甜菜はアカザ科の植物で、根に高濃度のスクロースとベタインおよびラフィノースを蓄積する。スクロースおよびベタインは葉で合成されるが、それらの合成・輸送・蓄積の制御機構は明らかではない。そこで、今回、幼少期の甜菜における適合溶質、イオンの蓄積・輸送について検討した。甜菜はストレスを加えない条件でもベタインを2～5 μmol/gFW蓄積する。1ヶ月間成育させた甜菜を、第1～4葉、茎、根に分け、各部位における適合溶質およびイオンについて調べた。ベタインはコリンの2段階の酸化反応により葉緑体で生合成されるが、その最初の反応を触媒するコリンモノオキシゲナーゼ（CMO）が律速酵素と考えられている。CMO の発現量を抗体で調べたところ、ストレスを加えないときでもCMO蛋白質は葉で検出された。NaClによる塩ストレスを加えると、各部位でCMOとベタインは著しく増加した。そのとき、Na⁺の蓄積量は増加したが、K⁺はあまり変化しなかった。ポリエチレングリコールによる浸透圧ストレスを加えたときも同様の現象が観測された。アンチセンス法によりCMOの発現を抑えた甜菜の作出を試みている。このような条件下において、スクロース、プロリンの蓄積量およびベタイントランスポーターの発現を調べる予定である。

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多くの高等植物は高塩環境で生育が阻害され、やがて枯死してしまう。生育阻害は、浸透圧上昇による吸水阻害、細胞質におけるNa⁺濃度増加によるK⁺/Na⁺比の減少、あるいは活性酸素の増大により引き起こされると考えられている。植物細胞では細胞質でのNa⁺濃度の上昇を防ぐ機構の一つとして液胞でのNa⁺の隔離がよく知られている。我々は、マングローブ培養細胞、オオムギやシロイヌナズナの根において塩ストレス下における塩蓄積に伴い、細胞内の液胞体積が急速に増大していくことを見出した。またその際、液胞小胞が中心液胞に融合していくことから、液胞への小胞輸送系が液胞の塩蓄積に関与していることが示唆された。
そこで本研究では小胞・液胞動態と液胞へのイオン隔離の関係を明らかにすることを目的として、シロイヌナズナ植物個体とその培養細胞Deep株を用いて実験を進めた。シロイヌナズナ芽生えに塩ストレスをかけると根端の細胞において液胞が増大し酸性小胞の動態も活発化した。また同様に培養細胞Deep株でも液胞の増大が確認され、その液胞にNa⁺が蓄積していることが蛍光色素を用いて観察された。また、その際、液胞まわりにNa⁺の蓄積を示すドット状の蛍光が観察された。今後さらに高塩環境下における小胞輸送、イオン輸送活性、輸送体タンパク質の挙動を解析する予定である。

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ホウ素は高等植物の微量必須元素であるがその生理機能は完全には理解されていない。我々はこれまで、植物細胞中のホウ素は細胞壁に局在し、ペクチン質多糖のラムノガラクツロナンII領域を架橋することで細胞壁超分子構造の構築に寄与することを明らかにした。一方で、ホウ素欠乏による障害や細胞死の発生機作はいまだ明らかでない。そこでタバコ培養細胞のホウ素欠乏応答について検討した。
3日齢のタバコ培養細胞BY-2をホウ素欠除培地で培養すると処理後12時間から原形質凝集を伴う細胞死が観察された。我々はこれまでに低ホウ素馴化細胞で抗酸化酵素遺伝子の発現量が増加することを見出している。そこでホウ素欠乏と酸化障害の関係について検討した結果、欠除処理細胞で活性酸素種と過酸化脂質が蓄積することを確認した。また抗酸化物質ブチルヒドロキシアニソールの添加で細胞死は抑制された。これらの結果はホウ素欠乏で酸化障害が発生し、それが直接の原因で細胞が死に至ることを示す。この細胞死過程においてプログラム細胞死の特徴は観察されなかった。またすでに死細胞が顕在化している処理開始18時間後でも、ホウ素を再添加すると以後の細胞死は直ちに抑制された。従ってホウ素欠乏による細胞死は酸化障害によるネクローシスであると結論した。現在、ホウ素欠乏で酸化障害が発生するメカニズムを解明するため欠除処理に対する初期応答の解析を行っている。

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地球上に存在する広大な酸性硫酸塩土壌地域の再生および有効利用のためには窒素栄養の獲得において有利なマメ科植物の活用が重要であると考えられる．本研究では，ダイズの機能発現cDNAライブラリーの選抜による耐酸性遺伝子の単離と機能解析について報告する．
ダイズ幼植物由来のcDNAライブラリーをpDEST14ベクターに導入して大腸菌に組み込み，pH 4またはpH 5の酸性LB培地上で生育するクローンを選抜した。耐酸性クローンのプラスミドを回収して塩基配列を解析し，ダイズにおけるこれらの遺伝子の発現をRT-PCRで確認した。また，インサートを植物発現用ベクターpGWB2に導入し花序浸潤法を用いてシロイヌナズナを形質転換した。T₂ 植物および野生型植物を各種条件の1/6 MS培地で栽培し生育を比較した．
大腸菌25万クローンより27のユニークな耐酸性クローンを確認した．これらに対応する遺伝子には，ダイズ幼植物において構成的に発現するものとアルミニウムストレスによって誘導されるものがあった．完全長ORFを含む6クローンをシロイヌナズナで発現させたところ，いずれの場合も酸性およびアルミニウムイオンストレス条件下での生育が野生型に比べて有意に改善された．

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イネの低温下における発芽性は、寒冷地における直播適性確保のために重要な形質である。イネの低温発芽性に関与する因子を単離するため、2組の低温発芽性に優れるヨーロッパ産品種と日本産品種、「Dunghanshali」×「かけはし」、「Arroz da terra」×「いわてっこ」を掛け合わせた組み替え近交系（RILs）を作り低温発芽性との連鎖を調べた。「Dunghanshali」由来として3ヶ所、「Arroz da terra」由来として4ヶ所、日本産品種由来として1ヶ所の低温発芽性と連鎖した領域を見いだした。「Dunghanshali」由来の領域のうち2ヶ所は「Arroz da terra」由来の領域と共通していた。現在、特に強い影響度を示した2番染色体上の「Dunghanshali」に特異的な領域と、3番染色体長腕部のヨーロッパ産品種に共通する領域の原因遺伝子を単離するためにF3世代や各領域の準同一遺伝子系統BC2F2を用いて解析を行っている。また新規に作出したイネ突然変異集団から低温発芽性の良い突然変異体を複数単離したので報告する。

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低温ストレス耐性は、北海道のイネの栽培において重要な育種形質である。本研究では、発芽時における低温ストレス耐性として、低温発芽性に着目した。イネの発芽適温25～30℃では、発芽性に大きな品種間差異は見られないが、15℃の低温下では大きな品種間差異が認められた。そこで、低温発芽性に優れるイタリア由来のイネ系統「Italica Livorno」を用いて、低温発芽性に関するQTL解析を行った。その結果、3個のQTLを同定した。このうち、最も作用力の大きなqLTG-3-1をポジショナルクローニングにより原因遺伝子を単離した。この遺伝子は2個の既知ドメインをもつものの、配列からはその機能は明らかでなかった。発現解析を行ったところ、発芽時の種子胚で強い発現が認められた。また、温度に関係なく、発芽時に発現していた。この遺伝子の機能を推定するために、発芽関連遺伝子の発現解析を行った。

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種子の形態形成は植物体の形態形成の中で最も重要な発達段階の一つである．シロイヌナズナ種子の形態形成の分子機構を解明するため，CRES-T法により転写制御因子の機能を抑制させた変異体のライブラリーから，種子の形態に異常を示すものを選抜した．その結果，植物特異的な転写因子ファミリーの一つであるNAC転写因子CR245が種子の形態形成に関与することを突き止めた．しかしながら，CR245のT-DNAタグラインの種子の形態は正常であったため，機能重複する因子の存在が示唆された．公開されているアレイデータをもとにCR245と器官別発現プロファイルが最も類似する因子を選び，その中で相同性が最も高いNAC転写因子CR248に注目した．CR245とCR248の両T-DNAタグラインより作製した二重変異体の種子の形態には異常が認められた．cr245cr248二重変異体の胚の多くはtorpedo期に成長を停止する．Torpedo期の成長停止を回避した胚は形態異常を起こしていた．興味深いことに，この胚発生異常は雌性配偶体側の異常による可能性がある．CR245とCR248は共に核に局在し，それぞれタンパク質のC末端領域に機能的な転写活性化ドメインを持つ．これらのことから，CR245とCR248は機能重複しながら，種子の形態形成を制御していると考えられる．

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胚発生から種子発芽にかけ、プラスチドの動態はめざましく変化する。しかしながら、その生物学的な意義はよくわかっていない。我々はこれまで、シロイヌナズナを用いたケミカルジェネティクス解析から発見されたE化合物を用いて種子発芽の研究を行っている。これら化合物はコンビナトリアルライブラリーから発見された未知の化合物であり、子葉特異的に緑化と伸張を阻害する。遺伝学的解析から、これら化合物はABAとGAが制御する種子発芽のプログラムを経由して作用する事がわかっている。今回我々は、この化合物がプラスチドレトログレードシグナルに関わるgenome uncoupled (gun)遺伝子を経由して作用することを報告する。gun突然変異株では全てE化合物に対する応答に変化が見られ、この中でもMg-chelataseの突然変異株であるgun4とgun5はE化合物に耐性である。プラスチドレトログレードシグナルのマーカー遺伝子の発現解析から、E化合物はこれらの発現に正・負の両方の活性を持ち、発芽後のタイミングでそれが変化することがわかった。これは、Mg-chelataseが関与する経路とプラスチド遺伝子発現依存経路の二つのプラスチドレトログレードシグナル経路の相互作用で説明することができ、後者に関わるgun1突然変異株はE化合物に高感受性であることが明らかとなった。種子発芽におけるこの二つの経路の意義を議論する。

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種子は親植物体中で成熟したのち、生長を停止して休眠状態となる。発芽は種子の生長再開であり、吸水と種子休眠性の喪失を前提とする。種子の休眠と発芽は二つの植物ホルモン、アブシジン酸とジベレリンによって調節され、吸水した種子が休眠性を維持するか、あるいは発芽するかはそれらの量的バランスによって決定される。シロイヌナズナCHO1遺伝子はAPETALA2ドメインを二つ持つ転写因子をコードしており、その変異は種子発芽におけるアブシジン酸非感受性の他、一次休眠性の低下をもたらす。逆に、CHO1を35Sプロモータの下流で発現させると、cho1変異を相補して種子発芽がアブシジン酸高感受性となる。cho1と野生型(Col-0)のアブシジン酸感受性の差は収穫直後は顕著であるが、乾燥保存(後熟)を経ると小さくなる。明確な差異が認められる乾燥保存1週目の種子を用いて吸水過程の遺伝子発現解析をおこうと、cho1では二つのGA 3β-oxidase遺伝子、GA3ox1、GA3ox2の転写産物レベルが高いことがわかった。数週間の乾燥保存を経ると野生型種子の吸水過程においてもこれらの遺伝子の発現レベルが高くなるため、cho1ではGA3oxの発現が乾燥保存を経ないでも脱抑制していると考えられた。本発表ではこれらの結果をふまえ、高感度LC-MSシステムを用いた種子吸水過程のホルモン分析の結果について報告する。

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乾燥種子が吸水して初期に起こる現象については分子レベルでほとんど理解されていない。我々はシロイヌナズナ全ゲノムアレイを用いて、Columbia株の乾燥種子、吸水後15分、30分、1時間、3時間の種子サンプルを用いて遺伝子発現解析を行った。その結果、吸水30分までは乾燥種子に比べ遺伝子発現量が上昇したものはなかった。それに対して、吸水1時間ではZat12 (At5g59820)のみで顕著にmRNA量が増加していた。吸水後3時間では約2200個の遺伝子の発現量が増加しており、その中には種子でABA内生量調節に関わるAtNCED9やCYP707A2、その情報伝達に関わるABI4、活性酸素の生合成に関わる遺伝子群などが含まれていた。さらに3時間後で発現が低下していた遺伝子は約1900個あり、これら遺伝子群のプロモーター領域を調べるとABRE (CACGTG)が有意に存在していた。吸水後のABA内生量を定量すると吸水後3時間目から急激な減少が観察され、定量的RT-PCRを用いた解析からCYP707A2の発現は吸水後3時間目に一過的に上昇していることが示された。またABI3やABI4の発現上昇は3時間目以降に、ABI5の発現量低下は3時間以内に起きている。以上の結果から、吸水後3時間目以降にABA内生量減少に伴う遺伝子発現の変化が起こると考えられた。

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シロイヌナズナL1Lは、ヘテロ3量体 CCAAT 結合タンパク質NF-YのBサブユニットで、種子成熟制御因子LEC1に最も近いホモログである。L1Lは種子発達過程初期から中期にかけて特異的に発現しており、その発現はLEC1ともうひとつの種子成熟制御因子FUS3に依存している。我々はこれまでに、L1L と NF-YCサブユニットであるHAP5B 及び ABRE結合因子bZIP12/bZIP67をT87 細胞で共発現させると、種子貯蔵タンパク質遺伝子CRCプロモーターを顕著に活性化することを示した。L1L-HAP5B と bZIP12/bZIP67はFUS3誘導性の中間転写因子として一群の種子特異的遺伝子を制御していると考えられることから、これらの作用メカニズムを詳細に解析した。その結果、L1L-HAP5B と bZIP67は植物細胞中で複合体を形成すること、l1l変異体では種子特異的遺伝子SUS2の発現が減少すること、並びにSUS2プロモーターもL1L-HAP5B と bZIP12/bZIP67の制御を受けることが明らかとなった。また、これらの転写因子によるCRCプロモーター活性化にはABREが必要であるが、CCAATは必須でないこと、NF-YAサブユニットによる増幅効果が認められないことなどから、L1L-HAP5Bヘテロ2量体と bZIP12/bZIP67との複合体が直接ABREに作用する可能性が考えられた。

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flo2変異体ではデンプンの生合成に関わる遺伝子群や貯蔵タンパク質遺伝子などの発現量が低下することが明らかになっている。このため、flo2変異の原因遺伝子はこれらの生合成系遺伝子群の発現を広範に制御する因子であると考えられる。 Flo2遺伝子座を同定するために、flo2とカサラスを交配して得られたF2のうち、flo2表現型を示す639の劣性ホモ系統を用いて遺伝子をマッピングした。これらの植物体のゲノムDNAについて、それぞれの親系統に特異的なプライマーを用いたPCRによるFlo2座の精密マッピングを行った。その結果、Flo2座は第4染色体の110 cM付近の約37 Kbの範囲にあることがわかった。そこで、変異体と野生型のこの領域の塩基配列を決定し、両者を比較した。その結果、この領域に存在する4つの遺伝子のうちの1つの遺伝子のコード領域に点変異があり、これにより終止コドンが生じていることがわかった。また、F2系統のうちでflo2表現型を示すものは全てに同様の変異が認められた。次に、独立に得られた他の7系統のflo2について、この領域の塩基配列を解析した。その結果、これらの全ての系統において、この遺伝子に変異が生じており、これによって遺伝子の機能が失われていることがわかった。以上のことから、この遺伝子がFlo2遺伝子であることが強く示唆された。この遺伝子は1721アミノ酸からなるタンパク質をコートしていたがこれは既知の転写因子との相同性は認められなかった。

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アブシジン酸（ABA）は種子成熟・発芽において重要な役割を担っており、bZIP型転写因子ABI5が種子成熟・発芽のABAシグナル伝達に関わっている。ABI5/AREBファミリーで保存されているSer/Thr型リン酸化酵素標的部位のアミノ酸を置換したABI5では、ABAによる転写活性化能が抑制された。また、ABI5断片はABAで活性化するSnRK2タイプのタンパク質リン酸化酵素SRK2D、SRK2E、SRK2Iでリン酸化された。これらの遺伝子は、種子成熟・発芽時に異なった様式で発現した。発芽時においてsrk2d/srk2e/srk2i三重変異体はsrk2d/srk2i二重変異体よりも強いABA非感受性を示したが、srk2d、srk2i変異体ではABA非感受性は見られなかった。ABA非感受性に応じて休眠の程度は異なった。さらに三重変異体では高湿度条件下では穂発芽が見られた。マイクロアレイ実験により、abi5変異体の種子で発現レベルが低い多くの遺伝子（AtEm6など）の発現レベルは、三重変異体の種子でも低下していることが明らかになった。以上の結果から、SRK2D、SRK2E、SRK2Iは種子成熟・発芽のABAシグナル伝達において重要な機能をもつタンパク質リン酸化酵素であることが示された。

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植物のスフィンゴ脂質には、long-chain base（LCB）部分のC4位が水酸化されたものが多く存在する。イネではLCBのC4位の水酸化を触媒する5つのジヒドロスフィンゴシンC4ハイドロキシラーゼ（DSH）の遺伝子（OsDSH1-OsDSH5 ）が存在する。これらのうちOsDSH1とOsDSH4は酵母のDSH欠損変異を相補することがわかった。OsDSH1の発現部位を解析したところ、OsDSH1は維管束や分裂組織、雌しべの柱頭で組織特異的な発現を示していることがわかった。そこで、植物でのOsDSH1の生理機能を解析するために、RNAiを用いたOsDSH1の発現抑制体を作製した。発現抑制体は、栄養生長期では野生型との差異は認められなかったが、稔実率の顕著な低下が認められた。発現抑制体の緑葉では、OsDSH1の発現量の減少に連動したOsDSH2の発現量の増加が認められ、これがOsDSH1の減少を相補している可能性が示唆された。一方、柱頭ではOsDSH1の発現抑制に連動したOsDSH2の発現量の上昇は観察されなかった。これらの結果から、発現抑制体での稔実率の低下は柱頭での OsDSH1の減少による機能低下によるものであると推察された。これらの結果からOsDSH1あるいはこれによって作られる物質が種子の稔性に関与している可能性が強く示唆された。

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Multiprotein Bridging Factor 1 (MBF1) は、転写因子と転写装置の間を橋渡しすることで転写を活性化する転写コアクチベーターであることが動物や酵母で報告されている。しかしながら、シロイヌナズナは3種類のMBF1遺伝子を有しているにも関わらず、その詳細な役割はわかっていない。我々はAtMBF1の生化学的機能を明らかにすべく、AtMBF1に強力な転写抑制ドメインSRDXを連結させた融合タンパク質(AtMBF1-SRDX)をシロイヌナズナ内で過剰発現させることを試みた。AtMBF1-SRDXは転写コリプレッサーとして内生のAtMBF1sにドミナントネガティブに働きかけ、それらが関与する転写因子の働きを阻害することで、AtMBF1の機能に関連した表現型が現れることが期待された。
AtMBF1-SRDX を過剰発現する植物は、その本葉が極端に矮小化し、本葉の細胞も野生型に比べ小さくなった。その本葉の細胞では核内のDNA含量の極端な減少が起こっており、AtMBF1-SRDX が本葉細胞でのエンドリデュプリケーションを抑制していることがわかった。また、いくつかのエンドリデュプリケーションを負に制御する遺伝子の発現が上昇していたことから、AtMBF1-SRDXはそれらの発現制御を通して本葉細胞におけるエンドリデュプリケーションを抑制していることが示唆された。

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シロイヌナズナ花茎の重力感受には内皮細胞内のアミロプラストの重力方向への沈降が重要である。アミロプラストはアクチンマイクロフィラメント(MF)に取り囲まれていることが知られており，アクチン重合阻害剤処理では重力屈性がやや促進されることが示されている。しかし，アミロプラストとMFとの関係，および，MFの重力屈性反応における役割は具体的には良く分かっていない。
shoot gravitropism9（sgr9），sgr5はいずれも花茎重力屈性能が低下し，また，sgr5 sgr9二重変異体は重力屈性能を完全に失う。これらの変異体ではアミロプラストが重力方向に沈降しておらず，SGR5とSGR9は重力方向へのアミロプラストの移動制御に関与すると考えられた。そこで，SGR5，SGR9が関与するアミロプラストの移動制御とMFとの関係を解析するため，sgr5，sgr9，sgr5 sgr9の花茎をアクチン重合阻害剤で処理したところ，これらの変異体の重力屈性反応が回復した。SGR5，SGR9は共に内皮細胞で機能することから，これらの変異体ではMFの脱重合阻害によりアミロプラスト沈降異常が生じ，重力屈性異常が引き起こされているのかもしれない。現在，アクチン重合，脱重合阻害剤を用いた薬理学的解析に加え，MF形成を優性阻害するアクチン分子種を用いた分子遺伝学的解析を行なっている。今後，SGR5とSGR9が重力感受細胞でアクチンのリモデリングを介してアミロプラスト移動制御に関わる可能性を検討していきたい。

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私たちはこれまでに、NACドメインタンパク質、Vascular-Related NAC-Domain6 (VND6) およびVND7、が活発な二次細胞壁形成と細胞死を伴う道管要素の分化を決定するマスター転写因子であることを明らかにした。本研究では、これらマスター転写因子を利用して効率的な道管要素分化誘導系の開発に成功した。VND6およびVND7を転写活性ドメイン(VP16)およびグルココルチコイドレセプター(GR)との融合タンパク質として恒常的に発現させるコンストラクト(35S-VP16-GR-VND6, -VND7)を構築し、シロイヌナズナ、タバコBY-2培養細胞、シロイヌナズナT87培養細胞に導入した。形質転換シロイヌナズナではグルココルチコイド誘導体であるDEX依存的にVND6およびVND7を活性化させることによって根毛細胞やトライコームを含む様々な細胞から道管要素への分化転換が誘導された。表現型が最も強い形質転換ラインでは、道管要素への分化転換による細胞死のために誘導後数日で植物体全体が白色化した。また、BY-2およびT87では35S-VP16-GR-VND7を導入した場合に、DEX依存的に高頻度な道管要素分化が誘導された。現在、誘導された道管要素の詳細な形態観察や細胞壁組成の分析、ポプラなどの他の植物の形質転換を進めており、これらの結果についても報告したい。

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温度は発芽を決定する重要な環境要因である。私達は温度による発芽調節機構を明らかにすることを目的として、野生型種子が発芽できない高温で発芽するシロイヌナズナの突然変異、5系統を単離した。このうち、trg1の種子は常温でABA感受性がわずかに低下し、28℃では明確なABA低感受性を示した。また、やや草丈が低く、果実のさやが短いなど、植物体においても変異形質が認められた。trg1変異は1番染色体の下腕の分子マーカー、TJ-5とFJ-4に挟まれた55kbpの領域にマップされた。この領域に推定される7遺伝子の塩基配列を決定したところ、trg1ではα-xylosidase遺伝子の第二エクソンに14bpの欠失を持つことが明らかになった。この欠失はプロペプチド内に終止コドンをもたらすことから、trg1はα-xylosidaseの機能喪失突然変異であると考えられた。α-xylosidaseは細胞壁におけるキシログルカンオリゴ糖の分解に関わることが示唆されており、trg1種子の高温耐性発芽形質は細胞壁代謝の攪乱によりもたらされると考えられた。α-xylosidaseをコードするTRG1/XYL1は発芽時に最も強く発現が誘導される遺伝子の一つであり、発芽におけるTRG1/XYL1の役割について議論する。

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Poplar cellulase (PaPopCel1) was overexpressed in a tropical leguminosae tree, sengon (Paraserianthes falcataria), by the Agrobacterium method. Expression increased the length and width of stems with larger leaves, which showed a moderately higher density of green color than those of the wild type. The pairs of leaves in the transgenic plants closed slower than those in the wild-type plants, showing a delay in the closing movements of leaves during sunset. Based on the carbohydrate analyses of cell walls, the leaves in the transgenic plants contained less wall-bound xyloglucan than those in the wild-type plants. The expression supports the concept that the paracrystalline sites of cellulose microfibrils are attacked by poplar cellulase to loosen xyloglucan intercalation followed by an irreversible wall modification, which could promote plant growth and disturb the closing movements of leaves within their biological clock.

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木本植物の茎は、伸長成長停止後も木部にあて材を形成することで屈曲による姿勢制御をしている。双子葉植物は主に屈曲したい側に引張あて材を形成し、その強い引張の成長応力によって茎を曲げる。引張あて材の典型例では、木繊維の細胞壁にリグニンを含まないセルロースに富んだ二次壁層であるG層を形成する。このG層は通常の木部よりも強い引張の成長応力を発生すると考えられている。キシログルカナーゼを構成発現させたポプラではあて材形成による引張応力が野性型より低く、姿勢制御能が極めて弱い。またメチル化分析の結果からG層にはキシログルカンが有意に含まれており、標識基質の in situ 取込み実験では高分子キシログルカンを取り込むキシログルカンエンドトランスグルコシラーゼ (XET) 活性がG層にあることがわかっている。これらのことから、キシログルカンが引張あて材G層の応力発生に深く関わっていることが示唆される。そこで、G層の微細構造をFE-SEMによって観察し、形質転換体と野性株を比較した。形質転換体では、亀裂のみられるG層が多く、セルロースフィブリル同士がほぐれ易いことが推察された。また、野性株由来のG層切片をキシログルカナーゼ処理することによってミクロフィブリルがほぐれ易くなることが確認された。野性株にみられるフィブリル間の接着・充填様の微細構造はキシログルカンによって形成されていると結論した。

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L-アラビノフラノース残基は植物細胞壁中に多く含まれる重要な構成単糖である。細胞質で合成されたUDP-L-アラビノピラノース（UDP-Arap）は、細胞壁アラビノースの直接の前駆体であるUDP-L-アラビノフラノース（UDP-Araf ）へと酵素的に変換される。我々はUDP-アラビノースの相互変換活性をイネ実生で見出し、酵素「UDP-アラビノースムターゼ (UAM)」の精製を行なった。UAMによる変換反応は可逆であり、UDP-ArapとUDP-Arafの比は90:10で平衡に達した。精製イネUAMのアミノ酸配列解読の結果、イネは3つの遺伝子UAM1, 2, 3を持ち、これらはアミノ酸レベルで80%以上の高い相同性を持っていた。また、UAMはReversibly glycosylated polypeptide (RGP) と呼ばれていた機能未知タンパク質と同一であった。さらに詳細な解析を行うため、UAM1, 2, 3それぞれについてバキュロウイルス発現系により組換えタンパク質を作製し、酵素の特徴づけを行なった。その結果、組換えUAM1および3はムターゼ活性を有し、類似した酵素特性を示したが、組換えUAM2は不活性型であった。UAMは植物界に広く保存されており、アラビノフラノースの生合成の最終段階に関与することから、UAMの機能は植物の生育に必要不可欠であると考えられる。

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植物のUDP-糖新生経路ではUDP-グルコース（UDP-Glc）がUDP-グルクロン酸を経てUDP-キシロース（UDP-Xyl）に変換され、ゴルジ体内腔でさらにUDP-L-アラビノース（UDP-L-Ara）へと変換される。今回我々は、トウミョウの可溶性画分よりUDP-Xyl 4-エピメラーゼを各種クロマトグラフィーにより単離した。N末のアミノ酸配列からこの酵素はUDP-Glc 4-エピメラーゼ遺伝子、PsGalE、によってコードされることが明らかになった。大腸菌で発現した組換えPsGalE (rPsGalE)は、UDP-Glc 4-エピメラーゼ活性とUDP-Xyl 4-エピメラーゼ活性を示した。rPsGalEのUDP-Glc、UDP-ガラクトース、UDP-Xyl、UDP-L-Araに対するK_m値はそれぞれ、0.21 mM,0.21 mM,0.17 mM, 0.14 mMであり、PsGalEはUDP-糖に対して幅広い基質特性を持つUDP-Glc 4-エピメラーゼであることが示唆された。他の植物にもPsGalEのホモログが広く存在しており、高等植物では幅広い基質特異性を持つUDP-Glc 4-エピメラーゼにより細胞質でUDP-XylとUDP-L-Araの変換が起こると予想される。

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アラビノガラクタンプロテイン(AGP)は植物プロテオグリカンの一種であり、ハイドロキシプロリンに富んだコアタンパク質と、タイプIIアラビノガラクタンの糖鎖部分からなる。分子の大部分を占める糖鎖は、β-1,3-ガラクタンの主鎖にβ-1,6-ガラクタンやアラビノオリゴ糖の側鎖が結合した構造を持つ。側鎖の非還元末端には、アラビノースをはじめ、グルクロン酸、ラムノース、フコースなどが結合していることが知られている。AGPは分子種が多く、糖鎖の構造も複雑であるため、その糖鎖に作用する酵素はAGP研究のツールとして有用である。
我々はAGP糖鎖の主骨格となるβ-1,3-ガラクタン及びβ-1,6-ガラクタンに作用する酵素を放線菌Streptomyces avermitilisが有することを見出した。このことは本菌がAGP糖鎖分解酵素系を有している可能性を示唆していることから、S. avermitilisのゲノム情報とAGPの糖鎖構造を考慮し、AGP糖鎖に作用できる可能性のある酵素をクローニングして組み換え酵素を得た。これらの酵素がどのようにAGP糖鎖に作用するかについて発表する予定である。

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アラビノガラクタンプロテイン（AGP）は高等植物の細胞間マトリックスや細胞膜に存在し、器官の分化・成長に伴いその糖鎖構造が変化する。AGPの糖鎖の基本骨格はβ-3,6-ガラクタンで、側鎖を構成するβ-1,6-結合したGal残基にα-L-Arafやウロン酸等が結合した分岐構造を有している。本研究ではAGPの糖鎖合成に関わるβ-ガラクトース転移酵素（GalT）の諸性質について調べた。
ダイズの黄化胚軸のミクロソーム画分を酵素源、UDP-Galを供与体、各種オリゴ糖を受容体に用いて酵素反応を行った。反応産物をp-aminobenzoic acid ethyl ester (ABEE)で蛍光標識してHPLC分析を行い、酵素活性を求めた。
各種ガラクトオリゴ糖を受容体にしてGalT活性を調べた結果、β-1,3-Gal₃、β-1,6-Gal₃、L-Araf α-1,3-Galβ-1,6-Gal、Galβ-1,6-Galβ-1,3-Gal、等が高い活性を示した。β-1,3-Gal₃の場合、比活性は約400 pmol/min/mg proteinで、中央のGal残基にGalがβ-1,6-結合で転移してGalβ-1,3(Galβ-1,6)-Galβ-1,3-Galが生じた。β-1,6-Gal₃からはβ-1,6-Gal₄が生じた。

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高等植物の細胞壁は細胞の成長にともなって活発に代謝されている。演者らはこれまでにギンドロ培養細胞を用いて成長過程における細胞壁多糖類の変化について研究し、細胞の伸長成長期にペクチンの中性糖側鎖を構成するガラクタンの代謝が活発に起きていることを明らかにしてきた。本研究では培養液中に分泌されるガラクタン分解酵素の活性変動を調べるとともに酵素の精製を行いその特性を明らかにすることを目的として実験を行った。
培養液中のガラクタン分解活性は培養10～14日目の伸長成長終期に急激に増加した。細胞壁中の活性は伸長成長が活発な培養6～10日目に高まり、その後減少することからこの酵素が細胞壁から培地中に分泌されると考えられた。そこで培養14日目の培地から硫安沈殿により粗酵素を回収し精製を加えた。粗酵素液に対して陰イオン交換、疎水、陽イオン交換、及びゲル濾過クロマトグラフィーを行い比活性で約100倍に精製した。精製した酵素はSDS-PAGE上で約70 kDaのメジャーなタンパク質と66 kDaのマイナーなタンパク質を含んでいた。メジャーなタンパク質の分子量は細胞壁から精製したガラクタン分解酵素のうちの一つとほぼ一致していた。また、精製した酵素の至適温度は約40℃、至適pHは約5.5でありこれまでに報告されているガラクタン分解酵素と一致していた。発表ではさらにいくつかの特性について報告する予定である。

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イールディン（yieldin; YLD）は、細胞壁の臨界降伏圧（y）を調節するタンパク質として、ミトリササゲ細胞壁より2000年に単離・精製されたが、その作用機構は未だ明らかではない。その理由のひとつにYLDのリガンドが解明されていないことが挙げられる。
これまでにYLDがclass III キチナーゼやコンカナバリンBのホモログであり、分子内部に糖鎖結合部位が保存されていることが明らかになっている。そこで中里はYLDにも糖鎖結合活性があると考え、細壁構成多糖を対象にYLDリガンドを探索してきたが、はっきりした結果は得られなかった。そこで今一度ウサギ赤血球凝集 (HA)試験を行ってYLDの糖鎖結合性を検討した。
無処理のウサギ赤血球に対しては、以前の報告と同じくYLDはHA活性を示さなかった。ところがトリプシン処理を行なったウサギ赤血球を用いたところ、YLDのHA活性が観察された。HA活性はYLDと赤血球表面の糖鎖との結合に基づくと考えられるため、この結果はYLDに糖鎖結合性があり、レクチンの一種である可能性を示している。またYLDのHA活性は酸性条件下で強く観察された。酸性条件下でyを低下させるという、細胞壁内におけるYLDの作用を考慮すると、YLDの糖鎖結合性がy調節機構に重要な役割を持つ可能性がある。

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細胞壁の伸展特性（張力-伸展速度曲線）は、ロックハート方程式に基づく直線近似によって数値化した二つのパラメータ（壁展性および臨界降伏張力）で簡便に記述されてきた。これら二つのパラメータは伸長生長に伴う細胞壁伸展でpH依存的に調節されるが、私たちはキュウリ（Cucumis sativus L.）胚軸の細胞壁でいずれのパラメータもエクスパンシン（CsEXPA1）によって制御されうることを示した（2006）。ササゲ（Vigna unguiculata L.）の細胞壁において臨界降伏張力のみを制御するタンパク質としてイールディンが示されているが、同時にエクスパンシンも存在すると考えられている。しかし、壁伸展パラメータ制御におけるエクスパンシンとイールディンの役割分担については知見が乏しい。そこで今回、両タンパク質をササゲ細胞壁から抽出・精製し、それらの機能を同一の細胞壁試料で比較検討することにした。測定装置として自動微小応力計（PCM）を使用し、解析法として張力スイープ法を用いた。
現在までのところ、ササゲ胚軸の細胞壁から抽出したエクスパンシンは、壁展性だけでなく臨界降伏張力をも調節しうることが明らかになっている。講演では、細胞壁試料の調整法、熱処理条件およびイールディン機能と比較検討した結果についても合わせて報告する。

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植物細胞の細胞壁（一次壁）は細胞の形体を維持するため強固な構造を形成しているが、細胞の成長が起こる際には細胞壁がゆるむ。エンド-1,4-b-グルカナーゼやキシログルカンエンドトランスグルコシラーゼ/ハイドロラーゼ、エクスパンシンなどは細胞壁に形成されている架橋の切断による細胞壁のゆるみの誘導や細胞壁の再構築に関与し、細胞の成長を制御していることが推察されている。
ベンサミアーナを用いた一過的発現系は短時間で目的のタンパク質を調製することが可能であり、タンパク質の機能解析には有効な手段である。特に大腸菌や酵母などを用いた異種発現系が機能しない植物由来タンパク質の解析には利用価値が高いと考えられる。また、ウィルスベクターの利用により高タンパク質発現が期待できる。
今回我々は、植物細胞の成長への関与が推測される酵素群をベンサミアーナにおいて発現させ、細胞成長への影響および発現させた酵素の性質、局在などを調べたので報告する。

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植物において、プログラム細胞死は様々な因子によって高度に制御されている。Bax Inhibitor-1 (BI-1) は生物間に広く保存された細胞死抑制因子である。シロイヌナズナのBI-1 (AtBI-1) は約26kDaの小胞体膜に局在する7回膜貫通タンパク質で、植物細胞に過剰発現させると、過酸化水素、サリチル酸、エリシターなどによって引き起こされる細胞死を抑制することがこれまでに報告されている。また、AtBI-1のC末端に存在するcoiled-coil構造が細胞死抑制機能に必須であり、カルモジュリンと相互作用することも明らかとなっている。しかし、これまでAtBI-1が細胞死を抑制する分子機構については明らかとなっていなかった。
最近の我々の研究から、AtBI-1がAtFAH (Arabidopsis fatty acid hydroxylase) とcytochrome b₅ (Cb5) を介して相互作用することが示唆された。Cb5は脂肪酸合成に関与する電子伝達因子で、AtFAHはスフィンゴ脂質脂肪酸のヒドロキシラーゼであり、小胞体に局在している。近年、セラミドを含むスフィンゴ脂質が細胞死制御に関与することが明らかになりつつある。本研究は、AtBI-1がスフィンゴ脂質制御を介して細胞死の抑制を行っていることを示唆している。

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イネEL5は膜局在性のRING型ユビキチンリガーゼ(E3)である。内在性EL5の機能を阻害するためにE3活性欠損型変異遺伝子(mEL5)を過剰発現させた結果、不定根原基が壊死し発根しなかったことから、EL5は根原基分化後の細胞維持に関与する細胞死抑制型E3であると考えている（Koiwai et al., Plant J., 2007）。今回我々は、細胞外の硝酸、亜硝酸あるいはカルシウムイオン濃度を高めると、mEL5発現イネ特異的に根端が壊死し根伸長が阻害されることを見出した。また、mEL5発現カルスは通常のN6培地上で正常に増殖するが、一酸化窒素（NO）生成剤SNPで処理すると、コントロールカルスより有意に多くの細胞が壊死した。以上の結果から、EL5は少なくとも根端および培養細胞のNOストレス耐性に関与していることが示唆された。次に、EL5の作用機構を明らかにするために、その基質認識領域と考えられるC末端領域（EL5-C; A195-N325）と相互作用するタンパク質をプルダウン法で探索した。Hisタグを付けたEL5-Cと共精製されたカルス由来のタンパク質を質量分析した結果、細胞質型グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(GapC1, 2, 3)と同定された。さらに、これら3種のGapCと種々の長さのEL5-Cとの相互作用を大腸菌2ハイブリッド法で解析した結果、GapC2がEL5のP249-S276領域と相互作用することが強く示唆された。

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AAL毒素はトマトアルターナリア茎枯病菌の病原性因子であり，宿主トマトに細胞死を誘導する．しかし，この毒素により誘導される細胞死のシグナル伝達経路については未知の部分が多い．そこで，AAL毒素および茎枯病菌に感受性であるNicotiana umbraticaとウイルス誘導型のジーンサイレンシング法を用いて，AAL毒素による細胞死に関わる遺伝子を解析した．その結果，エチレン生合成に関わるMAPKKであるMEK2およびエチレンのシグナル伝達に関わるEIN2をノックダウンすると，AAL毒素による細胞死が緩和された．さらに，EIN2の下流の転写因子であるEIN3をノックダウンすることで細胞死が緩和された．これらの結果より，AAL毒素による細胞死には，エチレンの生合成とそのシグナル伝達が必須であると考えられた．一方，EIN2，EIN3のサイレンシングは，INF1エリシターや恒常的活性型変異体であるMEK2^DDによる細胞死を抑制しなかった．さらにEIN3の下流の転写因子である各種ERFをノックダウンすることにより，AAL毒素による細胞死に関与するERFを同定した．このERFを一過的に過剰発現させた植物体では細胞死は誘導されなかった．この結果より，AAL毒素による細胞死にはエチレンのシグナル経路が必要であるが十分ではないことが示唆された．

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シロイヌナズナなどの高等植物にもホモログ(AtDAD1)が存在するDAD1 (Defender against Apoptotic cell Death 1)は小胞体膜に局在しBHK21-derived tsBN7 細胞より単離され、温度感受性動物培養細胞や酵母においてプログラム細胞死(PCD)を抑制する因子として機能していることが報告されている。また、DAD1はアミノ酸配列においては酵母のN結合型オリゴ糖転移酵素 (Oligosaccharyltransferase :OST)複合体のサブユニットOST2pと高い同一性を示している。一方、BI-1(Bax Inhibitor-1)は小胞体ストレス誘導によるPCDを抑制する小胞体膜タンパク質であり、高等植物においてもAtBI-1は植物細胞においてヒトBaxによる細胞死を抑制することが報告されている。
今回、AtDAD1及びAtBI-1の植物個体での発現部位をウェスタンブロット及びプロモーター GUS形質転換体の組織染色によりその発現部位を解析した。その結果、AtDAD-1及びAtBI-1が花茎において花弁の離層、莢において開裂部分、根においては根端及び維管束系で発現していることが判明した。これらの結果より、高等植物においてプログラム細胞死の生じる形態形成においてはこれらの小胞体膜タンパク質が重要な役割を果たしていることが示唆された。

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これまでの研究から、シロイヌナズナのLSD1はプログラム細胞死(PCD)の負の制御因子であり、自身のジンクフィンガー構造を介して細胞質で他のタンパク質と相互作用することで、核タンパク質の核輸送を抑制する細胞質リテンションタンパク質である事が明らかになっている(1)。これまで同定したLSD1相互作用タンパク質が転写制御因子(AtbZIP10, LIN1,IAA8)であることから、LSD1の細胞質リテンションタンパク質としての機能が、特にPCDの誘導における転写制御に間接的に関わっていると考えられる。そこで、LSD1とこれらの転写制御因子の相互作用機構を明らかにするために、まずファージディスプレイ法を用いてLSD1の標的認識配列を調べた。その結果、”GxP”モチーフが標的認識のコア配列であることが明らかとなった。そこで”GxP”モチーフに着目し、酵母のツーハイブリット法を用いてLSD1とAtbZIP10、LIN1、IAA8との相互作用を調べた結果、全てとこのモチーフを介して相互作用することを明らかにした。植物細胞中においても同様の相互作用機構によりLSD1とこれらの転写制御因子が相互作用することについて、GSTプルダウン法、共免疫沈降法、及びBiFC法により現在確認しており、これらについても報告する。
(1) Kaminaka et al., EMBO J., 25, 4400-4411 (2006)

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植物のプログラム細胞死（PCD）の誘導機構を明らかにするために、シロイヌナズナのLSD1について注目して研究を行ってきた。これまでの研究から、LSD1は他のタンパク質と相互作用することで、PCDの誘導に関与する遺伝子の転写調節を間接的に制御する機能を持つと考えられる。そこでLSD1の機能を更に明らかにするために、酵母のツーハイブリット（Y2H）スクリーニングによりLSD1の相互作用因子として同定したIAA8について注目して研究を行った。オーキシン応答性の転写制御因子であるAux/IAAの一つであるIAA8が、ドメインII内のTIR1との相互作用に関わる部位でLSD1と相互作用することを、Y2H法を用いて明らかにした。同様に、この保存配列を持つ他の多くのAux/IAAもLSD1と相互作用することが明らかになった。一方、LSD1は植物細胞中では細胞質のみに局在することから、相互作用因子も細胞質に局在すると考えられる。しかしながら、細胞質での局在を示したのはIAA8だけであったことから、in vivoで実際にLSD1と相互作用しているAux/IAAはIAA8だけであると示唆される。また、変異体を用いた解析から、IAA8の機能はlsd1変異体において誘導されるPCDを、負に制御していることを明らかにした。このことから、IAA8の機能が植物のPCD誘導機構に関与すると強く示唆された。

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これまでの研究により、シロイヌナズナのプログラム細胞死の誘導に関わるbZIP型転写因子AtbZIP10の機能発現が、細胞質リテンションタンパク質であるLSD1との相互作用による核局在の抑制により制御されていることを明らかにした(1)。また、AtbZIP10が微小管プラス端集積因子であるAtEB1と相互作用することも明らかにした(2)。この研究では、精緻な転写制御を行う上で重要なメカニズムである転写因子の細胞内でのトラフィックや選択的分解について注目し、AtbZIP10の機能制御機構の全体像を明らかにすることを試みた。AtEB1変異体(ateb1a/b/c)を用いた実験により、AtbZIP10の細胞質への局在にはAtEB1の機能が関与しないことを明らかにした。また、AtbZIP10が酵母のbZIP型転写因子であるYAP1変異体の表現型を部分的に相補したことから、YAP1と同様にAtbZIP10の核―細胞質間移行がレドックス制御を受けている可能性が示唆された。さらにAtbZIP10-GFP由来の蛍光を指標にした実験により、核におけるAtbZIP10の選択的分解機構の存在が示唆されたと共に、AtbZIP10上の分解に関わる領域についても同定した。
(1) Kaminaka et al., EMBO J., 25, 4400-4411(2006)
(2) 山本優香ら、第48回日本植物生理学会年会、1pE05

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Our previous research showed that the gene expression of Xylem Sap Lectin: XSP30 in root stele was circadian clock-controlled and the amplitude was up-regulated by the leaf-produced gibberellin in cucumber plant. In this research, GA-deficient mutant of Arabidopsis (ga3ox1/ga3ox2) was used to observe the effects of gibberellin in root area. Applying GA₄ on shoot area of the GA-deficient mutant showed obvious promotion in seminal root elongation and also root branching. In order to find out if gene expression in root area is affected by GA₄ application, the microarray analysis was performed on root samples of GA-treated or non-treated GA-deficient mutant. The results lead us to select several up and down-regulated genes which may be expressed in root and controlled by the shoot. The expressions of the selected genes were confirmed by real-time PCR. Some of them may be responsible in shoot-root interactions.

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我々は植物ホルモンを基質にする酵素の探索過程で、ジベレリン（GA）の生合成または代謝に関わると考えられる新規シトクロームP450遺伝子をシロイヌナズナより見いだした。本遺伝子を発現する酵母組み替え体に各種のGAまたは前駆体を与え、その代謝産物をGC-MSを用いて分析した。その結果、ent-カウレン酸を基質とした場合ステビオール（ent-13-ヒドロキシカウレン酸）が主要な産物として検出された。一方、GA₁₂を基質とした場合、主要な産物として12α-ヒドロキシGA₁₂と少量の13-ヒドロキシGA₁₂（GA₅₃）が検出された。本酵素遺伝子を過剰発現するシロイヌナズナは、GA合成不全変異体に似た半わい性を示した。この過剰発現体のGA内生量を測定したところ、活性型GA₄を含む13位非水酸化GAの量が減少し、逆に活性型GA₁（シロイヌナズナにおいてはGA₄よりも生物活性が弱い）を含む13位水酸化GAが増加していることが明らかになった。すなわち、本酵素遺伝子を利用することにより、植物体内のGA₄とGA₁の比率を変化させることが可能であることが示された。

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植物の蒸散は主に葉の表面に存在する気孔を通して行われ、その開閉には種々のシグナル伝達物質が関わっている。また、植物個体の生育や生存には、気孔の開閉だけでなく、周囲の環境条件に適合した気孔の数や密度のバランスを保つ必要がある。例えば長期間乾燥条件において生育した植物は気孔密度を低下させることで蒸散量を抑制していることが報告されている。アブシジン酸（ABA）は水分の不足を感知して速やかに気孔を閉鎖させることが知られている。ABA非感受性であるシロイヌナズナの変異体abi1-1及びabi2-1ではABAによる気孔閉鎖が見られず、野生型に比べて萎れ易い事が知られている。我々は、abi1-1、 abi2-1及びABA欠損株であるaba2-2変異体では野生型に比べて気孔密度の増加、あるいは気孔自体の大きさが増すことを見いだした。このことから、ABA非感受性及び欠損変異体が野生型に比べて蒸散量が上昇して萎れ易いのは気孔の開口度の増大だけではなく、気孔密度の上昇が影響している可能性が示唆された。また、ABAは気孔閉鎖といった短期的な蒸散量調節に加え、気孔の分化を抑制し、植物が乾燥等の環境に適応するための長期的な戦略に関わっている可能性が示唆された。

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温度は種子発芽の季節を決定する重要な環境シグナルである。冬型一年生草本であるシロイヌナズナ種子の発芽は、吸水時の高温条件で抑制される（高温阻害）。これまでに、高温は、アブシジン酸（ABA）合成に関わるZEP、NCED2、NCED5、NCED9遺伝子の発現を誘導することによりABA内生量を高め、ジベレリン（GA）合成に関わるGA20ox、GA3ox遺伝子の発現を抑制するとともにGAシグナリングの負の制御因子であるSPINDLY(SPY)の発現を高めることによってGA作用を抑制していることを明らかにしてきた。発芽の高温阻害におけるABAとGAの相互作用を検討するため、ABA欠損変異体種子におけるGA合成酵素遺伝子の発現を定量的RT-PCR法を用いて解析したところ、aba2-2種子では、高温条件でも常温と同様にGA3oxの発現が高まり、spyの発現が抑制されることを見出した。また、aba2変異体種子の高温耐性発芽形質は、ジベレリン合成阻害剤であるパクロブトラゾールにより強く抑制された。したがって、明所・高温条件で吸水したシロイヌナズナ種子では、ABAがGAの合成を抑制することにより発芽が抑制されていると考えられた

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我々は LC-MS/MS を用い、市販のカートリッジカラム等を用いた簡便な精製による植物ホルモンの高感度分析法の確立を目的とした研究を行っている。昨年度の本大会で報告したように、活性型ホルモンとしてジベレリン（GA₁, GA₄）、アブシジン酸、インドール-3-酢酸、ジャスモン酸、サリチル酸、サイトカイニン（trans-zeatin, dihydrozeatin, isopentenyladenine）、ブラシノステロイド（castasterone, brassinolide）の定量法を確立した。また、植物ホルモン内生量の調節機構を明らかにするには活性型ホルモンだけでなくその上流、下流に位置する関連物質も定量する必要がある。我々はこれまでに活性型を含む14種類のジベレリン関連物質、アブシジン酸とその代謝関連物質7種類の分析法を報告した。今年度の大会では、これらに加えてジャスモン酸関連物質の分析法について報告する。ジャスモン酸は様々なストレス応答に関るホルモンとして知られているが、その生合成、代謝の機構はいまだ未解明の部分も多い。それらを明らかにするために、OPDA, OPC:8, ジャスモン酸-ロイシン複合体、ジャスモン酸-イソロイシン複合体等の分析法の確立を目指した研究を現在進めている。

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ジャスモン酸による情報伝達経路は植物の様々なストレス応答や形態形成の過程において活性化され、ジャスモン酸応答遺伝子群の発現を介してストレス応答や形態変化を引き起こす。しかしそのような情報伝達経路の詳細は未解明である。本研究では、ジャスモン酸類および傷害に応答する遺伝子のクラスター解析を行い、発現パターンの相関性が高い遺伝子グループの中に含まれる転写因子に着目した。
ジャスモン酸応答性転写因子のひとつであるINU1は、ジャスモン酸類および傷害により早期に強く誘導されることから、ジャスモン酸情報伝達系の初期段階において重要な役割を担うと考えられた。INU1の傷害による発現は、ジャスモン酸生合成が欠損した変異体であるaosで顕著に抑制されることから、傷害時におけるINU1の発現誘導はジャスモン酸に依存していることがわかった。またINU1とGFPとの 融合蛋白質は核に局在することから、INU1が核で機能することが示唆された。メチルジャスモン酸処理したinu1変異体と野生株とのマイクロアレイ解析を行ったところ、inu1では野生株に対してフラボノイド生合成系の遺伝子発現が増加していた。さらにinu1のメタボローム解析によりフラボノイド類の蓄積量に変化があることも確認された。これらの結果から、INU1はフラボノイド生合成系を負に制御していると考えられる。

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イネは、土壌中の窒素を根で吸収、同化し、各器官に輸送後、様々な代謝を行っているが、窒素利用の制御に関する詳細は、未だ解明されていない。イネの根の伸長は、窒素の供給量に応じて変化する。窒素利用の制御に関わる遺伝子を同定するため、イネの根長を窒素利用の指標として用い、イネの根長を支配しているQTLのマッピングを行った。Koshihikari及びKasalathに由来する染色体断片置換系統群(CSSLs)を用いて、第8染色体の長腕側に、5 μM NH₄⁺濃度において根長を支配しているQTLを検出した。このQTLがKasalath型であるSL-225と遺伝背景のKoshihikariを、5-1000 μM NH₄⁺濃度で栽培したところ、すべての濃度区においてSL-225の根長はKoshihikariよりも有意に増加していた。また、各個体の窒素吸収量を測定したところ、50 μM NH₄⁺濃度区において、SL-225の窒素吸収量はKoshihikariよりも減少していた。この結果から、このQTLが特定のNH₄⁺濃度域において窒素利用の重要な役割を担っていることが考えられた。そこで、QTL原因遺伝子の同定を目的として、SL-225をKoshihikariに戻し交配し、F2、F3世代を獲得した。これらを用いて、少なくとも2つのQTL原因遺伝子の存在を確認し、効果の強いQTL原因遺伝子を、第8染色体長腕の7 cMの領域に絞り込んだ。更に原因遺伝子を絞り込むために、染色体組換え系統の選抜を行った。現在、獲得した系統を用いて高精度連鎖解析を行っている。

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イネのサイトゾル型グルタミン合成酵素（GS1）には、3種類の遺伝子（OsGS1;1、OsGS1;2、OsGS1;3）がある。3種のGS1のそれぞれの生理機能を明らかにするため、GS1遺伝子上にレトロトランスポゾンTos17が挿入された遺伝子破壊変異体を獲得し、機能解析を進めている。
OsGS1;1、OsGS1;2産物は、供試した全ての器官で蓄積が認められたが、OsGS1;3産物は、穎果と発芽過程の胚乳でのみ検出された。OsGS1;1、OsGS1;2産物は生育段階や窒素栄養条件により蓄積量および蓄積部位が変化し、その挙動は異なっていた。
OsGS1;1遺伝子破壊変異体は、GS1含量が減少しており、GS1活性も著しく低下していた。この変異体を、異なる窒素源を用いて栽培したところ、NH₄⁺が存在する条件では、葉身の抽出が滞り、成育が遅延した。また、トランスクリプトーム解析およびメタボローム解析の結果、変異体では、転写産物、代謝産物の蓄積量にも変化がみられた。変異体が正常に成育できないことから、GS1;1の機能は他のGS1や他の代謝系では相補できないことが判明し、GS1;1は極めて重要な役割を担っていることが明らかとなった。
さらに、OsGS1;2、OsGS1;3の遺伝子破壊変異体の解析を進めている。

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イネの窒素利用上の鍵酵素をコードするNADH-グルタミン酸合成酵素1遺伝子（OsNADH-GOGAT1）やアンモニウム輸送担体1遺伝子は、グルタミン（Gln）による発現制御を受ける。このことから、イネにはGlnをシグナルとした情報伝達系が存在すると考えられるが、その分子実体は全く不明である。演者らは、イネのGln情報伝達系の分子実体を解明するため、Glnセンサーの候補としてイネACT domain repeat protein（OsACR）の機能解析を進めている。OsACRをコードする遺伝子は、イネ核ゲノム上にOsACR1からOsACR9までの9つ存在する。このうち特にOsACR9は、OsNADH-GOGAT1が発現する多くの器官、組織、細胞に蓄積しており、OsNADH-GOGAT1の発現制御に関与している可能性が期待された。そこで、RNAi法を用いてOsACR9ノックダウンイネを作出し、その形質転換当代におけるOsNADH-GOGAT1の発現解析を行なった。その結果、OsACR9蓄積量が減少したOsACR9ノックダウンイネの当代では、分げつ未抽出葉身において、OsNADH-GOGAT1 mRNAの減少傾向が認められた。本発表では、T1世代におけるトランスクリプトーム解析の結果などから、OsACR9がイネのGln情報伝達系および遺伝子発現制御に関与している可能性について考察する。

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窒素栄養の効率的な吸収と同化は植物の生育を規定する重要な因子の一つである。自然界の土壌中には、硝酸やアンモニウムイオンなどの窒素栄養がごく少量存在する。環境から植物細胞へ輸送された硝酸はアンモニウムに還元されグルタミン合成酵素によりグルタミンへ同化される。シロイヌナズナの根には4つの細胞質型グルタミン合成酵素（GS1）が分布していて環境からのアンモニウムの同化を行っている。中でもGLN1;2は他のGS1アイソザイムと比較しても興味深い性質を持っている。第一に、窒素欠乏後のシロイヌナズナの根へアンモニウムを供給するとGLN1;2の転写産物量は増大する。第二に、GLN1;2の酵素学的な性質はアンモニウムに対する親和性が低い。第三に、GLN1;2のプロモーター活性はアンモニウムの供給後に根の表皮と根毛で集積する。それがゆえにGLN1;2は根に十分にアンモニウムが供給されている条件下でアンモニウムの初期同化を中心的に担う重要な因子の一つであると考えることができる。我々は蛍光緑色タンパク質（GFP）をレポーターとして、GLN1;2遺伝子のプロモーター領域を連結した融合遺伝子を形質転換し、プロモーターの欠損解析を行った。その結果、GLN1;2遺伝子の開始コドンから約3.6 kb上流にある21 bpの配列がGLN1;2遺伝子のアンモニウム供給に応答した発現に必要であることを見いだした。

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【目的】）有機物の施用によって土壌中の無機態窒素量が少なく推移するにも関わらず，旺盛な生育を示す作物種が存在する。この実験結果から，有機態窒素の吸収が示唆され、可給態窒素の本体であるPEON（Phosphate-buffer Extractable Organic Nitrogen）の吸収が示唆された。本報告では，有機物施用による増収効果を確認し、このPEONの直接的吸収について検証した。
【方法】 実験1：ポット条件下で，無窒素区、硫安区、硫安＋グルコース区（C/N比は10）、菜種油粕区を設け、チンゲンサイ，レタス、シュンギクを栽培した。4週間栽培し，植物の窒素吸収量、土壌の無機態窒素量の推移を観察した。実験2：石英砂を培地とし， 精製したPEONを添加して、上述の作物を栽培した。対照区に蒸留水（-PEON）区、硝安区を設けた。14日間栽培後、植物体を採取し，新鮮重を測定した。また、採取した植物体はパラフィン切片を作製した後、抗PEONウサギIgG抗体、Hrp標識二次抗体を処理し、PEON局在部位をDAB発色させて、顕微鏡観察した。
【結果】)実験1：チンゲンサイは硫安＋グルコース区と菜種油粕区で窒素吸収が旺盛で、シュンギク、レタスは硫安区と菜種油粕区で窒素吸収が多かった。実験2：砂耕条件下では、3作物とも硝安区よりPEON区での生育が良かった。顕微鏡観察から、レタス根の細胞間隙にPEONの局在と思われるDAB発色が観察された。

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葉緑体局在型NADK（NADK2）はPSIIの電子伝達とキサントフィルサイクルを正常に働かせるために必須の酵素である。代謝解析の結果、NADK2高発現体ではカルビン回路の代謝物が増加することが明らかになった。さらにカルビン回路の酵素であるRubisCO及びグリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素の活性化と二酸化炭素取り込み量の増加が観察されたことから、炭素固定能の上昇が示された。一方、本植物体ではグルタミン酸を中心とした遊離アミノ酸が増加し、さらに低窒素条件で生育が著しく悪化することから、窒素代謝への影響が示唆された。それらを明らかにするため、窒素代謝に関わる酵素の発現および活性、イオンについて調査した。高発現体では葉緑体局在型グルタミン合成酵素（GS2）とNADH依存性グルタミン酸合成酵素（GOGAT）の発現が上昇しており、GS/GOGAT経路が発現レベルで上昇していることが明らかになった。ここで、GS/GOGAT経路におけるアミノ酸合成には、硝酸の取り込みと還元による窒素源の供給が必須である。高発現体では硝酸取り込みの上昇と硝酸還元酵素の活性化が観察された。これらの結果から、NADK2の高発現によって硝酸還元活性が上昇し、同時に活性化したGS/GOGATによってアミノ酸合成が促進されていることが推測された。

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窒素同化に必要な炭素骨格の生合成経路の酵素の発現に関わるトウモロコシ転写因子Dof1を発現しているシロイヌナズナ形質転換体では、培地中にアンモニウムが存在すると、窒素同化能力の向上が見られることを既に報告している。同化窒素は、主にクロロフィルやリブロースビスリン酸カルボキシラーゼなどの光合成に関わる酵素の合成に利用されるとされている。そこで、今回、我々は窒素同化能の強化が、通常よりも強い光条件下で炭酸固定や炭素代謝に対してどのような効果を及ぼすのかを調べた。その結果、強光下では、Dof1形質転換植物体のグルタミン量が相対的により多く増加していること、また、3-ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、クエン酸が大きく増加していることが判明した。さらに、通常光下で観察されたDof1形質転換植物体でのリンゴ酸、フマル酸の減少は、強光下では見られなくなっていた。これらのことから、強光下でDof1形質転換植物体では炭酸固定が活性化しているのではと考え、クロロフィル含量と炭酸固定速度を調べたところ、強光下のDof1形質転換植物体ではいずれもが増加していた。さらに、強光下でDof1形質転換植物体では物質生産の指標になるタンパク質やでんぷんも増加していたことから、窒素同化が活性化している条件で強い光エネルギーが供給されると、炭酸固定が活性化し、その結果、物質生産が増大したと考えられる。

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核酸やヌクレオチドの構成成分として豊富に存在し，高い窒素／炭素比を誇るプリン塩基の代謝は，同化窒素の効率的利用の観点から重要な窒素代謝の一つと考えられる。プリン代謝には，代謝中間体を再生するサルベージ経路と，それらをキサンチンに収束したのちに無機分解する異化経路が知られているが，負担の大きい新規合成を回避するサルベージ経路に対して，異化代謝が持つ生理的役割は必ずしも分明ではない。私たちは，プリン異化代謝の初発かつ律速酵素であるキサンチン脱水素酵素（XDH）を標的としたRNAiが，シロイヌナズナにおいて生育遅延，稔性低下，老化の早期誘導などの多面的表現型をもたらすことを明らかにしたが，今回これについてさらに解析を進めた。形質転換体では，2コピー存在する遺伝子（AtXDH1，AtXDH2）のうち，RNAiの直接の標的であるAtXDH1 のみならず，AtXDH2 の発現も共抑制されており，キサンチンが高度に蓄積していた。高濃度のキサンチンは野生株の成長に殆ど影響しないが，形質転換体にプリン異化産物である尿酸を与えるとその生育遅延が回復することから，プリン異化代謝の欠損が形質転換体が呈する表現型の一因であることが示唆された。さらに，キサンチンを唯一の窒素源として野生株は生育できるが，形質転換体の成長は顕著に抑制されることから，プリン異化代謝およびその産物の植物生理学的重要性が示唆された。

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植物の主要な窒素源は硝酸イオンであり、我々はその輸送に関する研究をヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）を材料として行っている。これまでに硝酸イオン能動輸送体NRT2の遺伝子を8個（NRT2;1-NRT2;8）同定したが、それらの機能や活性の違いは不明であった。そこで8個の中で構造的特徴と遺伝子発現様式から重要と思われるNRT2;1、NRT2;3およびNRT2;5の相同組み換えによる破壊株（それぞれΔNRT2;1、ΔNRT2;3およびΔNRT2;5）を作製した。これらはいずれも硝酸イオンを唯一の窒素源として正常に生育した。高濃度の硝酸イオン培地で前培養した原糸体を用いて硝酸イオン取り込み活性を測定したところ、ΔNRT2;1とΔNRT2;5については野生株と大きな差はなかった。これに対してΔNRT2;3は低濃度領域（0～100 μM）での取り込み活性が高く、基質親和性が上昇していた。このときΔNRT2;3では野生株と比べて他のNRT2遺伝子、特にNRT2;1とNRT2;2の発現量が増加していることが明らかになった。このことから、NRT2;3は比較的基質親和性が低く、逆にNRT2;1やNRT2;2は親和性が高いことが推測された。また、高硝酸イオン条件の野生株ではNRT2;3がグルタミンによる抑制を介して他のNRT2遺伝子を間接的に制御していることが示唆された。

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