現在、CO₂排出による地球環境問題が深刻になってきており、植物バイオマスの効果的利用技術開発がその解決策の一つとして注目を浴びている。植物バイオマスの中でも種子油は、バイオディーゼル燃料や合成樹脂原料用の有力資源として期待されている。
そこで、本発表では油糧作物として重要なアブラナ科植物のモデル植物であるシロイヌナズナに、CRES-T法に基づくキメラリプレッサー転写因子融合遺伝子を導入することによって、種子油増産に寄与する新規遺伝子を探索した。CRES-T法は、類似の転写因子の活性をドミナントネガティブ型に抑制する効果が知られており、量的形質である種子中の油含量改善にも有効と判断した。
35Sプロモーターと共にCRES-T法によって作製した転写因子融合遺伝子を導入して得られた遺伝子組換えT2種子を、¹HパルスNMR分析する事により、非破壊で種子中の油含量を定量した。¹HパルスNMRによる定量分析には最低3 mgの種子（約150粒）があれば十分であった。T2種子中の油含量の分布を解析した結果、ねらい通り油含量が増加している形質転換種子が得られた。

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植物バイオマスの中でも種子油は、バイオディーゼル燃料や合成樹脂原料などのバイオマス由来の有力資源として期待されている。一方で、植物種子中の油脂貯蔵のメカニズムは不明な点が多く、油脂生産量の向上に結びついた分子育種の例は少ない。
そこで本研究では種子の油脂含量に関与する遺伝子の探索を目的に、CRES-T法によって作製した約200種類の転写因子-転写抑制ドメイン融合遺伝子を35Sプロモーターの下流に連結し、シロイヌナズナへ遺伝子導入した。各遺伝子10個体のT2種子中を、¹H-パルス-NMR分析により油脂含量を定量した。その結果、種子中の油分含量が野生株と比べ約20％増加した遺伝子導入系統が得られ、それらにはAP2/ERFファミリー、MYBファミリーに属する転写因子が含まれていた。種子の貯蔵タンパク質含量や油脂の脂肪酸組成等の生化学的な表現系解析、およびDNAアレイによる網羅的な遺伝子発現解析の結果より、これら転写因子と油脂生産のカスケードについて考察する。

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Phosphatidate phosphatase (PAP) はphosphatidic acid (PA) を脱リン酸化しdiacylglycerol (DAG) を生成する酵素である。DAGはmonogalactosyldiacylglycerol, digalactosyldiacylglycerolといった糖脂質, phosphatidylcholine, phosphatidyl-ethanolamineといったリン脂質、および貯蔵脂質 (triacylglycerol) の生合成の共通の基質となるため、PAPは脂質の代謝において重要な役割を果たしていると考えられてる。
我々は最近、シロイヌナズナにおける膜局在型PAPであるlipid phosphate phosphatases (LPP) について報告した(Nakamura et al. (2007) J Biol Chem, 282: 29013-29021)が、さらにこれらとは異なる新規のPAP (PAH1, PAH2) を単離した。解析の結果、pah1, pah2の単独変異体は表現型を示さなかったが、pah1pah2二重変異体では、野生型に比べてPAの蓄積、脂質組成の変化、葉の形態変化などが認められた。さらに発表では、通常生育条件下とリン酸欠乏条件下での脂質代謝経路におけるPAPの役割について解析した結果を述べる予定である。

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オジギソウの屈曲運動には、運動部位である主葉枕において、アクチン細胞骨格と運動細胞の膨圧変化が関与する事が知られている。膨圧変化の原動力と考えられるのが素早い水の移動である。この素早い水の移動には、アクアポリンが関与している事が考えられている。そこで本研究では、主葉枕運動細胞のプロトプラストを用いて、水の移動に関する詳細な解析とアクアポリン関与の可能性について調べた。プロトプラストを用いた水透過性測定の結果、浸透圧の変化に伴いプロトプラストの体積変化が観察された。また、アクアポリンの阻害剤である水銀によって水透過性への影響を観察した所、有意に阻害された。このような結果から主葉枕運動細胞では、アクアポリンの活性が何らかの調節を受けていることが考えられた。オジギソウアクアポリンは、Xenopus oocyteを用いた解析からリン酸化による調節の関与が示唆されている。そこで、プロトプラストの水透過性に及ぼすPKA activatorsの影響を調べた結果、水透過性が上昇する事が示された。今後、リン酸化による水透過性の調節機構について詳細に解析していく。

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空色西洋アサガオ（Ipomoea tricolor cv. Heavenly Blue）の花弁は、ツボミは赤紫色で開花すると青色になる。既に我々は、この変化がItNHX1による液胞pHの上昇によることを明らかにし^{1, 2)}、さらに、開花過程で表層の有色細胞内のK⁺量が増大することを報告した（2007年会）。今回、開花におけるNHX1の役割を解明する目的で、晩秋に見られる青色花弁中に赤色のスポットやセクター部分が出現したキメラ花弁の解析を行った。
キメラ花弁の赤色、青色部分に含まれるアントシアニンに差異は無く、いずれもHBAであった。細胞内微小電極法で液胞pHを測定したところ、赤色細胞の液胞pHは6.9で青色細胞の7.7よりも有意に低かった。それぞれの色の花弁から有色プロトプラストを調製してキャピラリー電気泳動法によるイオン分析を行った。赤色細胞内のK⁺量は青色細胞内よりも有意に低く、Na⁺はいずれの色の細胞にも全く検出されなかった。一方、陰イオン（Cl^-, PO₄^3-, malate）量には有意差は認められなかった。現在、それぞれの色の細胞におけるItNHX1および、ItNHX1タンパク質の発現量を分析中である。青色に開花する正常な花での分析結果とあわせ、ItNHX1が細胞の色変化と伸長生長にどのように関わるかを考察する。
1) K. Yoshida et al. Nature, 373, 291 (1995). 2) K. Yoshida et al. Plant Cell Physiol. 46, 407 (2005).

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細胞膜における水輸送を担うアクアポリンPIPのうち、PIP2サブファミリーは翻訳後修飾としてリン酸化が報告され、リン酸化がチャネルの開閉に関わると考えられている。本研究では、セイヨウナシPcPIP2;2においてリン酸化が予想される2つのセリン残基（S115, S280）をアミノ酸置換し、リン酸化状態（セリンをアスパラギン酸に置換）または脱リン酸化状態（セリンをアラニンに置換）をミミックした。これらの水輸送活性をアフリカツメガエルの卵母細胞を用いて測定したところ、S115またはS280の一方をアラニンに置換したものは野生型とほとんど同じ水輸送活性を示したが、S115とS280の両方をアラニンに置換した場合には水輸送活性が顕著に低下した。植物体内においてS280に相当するセリン残基のリン酸化について多数の報告があるが、S115に相当するセリン残基のリン酸化は確認されていない。このため植物体内ではS115はリン酸化されないか非常に低いリン酸化レベルで、S280のリン酸化状態により水輸送活性が調節されている可能性が考えられる。そこで我々はS280のリン酸化状態を特異的に認識する抗体を作製して、生体内でのPcPIP2;2のリン酸化状態の変化を調べたところ、PcPIP2;2がセイヨウナシ果実の日肥大に同調してリン酸化されることが明らかとなった。

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根から吸収されたイオンは導管を通って葉へ運ばれる。葉組織においてイオンは、アポプラストとシンプラストを経由して維管束から葉を構成する細胞に分配されると考えられている。しかし、その分配経路がどの段階でアポプラストからシンプラストに移行するかは明らかになっていない。本研究では、リン酸イオンに着目し、シロイヌナズナロゼット葉におけるリン酸輸送メカニズムを解析した。維管束組織と葉肉組織の個々の機能を解析するために、これらの細胞を生きた状態で単離する方法を確立した。得られた葉肉細胞を用いて行ったリン酸の放射性同位体の取り込み実験から、リン酸欠乏条件下で分化した葉の葉肉細胞のみがリン酸取り込み能を持つが、それ以外の条件ではいずれの葉肉細胞もリン酸を取り込まないことを確認した。そこで、各組織、細胞において実際にどのようなリン酸輸送体が働いているか、高親和性リン酸輸送体であるPht1輸送体の遺伝子発現パターンをリアルタイムPCRにより解析した。その結果、Pht1;1, Pht1;4, Pht1;5, Pht1;7について、維管束組織では葉肉細胞よりもリン酸輸送体の発現量が多く、またリン酸欠乏条件で、いずれの輸送体も葉肉細胞で顕著な発現上昇が見られた。さらに、単離処理によって得られた葉肉細胞と維管束組織を用いた。マイクロアレイ解析を進めている。以上の結果を基に、葉組織における導管から葉肉細胞への物質輸送メカニズムについて議論する。

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液胞は植物細胞における最も大きなオルガネラであり、細胞体積の増大や細胞内環境の維持に関わっている。内部には様々な物質が蓄積し、液胞内部への物質輸送には多様な輸送体が関与している。我々は液胞膜で機能する輸送体の実体を明らかにするために、液胞膜プロテオーム解析を進め、多数の機能未知膜タンパク質を見出し、現在それらの機能解析を進めている。一方、液胞膜に主要な輸送エネルギーを与えるプロトンポンプについては、分子レベルで詳細な解析が進められ、V-型 H⁺-ATPaseやH⁺-PPaseの存在がよく知られている。液胞膜上における輸送体の密度や局在の解析は、輸送体の役割を知るうえで有用な手がかりになると考えられる。しかし、各種の輸送体が液胞膜上でどのように存在しているかは、十分には明らかとなっていない。
本研究では、シロイヌナズナ培養細胞において、V-型 H⁺-ATPase、H⁺-PPaseなど各種膜タンパク質の細胞内局在を免疫蛍光抗体染色法を用いて観察した。さらに、液胞膜上において、これらの輸送体がどのように存在しているかを確認するために、細胞からインタクト液胞を単離して観察した結果も、併せて報告する。

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ホウ素は高等植物の微量必須元素のひとつであり、ホウ素欠乏症は作物の収量や品質を低下させる農業上の問題のひとつである。導管輸送に働くホウ酸トランスポーターBOR1を過剰発現するシロイヌナズナは、ホウ素欠乏条件において稔実性が改善する (Miwa et al, 2006)。本研究では根においてホウ素の効率的な吸収に働くホウ酸チャネルNIP5;1の発現増強によって、BOR1過剰発現株のホウ素欠乏条件での更なる生育改善を目指した。
35Sプロモーター制御下でNIP5;1を過剰発現する形質転換株ではホウ素欠乏条件で生育の改善がみられなかったが、NIP5;1アクチベーションタグラインのうち一つでホウ素欠乏条件における根の伸長改善が観察された。このアクチベーションタグラインのT-DNAとほぼ同じ位置に35SプロモーターをもつコンストラクトをBOR1過剰発現株に導入した結果、ホウ素欠乏条件のプレート上でBOR1過剰発現株と比較して根の伸長が改善される複数の独立な形質転換植物を得た。そのうちの一つの系統ではBOR1過剰発現株と比較して、長期間育てたときのホウ素の蓄積や短期間でのホウ素の吸収量が増加し、稔実性が改善していた。本研究は、必須栄養元素のチャネルを用いた栄養欠乏条件下での植物の生育改善の可能性を示すものであると考えている。

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糖輸送体は細胞への糖の輸送や蓄積、またシンク・ソース間の糖の長距離輸送を担う重要な分子である。今回は、かずさDNA研究所で構築されたトマトESTライブラリーに見出された、SFPサブファミリーに属する2つの新奇糖輸送体（SlSFP1, SlSFP2）について報告する。SlSFP1とSlSFP2はそれぞれ486個または490個のアミノ酸から成り，ともに12回の膜貫通領域と糖輸送体に特徴的なモチーフを持っていた。SlSFP1は果実での発現が比較的高く、その発現は開花直後と果実成長後期に特に高かった。一方、SlSFP2はどの器官においても比較的恒常的に発現していた。また、SlSFP1とSlSFP2の発現はNaCl、ABA、低温ストレスおよび乾燥ストレスに対して同様の応答を示し、ABAによる誘導はみられなかったが、NaCl処理、乾燥ストレスおよび低温ストレスにより発現が上昇した。このことから、SlSFP1とSlSFP2は、ストレス条件下における糖の分配に関与していることが示唆された。また、SlSFP1またはSlSFP2とGFPの融合タンパク質がともに液胞膜に局在したことから、これら2つの糖輸送体がトマトの果実への糖蓄積に関与している可能性も示唆された。

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植物は、浸透圧ストレスを受けると、ストレス耐性の獲得に関わる遺伝子群を働かせることにより、環境に柔軟に適応している。浸透圧ストレス下においては、代謝や膜輸送に関与する遺伝子の発現が変化し、糖やアミノ酸などが植物細胞中に蓄積することがこれまでに示されている。本研究では、乾燥ストレスで発現が誘導され、単糖トランスポーターと相同性が高い遺伝子であるシロイヌナズナのERD6Aとその相同性遺伝子であるERD6Bの機能を解析した。ノーザン法により発現解析を行ったところ、ERD6AとERD6Bではともに乾燥、低温、高塩ストレスによるmRNAの蓄積の増加が確認された。また、GUSまたはGFPをレポーター遺伝子を用いて組織特異的発現を調べたところ、ERD6Aは表皮、ERD6Bでは木部柔細胞においてGUS活性およびGFP蛍光が検出され、発現する組織の違いが確認された。T-DNA挿入欠失変異体では、乾燥ストレス下において、野生型に比べ生存率が低下することが観察された。これらの結果から、単糖トランスポーターであるERD6AおよびERD6Bが乾燥ストレス下における糖輸送に関与し、これらの遺伝子の欠失による糖輸送の変化が生存率に影響を及ぼしたと考えられた。

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浸透圧ストレスを受けると、植物中では、恒常性維持やストレス耐性獲得に関わる種々の遺伝子群が特異的に機能する。また、ストレス時の物質輸送の変化はストレス耐性獲得のために重要であると考えられる。マイクロアレイ解析により、浸透圧ストレス下において発現が誘導されるシロイヌナズナの膜タンパク質遺伝子を網羅的に探索した結果、KUP/HAK/KTファミリーに属するカリウムトランスポーターKUP6遺伝子を同定した。環境ストレス条件下におけるKUP6の発現量の変動をリアルタイムPCR法で解析した結果、KUP6はマンニトールおよび乾燥処理によって発現が誘導された。KUP6プロモーターによりGUS遺伝子を発現させたシロイヌナズナ形質転換体のGUS活性は、根の根端および維管束に検出され、マンニトールおよび塩処理によって活性は上昇した。KUP6-GFP融合タンパク質はシロイヌナズナ形質転換体において細胞膜に局在した。T-DNA挿入変異体であるkup6-1は、通常の生育条件下で、野生型と比較して植物体が大きくなった。kup6-1の植物ホルモンへの応答を解析した結果、kup6-1の根の生育は野生型と比較して、アブシジン酸に対して非感受性を、オーキシンに対して高感受性である可能性が示された。土植えの植物体を用いて乾燥耐性試験を行った結果、kup6-1では野生型と比較して乾燥耐性能が低下した。これらの結果より、KUP6は植物体の乾燥耐性獲得のために重要な機能を果たしていると考えられた。

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我々は、植物の機械刺激受容の分子機構を明らかにする目的で、シロイヌナズナのCa²⁺透過性機械受容チャネル候補の遺伝子MCA1 とMCA2を単離した（Nakagawa et al. , PNAS 104:3639-3644, 2007）。Mca1とMca2は、互いにアミノ酸配列上73%の同一性をもち、それぞれ出芽酵母のCa²⁺透過性機械受容チャネル候補の変異株(mid1)の致死性を部分相補する。しかし、Mca1/Mca2とMid1の間のアミノ酸配列の同一性は低い（~10%）。Mca1とMca2の構造上の共通した特徴は、N末端側にイネの推定上のプロティンキナーゼ群の制御領域に類似した領域とEF-ハンド様モチーフがあること、C末端側に推定上の膜貫通領域とシステインが豊富な領域があることである。これまでに、Mca1は根からのCa²⁺取り込みに関与し、根の接触感知に関与することを示してきた。今回、出芽酵母発現系を利用してMca1およびMca2タンパク質の構造と機能を解析した。非還元SDS-PAGEによる解析から、Mca1とMca2はそれぞれ二量体および四量体と予想される複合体を形成していることが示唆された。Mca1のC-halfのみを酵母細胞に発現させた場合、そのCa²⁺取り込み活性がなくなり、一方N-halfのみを発現させた場合は酵母細胞が致死となることを見出した。

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イネ科植物で最もアルカリ耐性であるオオムギでは、ファイトシデロフォアとしてムギネ酸を土壌に分泌することによって、本来不溶性の3価鉄イオンをキレートして可溶化し、特異的なトランスポーター（HvYS1）を介して鉄を取り込んでいる。一方、トウモロコシ（ZmYS1）では鉄のみならず様々な金属ムギネ酸錯体を輸送し、また、ニコチアナミン鉄錯体も輸送する。この特異性の違いを担うアミノ酸配列を解明するために、HvYS1-ZmYS1キメラ体を作成し、輸送活性を比較した。HvYS1とZmYS1のアミノ酸配列を比較すると、N末領域と6番目と7番目の間の膜外ループでは相同性が低いことから、2種のトランスポーターcDNAに共通に存在する制限酵素サイトKpn1, BglIIで切断後、キメラ体を作成した。アフリカツメガエルの卵母細胞に発現させて基質特異性を比較し、6番目と7番目の間の膜外ループが基質特異性に関与していることを突き止めた。また、このループのアミノ酸配列をAGARIAプログラムで計算すると、HvYS1はαヘリックス構造をとることが予想された。そこでHvYS1、ZmYS1についてそれぞれ対応する20アミノ酸を化学合成し、円二色性スペクトルを測定した結果、ZmYS1と異なり、HvYS1ではαヘリックス構造を示していた。以上の結果からこの領域がHvYS1の基質特異性に関与していると推定された。

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ALMT1遺伝子がコードするAl活性化型リンゴ酸トランスポーターは、アルミニウム（Al）存在下でリンゴ酸を放出しAlを排除することでAl耐性をもたらす。日本で育種されたコムギ品種では、Al耐性度は、リンゴ酸放出量と相関があるものの、ALMT1発現量との相関が低いことから、ALMT1の転写後調節機構の存在が示唆されていた（Sasaki et al., 2006）。本研究では、日本のコムギ品種におけるALMT1の転写後調節機構の解明を目的に、同一品種であるがAl耐性度が異なる2系統を用いて、比較解析を行った。Al耐性系統は、Al感受性系統よりも根端のAl集積量が低く、Alで活性されるリンゴ酸放出能も高いことから、リンゴ酸放出に依存した高いAl排除能力を持つと考えられた。一方、根端におけるALMT1遺伝子およびタンパク質の発現量を比較したところ、両系統間に差が認められないことから、これら系統ではALMT1タンパク質の機能発現が、翻訳後の修飾や他の因子の関与等により異なる可能性が示唆された。さらに、両系統の交雑を行い、F₂種子を用いて幼植物におけるAl耐性度を調べたところ、Al感受性とAl耐性の個体数が1：3に分離した。以上の結果から、ALMT1タンパク質の機能発現調節には、少なくとも一つの遺伝子が関与すると考えられた。

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高塩濃度環境で生育する植物における細胞内イオンの挙動を解析することは、耐塩性機構を明らかにする上で重要である。植物が塩ストレスを回避する時にNa⁺のカウンターイオンCl^-がどのように取り込まれ、挙動しているのか明らかではない。電気生理学的解析により、Cl^-輸送が様々な生命現象に関与していることが示唆されている。植物ではシロイヌナズナAtCLC-aおよびAtCLC-cが細胞内硝酸イオン濃度の調節に関与することが知られているが、最近pH感受性に関与するもの、PSIIに関与するものが報告された。しかしながら、その詳細な機能メカニズムは解明されておらず、クロライドチャンネル機能解析は始まったばかりといえる。
我々はイネの電位依存性クロライドチャンネルファミリーであるOsCLC-1,OsCLC-2遺伝子中にイネの内在性トランスポゾンTos17が挿入された遺伝子破壊系統を選抜し、解析を進めている。これらの遺伝子破壊系統を水耕栽培で生育させたところ、根の長さは野生型と比較して根の伸長が阻害されていた。これら破壊系統に加え、交配により作出した二重変異体について走査電子顕微鏡を用いた形態観察や内部構造等について詳細な検討を行った。

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円石藻Emiliania huxleyiは、細胞表面に炭酸カルシウムを主成分とする円形の結晶(円石)を持つことを特徴とする海産性単細胞藻類である。E. huxleyiは生育に硫黄のアナログ元素であるセレンを必須とし、数種類のセレノタンパク質を持つことがわかっている。E. huxleyiは亜セレン酸を低親和性の受動輸送系と高親和性の能動輸送系で取り込んでいる。本研究は、様々な条件下で亜セレン酸の取り込み活性の特性を調べた。
亜セレン酸を十分与えて培養した細胞を亜セレン酸欠乏の条件に移し、亜セレン酸取り込み活性を測定したところ、亜セレン酸に対するKmが3日間で約1/6まで低下した。一方Vmaxの値には差が見られなかった。また、セレン欠乏条件下の細胞に10 nMの亜セレン酸を添加すると、24時間で亜セレン酸取り込み活性は約半分に低下した。これらの結果から、セレン欠乏条件下では亜セレン酸輸送体の発現の誘導が起こっている可能性が示唆された。
また、亜セレン酸の取り込み活性を、硫酸、亜硫酸、セレン酸がそれぞれ1 mM存在する条件下で測定したところ、硫酸は亜セレン酸の取り込みに影響を及ぼさなかったが、亜硫酸およびセレン酸の共存下では亜セレン酸取り込みのKmは約3倍に上昇した。これらの結果から、亜セレン酸輸送体は亜硫酸およびセレン酸によって競合的に阻害される可能性が示唆された。

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【目的】イネ(Oryza sativa)の栄養貯蔵組織である胚乳にはデンプン、タンパクに加えて多様な一次、二次代謝産物が含まれている。それらの含量はコメの栄養価や品質に深く関わる重要な形質であるが、その制御に関わる遺伝子の詳細はよくわかっていない。本研究では胚乳中のアミノ酸含量に着目し、その制御に関わる量的形質座位(Quantitative trait loci, QTL)を染色体上にマッピングすることを目的とした。
【方法と結果】イネ品種ササニシキ（ジャポニカ）とハバタキ（インディカ）から由来する戻し交雑自殖系統群 (Back-crossed inbred lines, BILs) 85系統の胚乳から、それぞれ18種のアミノ酸とGABA, ビタミンB1を20%アセトニトリル水溶液で抽出し、それらの含有量をLC-ESI-MS（Waters）を用いて定量した。親品種の形質値とマッピング集団の形質値データを比較したところ、一部のアミノ酸では親品種の値を超える超越分離を示すものがあった。解析した全20代謝産物について区間マッピング法によるQTLの検出を試みたところ、合計25個のQTLを検出することができた。これらのうち、それぞれ6個のQTLが第3と第6染色体上に局在していることが明らかとなった。

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メリステムにおける幹細胞の維持や、特定の細胞への分化の機構について明らかにするために、茎頂分裂組織 (SAM) や前形成層で発現する遺伝子を複数同定してきた。それらのうち、葉酸のグルタミン酸鎖切断酵素Gamma-Glutamyl Hydorolase 1 (GGH1) は、過剰発現時や発現抑制時に異常な茎頂を作ることが明らかになった。葉酸は、核酸やアミノ酸の合成時において広く補酵素として機能することが知られており、生物の生存に不可欠な因子である。今回は、器官形成時の葉酸グルタミン酸鎖長制御の意義について明らかにするために、シロイヌナズナ胚軸外植片の培養系を用いて、カルスからの不定芽形成過程における GGH1 の発現解析、及びポリグルタミン酸型葉酸及びモノグルタミン酸型葉酸作用の解析を行った。GGH1 の発現は、カルス誘導培地では抑制され、不定芽誘導培地では顕著に亢進した。また、カルスからの不定芽形成において、モノグルタミン酸型葉酸は不定芽形成促進能を持ち、ポリグルタミン酸型葉酸は不定芽形成促進能を持たないことが明らかとなった。これらの結果より、GGH は SAM において未分化状態の維持に必須であるポリグルタミン酸型葉酸のグルタミン酸鎖を切断し、器官の分化を促すモノグルタミン酸型葉酸を生じさせることで器官形成に寄与していると考えられた。

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高等植物では、地上部の器官形成の大部分を茎頂分裂組織が担う。シロイヌナズナのCUP-SHAPED COTYLEDON1（CUC1）、CUC2、CUC3遺伝子は、NACドメインを持つ転写活性化因子をコードし、茎頂分裂組織の形成および様々なシュート器官境界部の形態形成に重要な役割を果たす。これまで主にマイクロアレイを用いたスクリーニングから、CUC遺伝子群の下流で機能すると予想される遺伝子が24個選抜されている。
今回これらの下流候補遺伝子の性質を詳しく調べるため、CUC1とグルココルチコイド受容体の融合タンパク質(CUC1-GR)を発現する植物を用いて、CUC1-GRの活性化が各遺伝子の発現に及ぼす影響を調べた。その結果、デキサメタゾンによるCUC1-GR活性化処理後、3時間で発現量が増加する遺伝子が3つあることがわかった。さらに、タンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミドの存在下でCUC1-GR活性化処理をおこなったところ、先の3つの遺伝子を含む10個の遺伝子において発現の上昇がみられた。以上から、これらの遺伝子がCUC1タンパク質による転写活性化の直接の標的であることが示唆された。現在10個の標的候補遺伝子のうち1つについて、プロモーターとルシフェラーゼとの融合遺伝子を用いたトランジェントアッセイを行うことでCUC1の標的領域の同定を進めている。

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植物の地上部は未分化な細胞の集団からなる茎頂分裂組織（SAM）から葉・茎・腋芽を連続的に形成することにより構築される。植物体の正常な発生にはSAM内における未分化な細胞の維持と葉原基などの側生器官への分化が厳密に調節されている必要がある。これまでに、未分化細胞の維持機構や葉原基の分化パターンについては多くの研究がなされているが、茎頂分裂組織における葉原基の細胞分化過程に関してはほとんど明らかにされていない。
KNOTTED型のホメオボックス遺伝子のひとつであるイネのOSH1は茎頂分裂組織の未分化な細胞で発現し、葉原基へと分化の決定づけられた細胞群（P0細胞群）で発現が抑制されることが知られている。したがって、OSH1は茎頂分裂組織における葉原基の細胞分化を可視化する分子マーカーとして利用できる。そこで、本研究では抗OSH1抗体を用いた免疫染色法により茎頂分裂組織におけるP0細胞群を可視化し、その分化過程を解析した。
その結果、野生型のイネ（金南風）のP0細胞群分化期の茎頂分裂組織は約150細胞からなり、葉原基分化の初期過程において、約40細胞からなるP0細胞群が分化することが明らかになった。また、P0細胞群は系統間での茎頂分裂組織の形や大きさの違いとは無関係にほぼ同じ細胞数で構成されていた。本発表では、これらの結果から考えられるP0領域の分化機構について考察する。

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双子葉植物の子葉と本葉は同じ光合成器官であるが、本葉が茎頂分裂組織から分化するのに対して子葉は子葉原基として胚発生中の種子の中で形成される。子葉と本葉はその形成過程が異なるだけでなく葉緑体の形成過程も異なっている。シロイヌナズナ変異体cyo1/abc2は糖添加培地上では子葉のみが白化し、本葉は正常に緑化するが、糖無添加培地上では茎頂分裂組織が発達出来ず本葉が発生せず、枯死してしまう。この変異体の子葉の色素体は、光照射下で生育させた植物体では膜構造が未発達で野生型とは顕著に異なる葉緑体が形成されるが、暗所で生育させた植物体では野生型同様に正常なエチオプラストを形成する。Blue Native PAGEによるチラコイドタンパク質の分離とウエスタンブロッティングの結果等より、CYO1/ABC2タンパク質はチラコイド膜上のPSI/LHCI・PSII/LHCIIコンプレックスと相互作用している事が示された。CYO1/ABC2タンパク質はインシュリンを基質としたジスルフィド結合の酸化還元活性と、還元状態としたRNaseを基質としたRNase Refolding活性を有しており、その活性発現にはZnイオンが必須であった。これらのことより、CYO1/ABC2タンパク質は子葉の葉緑体形成と茎頂分裂組織形成に必須な分子シャペロン (Protein-disulfide isomerase)である事が示された。

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未分化な茎頂分裂組織の特徴の一つはKNOX1遺伝子の発現であり、KNOX1遺伝子はその未分化状態の確立と維持において機能すると考えられている。茎頂分裂組織から葉原基への分化を示す最も早い特徴の一つは、KNOX1遺伝子ファミリーに属するSHOOT MERISTEMLESS (STM)遺伝子の発現が発生初期の葉原基において抑制されることである。単葉の種においてはこの発現抑制は葉の形成過程を通じて持続する。一方で、複葉の種においてはその発現が発生中の葉原基において後に再確立され、小葉形成のための未分化な環境を作り出すと考えられている。
今回我々は、単子葉・双子葉の植物種の中から、単葉あるいは複葉を持つ複数の種のSTM遺伝子5’上流領域を比較し、二つの保存された配列を同定した。そのうちの一つが、発生初期の葉原基におけるSTM遺伝子の発現抑制には関与しない一方で、発生中の葉原基におけるSTM遺伝子発現の持続的抑制あるいはその発現の再確立に関与することを示唆する知見を得た。また、この保存配列を介したSTM遺伝子の発現制御が、ASYMMETRIC LEAVES1遺伝子が関与する経路で機能し、葉の形成において重要な役割を果たすことも合わせて報告する。

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胚発生後の植物の形態形成では，地上部はシュート頂メリステムに，地下部は根端分裂組織に依存した器官形成が行われる．シロイヌナズナではシュート頂，花序，花のメリステムの維持制御にCLAVATA (CLV) シグナル伝達経路が重要な役割を果たすことが知られている．私たちは，これまで，イネのメリステムの維持制御に関わるFON1およびFON2遺伝子の解析を行ってきた． その結果，FON1 は CLV1 様のレセプターカイネースをコードしていること，FON2 はCLEドメインをもつCLV3様のペプチド性シグナル分子をコードしていることを明らかにし，イネにおいても，CLVシグナル伝達経路が基本的には保存されていることを示してきた．その一方で，研究過程でイネに独自の制御系が存在していることも示唆された．
今回は，FON2 と FON2に類似したCLEタンパクであるFON2-LIKE CLE PROTEIN1 (FCP1) の機能解析を行った．その結果，FON2は主に花メリステムの維持制御に関わるのに対して，FCP1はシュート頂メリステムと根端分裂組織の維持制御に関わることが明らかとなった．このように，イネでは異なる遺伝的経路の組み合わせによりメリステムが維持制御されていることが明らかとなった．また，FCP1 の作用には，FON1 は必要ないことも判明し， FCP1 は独自のレセプターを必要とすることが示唆された．さらに，FCP1とFON2の作用の違いを決定する重要なアミノ酸を同定することに成功したので合わせて報告する．

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高等植物の頂端分裂組織は、未分化状態を保ちながら分裂・増殖する細胞群であり、上下軸方向への成長や器官原基の形成に必要な細胞を提供するという重要な役割を担っている。シロイヌナズナにおける分子遺伝学的解析から、地上部の分裂組織である茎頂分裂組織の領域決定には、細胞外ドメインにleucine rich repeat(LRR)をもつ受容体CLAVATA1(CLV1)/CLV2が、分泌性のリガンドであるCLV3を認識する細胞間情報伝達系が重要であると考えられている。CLV3はシロイヌナズナで32遺伝子報告されているCLV3/ESR (CLE)ファミリーの一員であり、C末に保存されたCLEドメインの12アミノ酸配列を機能単位とすることが当研究室で明らかにされた(Ito et al. 2006; Kondo et al.2006)。
CLV3の機能単位である12アミノ酸の化学合成ペプチド（CLV3ペプチド）は、野生型植物体の茎頂分裂組織と根端分裂組織の縮小をもたらすことから、CLV3遺伝子の過剰発現と同等の効果を持つことが予想される。一方、clv1、clv2突然変異体は、CLV3ペプチドによる茎頂分裂組織の縮小効果に耐性を示し、地上部でCLV1とCLV2がCLV3を受容しているというこれまでの知見を強く支持する結果となった。今回は、サプレッサースクリーニングによりCLV3ペプチドに耐性を示す新規の突然変異体を単離し、その表現型について詳細な解析を行った結果について報告する。

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マメ科植物は自身の生長に応じて根粒の数を柔軟に制御する機構を持っており、これは根とシュートを介した全身的な制御機構であることがわかっている。この機構に関わる因子としてミヤコグサ（Lotus japonicus）から単離されたHAR1はシュートから根粒形成を抑制し、シロイヌナズナの受容体型キナーゼ（RLK）の中でCLAVATA1（CLV1）と最も相同性の高いRLKをコードしていた。CLV1はCLV3ペプチドをリガンドとして認識すると考えられていることから、HAR1のリガンドもCLV3様（CLE）ペプチドである可能性がある。そこで本研究ではミヤコグサゲノム情報からCLE遺伝子様配列を32個同定し、根粒菌接種による発現応答を調べた。その結果、LjCLE1, LjCLE2, LjCLE3の発現量が根で顕著に上昇した。これらのLjCLEを根で過剰発現させたところ、LjCLE1, LjCLE2がHAR1依存的に根粒形成を強く抑制した。また、LjCLE1, LjCLE2は根粒菌の接種により速やかに発現が誘導され、その発現誘導にはNodファクター及びそのシグナル伝達経路の構成因子が必要であった。以上の結果からLjCLE1, LjCLE2は根粒形成の全身的制御に関わる有力な候補であることが示唆された。

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1864年にRautenbergとKuhnは、窒素源が根粒形成を阻害する現象を見出した。以来、この現象について、ダイズやミヤコグサ(Lotus japonicus)より単離された根粒過剰変異体(har1等)が根粒形成において、硝酸イオンに対して耐性を示す等が知られている。しかしながら窒素源による根粒形成抑制の分子メカニズムはほとんど解明されていない。
マメ科モデル植物ミヤコグサでは、HAR1が根粒形成の全身的制御機構に関わっていることが知られている。当研究室の岡本は、ミヤコグサのゲノム情報より特定された32種のLjCLE遺伝子のうち、LjCLE1, LjCLE2が根粒菌感染により顕著に発現が誘導され、HAR1依存的に根粒形成を抑制することを見出した。そこで本研究では、har1変異体の根粒形成における硝酸イオン耐性に注目し、KNO₃の処理によって発現が誘導されるLjCLE遺伝子の探索を行った。
その結果、32種のLjCLE遺伝子のうち、LjCLE2のみが10 mMのKNO₃処理によって顕著に発現が誘導された。また、この遺伝子は根粒菌感染により速やかに発現が誘導されるが、10 mM KNO₃の存在下では根粒菌の感染を受けても発現の上昇は見られなかった。以上の結果から、KNO₃がLjCLE2の発現を誘導し、HAR1を介して根粒形成を抑制するというモデルが示唆された。

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Asparagus（クサスギカズラ）属植物は、葉が極めて矮小に退化し、その代わりに茎が葉状に変化した擬葉という器官を有する。この擬葉が分枝系であることは鱗片葉の腋に発生することから示唆されている。また、Asparagus 属植物では擬葉で光合成を行い、葉としての機能を代替していることも知られており、茎と葉の中間体として見なすことができる。
現在まで、茎と茎のアイデンティティーの違いがどのような遺伝的機構により制御されているかは明らかとはなっておらず、擬葉の理解はこの問題を解決するための興味深い材料であると言える。また、Asparagus 属の擬葉は多様な形態を示し、近縁種間で比較を行うことで発生進化学的研究も可能である。
そこで本研究では擬葉が広卵形を示すAsparagus asparagoides (L.) W.Wightを用いて、擬葉の発生過程を形態学的、解剖学的解析により明らかとすること、加えて、分子マーカーを用いた遺伝子発現解析により、擬葉の発生機構、そのアイデンティティーを明らかにすることを目的として研究を行った。その結果、擬葉は組織レベルで背腹性を有していること、発生後期の擬葉において分裂活性は基部に存在することを明らかとした。それらの結果をふまえ、葉およびシュート発生制御遺伝子群の擬葉におけるmRNAの蓄積の時空間的解析結果にも基づき、擬葉の発生機構に関して考察する

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単面葉とは，一般的な葉（両面葉）の背軸面に相当する組織だけで葉身が構成される，背腹性を持たない葉のことであり，このような葉を持つ植物は，単子葉植物で何度も繰り返し進化している．この単面葉は，単子葉植物における葉の極性決定の遺伝的機構，そして，生物の進化過程における平行進化の分子機構を解明するために，独自の優れた材料であると考えられる．
我々は，単面葉の発生・進化機構を解明するために，研究材料として優れているイグサ属植物をモデルとした解析を行っている．また，イグサ属植物は，葉の形態に非常に大きな多様性をしめし，単面葉，両面葉，あるいはその中間的な葉を持つ種が存在し，さらには単面葉の葉身横断面の相称性に関しても，左右対称あるいは放射相称などの多様性が観察される．
今回我々は，葉の背腹性に着目したイグサ属植物の分子系統関係，そして葉の極性を制御する遺伝子群や small RNA の発現パターンを統合的に解析した．その結果，イグサ属植物は葉が単面化しやすい遺伝的背景を持ち，何度か単面葉化のイベントが起きているが，ある一群の共通祖先において，単面葉の確立に決定的な遺伝的変化が起きたこと，そしてそれには葉の背軸側決定因子の異所的発現が伴うことを明らかにした．また，単面葉の相称性は比較的変化しやすい形質であり，DL サブファミリーのYABBY 転写因子がその制御に関与することを明らかにした．

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植物の主要な器官である葉は、有限性の細胞増殖を経て形成されるが、細胞増殖が可能な期間を規定する機構は不明である。我々は、これまでに葉の細胞数が変化したシロイヌナズナ突然変異株を大規模に単離している。その中には、葉原基における細胞増殖期間が通常よりも延長された表現型を示す優性のgrandifolia-D (gra-D)変異株が3系統 (#488, #675, #2001系統)含まれる。このような表現型の分子的背景を明らかにするため、これら3変異株の原因遺伝子座の遺伝学的マッピングを行った。その結果、#488および#675系統では2番染色体上部、#2001系統では4番染色体上部にその変異が位置することが明らかになった。ところが奇妙なことに、これらのマッピング集団のうち、gra-D表現型を示すホモ接合体は、4番染色体下部にも連鎖を示した。一方、野生株の表現型を示す分離個体には、そのような連鎖は認められなかった。この結果をもとに、より詳細なマッピングを行ったところ、gra-D変異株ではいずれも4番染色体下部が重複している可能性が示唆された。この領域には、葉の細胞増殖を正に制御する転写因子をコードするAINTEGUMENTA (ANT) 遺伝子が含まれる。そこで、ANTの発現レベルを解析したところ、gra-D変異株での発現上昇が確認された。ANTのこのような発現レベルの上昇とgra-D変異における細胞増殖期間の延長との関連について、現在さらに解析を進めており、その結果についても合わせて報告する

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シロイヌナズナの優性変異体rotundifolia4-1Dでは、細胞数が長さ方向特異的に減少して葉が短くなる。この仕組みを明らかにするために、我々は原因遺伝子であるROT4遺伝子の機能を調べている。ROT4は、6.2kDaの低分子タンパク質をコードしている。その機能領域が、C末端側のROTUNDIFOLIA4-LIKE/DEVILファミリーに共通の領域付近にあることは既に判明していたが、詳細な機能領域は同定されていなかった。また、その領域が切り出されているのか否かを示す知見は、今までに得られていなかった。今回我々は、まずROT4のコード領域をN末端側およびC末端側から削り込んだものを過剰発現させ、その表現型を調べることにより、機能に必要十分な領域の絞り込みを行った。また、生体内における分子内プロセシングの有無を調べるために、まずROT4:GFPおよびGFP:ROT4融合タンパク質を過剰発現させ、表現型からその機能を評価した。その上で、免疫ブロッティング法を用いて、発現したタンパク質のサイズを調べている。上記の解析およびタグを用いた他の解析に基づき、ROT4の分子機能について議論する。

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我々は、葉の細胞数が増加し、細胞サイズが低下するシロイヌナズナ突然変異体を4系統単離し、このうち3系統では、葉の幼若相から成熟相への転換が早まっていることを見いだした。多くの植物で、幼若相から成熟相、生殖相への転換に伴い葉の様々な形質が変化することが知られており、この現象は異形葉性（heteroblasty）と呼ばれている。シロイヌナズナ野生株では、上位葉ほど細胞数が多く、細胞サイズは小さい。従って、これら3系統の変異体では、異形葉性が早まり、葉が野生株における上位葉の形質を持ったために、細胞数の増加と細胞サイズの低下が見られたと考えられた（宇佐見ら、日本植物生理学会2007年度年会）。
異形葉性には、miR156を介したSPL転写因子の発現調節が重要である。そこで、本研究では葉の細胞数と細胞サイズの制御におけるSPL転写因子の機能について解析した。異形葉性が早まっていた前述の3系統のうち1系統ではSPL15遺伝子のmiR156認識配列に変異があり、mRNA蓄積量が上昇していた。また、miR156を構成的に発現させた植物では異形葉性が非常に遅れるが、この植物では上位葉における細胞数の増加と細胞サイズの低下がほとんど見られなかった。従って、SPL転写因子は葉の細胞数と細胞サイズの制御においても重要な働きを持っていることが示された。

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葉の形態形成は先端基部軸，向背軸及び中央側方軸に沿って生じる．葉は葉身及び葉柄で構成されるが，この二者の先端基部軸に沿った分化に関する知見は乏しい．そこで，葉身と葉柄の境界がいかにして決定されるのかを明らかにすることで，先端基部軸に沿った，新たな葉形態形成の制御機構を理解できると考えた．まず，シロイヌナズナの野生株及び細胞周期のG2/M期の細胞を可視化できるCYCB1;2:GUS系統を用いて，葉の発生過程を特に先端基部軸に注目して詳細に観察した．その結果，分裂細胞が葉原基に一様に分布している比較的初期の発生段階で葉身基部にくびれが生じ始め，葉身／葉柄の境界領域が形成されることがわかった．また，葉身における分裂細胞の分布はその基部側に多いことが知られていたが，興味深いことに，葉柄においては先端部に多く分布することが明らかになった．同様の解析を，先端基部軸上の器官分化に異常があると考えられる既知の形質転換体及び変異体として，見かけ上葉柄を形成しないLEP過剰発現体及び，葉柄に異所的な葉身を形成する bop1bop2二重変異体についても進めている．今回見いだした葉身／葉柄の境界領域の発生制御に関わる遺伝子を同定するため，この境界領域で発現を示すエンハンサートラップラインの探索も進めており，それらについての解析結果も併せて報告する．

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シロイヌナズナのANGUSTIFOLIA (AN)は、動物のCtBP（転写抑制因子）/BARS（ゴルジ体の維持因子）のホモログに相当する。ANは微小管の配向を介して、葉の細胞の横方向への極性伸長に関わる可能性が示唆されている。先行研究では、ANの核局在性やan変異体のマイクロアレイ解析から、ANはCtBPとして機能すると推測されていた。しかし、ANのBARSとしての機能の有無が未解析の上、ANがCtBPの機能に必須なアミノ酸残基を欠いていることから、ANの分子機能は改めて検討する必要がある。本研究では、スワッピング実験及び細胞内局在の解析から、ANの分子機能を明らかにしようと試みた。まず、キイロショウジョウバエにおいてdCtBPの機能をANが代替するかどうか解析したところ、結果は否定的だった。次に、ANとGFPのキメラ遺伝子を、シロイヌナズナan変異体に発現させた変異相補系統を新たに作成した。その結果、AN-GFPは核への局在を示さなかった。また、ANの核局在シグナル様配列に変異を導入した変異型ANも、an変異体の表現型を相補した。以上のことから、極性伸長制御において、ANがCtBPとして機能するとは考えにくい。その一方、AN-GFPの細胞内局在を観察すると、ゴルジ体に隣接してドット状の構造を作る、新規の局在パターンが見られた。これはBARSとしての機能からも想定しがたい局在パターンである。ANのこの様な局在と細胞の極性伸長制御の関連について、現在解析を進めている。

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エチレンシグナル伝達系で機能するEIN3のタバコホモログであるTEIL（Tobacco EIN3-like）は，タバコ酸性PR1遺伝子のプロモーター領域に結合する転写因子として単離された（Kosugi and Ohashi, 2000）．我々はこれまでに TEIL過剰発現タバコおよび抑制タバコの解析から，TEILはbasic PR遺伝子の発現や花器形態形成へ関与すること（Hibi et al., 2007），さらに傷害に応答したエチレン放出にも関与することを示唆してきた．シロイヌナズナではEIN3がERF1の発現を制御すると報告されているが、タバコではTEILがエチレン応答性の既知ERF遺伝子群の発現に影響を及ぼすかどうかについては分かっていない．そこで， TEIL発現抑制体におけるこれらERF遺伝子の発現誘導を調べたところ，この組換えタバコでは NtERF2遺伝子のACC誘導性発現が抑制されることが分かった．また，病害抵抗性に果たすTEILの役割を明らかにするためにTEIL過剰発現体およびTEIL発現抑制体のタバコ腰折れ病菌に対する応答を経時的に調べたところ，野生型と比較して枯死に至るまでの期間に差がみられることが分かった．これらの結果は，TEILが下流の転写因子の発現を介してエチレンシグナル経路に関与していること，また，ある種の病害抵抗性に関与していることを示唆する．

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アグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens)は、植物に感染し腫瘍を形成する。この感染とは、アグロバクテリウムが腫瘍形成遺伝子を植物へ導入することである。遺伝子導入の過程は、植物表面上でアグロバクテリウムが増殖することと、vir遺伝子群を発現することから始まる。
遺伝子導入は、植物ホルモンのエチレンにより抑制されるが、その機構は明らかではない。本研究では、アグロバクテリウムの増殖とvir遺伝子の発現に着目してエチレンの遺伝子導入抑制機構を解析した。
遺伝的改変を加えたアグロバクテリウムを用いて、遺伝子導入時に発生するエチレンが遺伝子導入を抑制することを示した。さらに、エチレン感受性変異体への遺伝子導入実験は、発生したエチレンが植物のエチレン感受性を介して、遺伝子導入を抑制することを示した。エチレン感受性は、アグロバクテリウムの増殖を抑制しなかったが、vir遺伝子の発現を抑制した。以上のことから、アグロバクテリウムの感染は、植物のエチレン発生を促進し、植物はそのエチレンを受容しアグロバクテリウムのvir遺伝子の発現を低下させ、遺伝子導入を抑制することが明らかとなった。遺伝子導入可能な植物細胞をアグロバクテリウムが認識してvir遺伝子は、発現する。従って、植物のエチレン感受性は、アグロバクテリウムの宿主認識を低下させ、遺伝子導入を抑制していると考えられる。

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植物の免疫活性化は、防御関連遺伝子の発現のみならず細胞死を伴うことがある。この細胞死には、病原体の全身感染を抑制する働きがあり戦略的細胞死と考えられている。このような細胞死形質を恒常的に示すシロイヌナズナ突然変異体cad1（constitutively activated cell death 1）を単離した。cad1変異体では、病原性細菌に対する抵抗性を獲得していたことから、この変異体の細胞死形質は免疫機構に関与することが明らかとなった（Plant Cell Physiol. 2005, 46: 902-912）。
cad1変異体では内生ジャスモン酸の上昇、ジャスモン酸およびエチレンによって誘導されるPDF1.2遺伝子の発現が確認された。これらの結果はcad1変異体が示す抵抗性に、ジャスモン酸およびエチレンの情報伝達に関与する転写調節因子であるERF遺伝子が関わっていることを示唆している。マイクロアレイ解析を行ったところ、いくつかのERF遺伝子がその候補としてあげられた。そのうちの一つをECC1（ERF gene controlled by cad1）と名付け、解析を進めた。本発表では、ECC1と植物ホルモンとの関係を中心に議論していきたい。

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病原体感染時にみられるようなHR様細胞死を示す疑似病斑変異体cad1は，サリチル酸（SA）の顕著な蓄積が観察され，病原性細菌に対する抵抗性を獲得している．従って，原因遺伝子CAD1は，局所的な抵抗性といった免疫機能を負に制御していると考えられた（Plant Cell Physiol. 2005, 46: 902-912）．これらの結果は，cad1において身獲得抵抗性（SAR）が誘導されると考えられ，感染部位においてCAD1が低下することにより，未感染部位においても，SAの蓄積と感染特異的(PR)遺伝子の発現誘導と抵抗性の上昇が期待される．
SARとCAD1との関連性について検討するため，CSIROのpOpOff2ベクターを利用したDEX誘導型RNAiシステムを用いた解析を進めた．CAD1のコード領域500bpを標的として作製されたpOpOff2導入植物をDEX培地で生育させたところ，cad1-1様の表現型が観察された．また，局所的なCAD1遺伝子のサイレンシングによって，PR遺伝子等の全身的な発現が観察された．これらの知見は，CAD1がSARを負に制御していることを示唆している．実験ならびに制御の分子機構の詳細について報告する．

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植物は種々の病原微生物の攻撃に対して、様々な防御機構を備えている。その中でも、感染部位における過敏感細胞死は、防御応答機構において重要な役割を担っていると考えられている。しかし、過敏感細胞死の分子機構については未だ不明な点が多い。私たちは液胞が過敏感細胞死を引き起こす重要なオルガネラであることを示してきた。感染に伴って過敏感細胞死に関わる因子の液胞への輸送が活発になることが期待される。今回、液胞を中心とした細胞内輸送系が過敏感細胞死にどのように寄与しているかを明らかにするために、細胞内輸送系に異常を示すシロイヌナズナ変異体にPseudomonas syringae pv. tomato (Pst) DC3000 (avrRpm1)を接種し、過敏感細胞死に与える影響を調べた。その結果、いくつかの変異体において非病原性のPst DC3000 (avrRpm1)の感染に対して過敏感細胞死が抑制され、抵抗性の低下が認められた。そのうち、katamari2 （kam2）変異体は、エンドソームから液胞への小胞輸送が異常となる変異体である。kam2変異体において、感染後の防御遺伝子（PR-1）の発現を調べたところ、野生株と変化はなかった。このことはkam2変異体における感染シグナルの伝達は正常であることを示している。一方、病原性のPst DC3000の感染に対しては、野生株と同程度の罹病性を示した。以上の結果から、KAM2を介した細胞内輸送系がavr遺伝子特異的な抵抗性に関与していることが強く示唆された。

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過敏感細胞死は、植物が非親和性病原菌を認識したときに速やかに誘導される免疫反応の一つであり、DNAの断片化や核の収縮などを伴うプログラム細胞死である。これまでに我々は、過敏感細胞死の誘導に植物特有の転写因子であるOsNAC4が関与することを明らかにしてきた。そこで、OsNAC4による過敏感細胞死の誘導機構について検討した。まず、OsNAC4の局在について特異抗体を用いて調べたところ、過敏感細胞死誘導時特異的に核に局在化することが明らかになった。また、過敏感細胞死誘導時にリン酸化阻害剤であるStaurosporineを加えたところ、過敏感細胞死の抑制が認められ、OsNAC4の核への移行も阻害されることが明らかになった。このことから、OsNAC4の核移行にはリン酸化が必須であることが示唆された。次に、OsNAC4のRNAi抑制体を用いたマイクロアレイ解析を行ったところ、分子シャペロンであるOsHSP90をコードする遺伝子の発現がOsNAC4によって制御されていることを見いだした。そこで、OsHSP90をイネ培養細胞内で一過的に過剰発現させたところ、細胞死の誘導が認められた。現在、OsHSP90を介した細胞死誘導の詳細な機構について解析を行っている。

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植物は病原体のMAMP（microbe-associated molecular patterns）を認識し、防御応答を誘導する。これに対し病原細菌は、進化の過程でタイプIIIエフェクターのような防御応答抑制因子を獲得し、一方で植物はさらに個々の防御応答抑制因子を特異的に認識する抵抗性(Resistance, R)遺伝子を獲得したと考えられる。植物のR遺伝子を介した防御応答において、サリチル酸シグナリングは主要な役割を果たしている。しかし、MAMPによって誘導される防御応答とサリチル酸シグナリングとの関係は明らかにされていない。本題では、シロイヌナズナでのMAMPシグナリングとサリチル酸シグナリングの相互作用を報告する。我々の観察では、1)MAMPの一種であるflg22によってサリチル酸の蓄積が見られた。2）flg22によって誘導される遺伝子発現変動は、ある遺伝子群においてサリチル酸依存的であった。3）flg22処理によって誘導される病原細菌Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (PstDC3000)への抵抗性はサリチル酸シグナリングに部分的に依存していた。これらの結果はflg22によって誘導される防御応答において、サリチル酸シグナリングが重要な役割を果たしていることを示す。現在、flg22によって誘導されるサリチル酸蓄積のメカニズムを解析している。

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病原体からのさまざまな阻害を受けても防御応答を達成するために、植物の防御応答は複雑かつ密なネットワーク構造をもつシグナル伝達ネットワークを発達させた。このようなシステムを理解するには、個々の遺伝子機能だけでなく、ネットワークレベルでのシグナル伝達を明らかにすることが必要である。この課題に取り組む為に我々はシロイヌナズナ-Pseudomonasの系を使って、遺伝子発現プロファイリングを組み合わせた逆遺伝学的アプローチをとった。まず、防御シグナル伝達ネットワークの様々な箇所が阻害されている25変異体にバクテリアを接種し、遺伝子発現プロファイルを取った。次に非線形次元圧縮アルゴリズムを用いて、それらのプロファイル間の類似性を分析した。結果として、既知および新たに予想された遺伝子相互作用を含むシグナル伝達ネットワークモデルを構築した。これを使って、我々は1) サリチル酸を介するサブネットワークのシグナル増幅様式、2）複数の拮抗するシグナル伝達サブネットワークによるシグナル伝達制御などについてモデルを立て、検証中である。

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真性抵抗性遺伝子(R)を持つ植物細胞は、多くの場合、対応する病原菌特異的に活性酸素生成を伴う過敏感反応（HR）細胞死を誘導するが、その分子機構には不明な点が多い。キチンエリシターはnMオーダーで活性酸素生成等の防御反応を誘導するが、細胞死はほとんど誘導しない。そこで我々は、イネのキチンエリシター受容体遺伝子CEBiPの細胞外領域と、受容体型プロテインキナーゼをコードするイネ白葉枯病R遺伝子Xa21の細胞内領域を連結したキメラ遺伝子(CRXa)を作製し、キチンオリゴ糖(GN7)によってXA21下流のシグナル伝達経路を活性化する実験系の開発を試みた。CRXaを発現するイネカルスをGN7で処理し、細胞死誘導ならびに活性酸素生成を定量したところ、いずれもコントロールカルスより有意に増加した。一方、リポ多糖応答性は変化しなかった。また、XA21の自己リン酸化領域を欠くキメラタンパク質を発現するカルスではGN7応答性は変化しなかった。以上の結果から、GN7シグナルがCRXAによって特異的に細胞死誘導シグナルに変換されると考えられた。次に、このCRXa発現カルスを用いて活性窒素（NO、ONOO）生成と細胞死誘導の関係を解析した。GN7処理によって両活性窒素種の生成量はコントロールカルスより増加したが、消去剤を用いた実験結果から、XA21を介したHR細胞死誘導にはNOが関与することが示唆された。

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近年、マメ科モデル植物ミヤコグサより根粒・菌根共生に必須な遺伝子が単離されている。これらの遺伝子群は2つの共生菌の感染の最初期過程を司る共通シグナル伝達経路common signaling pathway (CSP) を構成しており、共生菌の感染シグナルを受容してCaシグナルを誘導し、CSP下流のシグナル経路を活性化していると考えられる。
CSP 遺伝子の一つであるCCaMK（Ca・CaM依存型プロテインキナーゼ）は、自己リン酸化部位への変異導入で機能獲得型となる。機能獲得型CCaMKをマメ科植物に導入すると根粒菌非存在下で根粒様構造を形成する。このことは、Caシグナル受容により活性化したCCaMKが、下流の根粒形成シグナル経路の制御因子として機能していることを示している。
根粒は、皮層細胞分裂誘導による根粒原基形成（根粒器官形成）と根粒菌感染が同時進行することにより形成される。我々はCSP及びその周辺に位置づけられる遺伝子の変異体に機能獲得型CCaMKを導入し、共生表現型を調べることにより、当該遺伝子の「根粒器官形成」及び「根粒菌感染」への関与を検証・解析した。解析結果を基に、根粒形成初期過程を制御する遺伝子ネットワークについて報告する。

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マメ科植物は根粒菌と共生し、窒素固定を行う機能を有するが、この高度に制御された共生関係の確立と維持において、多くの代謝物の相互輸送が重要な役割を担っている。ATP-binding cassette（ABC）タンパク質は細菌からヒトまで生物界に広く分布し、植物の生命活動において多様な生理機能を担っている。根粒形成過程においても大きな発現変動を示すABCタンパク質が複数見いだされ、ABCタンパク質の根粒形成への関与が示唆されている。本研究では、マメ科のモデル植物であるミヤコグサにおけるABCタンパク質の全ゲノム的解析と、リアルタイムPCR法による発現プロファイルの結果から、ミヤコグサに特徴的なクレードに存在し、根粒形成によって最も顕著に発現調節される遺伝子LjPDR1（LjABCG1）に着目し、詳細な解析を行った。ミヤコグサの実生を用いて植物ホルモンを含む種々の化合物への発現応答を解析したところ、LjPDR1はメチルジャスモン酸に対して最も顕著な正の応答を示した。また、地上部へのジャスモン酸処理により、根での発現が800倍にまで増加することが見出された。LjPDR1の細胞内局在性は、不連続ショ糖密度勾配遠心法、及び水性二層分配法により、細胞膜局在であることを明らかにした。年会では、Promoter::GUS形質転換体による組織発現解析やRNAi植物の表現型解析の結果も併せて報告する。

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マメ科植物には, 全植物種に共通して保存されていると考えられるclass 1ヘモグロビン(Hb)と根粒特異的に機能するclass 2 Hbが存在する。Class 1 Hbは, 様々な刺激に応答して植物細胞内で発生する一酸化窒素(NO)との相互作用により, 植物の生理機能の調節している可能性がある。本研究では、NO発生とHbの遺伝子発現を指標に, ミヤコグサ根粒菌野生株、変異株及び病原菌に対するミヤコグサの応答を解析した。ミヤコグサの根に病原菌を接種した場合, 少なくとも接種24時間後までNOが持続的に発生したが, ミヤコグサのclass 1 Hb (LjHb1)は, 発現しなかった。共生根粒菌接種の場合, NOは一過的に発生し, それと同調してLjHb1が発現した。また, nodAC欠損変異株接種の場合, NOは一過的に発生したが, LjHb1発現は誘導されなかった。しかし, exo変異株接種時は, NOの発生とLjHb1発現はともに検出されなかった。ミヤコグサ根粒菌の粗LPSを添加すると, 一過的なNO発生とLjHb1の発現がみられた。精製した根粒菌LPSを添加すると, LPSを含む画分の添加4時間後にNO発生が観察でき, NO発生の誘導活性成分がLPSを含む画分に存在することが示唆された。現在, NO発生とLjHb1発現の誘導活性は同一画分によるか検討中である。

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共生成立の過程には共生特有の相互認識機構だけではなく、病原菌の感染と似た現象が存在する可能性を示唆する結果が報告されている。根粒菌表層のリポ多糖変異体に共生変異体が見出された、根粒菌の接種が宿主植物に一酸化窒素（NO）や過酸化水素などの活性酸素種（ROS）の発生を誘導するなどの報告がある。病原菌のリポ多糖によって植物の病原抵抗性が誘導されることや、病原応答のシグナルとしてNOやROSが発生する現象を考えると、共生成立に特有な相互認識だけでなく、病原応答の視点からマメ科植物と根粒菌の相互認識を捉える必要がある。シロイヌナズナのAtNOA1の変異体は、NO発生レベルが野生型の20%に抑えられ、病原応答関連遺伝子の発現と病原菌に対する抵抗性がともに低下していることから、AtNOA1はNOを介した病原応答に関与していると考えられている。AtNOA1のホモログであるミヤコグサのLjNOA1遺伝子をクローニングし、その発現を定量的RT-PCRにて解析した。その結果、根粒が着生したミヤコグサでは、根粒非着生体よりもLjNOA1の発現が全身的に高くなっていることが確認された。この結果は、マメ科のモデル植物であるミヤコグサに根粒菌が共生することによって、宿主の病原抵抗性が全身的に高まっている可能性を示している。

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Galegoidグループに属するタルウマゴヤシやエンドウなどのマメ科植物では、共生状態の根粒菌（バクテロイド）の形態は培養菌体とは大きく異なり、分裂能を喪失した多核体となっている。このような変化を誘導する因子は、宿主植物側にあるものと推測されるが(Mergaert et al., PNAS, 2006)、その実体は不明である。Galegoidグループの根粒内部には、NCR (nodule-specific cystein-rich)ペプチドが存在しており、ダイズやミヤコグサには、その遺伝子が存在しない。NCRペプチドは、抗菌活性のあるディフェンシンとよく似た構造をしており、Galegoidグループでは、NCRペプチドが根粒菌のバクテロイド化とその維持に関与している可能性がある。そこで、NCRペプチド遺伝子を発現するミヤコグサ毛状根を作出し、ミヤコグサ根粒菌の接種により根粒を着生させた。これらの根粒内部のミヤコグサ根粒菌のバクテロイドの形態、及び、根粒の窒素固定活性について報告する。

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マメ科植物は根粒を形成し、土壌細菌である根粒菌と共生窒素固定を行う。近年、ミヤコグサ等のマメ科のモデル植物を利用した分子遺伝学的解析により、根粒菌感染初期のNod factorの受容と初期シグナル伝達に関わる植物側の因子の単離・同定が進み、その過程が明らかになりつつある。しかしながら、根粒は形成されるが窒素固定活性に異常があるFix^-変異体の存在は、初期シグナル伝達の後に引き続く根粒菌の感染プロセスと細胞内共生の成立、窒素固定活性の発現過程に植物側の因子が必須であることを示している。これまでFix^-変異体の原因遺伝子は、硫酸トランスポーターやアンキリンリピート蛋白等が明らかにされてきたが、そのほとんどは未解明である。
Ljsym89は、ミヤコグサ根粒菌の感染時に、根粒は形成するが、窒素欠乏症状を呈する新規Fix^-変異体である。接種後14日目の根粒の光学顕微鏡、電子顕微鏡による予備的な観察の結果、シンビオゾームの肥大や感染細胞の崩壊などの早期老化の兆候とともに、バクテロイドの異常や細胞間隙への何らかの物質の沈着など、本変異体に特徴的な変化を認めた。本変異体の原因遺伝子は共生窒素固定活性発現に必須の因子であると考えられたため、その構造を明らかにする目的で、ポジショナルクローニングを試みた。本発表では、今回行った、新規Fix^-変異体Ljsym89についての性状解析と原因遺伝子のクローニングの結果を報告する。

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ある種の植物は微生物との共生によって大気中の窒素を固定し, 窒素飢餓の環境でも迅速に生育する。グラム陽性菌である放線菌フランキアは, 非マメ科植物の主に木本のアクチノリザル植物の根に形成された根粒中に共生し, 窒素固定を行っている。フランキアの共生に関連する遺伝子の研究はあまり進んでいない。マメ科植物と共生する根粒菌は, 宿主植物の根滲出液で共生に必要な遺伝子が誘導されることが分かっている。
Casuarina glaucaを宿主植物とするフランキアCcI3株を, C. glaucaと非宿主植物であるAlnus glutinosaの滲出液でそれぞれ処理し, 宿主植物の滲出液で発現が誘導される遺伝子を, Suppression subtractive hybridization (SSH) 法で探索した。この方法は真核生物のmRNAを用いる方法として開発されたものであるが, 我々はCcI3株のtotal RNAから23Sと16S リボソームRNAを取り除いた後, RNA poly(A)ポリメラーゼを用いてpoly(A)を付加し, 真核生物型のmRNAを調製することによりバクテリアへの応用を実現した。SSHにより得られたライブラリーからディファレンシャルスクリーニング法により, 宿主植物の根滲出液特異的に誘導されるCcI3株の遺伝子の同定を試みた。

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