対しては、他の部位由来のがん細胞株と同様に放射線感受性が高くなったことが判った。各種類中皮腫細胞の染色体平均数は48~95本と幅の広い分布を取った。異なる中皮腫細胞株間の染色体数に違いがあると共に、一つの細胞株においても幅の広い染色体数の分布を取ることが判った。平均の染色体数に対するX線、炭素線のD10値をplotした結果は、一種類の細胞株を除いていずれの細胞のD10 値も染色体数に依存しないことが判った。以上の結果は、鈴木とSchwartz et al らが報告した、DNAの量あるいは染色体の数と放射線感受性が関係ない、とする研究結果と一致している。
  • 松本 孔貴, 小池 幸子, 鵜澤 玲子, 平山 亮一, 崔 星, 高瀬 信宏, 安藤 興一, 岡安 隆一, 古澤 佳也
    セッションID: P2-57
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
    会議録・要旨集 フリー
    放医研における炭素線治療は4500件を越え、その中で悪性黒色腫(メラノーマ)のように優れた局所制御が得られながら遠隔転移により生存率が低下する例が見られる。今後の放射線治療において転移の制御は重要な課題であり、基礎的に転移に対する放射線の効果を明らかにする必要性がある。高転移能を持つマウスメラノーマ細胞の重粒子線及び光子線に対する感受性を明らかにし、転移抑制効果について検討する。高転移能株としてB16/BL6細胞を用いた。重粒子線は290 MeV/uで加速された炭素線、光子線はX線またはγ線を用いた。<in vitro実験>細胞生存率曲線の結果から、B16/BL6はX線に対して非常に大きな肩を持ち、炭素線のRBEは1.6であった。Wound-healing assayの結果からは、照射により水平方向の遊走能が亢進される傾向が観察された。一方、Boyden chamber assayから、垂直方向の遊走能がX線照射後有意な変化を示さないのに対し、炭素線により抑制される結果が得られた。また、Matrigel invasion assayから、炭素線により浸潤能が抑制される結果が得られた。<in vivo実験>in vivo-in vitro assayを用いて腫瘍内B16/BL6細胞の感受性を求めた結果、腫瘍状態で照射された細胞は炭素線に対しても非常に大きな肩を有し、γ線に対する炭素線のRBEは1.9であった。また、腫瘍増殖遅延解析の結果からは、3.7と非常に大きなRBEが得られた。さらに自然肺転移モデルを用いた実験から、炭素線照射後はγ線に比べより低い線量で顕著な肺転移結節数の減少が観察された。加えて炭素線照射群では、非照射及びγ線照射群に比べて顕著なマウス生存率の延長が見られた。以上の結果から、炭素線などの高LET放射線はγ線やX線などの光子線に比べ有意に転移を抑制する可能性が示唆された。
  • 小池 幸子, 安藤 興一, 鵜澤 玲子, 古澤 佳也, 平山 亮一, 松本 孔貴, 吉田 光明, 岡安 隆一
    セッションID: P2-58
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    目的:ヒト原発腫瘍は他面的に不均一であり、放射線感受性もその1つである。本研究で我々は炭素線RBEに対する腫瘍不均一性の意義について実験的に調べることを目的とし、実験腫瘍を用いて人為的に不均一腫瘍をマウスに移植して調べた。材料・方法:3種類のマウス線維肉腫(#6107、#8697と#9037)を用いた。#6107は炭素線・ガンマ線感受性、#8697は炭素線感受性・ガンマ線中感受性、#9037は炭素線・ガンマ線抵抗性である。肉腫#6107、#8697と#9037細胞を同系C3H雄マウスに移植し、これが生着して成育した腫瘍を摘出して単一細胞浮游液を作製した。適切な混合比率にて2種類の肉腫細胞数を調整し、マウス下肢皮下移植した。腫瘍が7.5-8.0mm径に達した時点で、下肢腫瘍を290MeV/n炭素線またはガンマ線にて1回照射した。腫瘍増殖時間(TG time)を腫瘍毎に調べ、腫瘍増殖遅延時間(TGD time)を計算し、線量―効果関係を求めた。炭素線RBEは対照ガンマ線との比較にて求めた。1線量当たりのマウス数は5匹を用いた。結果:移植時の細胞数混合比を変えて移植し、腫瘍増殖時間を調べた。2種類の混合比を0:100,10:90,50:50,90:10と100:0の5段階に変化させて、3通りの組み合わせで計12種類の腫瘍が得られた。これに照射しTGD timeを求めた。TGD time=15日(等効果線量)よりRBEを求めた。(1)12種類の腫瘍の等効果線量はガンマ線で25から44Gy,炭素線で6.5から25Gyまでの間に分布していた。炭素線RBEは1.7から4.6の間に分布していた。(2) RBEの大きさは腫瘍の炭素線感受性に依存しており、炭素線感受性が高い腫瘍の方が低い腫瘍よりも大きいRBE値を示した。しかしガンマ線感受性はRBEに影響しなかった。(3)炭素線感受性腫瘍2種類(#6107と#8697) を組み合わせると、そのRBE はそれぞれの腫瘍のRBEと同等ないしより大きかった。(4)炭素線感受性と抵抗性の何れの組み合わせでも抵抗性腫瘍よりも大きなRBEとなる。即ち、炭素線感受性(#8697)と抵抗性(#9037)の組み合わせでは感受性腫瘍のRBE とほぼ同等であり、炭素線感受性(#6107)と抵抗性(#9037)の組み合わせでは中間のRBE になる。結論:炭素線RBEは腫瘍の炭素線感受性に依存しているが、ガンマ線感受性とは無関係である。不均一腫瘍のRBEを決定するのは炭素線抵抗性細胞でなく炭素線感受性細胞である。
  • 石原 弘, 田中 泉, 薬丸 晴子, 田中 美香, 石渡 明子, 横地 和子, 柴田 知容, 蜂谷 みさを, 明石 真言
    セッションID: P2-59
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    小腸は放射線に感受性であり、12Gyを大幅に超える高線量放射線による局所もしくは全身被ばくにより、クリプトもしくは微小血管内皮細胞のアポトーシスを介した重篤な障害を受けることが知られている。我々はマウスをモデルとした実験系を使用して、高線量放射線により障害を受けた腸管の再生に寄与する医薬品を検索した。
    頭部~肋骨領域を遮蔽したC3H/Heマウスに、15.7GyのX線(0.53~0.57 Gy/min)を照射して腸管全体を被ばくさせた。その際、概日リズムの影響を抑えるために、各処理群の構成個体が同一の照射時刻となるように設定した。そして、照射の翌日から栄養液および薬剤を10日間連日投与して小腸粘膜における遺伝子発現、組織の状態解析、および生残率から薬効を判定した。照射後1~4日に粘膜組織の再生は見られず、5日後以降BrdU取り込みクリプト組織が急速に拡大した。それに先だって4日後にクリプト組織のマーカーとなるmyb RNA発現レベルが増加した。照射8日後に新生組織で粘膜全体が覆われた個体は体重が増加し、その後28日後まで生存した。薬剤を投与せずに栄養液のみを投与したマウスの生存率は約60%であった。
    種々の医薬品を投与して効果を比較したところ、蛋白同化ステロイドである19-nortestosteroneの投与により腸管粘膜における4日後のmyb RNA発現量、5日後のBrdU取り込み細胞数、ならびに生存率は有意に増加した。一方、卵胞ホルモンであるestradiolは逆の効果を呈し、雄性ホルモン受容体刺激が腸管再生に寄与することが示された。昨年度の本大会では腸管平滑筋弛緩薬の改善効果を報告したが、こうした既存医薬品の複合投与により、放射線被ばくした腸管障害の治療に有用であることが示唆された。
  • 高橋 桃子, 藤森 亮, 岡安 隆一
    セッションID: P2-60
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    近年、化学ならびに放射線療法などの治療に対して抵抗性を示す腫瘍において、幹細胞様の形態を示す癌幹細胞(tumor initiating cell)の存在が実験的に証明されつつある。CD133は脳腫瘍細胞の癌幹細胞で強発現していることが知られており、癌幹細胞のマーカーとして広く認知されているが、その発現機構については不明な点が多い。また、最新の研究からCD133が低酸素状態の脳腫瘍細胞において発現するという報告もなされている(Griguer E. et al, 2007)。筆者らはミトコンドリア機能を欠損させた脳腫瘍細胞を用いてCD133の発現を検討した。
低線量・低線量率
  • 田中 公夫, 香田 淳, 佐藤 健一, 豊川 拓応, 一戸 一晃, 小木曽 洋一
    セッションID: P2-61
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
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    目的:本研究では低線量率(1 mGy/22h/日:0.045 mGy/h)と中線量率(400 mGy/22h/日:18.2 mGy/h)ガンマ線連続照射マウスの二動原体染色体異常頻度に線量と線量率効果があるかを調べるためにガンマ線長期照射を行った。方法:低線量率(1 mGy/22h/日と 20 mGy/22h/日)と中線量率(200 mGy/22h/日と 400 mGy/22h/日)ガンマ線をSPF C3H メスマウスに56日齢から最大615日齢まで連続照射した。リンパ球の染色体分裂像を得るために脾細胞をLPS, ConA, 2-ME存在下で48時間培養した。結果:ギムザ染色法で検出した二動原体染色体異常と環状染色体異常の和の頻度と、FISH法を用いて検出した二動原体染色体異常(Dic by FISH)頻度は、20 mGy/22h/日の低線量率照射では集積線量8000 mGyまでほぼ直線的に増加した。これらの染色体異常頻度の線量効果が直線および線量二乗効果関係と仮定して、直線及び曲線の勾配に相当する1次項の回帰係数の値を年齢補正を加味した重回帰分析にて求めたところ、中線量率から、低線量率まで線量率が低くなるに従い低下し、正の線量率効果が存在することがわかった。この結果は、国際放射線防護委員会(ICRP)が提唱している、1次項の値がDNA修復に非依存であると仮定して線量・線量率効果係数(DDREF)を求める現在の公式に矛盾があることを示している。高線量率照射で生じる異常頻度と比較することにより求めたDDREF値は集積線量により異なるが、100 mGyではDic by FISHを指標とすると5.2という値が得られた。また高線量率(890 mGy/min)と低線量率(20 mGy/22h/day)の線量効果関係曲線の1次項の値の比でとると3.0になった。結論:低線量率放射線照射被ばくの影響評価を行う上で、これらの結果は有益な情報となる。本研究は青森県からの受託事業により得られた成果の一部である。
  • 野村 崇治
    セッションID: P2-62
    発行日: 2009年
    公開日: 2010/02/12
    会議録・要旨集 フリー
    これまで当所では、老化を制御するklotho遺伝子を欠損したヒト早発性老化症候群モデルマウス(以下klothoマウス)に、長期間連続した低線量率ガンマ線(0.63 mGy/h)照射を行うと、顕著に寿命の延長効果が生じることを見出した。さらに種々の臓器で抗酸化機能が亢進することも明らかにした。寿命延長効果の成因には、抗酸化機能の亢進やインスリン抵抗性の亢進など様々な報告が挙げられている。klothoマウスの加速的な老化現象は、糖代謝やカルシウム代謝に関与するklotho遺伝子の欠損である。昨年度、低線量率連続照射による抗酸化機能の亢進と、非照射で減少する血中カルシウム濃度の維持を報告した。今回、さらにklothoマウスの低線量率照射による寿命延長効果の成因を調べるため、血液中の糖濃度・インスリン濃度の変動を測定した。また、照射による酸化ストレス等で生じる炎症についても、そのマーカーの一つであるTNF-alphaの血中濃度の変動を測定した。線源に137Cs(314 GBq)のガンマ線を用いた。メスのklothoマウス28日齢を0.63 mGy/hrの線量率で連続照射を行った。
    klothoマウスのTNF-alpha血中濃度は照射により減少したことから、照射による生体内の炎症の抑制が生じたと考えられる。またklothoマウス照射群の血糖値は低下したが、血中インスリン量の変動はなかった。これに対し非照射対照群では、血糖値は変化しないものの、インスリン量は低下した。これまでの知見から、照射群の抗酸化物質の増強による酸化ストレスの軽減を示唆できる結果となった。
    klothoマウスの寿命延長効果は、今回新たに得られた炎症の抑制と、これまで得た抗酸化機能の亢進、およびカルシウム代謝に関する機能の制御から複合的な効果が寄与したと推察できた。
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