植物の光合成器官である葉緑体には、独自のゲノム DNA とタンパク質合成系が存在する。これまで、植物葉緑体におけるタンパク質合成に関する多くの研究が行われてきたが、いまだその分子メカニズムは十分理解されているとは言えない。本研究では、葉緑体タンパク質合成に関する新たな知見を得るために、葉緑体において緑葉可溶性タンパク質の約5割を占める程多量に合成される RuBisCO をモデルタンパク質として、その蓄積量が減少したシロイヌナズナ nara (genes necessary for the achievement of RuBisCO accumulation) 変異株をスクリーニングしてきた。これら変異株のひとつである nara12 は、葉緑体ゲノムにコードされる RuBisCO 大サブユニットの翻訳効率が大きく低下していた。またRuBisCO だけでなく、その他の光合成関連の葉緑体タンパク質の蓄積量も減少していた。葉緑体の翻訳に異常が見られたことから、葉緑体ribosomal RNA (rRNA) 量を解析したところ、23S rRNA のプロセシングに異常があることが分かった。一方、その他の葉緑体 rRNA のプロセシングへの影響は比較的軽微であった。以上のことから、nara12 の原因遺伝子は葉緑体の 23S rRNA のプロセシングに関わることが示唆された。

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ダイナミンは自己重合能を持つGTPaseであり、エンドサイトーシス、細胞板形成、ミトコンドリア融合、オルガネラ分裂など生体内の様々な膜の分裂・融合にはたらいている。そのメカニズムはいくつものモデルが立てられているが、生体内での動態はわからない部分が多く、多様な現象をすべて説明できるには至っていない。なかでも、巨大な葉緑体のくびれ切りは小胞をモデルとした現在の仮説ではとうてい説明できない。葉緑体の分裂期にはダイナミン様タンパク質ARC5が分裂面にリング状に局在すること、arc5変異体では葉緑体の数が著しく減少することから葉緑体分裂に重要な役割を果たしていると考えられるが、実際にダイナミンがどのようにして葉緑体を分裂させるのかはわかっていない。そこでダイナミンによる葉緑体分裂のメカニズムの解明を目指し、ARC5の様々な位置にアミノ酸置換を導入したものと蛍光タンパク質GFPとの融合タンパク質をARC5プロモーターによってarc5変異体に発現させ、葉緑体数とタンパク質局在を観察した。変異タンパク質のうち、GTPaseドメインに変異を導入したものでは、葉緑体の分裂面にGFPの蛍光がリング状に局在するが、葉緑体数が減少する表現型は相補しなかったことから、分裂面への局在にはGTPase活性は必要ではないが、正常な分裂には必須である可能性が考えられた。その他の変異タンパク質の解析とあわせ、ダイナミンの葉緑体分裂時の動態を考察する。

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植物に特有なオルガネラである葉緑体はシアノバクテリアの細胞内共生によって生じたと考えられている。葉緑体は分裂によって増殖し、細胞内に維持されるが、その分裂機構は原核型の分裂装置と宿主真核型の分裂装置の両方が関わっていることが示された。これまでに20ラインの葉緑体分裂変異株が同定されたが、宿主由来の葉緑体分裂タンパク質として同定されているのはダイナミン用タンパク質とPDV1/PDV2の2種類のみである。植物ゲノムからはシアノバクテリアの分裂遺伝子の多くが失われているため、多くの宿主由来の分裂タンパク質が未知であると予想される。そこで、シロイヌナズナのアクティベーションタギングライン及びFOXラインから新規葉緑体分裂変異株のスクリーニングを行った。これらのラインを用いることで、遺伝子の機能を増強した変異株と、遺伝子の機能を破壊した変異株の2種類を得ることが可能となる。約30,000ラインのスクリーニングの結果、新規葉緑体分裂変異株を複数株見つけ、そのうちの1つが宿主真核細胞由来であると考えられた。その原因遺伝子はバクテリアにはない機能未知なタンパク質をコードし、葉緑体移行シグナルとコイルドコイルドメインを持つ膜貫通タンパク質と推測された。本発表では、葉緑体分裂変異株のスクリーニングと、そこから得られた新規葉緑体分裂因子について報告する。

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葉緑体は、シアノバクテリアの細胞内共生によって成立したと考えられおり、核による厳密な制御の下に分裂し増殖する。この細胞内共生は、シアノバクテリアの細胞内への取り込み、および分裂させ数を維持する機構を身につけることによって確立されたと考えられる。細胞内で葉緑体数を調節する機構については、あまりわかっていない。増殖制御機構の解明は、いかにして真核細胞が成立し進化してきたかを理解する上で重要である。その分裂装置は最近まで不明であったが、葉緑体とミトコンドリアの分裂面にリング上の装置が電子顕微鏡観察によって発見され、葉緑体分裂面上には祖先のバクテリアと同様にFtsZタンパク質からなるリングを形成していることが示された。さらに、その外側には、真核由来のダイナミンタンパク質が存在し、分裂装置は原核型と真核型の両タンパク質によって構成されるハイブリット装置であることが示された。それに対して、分裂時期を決定する因子については、まだわかっていない。葉緑体が一つの生物シアニディオシゾンなどでは、細胞周期に連動する形で葉緑体分裂を行っている。細胞内に複数の葉緑体を有する高等植物では一見ランダムに分裂しているように見えるが、これらはどのような調節を受けているのだろうか？様々なシロイヌナズナの変異体の解析から、葉緑体分裂における新規調節機構の存在が示唆されたので、これらについて報告したい。

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葉緑体はシアノバクテリアの祖先種の細胞内共生によって生じたと考えられ、分裂によって増殖する。葉緑体の分裂には、FtsZなどの共生体由来のタンパク質と ダイナミンなどの宿主由来のタンパク質が関与していることが明らかになっている。当研究室では、新規葉緑体分裂関連因子を同定するためにシロイヌナズナのアクチべーションタギングラインおよびFOXラインをスクリーニングし、いくつかの遺伝子を同定している。本研究では、FOXラインから得られた葉緑体が巨大化したラインの原因cDNAを同定し、解析を行った。同定したcDNAは、葉緑体包膜局在と予想されるタンパク質をコードしており、シアノバクテリアや紅藻、緑色植物に広く存在し、マラリア原虫にも保存されていた。この遺伝子は、一部のバクテリアでFtsAやFtsZなどの細胞分裂因子をコードする遺伝子とオペロンを構成することから、分裂に何らかの役割を担うことが予想されるが、機能は明らかにされていない。現在、GFP融合タンパク質を用いて葉緑体内局在を調べると共に、T-DNA挿入変異体の解析も行っているので、それらを合わせて報告したい。

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The catalytic F₁ complex of ATP synthase is the smallest mechanical motor known. The ATPase function is coupled to the stepwise rotation of the γ subunit in a catalytic core formed by three copies of subunits α and β. Tentoxin, a cyclic peptide produced by phytopathogenic fungi of the Alternaria species inactivates the F₁-ATPase in sensitive species at micromolar concentrations, whereas milimolar amounts of the toxin restore and surpass the natural enzyme activity. Although it is known that this inhibition and stimulation is related to the binding of one and two or three molecules of tentoxin, the mechanism of the change of the activity is not known very well. Here we report the detailed molecular mechanism of the regulation revealed by the single molecule analysis.

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The primary stress on photosynthetic organisms is their life-giving sun. To counteract this stress, eukaryotic photosynthesizers have developed methods to recruit light-harvesting carotenoids for photoprotection. During the xanthophyll cycle, violaxanthin is rapidly de-epoxidated to help quench energy flow from the reaction center. While this reaction is efficient in land plants, it is unproductive in the model alga Chlamydomonas reinhardtii. As the earliest branching green algal group, the prasinophytes are of primary interest to the origin of eukaryotic light-adaptation. Our work characterizes the xanthophyll cycle in the model prasinophyte Ostreococcus tauri. Under high-light stress, O. tauri effectively converts up to 50% of its violaxanthin to antheraxanthin to zeaxanthin. Spectroscopic analysis reveals that this conversion correlates to a large increase in non-photochemical quenching, indicative of an effective photoprotective measure. This rapid change is a useful adaptation under changing environmental conditions and is likely a necessary practice for this inter-tidal Ostreococcus species.

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ステート遷移は、植物が様々な光環境条件に適応するための機構である。ステート遷移が起きる際、光化学系II(PSII)の周辺集光装置である集光アンテナタンパク質(LHCII)は、可逆的に光化学系I(PSI)周辺へ移動すると考えられている。最近、我々は、ステート2で形成されるPSI-LHCI/II超複合体には、3つのLHCIIが含まれていることを報告した。またシングルパーティクル解析などから、これらのLHCIIのうち、特にCP29は、PSIと他のLHCIIの間のリンカーであることが予想されている。そこで本研究では、ステート遷移におけるCP29の機能を、より直接的に明らかにするため、緑藻クラミドモナスを用いCP29のRNAi株(b4i)を作成した。得られたb4i-8株をステート2誘導条件下に置き、そのチラコイド膜を用いてショ糖密度勾配超遠心解析を行ったところ、PSI-LHCI/II超複合体は観察できなかった。しかし、この他のクロロフィル蛍光解析及び電子伝達解析の結果から、b4-8i株はステート遷移能を持つことが確認された。これらの結果より、CP29はステート2条件下においてPSI-LHCI/II超複合体の安定性へ寄与するが、ステート遷移において必須ではないことが明らかとなった。本大会では、CP29以外のRNAi株の解析も併せて、ステート遷移におけるCP29の重要性について議論する。

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刻々と変化する光環境下では，集光アンテナタンパク質（LHCII）が各光化学系（PSI，PSII）の光吸収断面を調節することにより，安全で効率の良い光合成を可能としている．このような光環境適応機構の一つがステート遷移である．近年，LHCIIがPSIに結合したタンパク質超複合体の精製が報告され，ステート遷移におけるLHCIIの移動，そしてPSIへの結合が証明されつつある．一方，それと同時に起きているはずのLHCIIがPSIIから脱離する過程については未だ詳細は不明である．本研究では，変異体クラミドモナスを用いたニッケル吸着クロマトグラフィーにより，PSII-LHCII超複合体の精製を行い，ステート遷移におけるLHCIIのPSIIからの脱離について解析した．ゲルろ過の結果，1500 kDa, 750 kDa, 480 kDaの3種類のPSII-LHCII超複合体が存在することが示され，LHCIIの脱離によってそれらの割合が変化することがわかった．また，その際のLHCII脱離とリン酸化の関係を詳細に解析した．得られた結果をもとに，ステート遷移におけるLHCII脱離機構のモデルを報告する．

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植物は多くの環境ストレスにおいて余剰な光エネルギーに暴露される。特に、強光乾燥下では気孔閉鎖に伴いCO2固定反応が停止するが、このときチラコイド膜の電気化学ポテンシャルがどのように制御されているについては知見が少ない。本研究では強光乾燥耐性に優れる野生種スイカの生葉を実験材料に、強光乾燥ストレス下におけるチラコイド膜のプロトン透過流量および電子伝達量との関係を、non-focusing opticsを利用したカロテノイド吸収のelectrochromic shift (ECS)測定とクロロフィル蛍光測定を併用することにより評価した。光照射定常条件下の葉に300 msの暗処理を行なった際のECS強度変化とECS減衰の時定数から、チラコイド膜を介したプロトン透過流量を見積った。その結果、直鎖型電子伝達量当たりのプロトン透過流量は、潅水下に比べて強光乾燥下の野生種スイカ葉において顕著に大きいことが見出された。また、methyl viologen (MV)を浸潤させたリーフディスクを用いて同様の測定を行なったところ、潅水下の葉ではMV処理はプロトン透過流量に大きな影響を及ぼさないが、強光乾燥下の葉ではMV処理によりプロトン透過流量の顕著な低下が見られた。これらの実験結果は、強光乾燥ストレス下の野生種スイカ葉において、光化学系Iサイクリック電子伝達経路が活性化していることを示唆している。

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高等植物葉緑体NDH(NAD(P)H dehydrogenase)はチラコイド膜に局在し、光化学系I循環的電子伝達経路で機能する複合体である。NDHの生理的機能としては、C₃植物では高温・低温・乾燥等の環境ストレス条件下での光酸化ストレス回避に重要であること、C₄植物ではCO₂の濃縮機構を駆動するためのエネルギー供給に重要であることが知られている。一方、そのサブユニット組成に着目すると、NDHは呼吸鎖の複合体Iのホモログであり、11種の葉緑体ゲノムコードのサブユニットと3種以上の核ゲノムコードのサブユニットから構成される巨大な複合体である。しかし、変異株解析やプロテオーム解析が相次いで報告されている現在でも、その電子供与体の認識と酸化に関与するサブユニット群は未だ同定されていない。
そこで私たちは、まずバイオインフォマティクスの手法、すなわち、共発現解析と系統プロファイル法を用いてNDHサブユニットの候補を65タンパク質にまで絞り込んだ。次に、それらのT-DNA挿入変異株のNDH活性を測定することで、6つのNDH欠損株を単離し、NDF(NDH-Dependent cyclic electron Flow)変異株と名づけた。本発表では4つのNDFタンパク質(NDF1-4)についてその解析結果を紹介し、NDHの新規サブユニットであるかどうかについて議論する。

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The mechanism by which plants regulate channeling of photosynthetically derived electrons into different areas of chloroplast metabolism remains obscure. Possible fates of such electrons include carbon assimilation, nitrogen assimilation and signaling pathways, or return to the plastoquinone pool through cyclic electron flow. In higher plants, these electrons are made accessible to stromal enzymes, or for cyclic electron flow, as reduced ferredoxin (Fd), or NADPH. We investigated how knock-out of an Arabidopsis ferredoxin:NADPH reductase (FNR) isoprotein, and the loss of strong thylakoid binding by the remaining FNR in this mutant, affected channeling of photosynthetic electrons into NADPH and Fd dependent metabolism. We found significant differences in electron channeling in the chloroplasts of mutant and wild type plants, and in addition uncovered evidence that FNR may be involved in stress signaling. Taken together, our results demonstrate the integral role played by FNR isoform and location in the partitioning of photosynthetic reducing power.

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シアノバクテリアは、高い環状電子伝達活性を持つ。そこには、多くの経路が関与していることが示唆されているが、その正確な経路や構成成分はまだ解明されていない。それらの点を明らかにするために、シアノバクテリアのSynechocystis PCC 6803のチラコイド膜を用いて、無細胞系での環状電子伝達系の再構成を試みた。チラコイド膜の調製法を改良して、活性の高い膜画分を得た。これに、DCMU存在下で可溶性画分を加えると、環状電子伝達活性が再構成された。この系を用いて環状電子伝達系に関与する可溶性成分、さらには膜結合成分の同定を試みた。可溶性画分を分画して添加し、活性が見られるか調べた。その結果、重要な成分としてフェレドキシン（Fd）を同定することができた。チラコイド膜にFdとNADPHまたはNADHを加えるだけで、環状電子伝達系が再構成された。電子供与体としてNADPHまたはNADHを使用したときの、それぞれの環状電子伝達系の経路を調べた。その結果、NADHを電子供与体とした場合、ロテノンにより活性が大きく阻害された。したがって、NADHを電子供与体とするときは主にNAD(P)H脱水素酵素複合体1（NDH-1）を介する経路を使用することがわかった。現在、NDH-1活性を保持するチラコイド膜を用いて、NDH-1の電子受容体部分のタンパク質の同定を試みている。その結果についても報告する。

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葉に光が当るとチラコイド膜を電子が流れ、光のエネルギーは化学エネルギーへと変換される。化学エネルギー（ATP、NADPH）は炭酸固定を始めとする様々な代謝により消費される。本研究では、光合成電子伝達反応に異常を示すシロイヌナズナ突然変異体の単離を試みた。特に、光化学系Iサイクリック電子伝達などリニアー電子伝達以外の経路の変異体を得ることを目的とした。低酸素条件下（2% O2）でクロロフィル蛍光を測定し突然変異体の選抜を行い、約30,000株のF2集団（EMS処理由来）から37系統の変異株を得た。低酸素条件下でのクロロフィル蛍光誘導に特に著しい表現型を示すNo.8変異株について原因遺伝子の同定を行ったところ、fructose-1,6-bisphosphate aldolase遺伝子（At4g38970）に変異を見出した。葉緑体の総アルドラーゼ活性は、野生株よりも変異株の方が約20％低かった。空気中の電子伝達活性も変異株の方が小さかった。また、連続光消灯後のクロロフィル蛍光強度の変化（一過的上昇）から、変異株においてはストロマ成分（NADPH）による電子伝達体（プラストキノンPQ）の還元活性が極めて大きいことが示唆された。さらに変異株において、野生株では検出できない（ストロマ成分による）PQ還元活性を見出した。

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光合成電子伝達反応において電子は光化学系ΙΙから光化学系Ιへと伝達される。電子はさらに電子受容体NADP⁺へ流れ、葉緑体ストロマに還元力NADPHが蓄積する。電子伝達に伴い形成されたチラコイド膜内外のプロトン濃度勾配はATP合成の駆動力となる。生成されたNADPHおよびATPは炭酸固定を始めとする様々な代謝により消費される。強光下など光合成能力を超える電子伝達が可能な条件下ではNADPHの過剰な蓄積により電子伝達は滞り、光合成機能の阻害を引き起こす原因となる。本研究では、系Ι受容体側の電子伝達の制限について調べた。弱光下の定常状態で系Ι反応中心クロロフィル（P700）は全て還元型であった。P700は光強度の上昇とともに酸化された。これは、プロトン濃度勾配の形成による光合成制御を反映する。飽和光パルスの照射によるP700の酸化を調べたところ、極端な強光下に加えて弱光下においてもP700の最大酸化を得ることはできなかった。これは、還元型不活性P700の蓄積によると思われる。弱光下でP700が全て還元型にある場合、系Ι電子伝達の効率はほぼ100％であると考えられている。上記の結果は、弱光下でも系Ι電子伝達の効率は制御されていることを示す。弱光下での還元型不活性P700の蓄積の原因は、ストロマにおける電子受容体の不足にあることが分かった。

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光化学系I(PSI)サイクリック電子伝達は、リニア電子伝達と同様、光合成と光防御に不可欠である。PSIサイクリック電子伝達にはPGR5依存の経路とNDH依存の経路があり、高等植物ではPGR5依存の経路がメインの機能を担っている。PGR5の過剰発現はPSIサイクリック電子伝達を増幅させ、結果として葉緑体分化に影響を与えた。過剰発現株ではプラストキノン(PQ)の還元状態が野生株に比べて高く、このことが表現型の原因であると考えられる。葉緑体分化時においてカロテノイドおよびクロロフィルの合成には、PTOXによりPQの酸化還元状態が保たれることが重要である。PTOXはミトコンドリアのterminal oxidaseであるAOXのホモログで、葉緑体おいてPQの酸化を触媒する。PTOXを欠損する突然変異株、immutansはPQの高い還元状態のため斑入りの表現型を示す。以上のことから、PSIサイクリック電子伝達とPTOXの活性が、葉緑体分化時に相互に関与していることが示唆された。
そこでPSIサイクリック電子伝達の欠損株であるpgr5とimmutansの二重変異株を作出し表現型の解析を行った。その結果、二重変異株では斑入りの表現型が部分的に抑制された。このことから、葉緑体分化初期にPSIサイクリック電子伝達がPQ還元活性を持つことが示唆された。

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The chloroplast NAD(P)H dehydrogenase (NDH) complex functions in PSI cyclic electron transport and chlororespiration. The electron donor binding module is still unclear. An Arabidopsis crr6 mutant was isolated based on the chlorophyll fluorescence. Photosynthetic electron transport and protein blot analyses indicate that the specific defect of the NDH complex in the mutant due to the mutation of CRR6. However, CRR6 protein was stable in other crr mutants. Inconsistently with our previous report, western blot analyses showed that the CRR6 dominantly localized in the stroma fraction and trace amount of it associate with thylakoid membrane. This result suggests that CRR6 transiently interacts with NDH complex, possibly as a subunit of electron donor binding module present in the stroma.

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PGR5 (proton gradient regulation)タンパク質は、葉緑体チラコイド膜に局在する表在性タンパク質で、光化学系I(PSI)を中心としたサイクリックな電子伝達経路であるフェレドキシン依存プラストキノン還元(FQR)経路に必須な因子として同定された。しかし、PGR5タンパク質を含むFQR複合体の生化学的な実体は、まだわかっていない。私たちは、PGR5の生化学的な実体解明からこのタンパク質の機能に迫ることを目指し、まずホウレンソウ緑葉から抽出精製した成熟タンパク質のN末端配列を決定した。次に、PGR5タンパク質の葉緑体内における局在を明らかにするため、無傷葉緑体を用いてプロテアーゼ消化実験を行った。さらに、PGR5タンパク質がチラコイド膜のどの複合体と共局在するのかを明らかにするために、チラコイド膜を界面活性剤で可溶化し、ショ糖勾配遠心によって複合体を分離することによって解析した。これら一連のの研究結果を報告し、PGR5の生化学的な役割を考察する。

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光合成において過剰な光エネルギーは光化学系IIに障害をあたえ、光合成機能の低下を引き起こす。これを回避するため、光化学系IIでは障害をうけたD1タンパク質を直ちに分解し、系全体の機能維持を行うための修復サイクルが重要であると考えられている。光化学系IIの維持に最も重要であると考えられているD1分解には、チラコイド膜局在型のATP依存型メタロプロテアーゼFtsHの関与が示唆されている。しかし、FtsHプロテアーゼ複合体を欠損したシロイヌナズナ変異体var2は斑入りであるためin vivoでの解析が困難であった。そこで本研究では当研究室で見出され斑入りが回復したfug1 var2二重変異体を用いて均一な葉組織を準備し、in vivoにおけるD1分解の検出と解析を試みた。葉緑体のタンパク質合成阻害剤であるリンコマイシンによってfug1, fug1 var2の葉を処理した後、強光条件下でのD1分解を比較した。その結果、fug1ではD1が速やかに分解されたのに対し、fug1 var2ではD1分解の顕著な遅延が認められた。この遅延は、強光条件だけでなく葉を弱光条件下に置いた場合にも観察された。以上の結果は、これまで示唆されてきたin vivoでのFtsHによるD1分解を強く支持するもので、FtsHがD1分解に寄与する主要なプロテアーゼであることが裏付けられた。

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FtsH is an ATP-dependent metalloprotease and present as a hetero-complex in thylakoid membranes. FtsH2, encoded in Arabidopsis VAR2 locus, is a major isoform. Lack of FtsH2 results in a typical leaf-variegated phenotype. While we have identified more than 20 var2 alleles, none of the mutations was found in the catalytic center of protease activity (comprised by zinc-binding domain). To test the importance of this domain, we replaced one of the essential histidine residues in the domain with leucine, and over expressed it in var2. We found that this mutation in E. coli FtsH abolishes protease activity in vivo, and that the mutated FtsH2 rescued the variegated phenotype in var2. The result implies that the protein level rather than the protease activity determines leaf variegation. Loss of the protease activity may be mitigated by other isoforms of the FtsH complex. Experiments to clarify these observations are currently underway.

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高等植物には光化学系II（PSII）酸素発生系タンパク質（OEC）であるPsbPに加えて、PsbPドメインを持つ機能未知のパラログが複数存在している。特に我々がPsbP-like（PPL）と呼ぶ2つのタンパク質（PPL1、PPL2）は、その配列からシアノバクテリアのPsbPホモログ（cyanoP）により近い原核型のパラログであり、cyanoPが光合成の進化の過程でPsbPやPPLを含む多様なPsbPドメインタンパク質となり、様々な生理機能を担っている可能性を示唆していた。そこで本研究では、PsbPドメイン機能の多様性と重要性を明らかにするべく、シロイヌナズナppl1及びppl2変異株を用いてPPL1およびPPL2の生理機能の解明を試みた。その結果、PPL1はPSIIの構成的なサブユニットではないものの、強光時におけるPSIIサイクルの修復段階に関与していること、またPPL2は循環的電子伝達のうち、乾燥・低温・高温といった環境ストレスでの役割が示唆されている経路を担うNAD(P)H dehydrogenase (NDH) 複合体の活性および蓄積に必須の因子であることを明らかにした（Ishihara et al. Plant physiol. 2007）。これらの結果から、PsbPパラログがPSIIに限らない広範なチラコイド膜機能に関わっていることが示された。

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昨年の年会で報告した、ネットワーク解析に基づく共発現予測アルゴリズムを、公開されているシロイヌナズナDNAマイクロアレイデータセット（1，388枚）に適用した。その適用結果に基づき、22，263遺伝子の中から、互いに高い相関を示す約300グループの遺伝子群に注目した。これらの遺伝子群は各群内で機能的に関連していると考え、機能的な関連性を示す個々の生物プロセスに対応すると仮定した。そこで、共発現解析に基づく生物プロセスの予測データベースを作成して一般公開した。従来の植物共発現解析データベースでは、ユーザーが注目する遺伝子群に対する共発現遺伝子を検索できる（遺伝子群対遺伝子群）が、本データベースは、あらかじめ生物プロセスに共発現遺伝子群を対応付けており、ユーザーは注目遺伝子群が関与する生物プロセスを検索することができる（遺伝子群対生物プロセス）。各プロセスはネットワークトポロジーに基づく共発現性の強い順に、対応する共発現ネットワーク、遺伝子機能情報、代謝経路との関連等に関して順次公開している。

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トランスクリプトミクスとメタボロミクスの統合解析やDNAアレイの公開データの解析により、シロイヌナズナの様々な条件下で同調的に制御される遺伝子群および代謝産物群の予測が可能になった。これらのオミックス解析は、同一代謝経路で働く生合成遺伝子群およびその転写制御因子の機能予測に有効である[1]。本研究では、オミックス解析から推定されたメチオニン由来グルコシノレート (MET-GSL) 生合成の転写制御因子 PMG1, PMG2, PMG3 の過剰発現株と機能破壊株およびその掛け合わせ体の代謝産物と転写産物を解析した。その結果、最も顕著な変化が見られた転写制御因子のダブルノックアウトラインpmg1pmg2では、種子およびロゼット葉で MET-GSL が検出されず、トリプトファン由来のインドールグルコシノレートのみが検出された。また DNA マイクロアレイで転写レベルを測定した結果、 pmg1pmg2では野生型と比較してMET-GSL 生合成に関与する既知および候補遺伝子と PMG 3 の発現が顕著に減少した。さらに、PMG2過剰発現株の種子では、野生株の約10倍にMET-GSLが増加した。これらの結果から、PMG1とPMG2は、MET-GSL生合成遺伝子の主要な転写制御因子であることがわかった。現在、機能未知のPMG3およびMET-GSL生合成遺伝子候補の機能解析を行っている。[1] PNAS 104, 6478-6483

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メチオニン由来グルコシノレート（MET-GSL）生合成にかかわる2つの転写因子PMG1, PMG2のダブルノックアウト体（pmg1pmg2）ではMET-GSLが検出されないことが明らかとなった(本大会 澤田ら発表 )。マイクロアレイ解析によると新規候補転写因子PMG3の発現がpmg1pmg2の葉で顕著に低下していた。本研究ではPMG3の機能解明に向けて、液体振とう培養したシロイヌナズナ実生におけるPMG1、PMG2およびPMG3の発現量を定量的PCRにより詳細に解析した。MET-GSLが減少しているpmg1株におけるPMG2, PMG3の発現量はそれぞれ野生型の30%, 10%であった。またMET-GLSが全く検出されないpmg1pmg2株におけるPMG3の発現量は野生型の5%であった。一方、MET-GSLの減少が見られなかったpmg2株におけるPMG1, PMG3の発現量はそれぞれ野生型の100%, 40%であった。以上の結果より、PMG1が主たる制御因子であること、およびPMG3はPMG1, PMG2の制御下にあり、MET-GSL生合成制御に関わっていることが示唆された。現在、PMG3のノックアウト株も用いて、様々な条件下での発現解析を行っている。

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植物は移動の自由がないため、乾燥、低温、塩などのストレスに対する独自の制御機構を備えている。これまでにDNAマイクロアレイ法などを用いて、乾燥、低温、塩などのストレスに対し発現応答する植物遺伝子が多数単離され、それらの機能が同定されつつある。また、近年の研究で広範囲の生物においてタンパク質をコードしないRNAが大量に存在することが明らかになりつつあり、これらのRNAの機能が注目されている。そこで私たちは新規RNAの探索・機能解析を目指して、タイリングアレイを用いてシロイヌナズナの全ゲノムトランスクリプトーム解析を行った。
乾燥、低温、塩などのストレスやABA処理(2時間および10時間)したサンプルを用いて発現解析を行い。AGIコード遺伝子以外に新規な転写単位を7,719個同定した。これらの新規RNAの大半は既知のタンパク質をコードしないものであり、約9割はAGIコード遺伝子の反対鎖にマップされていた。興味深い事に新規転写単位とアンチセンス鎖に存在するAGIコード遺伝子の発現応答性の間に高い相同性が存在する事が明らかになった。アンチセンスRNAが存在するストレス応答性遺伝子領域の幾つかについてノーザンおよびreal time RT-PCR解析を行い、ストレス応答性のアンチセンスRNAの存在を確認した。現在、これらのストレス応答性のアンチセンスRNAの生成メカニズムと機能に関する解析を進めている。

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アブシジン酸(ABA)は種子休眠を制御する主要な植物ホルモンである。我々は、ABAによって制御される種子休眠・発芽を制御する遺伝子群やその制御機構を明らかにするために、ABA欠損変異株（aba2）とABA過剰蓄積変異株(cyp707a1 cyp707a2 cyp707a3)の種子におけるタイリングアレイを用いたトランスクリプトーム解析を行った。その結果、予想に反して乾燥種子における遺伝子発現変化は変異株と野生株の間で大きな差は認められなかった。一方、吸水24時間後の種子では多数の遺伝子発現が認められ、種子におけるABA応答性遺伝子群を同定した。さらに、我々は重複のない4884の新奇遺伝子を種子から同定した。驚いたことに新奇遺伝子の約93%がタンパク質をコードしていないものであることが推測された。また、新奇遺伝子が既存の遺伝子とantisense関係にあるものや、既知の遺伝子と遺伝子の間で発現しているもの、新奇遺伝子どうしがsense鎖とantisense鎖の関係にあるものなど、非常に様々なタイプの転写がゲノム上で行われているこが明らかとなった。現在、タイリングアレイによって明らかにされたタンパク質をコードしていないと推定される新奇遺伝子に着目して、機能解析を進めている。

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高等植物のコアプロモーター因子としてはTATAボックス、Inrが知られているのみであり、極めて知見が少ないのが現状である。私たちは植物プロモーターのゲノムワイドな統計解析（Yamamoto et al, BMC Genomics 8: 67, 2007、Yamamoto et al, Nucleic Acids Res 35: 6219, 2007）から、新規のコアプロモーター因子と見られるグループを4種類ほど同定してきた。今回CapTrapper-MPSS法という手法を開発し、大規模TSS解析を行った。植物コアプロモーター因子群と遺伝子発現との相関解析を行った結果、それぞれの因子に関して遺伝子発現に与える特徴を見出した。また、因子間の親和性を調べたところ、シロイヌナズナコアプロモーターは二つの排他的なグループに分かれることが明らかになった。我々の抽出したプロモーター因子並びに大規模TSS解析結果はデータベース上で公開している(http://ppdb.gene.nagoya-u.ac.jp)。

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私たちはヒメツリガネゴケにおいて葉細胞が多能性幹細胞へと分化転換する系を確立し、多能性幹細胞化の分子機構解明を目指し研究を行っている。分化転換過程の理解には全トランスクリプトーム及びクロマチン動態のゲノムワイドな解析が必要だと考えられ、次世代高速シーケンサーを用いたシーケンスベースの解析手法の開発を行っている。本研究ではトランスクリプトーム解析における次世代高速シーケンサーの有用性について検討を行った。そこで、mRNA-3’末端及びsmall RNAの大規模配列決定を454シーケンサーで行った。mRNA-3’末端配列を決定するためには、独自に配列決定法を開発した。この手法では逆転写の際にmRNAのpolyA配列について改変型dTを含むアダプタープライマーにより高効率にトラップし、454シーケンサーで読み取り可能な構造にしたライブラリーを構築し大規模な配列決定を行う。これまでに、mRNA-3’末端配列については5つの組織由来のmRNAサンプルについて延べ193万リード、small RNAについては分化転換葉について56万リードを取得した。mRNA-3’末端配列については、ゲノムへのマッピングを行ったところ3’末端配列を濃縮できていることを確認した。

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（目的）植物個体は栄養状態やストレスを感知し、最終的に遺伝子の発現を変化させることで環境変化に適応する。ゆえに細胞核はもっとも重要な細胞内オルガネラのひとつである。外部環境に応答した核内タンパク質、特に転写因子、の組成変化を包括的に解析する方法論の確立に向けて、核タンパク質のプロテオーム解析を試みているので報告する。（方法と結果）栄養成長段階にある播種後5週のイネ地上部よりパーコール密度勾配遠心法を用いて核を単離し、塩化カリウムを用いて核内容物を抽出した。イオントラップ型のnanoLC/MSを用いて解析したところ、182個のタンパク質が同定された。同定タンパク質はリボゾームタンパク質、RNAヘリガーゼ等の比較的存在量が多いと考えられるタンパク質が中心であり、DNA結合タンパク質についてはヒストンH1・H2A・H2B・H3・H4の全てが検出された一方で、転写因子等の制御因子の割合は全体の1割程度にとどまっていた。そこで転写因子の同定数の向上を目的として、1）ヘパリンカラムクロマトグラフィー、2）DNAアフィニティーカラムクロマトグラフィーによるDNA結合タンパク質の濃縮を試みている。これらの手法の有用性について議論する。

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光は植物の生育に必須な要素である。過去、植物の光応答に関する様々な研究がなされており、短時間の光刺激による情報伝達経路の活性化や長時間の光照射によって誘導される代謝経路の活性化などが示されている。我々は、植物の光応答を包括的に明らかにするために、比較プロテオーム解析を行った。播種後13日間暗所で生育させたイネとその後24時間明所で生育させたイネの地上部より蛋白質を抽出し、ゲル電気泳動により40の画分に分画した。ゲル内トリプシン消化で得られたペプチドをナノフロー液体クロマトグラフィーとイオントラップ型質量分析計を用いて解析し、それぞれ868、1026個の蛋白質を同定した。相対蛋白質量の比較には同位体標識法の替わりに検出されたペプチドイオンのシグナル強度を比較する方法を用いても可能であるという知見が得られたので、シグナル強度により600個以上の蛋白質の相対量の比較解析を行った。その結果、リブロース1,5-ビスリン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼとその活性化因子、グリコール酸オキシダーゼ等の炭酸固定・光呼吸に関わる酵素の発現上昇が確認され、光応答による発現変動が検出されていることが分かった。現在、光刺激による個々の蛋白質の相対量の経時変化について詳細な解析を行っている。様々な代謝経路及び情報伝達経路の光刺激による一括した応答について議論したい。

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植物の生理的な機能を基盤とした工業原料等の有用物質の生産を可能とする為に、植物の物質生産プロセスを解明することが必要とされている。セルロースを主成分とする細胞壁は、紙パルプ、バイオ燃料、バイオプラスチックなどの工業原料として利用価値が高く非常に有用である。ところが、細胞壁の形成は非常に多くの酵素が関与する複雑なプロセスである為、未知の部分が多い。そのプロセスを解明する為の手段として、公開されているシロイヌナズナのマイクロアレイデータを基にした遺伝子共発現相関解析を用い、それにより得られた有望な候補遺伝子に関して実験的な解析を進めている。
それら候補遺伝子に関して、シロイヌナズナ培養細胞T87を材料として形質転換体を作製した。それらの中で一次壁形成をターゲットとした転写因子のデキサメタゾン（DEX）誘導型RNAiが、DEX処理により生育が抑制され致死になるという表現型を示した。また、植物体のRNAiにおいても、幼植物をDEX処理することにより根の生育が抑制され培養細胞と同様に致死となることが確認できた。今回、この転写因子の機能に関して、マイクロアレイ解析やガスクロマトグラフィー質量分析器などを利用したメタボロミクス解析を含めて報告する。

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植物の外部環境の刺激に対する代謝物レベルの応答は、恒常性維持のための細胞レベルさらに個体レベルの代謝物バランス変動と捉えることができる。その応答を解析するには、経時的に変動する代謝物バランスを簡便に記述する方法や、化学反応の方向を詳細に記述する動的な解析手段が必要である。そこで我々は、外部刺激のコントロールが容易な培養細胞系を用い、物質動態情報を抽出する方法論を構築する事とした。まず、モデル系としてシロイヌナズナT87培養細胞を用い、種々の化学刺激で誘導される代謝物の¹H-NMR解析から、刺激応答に即した代謝変動を簡便に抽出できた。さらに、T87培養細胞を¹³C安定同位体標識し、¹H-¹³C HSQC、HCCH-TOCSY、HCACO等の測定法を駆使することで遊離の低分子主要代謝物を同定し、¹³C-¹³Cカップリング等に基づいた、代謝フラックス解析の基盤となる動態情報の抽出を行った。本会では、新たに不溶性の高分子代謝物も解析対象とし、蓄積された高分子物質と遊離物質との比較も議論する。これは植物の外部刺激の応答による代謝物バランス変動が、高分子バイオマスの蓄積などの表現型として表れることを理解しようとするものである。食糧やエネルギー源である植物の生産性を向上させる代謝工学の実現には、この表現型に至る物質動態を記述する方法論構築が不可欠であり、その展望についても議論したい。

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我々は昨年までに、未知代謝物について、LC/FT-ICR-MS分析から得た化学構造的情報を付した代謝物アノテーション手法について報告した。本研究では、この手法によって得られた代謝物情報のデータベース化、並びにこれらの情報の生物学的な知見への応用についてトマト果実の例を報告する。
成熟段階の異なるトマト（Micro-Tom）果実から調製したメタノール抽出液のLC/FT-ICR-MS分析によって、総計869の代謝物情報を得、代謝物データベースを作成した。既存の代謝物データベースでの検索結果から、494の代謝物については、新規であることが示唆された。代謝物数は、総じて果肉よりも果皮が多く、また果実成熟により増加し、組成も変化することが分かった。取得した代謝物の全組成式比較の結果、トマト果実ではhexoseやcaffeic acid、malonic acidなどの付加反応が起こりやすいことが分かった。二次代謝物については、70種のフラボノイド、93種のグリコアルカロイドの代謝物情報を得た。これらについては、さらに多段階MS/MS分析により構造相関を予測し、いずれも成熟に伴い、配糖化などの付加による修飾反応が進むことが分かった。また、野生株と変異株の比較においても代謝物アノテーション情報が有用であることについても紹介する。本研究の一部は生研センター異分野融合研究事業の補助を受け実施された。

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Metabolomics is a powerful high-throughput tool in the functional annotation of genes. We applied gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry (GC-TOF/MS)-based techniques to detect changes in the metabolite profile of 345 3-weeks-old independent Arabidopsis lines overexpressing full-length rice cDNAs (Rice-Arabidopsis FOX lines).
Out of these 345 T2-lines analyzed, 234 showed a wild type phenotype and 111 exhibited an altered phenotype under defined growth conditions. The secondary screen of a total of 50 lines confirmed the metabolite change in 26 lines.
Data for one retransformed Arabidopsis line with a metabolic change in accordance with the results obtained in the primary and secondary screen will be presented. The line harbors a rice cDNA of unknown function. The linkage between metabolomic and transcriptomic changes in this line sheds light on the relationship between nitrogen-assimilatory and developmental pathways. The analysis of the corresponding rice overexpressor line will be presented as well.

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植物細胞において液胞は細胞体積の約8割を占めるオルガネラであり、膨圧形成、無機イオンや代謝産物の蓄積、不要となったタンパク質の分解など細胞内恒常性の維持に重要な役割を果たしている。その機能から液胞内に存在すると思われる物質がこれまでにいくつか報告されてきているが、液胞内に実際にどんな物質が含まれているのか、直接的かつ網羅的に調べた研究はほとんどない。我々は、すでにいくつかの培養細胞（ニチニチソウ、シロイヌナズナ、タバコ）や植物体（シロイヌナズナ、シャジクモ）から、液胞内物質を含んだ状態でのインタクト液胞ないし、液胞内液を単離する方法を確立している。今回、単離したインタクト液胞より液胞内液を調製、または直接採取した液胞内液をCE-MSやFT-ICR-MSにより分析した。その結果、すでに液胞内に含まれていることが知られていた物質の他に、これまで知られている液胞内環境からは想像しにくい物質の存在を、多数確認している。現在、これらの物質が、サンプル調製の際に混入したのか、あるいは実際に液胞に存在するのか、その詳細を検討中なので、それについても併せて報告する。

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液胞は細胞内において様々な化合物の貯蔵・分解・隔離を司っている．液胞内に存在する化合物の種類や量は植物の成長や外部環境によって変化することが予想される．そのため，液胞内のメタボローム情報を知ることは，その細胞の成長の状態や環境への応答反応を化合物レベルから理解することに有用であると考えられる．その際、一つの細胞から単離した一つの液胞内におけるメタボローム情報を得ることが理想的となる．しかし，シロイヌナズナなどのモデル植物では一つの細胞の体積が極めて小さくまた液胞の単離も困難である．そこで我々は淡水に住む藻類であるオオシャジクモに注目した．オオシャジクモの節間細胞は大きいもので長さが10 cmを超え、一つの節間細胞から液胞内液を10 μL以上採取することが可能である．我々はガラスキャピラリーを用いて液胞内液を採取し、昨年度の本大会で報告したキャピラリー電気泳動/質量分析装置（CE-MS）を用いたメタボローム解析システムに導入した．CE-MSは極性化合物の高分解能な解析に適した装置であり，分析に必要なサンプル量は5 μL以下である．カチオンおよびアニオン分析の結果，アミノ酸や有機酸など同定されたピークを含め約1,000個のピークが検出された．本大会ではこれに加えて，様々な環境ストレス下での液胞メタボロームの変化を報告する．

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植物の病原微生物に対する応答の研究は、サリチル酸等少数のシグナル物質による制御系を中心に進んでいるが、他の代謝物による未知の制御系の存在を示唆する報告も多い。しかしながら、植物の防御応答時の代謝物変化を包括的に調べた例は少ない。そこで我々は、細胞死により病原体を感染部位周辺に局在化させるHR誘導時の代謝物変化を把握するために、2種類の強度の異なる抵抗性系統を用いて代謝プロファイルの比較を試みた。
キュウリモザイクウイルス黄斑系統[CMV(Y)]はシロイヌナズナCol-0に全身感染する。Col-0に抵抗性遺伝子RCY1を導入することで、HRを伴う抵抗性を示す系統(HR系統)、細胞死を伴わずに抵抗性を示す系統(ER系統)を得た。各系統にCMV接種し、24時間後の接種葉をUPLC-TOF-MSを用いて分析し、主成分分析を行った。接種区と、傷のみ与えたmock接種区との比較から、Col-0およびHR系統では全代謝物プロファイルに処理区間での差が認められ、この差はCol-0でより顕著であった。一方、ER系統では処理区間で違いが認められなかった。これは、抵抗性の強度に依存して代謝物変化の程度に違いがあることを示している。また、処理前の植物体ではER系統のみ他の2系統と異なる代謝プロファイルを示した。これは、ER系統が平常時から抵抗性に関連する代謝物を蓄積していることを示唆すると考えられる。

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リンドウ花弁におけるフラボノイド生合成代謝経路の解明を目指して研究を進めている。今回、転写レベルでの制御機構の解明を目的にR2R3-MYB転写因子を単離し、解析を行った結果について報告する。R2R3-MYB転写因子の保存ドメインをターゲットにリンドウ花弁cDNAからDegenerate PCR法により、R2R3-MYB様転写因子の単離を試みた。増幅断片をサブクローニング後160クローンについてシークエンス解析を行った結果、24グループに分類されたが、多くのクローンは4グループに集中した。そこでこの4つについてRACE法により全長を単離し、GtMYB2a、GtMYB2b, GtMYB3, GtMYB4と命名した。他の植物のMYB転写因子との系統解析からGtMYB3、GtMYB4がフラボノイド生合成に関わる遺伝子群に分類され、リンドウ花色の生合成に関わる可能性が示唆された。GtMYB4はシロイヌナズナのMYB12、トウモロコシのPと高い相同性を示し、ノザン解析の結果、花の発達段階の前半で発現することが示された。リンドウのフラボノイド生合成遺伝子のプロモーターに対する活性化能を花弁における一過的な発現系を用いて解析した結果、CHS（カルコン合成酵素）及びFSII（フラボン合成酵素）プロモーターに対する活性化が認められた。またGtMYB4過剰発現形質転換タバコではアントシアニン量の減少、フラボノール量の増加が認められ、遺伝子発現解析の結果、初期のフラボノイド生合成遺伝子の発現が増加することがわかった。

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我々は、これまでに高次アントシアニンを蓄積するリンドウ花弁におけるアントシアニン生合成構造遺伝子の解析を行い、これらの生合成が転写レベルで制御されていることを報告している。アラビドプシスやペチュニアの研究からアントシアニン生合成制御因子として、MYBとbasic Helix-Loop-Helix (bHLH)の転写因子が関与していることが知られている。そこで本研究では、リンドウにおけるそれらの相同遺伝子の単離・解析を行った。花弁cDNAから縮合PCR法をより、GtMYB3とGtbHLH1を単離した。この2つの転写制御因子遺伝子の花弁発達段階における発現は、アントシアニンの蓄積およびその生合成を触媒する酵素遺伝子群の発現様式と一致した。酵母2ハイブリッド解析により、GtMYB3とGtbHLH1は相互作用することが示された。また、一過的発現系を用いてアントシアニン生合成遺伝子のプロモーターに対する活性化能を調査したところ、両遺伝子を共発現した場合においてのみ活性化を示した。さらに、アントシアニンを蓄積しない白花リンドウ品種のGtMYB3遺伝子配列が、トランスポゾン挿入等により機能喪失していることが確認され、GtMYB3がアントシアニン生合成の制御因子である可能性が強く示唆された。現在、GtMYB3遺伝子を抑制したリンドウ形質転換体を作出し、さらなる解析を行っている。

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7000種以上におよぶフラボノイドの多様性は、その多彩な修飾系（配糖化、アシル化、メチル化等）に起因している。シロイヌナズナにおいても、少なくとも19種類のフラボノイドが報告されており、9種類の配糖化酵素および3種類のアシル基転移酵素の関与が示唆されている。しかしながら、シロイヌナズナには107の配糖化酵素遺伝子が存在する。このため、全塩基配列の決定されたシロイヌナズナでさえ、一次構造から修飾系酵素遺伝子の生理的な機能を推測することは困難である。
フラボノイド配糖化酵素遺伝子の網羅的機能同定を目的に、既知のフラボノイド代謝系酵素および転写因子をコードする遺伝子をクエリーとして、遺伝子共発現解析を行ったところ、フラボノイド代謝系遺伝子と相関の高い配糖化酵素遺伝子(UGT5)を見出した。UGT5は、その構造からフラボノイド3位配糖化酵素であると予想された。当該T-DNA挿入変異体のフラボノイド分析によりフラボノール配糖体の欠損が確認できたが、欠損化合物の正確な構造同定には至らなかった。しかしながらUGT5組換えタンパク質を用いたin vitro活性測定により、UGT5はUDP-arabinoseに特異的であり、フラボノールアグリコンを基質とすることが明らかとなった。即ちUGT5はflavonol 3-O-arabinosyltransferaseをコードしていることが判明した。

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シソ目(Lamiales)にはハーブや食品、花卉など我々の生活に密着した植物種が多い。シソ科シソ(Perilla frutescens)の葉、シソ科コガネバナ(Scutellaria baicalensis)の根、およびゴマノハグサ科キンギョソウ(Antirrhinum majus)の花弁にはフラボノイドの一種であるフラボン7位グルコシドと共に7位グルクロナイドが含まれている。フラボノイドの7位に対する異なる糖修飾機構を明らかにするために、シソ目に属するシソ、ヤクシマタツナミソウ(Scutellaria laeteviolacea)、キンギョソウ、およびゴマ(Sesamum indicum)からフラボノイド7位グルコース転移酵素(F7GlcT)とフラボノイド7位グルクロン酸転移酵素(F7GAT)をコードする遺伝子単離を試みた。大腸菌発現タンパク質の酵素解析の結果、高い糖供与体選択性を示す3種のF7GlcTと4種のF7GATを同定した。シソF7GlcTsは既知のF7GlcTが形成するクラスターIIIに属し、一方のシソF7GATはダイズ由来イソフラボン7位グルコース転移酵素に代表される異なるフラボノイド7位配糖体化酵素が形成するグループに属した。このことからシソ目には少なくとも機能的および構造的に異なる二種類のフラボノイド7位配糖体化酵素が存在していることが示された。

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植物におけるフェニルプロパノイド生合成経路は、フェニルアラニンを起点としてケイ皮酸を経てクマル酸が生成し、ここから様々な芳香族二次代謝化合物の生合成へ分岐することが明らかにされている。この経路のもう一つの重要な分岐点はフラバノンからフラボンやイソフラボンなどに別れる所である。本研究では、光合成細菌由来のチロシンを出発基質としてクマル酸を合成するチロシンアンモニアリアーゼ（TAL）とパセリ由来フラボンシンターゼ（FNS）を利用してシロイヌナズナにおけるフェニルプロパノイド生合成経路の改変を試みた。形質転換によりシロイヌナズナに導入したTALあるいはFNS遺伝子の発現を確認後、LC-MS及びHPLCにより植物内芳香族二次代謝化合物を解析した結果、TALおよびFNS発現植物ともに、それぞれ特定のフラボノイドが導入遺伝子であるTALまたはFNSの発現に依存的に増加していることが確認された。これらの結果は個々の導入遺伝子が植物内で機能していることを示し、これらの導入遺伝子の発現がシロイヌナズナのフラボノイド生合成経路の改良に有効であることを示している

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ノルリグナン類は、スギやヒノキ、セコイアなどの針葉樹の心材部に多く蓄積するいわゆる心材成分であるとともに、アスパラガスなどの単子葉植物ではファイトアレキシンとして産生される。我々は、アスパラガスとスギ培養細胞由来の粗酵素が、クマル酸のクマリルアルコールエステル体であるクマル酸クマリルをノルリグナンの一種であるヒノキレジノールへと変換できることを明らかにしてきた。しかし、このノルリグナン合成の初発反応を触媒する酵素の実体については不明であった。そこで、酵素をコードする遺伝子を明らかにすることを目的として実験を行った。
ヒノキレジノールを産生するアスパラガスの培養細胞より、活性を指標に酵素を精製したところ、精製酵素に2種類のポリペプチドが見出された。それぞれのポリペプチドの部分アミノ酸配列をもとに遺伝子をクローニングし、各々のORF（ヒノキレジノール合成酵素と命名）を大腸菌で発現させた。得られた組換え酵素の活性を測定したところ、いずれもクマル酸クマリルからトランス体ヒノキレジノールのみを与えた。一方、2種類の組換え酵素を等モル混合してクマル酸クマリルと反応させるとシス体のヒノキレジノールのみを与えた。天然型酵素および組換え酵素がいずれも2量体であることから、ヒノキレジノール生成反応の幾何選択性はヒノキレジノール合成酵素のサブユニット組成に依存することが強く示唆された。

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植物は細胞質のメバロン酸(MVA)経路とプラスチドの非メバロン酸(MEP)経路の二つのイソプレノイド生合成経路を持つ。MEP経路の発見以来、両者間のクロストークの有無は大きな研究テーマであった。クロストークの存在を示した投与実験は数多く報告されているものの、外からの投与でない内生のクロストークが片方のイソプレノイド生合成経路の欠損を補えるかどうかは未だ明らかではない。我々はこれまでにMVA経路のHMG-CoAレダクターゼをコードするシロイヌナズナHMG1とHMG2の変異体をこれまでに単離・解析してきた。内生のクロストークが植物の発生にどの程度寄与できるのかを調べるためにhmg1 hmg2二重変異体を作成した。しかし、二重変異体は得られず、掛け合わせ実験と顕微鏡観察の結果から二重変異体小胞子は配偶体致死になることが二重変異体の得られない原因であることがわかった。このことはプラスチドからの内生のクロストークが少なくとも雄性配偶体形成時においてMVA経路を補填できないことを示している。

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リン脂質を、リンを含まない糖脂質に置き換える膜脂質転換はリン酸欠乏への適応機構の一つである。近年、オーキシンがこの応答に関与することが明らかになった。本研究では、オーキシンとリン酸欠乏応答の関係を明らかにするため、オーキシンのシグナル伝達に関わる二つのファミリーAux/IAA、ARFのうち、IAA14、ARF7、ARF19の変異体を用いて研究を行った。脂質解析の結果、オーキシン抵抗性の変異体slr、arf7arf19において、リン脂質を分解し、糖脂質digalactosyldiacylglycerol (DGDG)とsulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) を合成する応答が抑制されていることがわかった。DGDG合成とSQDG合成にはmonogalactosyldiacylglycerol synthase (MGD) 2/3 とsulfoquinovosyldiacylglycerol synthase (SQD) 1/2 が関与している。発現解析の結果、SQDGの合成については、SQD1/2の発現上昇の抑制がみられた。一方、MGD2/3はリン酸十分条件からすでに発現が低下しており、これがDGDG蓄積の抑制に大きく寄与していると考えられる。このことから、オーキシンがガラクト脂質合成とスルホ脂質合成に異なる形で寄与することがわかった。

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チラコイド膜では、モノガラクトシルジアシルグリセロール(MGDG)という葉緑体特異的な糖脂質が、膜脂質全体の約半分を占めている。MGDGは光化学系複合体にも強固に結合しており、葉緑体の機能に重要であると考えられる。当研究室では、シロイヌナズナにおいてMGDG合成酵素遺伝子を単離し、その機能や制御の解析を行なってきた。これまでの解析から、MGDG合成酵素は光合成器官で働くtypeA(MGD1)、非光合成器官で働くtypeB(MGD2,3)の2つのタイプに分類でき、MGD1のノックアウト体の解析から、MGD1による糖脂質合成がチラコイド膜の形成に重要であることが分かった。さらに、MGDG合成酵素遺伝子の発現は、光とサイトカイニンによって上昇することが示された。本研究では、光とサイトカイニン受容体の変異体を用い、MGDG合成のシグナル機構について解析を行なった。変異体の脂質定量の結果から、光とサイトカイニン両方がMGDG合成を制御していることが分かった。特に、サイトカイニンレセプターahk2ahk3の変異体において、発芽直後のMGDGに大きな減少が見られた。また、光照射直後の変異体において、MGD1の発現の一過的な減少が見られた。さらに、クロロフィル量も減少していたことから、光とサイトカイニンによる糖脂質合成の制御が、葉緑体の分化に影響していることが示唆された。

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植物やシアノバクテリアなどの酸素発生型光合成を行う生物では、モノガラクトシルジアシルグリセロール（MGDG）やジガラクトシルジアシルグリセロール(DGDG) などの糖脂質含量が高く、チラコイド膜ではおよそ90%を占める。これは、複雑な膜構造を持つチラコイド膜をリン脂質で構築すると、大量のリンが必要となり生存に不利なためであると考えられている。実際、シロイヌナズナやSynechococcus sp. PCC7942では、リン酸欠乏条件下でチラコイド膜の唯一のリン脂質であるホスファチジルグリセロール (PG) が減少し、糖脂質の割合が増加することが知られている。今回我々はシアノバクテリアSynechocystis sp. PCC6803のDGDG合成酵素遺伝子 (dgdA) を同定し、リン酸欠乏条件におけるDGDGの機能を、遺伝子破壊株を用いて解析した。その結果、必須栄養素を十分に含む培地では野生株、dgdA破壊株の間に生育の違いは見られなかったが、リン酸欠乏培地ではdgdA破壊株に明らかな生育阻害が見られた。また、野生株、dgdA破壊株ともにリン酸欠乏培地で生育すると、クロロフィル含量が減少し、細胞当たりの脂質含量が4分の1程度に低下することがわかった。自然界ではリン酸の供給が制限されていることから、DGDGはその様な環境でシアノバクテリアが生きていく上で必須であると考えられた。

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光合成生物の膜脂質であるグリセロ脂質のsn-2位にはC16の脂肪酸が特異的に結合しているが、その特性は、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼの脂肪酸基質特異性によって支配される。シアノバクテリアSynechocystis sp. PCC6803には、C16脂肪酸特異的リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（LPAAT）遺伝子sll1848と、C18脂肪酸特異的LPAATをコードするsll1752遺伝子が存在するが、sll1848の遺伝子破壊株Δ1848は、グリセロ脂質のsn-2位にC18脂肪酸のみを結合し、光合成条件下での生育が野性株に比べて低下する。一方、高等植物のプラスチド膜のリン脂質ホスファチジルグリセロール（PG）のsn-2位には、パルミチン酸あるいはトランス-3-ヘキサデセン酸が結合している。本研究では、プラスチド膜PGのsn-2位脂肪酸の重要性を検証するために、シロイヌナズナのプラスチド型LPAAT変異株ats2株に、Synechocystis sp. PCC6803の組換えsll1752遺伝子を導入し、PGの脂肪酸組成の改変を試みた。PGの脂肪酸組成と植物体の表現型に対する遺伝子導入の影響について報告する。

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我々はこれまで、硫黄欠乏条件下において葉緑体酸性スルフォ脂質、スルフォキノボシルジアシルグリセロール(SQDG)が分解され、細胞内に硫黄原子を供給することを、単細胞緑藻クラミドモナスを用いて明らかにした。本研究では、硫黄欠乏条件下における膜脂質の代謝変動を調べた。その結果SQDGの分解に伴って葉緑体酸性リン脂質、フォスファチジルグリセロール(PG)がSQDGの欠失に見合う程度増加していた。このPG量の変化はPG合成活性の誘導により引き起こされていた。この結果から、硫黄欠乏条件下において葉緑体酸性脂質の総量が維持されることの重要性が示唆された。一方PG量が増加しているSQDG欠損変異体では、通常培養条件下においてもPG合成活性が高まっていた。このことから、硫黄欠乏条件下で観察された野生株のPG合成活性誘導は、硫黄欠乏ではなくSQDG量の減少によりもたらされると考えられた。続いてPG合成誘導の意義を明らかにするために、硫黄欠乏状態の野生株から単離したチラコイド膜をホスホリパーゼ処理し、増加したPGを分解したところ、光化学系Iの活性低下が観察された。この結果から、硫黄欠乏条件下で観察されたSQDG量の減少に対するPG量の補填が、光化学系I活性の維持に貢献する可能性が考えられた。

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R3-type のシングルMYBタンパク質(S-MYB)が、根毛およびトリコームの分化制御に関わることが報告されている。しかし、アントシアニン合成に関わるS-MYBについては明らかになっていなかった。そこでアントシアニン生合成に関与するS-MYBを探索するため、転写抑制ドメイン(SRDX)を融合した種々のS-MYBのキメラリプレッサーを発現させた形質転換植物を作製してT2種子の色を観察した結果、35S:AtMYBL2SRDX植物体のT2種子が高頻度で黄褐色に変化した。また、ロゼット葉のアントシアニン量の顕著な減少も認められた。AtMYBL2の過剰発現体においても35S:AtMYBL2SRDX植物体と同様の表現型が見られたことからAtMYBL2は転写抑制因子としてアントシアニン合成を抑制することが判った。一方、AtMYBL2遺伝子破壊株(mybl2)では、TT8およびDFR遺伝子発現が誘導され、ectopicなアントシアニン蓄積が認められた。mybl2表現型は、35S:AtMYBL2により相補されるが、AtMYBL2の転写抑制ドメインを欠損させた35S:AtMYBL2ΔC遺伝子では、寧ろmybl2表現型を増強させる傾向が認められた。これらの結果からAtMYBL2はアントシアニン生合成を負に制御し、且つその機能に転写抑制ドメインは重要であることが示された。

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