組織培養系において未分化細胞は根にもシュートにも分化する能力がある。サイトカイニンは根の形成を抑え、分化をシュートへと方向付ける。私達は、サイトカイニン高感受性突然変異体ckh1,ckh2においてサイトカイニンで強く抑制される16個の遺伝子の解析をおこなった。プロモーター/レポーター融合遺伝子を用いた解析により、これらの遺伝子の多くは根の原基、根端、根全体、根毛形成細胞などで特異的に発現していた。これらの遺伝子の機能を知るため、過剰発現体の表現型を観察したところ、一つの遺伝子について、子葉に根が形成される形質転換体が見いだされた。この遺伝子は根端で発現しており、転写因子をコードしていた。この遺伝子を転写抑制ドメインをコードする配列、SRDXと融合させ、植物に導入したところ、根の一部にシュートの性質を与えた。これらのことから、この遺伝子の機能として、根端分裂組織の構築と細胞の根への分化に関わることが予想された。

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マメ科植物は根に根粒菌を感染させることで間接的に大気中の窒素を利用できる。この植物微生物相互作用の場となるのは、根粒と呼ばれるマメ科植物に特有の器官である。マメ科植物は根粒菌を認識した後、根の皮層細胞からの根粒形成を開始する。
近年、遺伝学的解析が可能なマメ科植物ミヤコグサやアルファルファの根粒形成不全変異体の研究から、根粒形成に必要な幾つかの因子が報告されている。ミヤコグサLhk1機能欠損型変異体では根粒形成が阻害され、Lhk1機能獲得型変異体では根粒菌の感染無しに自発的に根粒器官が形成されることが報告されている。Lhk1はモデル植物シロイヌナズナのサイトカイニン受容体をコードするCREIと高い相同性を示す。これらの報告から、根粒形成においてサイトカイニンシグナルが重要な働きをすることが示唆されている。しかしサイトカイニンシグナルが根粒形成機構に関与する分子メカニズムは不明である。
サイトカイニン受容体CRE1からのサイトカイニンシグナルや、その下流因子の転写調節を行う因子の働きは、シロイヌナズナを用いて明らかにされている。本発表ではサイトカイニンシグナル関連因子ミヤコグサホモログの根粒形成過程への関与について報告する。

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沖縄原種の褐藻であるオキナワモズク（Cladosiphon okamuranus）では、珪藻、褐藻などに独特のアンテナであるフコキサンチン‐クロロフィルa/c蛋白質（FCP）が光化学系I、II反応中心にエネルギーを供給していると考えられているが詳細は不明である。伊波らは近年このオキナワモズクの藻体に至る前駆体である盤状体の大量培養に成功した。前回の年会で報告したように、我々はこの盤状体よりFCPを単離・精製する手法を確立し、FCPが二種類のサブユニットから成る3量体を形成していることを見出した(以下、これをモズクFCPと呼ぶ)。FCPにおいて光エネルギーを伝達するという機能を発現するのは、FCPに結合した光合成色素である。現在、モズクFCPの普遍的な機能の解明、および生育条件により機能がどのように変化するのかについて研究を進めている。そこで今回我々は、生化学的な純度の高いモズクFCPを用いて、これに結合している光合成色素の光学特性を決定した。まず高速液体クロマトグラフィー（HPLC）及び ¹H－NMR測定を組み合わせて、結合する色素を同定し、化学量論比を決定した。またモズクFCPの蛍光及び蛍光励起スペクトル測定により、Chl cからChl aへ、フコキサンチンからChl aへのエネルギー伝達効率を算出し、当日議論する予定である

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我々は光合成装置形成に関わる協調的な遺伝子発現制御機構の解明を目的として、シロイヌナズナの根の葉緑体分化に着目して研究を行っている。これまでに、根の葉緑体分化には、1）HY5を介した光シグナル伝達が必須であること、2）サイトカイニンおよびオーキシンが、それぞれ促進的、抑制的に働くこと、3）これら植物ホルモンはHY5とは異なる転写因子を介して発現制御すること、を明らかにしている。最近、光合成装置形成を協調的に制御するGARP型転写因子Golden-2 like (GLK)が同定された。シロイヌナズナのアイソフォームGLK1, GLK2の発現ついて、緑化した根で解析した結果、GLK1は検出できなかったが、GLK2の誘導が認められた。二重変異体glk1 glk2、過剰発現株GLK1_OEおよびGLK2_OEにおける根のクロロフィル蓄積を調べた結果、glk1 glk2ではWTに対して有意に低下していたが、GLK1_OEおよびGLK2_OEでは、それぞれ6倍および3倍の蓄積が認められた。以上より、植物ホルモンによる根の葉緑体分化制御にはGLK2が主要な制御転写因子として関与していることが示された。また、これらのラインにサイトカイニンやアンチオーキシンPCIBを処理すると、更なるクロロフィル蓄積の促進が認められたため、植物ホルモンによる葉緑体分化制御には他の転写因子も関与していることが示された。

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暗所で生育した被子植物では、プロトクロロフィリド(PChlide)からクロロフィル(Chl)への変換が起こらず黄化する。黄化葉細胞内に存在する葉緑体前駆体エチオプラスト内では、PChlideはプロチラコイド(PT)とプロラメラボディー(PLB)に局在し、それぞれ633、657 nmに主な蛍光極大を示す。黄化葉に光照射すると速やかにPChlideからChlの変換が起こり、光化学系の構築が開始される。本研究では低温90 Kで緑化過程を止めた黄化葉の顕微分光測定を行い、黄化時と緑化過程での光合成色素－タンパク質複合体およびその中間体の分布を直接観測し、光化学系の構築過程を検討した。低温スペクトル測定法により細胞内に点在するPChlideと、異なった複合体上のChlの蛍光を正確に定量可能にした。
C₄植物であるZea maysを用いた。C₄植物は維管束鞘細胞と葉肉細胞で光化学系IとIIの分布が異なり、細胞内での光合成光化学系の分化が緑化過程のどの段階で進行するかは興味深い。黄化葉の維管束周りの細胞では、PLB由来の蛍光とPT由来の蛍光強度比が周辺細胞とは異なっていた。光照射3時間後には680 nm付近と720 nm付近の2つの蛍光バンドが見られた。特に維管束周りで系I由来の720 nmの蛍光強度が強く、既に細胞ごとの光化学系分化が起こっていることが示された。

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暗所作動型プロトクロロフィリド（Pchlide）還元酵素（DPOR）はニトロゲナーゼ類似酵素であり、BchL蛋白質のホモ二量体からなるL-蛋白質と、BchN蛋白質とBchB蛋白質のへテロ四量体からなるNB-蛋白質から構成される。L-蛋白質とNB-蛋白質は、各々還元コンポーネントおよび触媒コンポーネントとして機能し、PchlideのポルフィリンD環を立体特異的に還元してクロロフィリドaを生成する反応を触媒する。私達はこれまでに光合成細菌Rhodobacter capsulatusのNB-蛋白質の結晶構造を決定し、ニトロゲナーゼのMoFe-蛋白質と立体構造的に高い類似性を示すことを明らかにした。しかし、BchB蛋白質のC-末端領域（110アミノ酸残基）は構造が未決定である。このC-末端領域は、MoFe-蛋白質を構成するNifK蛋白質には見いだされていないが、全ての既知のBchB(ChlB)蛋白質で保存されていることから、DPOR反応において重要な機能を果たしていると推測される。このC-末端領域を完全に、または部分的に欠失した一連の変異型BchBを作製し、精製を行なった。全ての変異型BchBについてBchNとの複合体が形成されたことから、C-末端領域は複合体形成に必要ではないことが分かった。精製した変異型NB-蛋白質の活性およびPchlide結合能について報告する。

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クロロフィル(Chl)生合成系には進化的起源の異なる2つのプロトクロロフィリド還元酵素が存在し、このうち光非依存型酵素(DPOR)が暗所でのChl生合成能を決定づけている。DPORはL-蛋白質(ChlL)とNB-蛋白質(ChlN-ChlB)という各々ニトロゲナーゼのFe-蛋白質とMoFe-蛋白質と類似した2つのコンポーネントから構成される。ニトロゲナーゼは限られた原核生物にのみ分布し、ニトロゲナーゼ類似酵素が真核生物で機能していることを示す直接的証拠は得られていない。本研究ではヒメツリガネゴケPhyscomitrella patens葉緑体DNAにコードされるDPOR推定遺伝子を、ラン藻Leptolyngbya boryanaのDPOR欠損株で発現させ、暗所でのChl生合成能の回復を示標として評価を試みた。L. boryanaのchlL欠損株とchlB欠損株において各々P. patensのchlL及びchlN-chlBを発現させるといずれも暗所で有意な量のChlを蓄積した。これは、これらの葉緑体遺伝子が機能的なDPORサブユニットをコードしており、各コンポーネントが両生物種の間で互換性があることを示唆している。さらにこの互換性は精製蛋白質を用いた再構成系でも確認された。これらの結果は真核光合成生物の葉緑体においてニトロゲナーゼ類似酵素DPORが機能していることを示している。

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ヘムオキシゲナーゼ（HO）は、フィコビリン生合成系において、ヘムのテトラピロール環を酸化的に開裂しビリベルジンIXαに変換する酵素である。ラン藻Synechocystis sp. PCC 6803のゲノムには、ho1（sll1184）、ho2（sll1875）の2つのHOをコードする遺伝子が存在しており、両遺伝子産物は共にHO活性を示すことが確認されている。ラン藻細胞でのこれら2つのHOの機能分化を明らかにするために、それぞれの遺伝子破壊株を単離した。ho1破壊株は、好気条件では生育できなかった。嫌気（微好気）条件では生育可能であるが、野生株と比べ有意な生育不良を示した。一方、ho2破壊株は好気・嫌気両条件下において野生株と同様に生育した。これらの結果から、1）好気条件ではHO1が生育に必須であり、唯一のHOとして機能していること、2）嫌気条件でもHO1は主要なHOとして機能するが、低酸素条件で誘導されるHO2がHO1の機能を補完していることが示唆された。HO2が低酸素環境で誘導される生理学的意義を明らかにするため、ho1破壊株の好気条件下での生育が、ho2遺伝子の大量発現によって回復されるかどうかの検討を行っている。あわせて、各遺伝子破壊株の色素分析結果についても報告する。

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クロロフィル合成経路における代謝制御や酵素反応のメカニズムを理解するために、我々は、2002年より、クロロフィル合成に影響の見られるシロイヌナズナの変異体をスクリーニングするプロジェクトを続けている。今回、このプロジェクトにおいて、理研のトランスポゾンラインのコレクションから同定された、クロロフィル側鎖の合成に影響がある2種類の変異体について報告する。この2種類の変異体は、どちらも、フィトール側鎖の還元が不十分なクロロフィルを数%から10%程度含んでいた。それぞれ、LIL3:1遺伝子、LIL3:2遺伝子という相同な遺伝子にトランスポゾンが挿入されている事が確認された。LIL3:1およびLIL3:2タンパク質は、どちらも、LHCモチーフを持つ、機能未知の膜タンパク質として知られている。そこで、これらの変異体をかけあわせて、2重変異体を作成したところ、この2重変異体においては、クロロフィルのおよそ90%において、フィトール側鎖が全く還元されていないことがわかった。また、この2重変異体においては、フィトール側鎖の還元を触媒するゲラニルゲラニル還元酵素の蓄積が、ほとんど見られなかった。さらに、この2重変異体においては、フィトールを前駆体として合成されるトコフェロールの蓄積が全く見られなかった。これらの結果は、LIL3がゲラニルゲラニル還元酵素の蓄積に必須である事を示している。

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光合成生物は、多種多様な光合成色素を利用しているが、進化の過程で新たな光合成色素を利用するためには、新しい光合成色素を生合成するだけでは不十分で、光化学系タンパク質も、新しい光合成色素に適合するように作り替える必要があると考えられる。我々は、光合成生物が新たな色素を獲得した過程を理解するために、モノビニルクロロフィルを持つラン藻の祖先から、ジビニルクロロフィル(DV-Chl)をもつProchlorococcus類が出現した過程をモデルケースとして以下の実験を行った。
我々は、本来、モノビニルクロロフィル(MV-Chl)を利用するSynechocystisにおいて、DV-ChlをMV-Chlに還元する遺伝子を破壊することによってDV-Chlを蓄積するSynechocystisの形質転換体を得ることができた。この形質転換体は光傷害を受けやすいが、これはDV-Chlに対してSynechocystisのクロロフィルタンパク質が適合していないためだと思われる。この仮定を検証するために、DV-Chlを蓄積するSynechocystisのD1タンパク質のアミノ酸を改変して、Prochlorococcus類のD1にのみ保存されているアミノ酸を導入したところ、光傷害が抑制された。これらの結果は、DV-Chlを利用するためには、クロロフィルタンパク質を改変する必要があることを示している。

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植物は2種類のクロロフィル（クロロフィルaとクロロフィルb）を合成する。これらのクロロフィルは、葉緑体内の酵素によって相互転換しうることが明らかになっている。クロロフィルbからクロロフィルaへの転換反応は、2種類の酵素によって触媒される2段階の反応であるが、この一段階目を触媒する酵素をクロロフィルb還元酵素とよぶ。この酵素は、緑葉におけるクロロフィルbの分解に必須であることがわかっている。この酵素の遺伝子は、種子の登熟期にも発現する事が知られているが、この酵素の種子の登熟期における機能はわかっていない。そこで本研究では種子形成に着目して、クロロフィルb還元酵素欠損株の種子の色素測定を行ったところ、登熟後の種子でもクロロフィルの蓄積が見られた。またwestern blottingによりクロロフィルb結合タンパク質（LHCII）の存在が確認された。電子顕微鏡観察では野性株とは大きさの違う脂肪体が見られ、細胞の内部構造が異なることが明らかとなった。さらに、クロロフィルb分解酵素欠損株の種子は劣化しやすく、保存期間の長さに応じて発芽率の低下が観察された。このようにクロロフィルb還元酵素は種子形成と発芽を正常に進行するために必須であることが明らかになった。

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クロロフィルは光合成において中心的な役割を担っているが、タンパク質と結合していないクロロフィルは光に当たると活性酸素を発生させる危険な分子となる。そのため、老化過程ではクロロフィルを安全な分子に転換する必要がある。クロロフィル分解に関わる酵素の多くは還元力を必要とする反応である。しかし、還元力がどのようにクロロフィル分解に供給されるのかは明らかではない。そこで、クロロフィル分解過程での還元力供給メカニズムについて新たな知見を得るため、クロロフィル分解の中間生成物を蓄積するシロイヌナズナの変異体(hmc2)の解析と原因遺伝子産物の生化学的解析を行ったので報告する。hmc2変異体は、2つのクロロフィル分解中間生成物、7－ヒドロキシメチルクロロフィルaとフェオフォルビドaを蓄積した。このことは、それらを基質とする7－ヒドロキシメチルクロロフィルaレダクターゼと、フェオフォルビドaオキシゲナーゼの活性が阻害されていることを示唆している。HMC2のアミノ酸配列の解析により、フラビン結合領域の存在が明らかとなった。また、大腸菌のHMC2組み換え体を用いた解析により、HMC2はジチオナイトの添加で吸収スペクトルを変化させるフラビンを保持することが示された。これらのことから、HMC2がクロロフィル分解における還元力の供給に関与していることが示唆された。

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クロロフィル分解経路は光毒性をもつ遊離クロロフィルを除去する経路として重要である。その分解過程においてpheophorbide aのクロリン環が開裂されて生じたRCCは、RCC 還元酵素 (RCCR)によって、20位と1位の間の二重結合が還元され、pFCCとなり、その色調を失う。近年、我々はシロイヌナズナ由来RCCRの結晶構造を新規に決定し、RCCRがフィトクロムなどの発色団合成を行うFDBRに特徴的なα/β/αサンドウィッチ構造を形成しており、両者が共通の反応基盤を持つ事を示した。
今回、我々はRCC結合型RCCRおよびF218V変異体の立体構造を2.6Åおよび2.0Å分解能で決定した。F218V変異体は、pFCCのC1位の絶対構造が反転した反応物を生じる変異体である。構造解析の結果、RCCはβシートとC末端側αヘリックス間に形成されるポケットに結合することが分かり、その結合様式はFDBRの基質結合と同様であるが、それに比べて結合が緩いことが示唆された。この事は反応中に基質よりかさ高い反応中間体を経由する事を考えると合理的である。RCCの還元部位近傍にはGlu-154とAsp-291が存在し、これらの酸触媒としての機能が示唆された。また、 F218V変異体と野生型の構造比較から、C1位を攻撃する触媒が両者で異なることによりpFCCの絶対構造が異なることが示唆された。

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1993年に宮下は、Chl dを主要色素として酸素発生型光合成を行う海洋原核藻類Acaryochloris marina を発見した。Chl dはChl bと同様に、Chl aから酸化的に生合成されていると考えられているが、その詳細は不明である。Chl a → d変換では、Chl aの環Iのビニル基がC=C結合の切断および酸素の付加という過酷な反応を伴ってフォルミル基になる必要がある（-CH=CH₂ → -CHO）。ところが、Chl aにはC=C結合が多数存在するため、通常の酸化方法ではこれらのC=C結合もダメージを受ける。
最近我々は、プロテアーゼの一種パパインが含水アセトン中でChl aをChl dに変換することを発見した。Chl a → d変換効率は、含水率10％のアセトン中および、温度約60℃で最大となった。
今回我々は、種々の野菜および果実とChl aを、含水アセトン中でインキュベートしたところ、いくつかの野菜抽出液で、Chl a → d変換が起こることを初めて明らかにした。青パパイヤやきゅうりなどの多くの植物の皮や葉でChl a → d 変換反応が見られたが、ゴーヤやトマトの皮などでは、Chl a → d変換は確認されなかった。このように、様々な野菜で、Chl a → d変換が起こることから、Chl a → d変換が天然でも起きていると予想される。

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1993年に宮下は、Chl d を主要色素として酸素発生型光合成を行う海洋原核藻類Acaryochloris marinaを発見した。Chl d はChl bと同様にChl aから酸化的に生合成されていると考えられているが、その詳細は不明である。Chl a → d 変換では、Chl aの環Iのビニル基がC=C結合の切断を伴う酸化反応というかなり過酷な反応によりフォルミル基になる必要がある（-CH=CH2 → -CHO）。ところが、Chl aにはC=C結合が多数存在するため、通常の強い酸化反応ではこれらのC=C結合も反応してしまう。
我々は、プロテアーゼの一種パパインが含水アセトン中でChlaをChl d に変換することを偶然発見した。また最近、種々の野菜抽出物によってもChl a → Chl d 変換が起こることを明らかにした。
ところで、Chl a の変性物としてPhe a や Chla’がよく知られているが、Chl d も Chl a の変性物として見ることができる。今回我々は、藻類とChl a を含水アセトン中でインキュベートしたところ、Chla がChl d に変化することを初めて明らかにした。この事実は自然環境の土壌や水圏の堆積物中など、あらゆるシーンにおいてChl d がPhe a やChl a’ と同様に、artifact として観察される可能性を示唆している。

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Acaryochloris spp.は、クロロフィルdを合成することが判明している唯一の生物である。クロロフィルdの吸収極大波長は、他のクロロフィルと比較して長波長側にシフトしているので、Acaryochloris spp.は遠赤色光をも利用して光合成を行うことができる。2008年に、我々は基準株であるAcaryochloris marina MBIC 11017のゲノム配列を解読したが、遺伝子操作技術が全く確立していなかったため、これまでに分子遺伝学的解析を行うことができなかった。今回、我々はA. marinaへの遺伝子導入法を開発し、外来遺伝子の機能的発現に成功したので、その結果について報告する。始めに、多くのシアノバクテリアで保持されることが示されている広宿主域のプラスミドから発現ベクターを作製した。そのベクターを用いて接合法によるA. marinaへの導入を検討したところ、薬剤耐性を示すコロニーを得た。薬剤耐性株に導入したベクターが保持されていたことから、接合によるプラスミドの導入が可能であることが示された。次に、外来遺伝子としてクロロフィルb合成酵素遺伝子であるCAOをA. marinaへ導入した。その結果、CAO導入株では野生型には見られない新奇なクロロフィルが蓄積していた。発表では、新奇クロロフィルの構造、性質と推定される生合成経路について考察する。

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Chl dを使い、700-730nmの光で、酸素発生型光合成をするシアノバクテリア Acaryochloris が宮下ら[1]により発見され14年、PSIではChl dとChl d‘2量体が反応中心P740を形成し[2]、光化学系IIではChl d2量体[3-5]かChl d／Chl aのヘテロ2量体[6]が光反応をすると、推定されています。では、吸収波長が30nmもずれているのに、どうしてうまくいくの？不思議ですね。アミノ酸配列は殆ど変わっていない！ divinylChl a変異株や、アカリオクロリスのバラエテーを遺伝子、タンパク、色素状態などについて検討してみました。パラオのラグーンや群体ホヤは、ガラパゴスの島々のように不思議な変異をもたらしました。未発表データをもとにもう一度考えてみました。エッ、何でガラパゴスかって？1.Miyashita, H., et al. (1996). 2. Hu, Q., et al. (1998). 3. Itoh, S., et. al (2002). 4. Itoh, S. et al (2007) 5. Tomo T. et al (2007) 6. Schlodder, E. et al.(2007)

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植物の細胞には、ゴルジ体・液胞・エンドソームなど一重膜で区画された単膜系オルガネラが多数点在する。これらのオルガネラと細胞膜との間では、小胞輸送を介したタンパク質や脂質などの物質輸送が活発に行われている。近年、生細胞蛍光イメージングにより、膜タンパク質や輸送制御分子などを蛍光タンパク質や蛍光色素により標識することで、植物組織におけるゴルジ体やエンドソームなど単膜系オルガネラの可視化が容易にできるようになった。しかしながら、蛍光のドットとして示されるゴルジ小胞やエンドソーム等の単膜系オルガネラの超微細構造は未だ不明瞭である。そこで、我々は高圧凍結技法を用いた電顕観察により、シロイヌナズナおよびタバコの根端組織における全ての単膜系オルガネラの超微形態を明らかにすることを目的に、網羅的な解析を開始した。無作為に根端細胞を観察した結果、分泌小胞塊が多く観られる細胞や全く存在しない細胞、ゴルジ体由来の大きな小胞など未同定の単膜系オルガネラが多数存在する細胞があることがわかってきた。さらに、組織によってゴルジ体や多胞体(液胞前区画)の形態や数も大きく異なることがわかった。現在、各根端組織における単膜系オルガネラを網羅的に撮影し、各細胞におけるオルガネラ数を数値化することで、それらの分布解析を進めている。今回は、根冠組織を中心に報告する。

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Atg6/Vps30 はVps34とホスファチジルイノシトール3キナーゼ（PI3K）複合体を構成して、オートファジーや液胞タンパク質輸送など多様な膜動態を担っている。植物においてもPI3K阻害剤によりエンドサイトーシスやオートファジーが影響を受ける例が知られている。しかし、シロイヌナズナのAtATG6、AtVPS34遺伝子欠損株はいずれも雄性不稔となり、PI3Kのホモ変異体を用いた逆遺伝学による解析は困難であった。我々は最近、花粉特異的なAtATG6の機能相補によりatatg6の雄性不稔を回避することで、PI3K複合体の遺伝子破壊株を植物個体として得ることに成功した。得られたatatg6変異体はオートファジー能を欠損し、過敏感細胞死や老化促進などオートファジー変異体(atatg)としての特徴を示した。さらに、他のatatg変異体と異なり、atatg6植物には著しい生育阻害など多面的な表現型が見られた。これにより、植物のAtg6-PI3K複合体が花粉発芽やオートファジー以外に様々な生理機能を持つことが分子レベルでも示された。

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複雑な細胞内交通には、モータータンパク質による方向性を持った運動制御が不可欠である。微小管をメインレールとする動物に対し、植物ではアクチンフィラメントをメインレールとする独特の交通網が発達している。アクチン系モーターは植物特異的ミオシンVIIIとXIの2クラスしか存在しない。ただ、高等植物ではメンバーの多様化が進み、シロイヌナズナではミオシンVIIIにおいて4メンバー、ミオシンXIでは13ものメンバーが存在する。メンバー個々の機能を分子から細胞・組織レベルまで明らかにすることで、植物独特の細胞内交通機構の統合的理解を目指す。
私は、ミオシン全メンバー全長cDNAのクローニングに成功し、プロトプラストでの発現から、メンバー特異的な局在や運動を明らかにした。今回、よりインタクトな環境であるシロイヌナズナ培養細胞や形質転換植物における全長ミオシンの発現を試みた。並行し、モータードメインからIQモチーフまでを欠損したテイルドメインの発現を行った。テイルドメインの過剰発現は、正常なミオシンの結合サイトを奪うため、ドミナントネガティブとして機能する。いくつかのメンバーにおいて、テイルドメインが全長とは異なる局在を示した。メンバーが独立した交通経路において、特異的機能をもつことを示唆している。得られた結果から細胞内交通におけるミオシンメンバーの機能や役割分担について議論していく。

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シロイヌナズナにおける植物特異的ミオシンVIIIは、ATM1・ATM2・VIIIA・VIIIBの4メンバーにより構成される。結合領域であるテイルドメインの局在解析から、これらの分子は、原形質連絡、核、小胞体あるいはエンドソームといった多様な細胞内局在を示すことが示唆されている。このことから、テイルドメインがメンバー依存的に多様化し、各々が特異的な積み荷と相互作用していると予想される。我々は、ライブイメージングおよびテイルドメインと相互作用するアダプター分子の探索を行い、ミオシンVIIIメンバー個々の分子機能を明らかにしようと試みた。全長ミオシンVIIIの局在や運動に関する情報を得るため、プロトプラストや培養細胞での一過的発現によるライブイメージング解析を行った。その結果、ATM1・VIIIAは原形質連絡やアクチンと思われる繊維上にドットとして観察された。ATM2は、細胞質中のドットおよび核内に局在が見られた。VIIIBは凝集した膜構造として観察された。次に、テイルドメインと相互作用する分子を単離するため、HaloTagを融合させたテイルドメインを大腸菌で発現・精製した後、植物培養細胞の抽出液よりpull-downを行い、質量分析により分子の同定を行った。その結果、これまでに多くの候補分子を得ている。今大会では、以上の結果を統合して、植物特異的ミオシンVIIIの機能について議論する。

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RABはそれぞれ異なるオルガネラ膜上に局在し，GTP結合型とGDP結合型をサイクルすることで下流因子（エフェクター）の機能発現を調節する．なかでもRAB5は多彩なエフェクター分子を介して，初期エンドサイトーシスにおける複雑な小胞輸送制御の一端を担うことが動物で明らかにされている．陸上植物には植物特異的RAB5と真核生物に共通の保存型RAB5の2種類のRAB5が存在するが，動物と共通するエフェクターは見出されておらず，植物が独自のエンドサイトーシス機構を発達させてきたことが窺える．なかでも保存型RAB5の機能欠損は配偶体致死となることから，その機能の重要性は明らかである．そこで我々は，保存型RAB5の機能発現機構を明らかにするため，エフェクター候補を酵母ツーハイブリット法により探索した．その結果，リン脂質結合能を有するEREX1（Endosomal Rab Effector with pX-domain）を単離した．また，シロイヌナズナにはEREX1の類似遺伝子としてEREX2，EREX3が存在する．EREXメンバーとポストゴルジ小胞輸送経路で機能する各種RABとの相互作用能を検討した結果，EREXメンバーは組み合わせの異なる複数のRABと相互作用する可能性が示唆された．本発表では，このEREXメンバー間における，機能の冗長性と差異について報告する．

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シロイヌナズナのゲノム中にはRab GTPaseをコードする遺伝子が57個存在し，そのうち26遺伝子がRab11グループ(RabA1~RabA6)に分類される．一方で，酵母・動物ではRab11グループに属する遺伝子はごく少数であることから，植物においてRab11グループは独自の進化を辿り多様化したと考えられる．我々は，Rab11グループの多様化が植物の膜交通システムに与えた意義を解明すべく解析を行っている．これまでにRabA1サブグループ(RabA1a~RabA1iの9遺伝子)のメンバーがトランスゴルジネットワーク（TGN）近傍のドット状のオルガネラに局在し，特にRabA1eはTGN近傍から根毛先端への輸送を担っていることを示唆する結果を得ている．今回はさらに詳細な細胞内局在の解析を行い，RabA1bおよびRabA1eが，シロイヌナズナ個体において，分泌経路で機能するR-SNAREであるVAMP722と極めてよく共局在することを明らかにした．その一方で，RabA1bとRabA1eは一部異なるコンパートメントに局在していたことより，RabA1メンバー内においても機能すべき輸送経路が分化している可能性が示唆された．本発表では，Rab11メンバーの相互作用因子探索の経過についても報告したい．

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RAB5は，活性型時に，エフェクターと呼ばれる分子群と相互作用することにより，細胞内輸送において多様な現象を制御していると考えられている．RAB5は真核生物に広く保存されているが，陸上植物には保存型RAB5に加え，ユニークな一次構造を有するRAB5ホモログをもつ．シロイヌナズナには，保存型RAB5であるARA7・RHA1と，植物固有型RAB5であるARA6が存在し，私たちの研究室では，保存型RAB5とARA6が，異なる輸送経路を制御することにより，花成や細胞分化，根の形態形成などの現象を制御することを明らかにしてきた．このようなRAB5の機能は，さまざまなエフェクターとの相互作用を介して発現していると考えられるが，植物には，これまで報告されている動物のRAB5エフェクターのホモログは見いだされず，その仕組みは全く明らかになっていない．そこで私は，植物固有型RAB5であるARA6がどのような機能を持つか，また，どのようにして保存型RAB5とは異なる膜輸送経路を制御するのかを明らかにすることを目的とし，ARA6エフェクターの同定と機能解析を試みた．本大会では，得られたエフェクター候補のうち，PUF2 (Plant-unique RAB5 Effector 2)について報告する．

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細胞内では小胞を介して様々な物質の輸送が行われており，RABとSNAREはこの小胞の融合を制御している鍵因子である．我々は小胞輸送が植物の高次現象において果たす役割を明らかにすることを目的とし,特に陸上植物固有のRABとSNAREであるARA6とVAMP727に注目し研究を行っている．ARA6は特徴的な一次構造を持つ植物固有のRAB5であり，保存型のRAB5とは一部重なりながらも異なるエンドソームに局在している．我々はこれまで液胞膜に局在するQ-SNAREであるVAM3との遺伝学的解析から，ARA6と保存型RAB5が拮抗した機能を持つことを明らかにしているが，その詳細なメカニズムは不明であった．一方で，VAMP727はlongin domainに約20アミノ酸からなる挿入を持つR-SNAREであり，シロイヌナズナでは液胞膜とエンドソームの接する部分でVAM3と複合体を形成し，エンドソーム/液胞輸送において機能することを明らかにしている（Ebine et al., 2008）．
これら植物固有の小胞輸送制御因子について複合的な解析を行った結果，ARA6がVAMP727を介してエンドソームから細胞膜への輸送を制御していることが明らかになった．今大会ではこの解析結果について報告する．

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SNAREは小胞輸送において膜融合を実行する因子であり，SNAREモチーフと呼ばれるcoiled-coil構造を形成するアミノ酸配列の特徴から，Qa，Qb，QcとRの4種に分類される．陸上植物種に保存された主要なR-SNAREであるVAMP7ファミリーは，VAMP71とVAMP72という二つのサブグループで構成されている．さらに，種子植物のVAMP72グループには，longin domainに約20アミノ酸からなる酸性配列が挿入された特異な分子種が存在する．当研究室ではこれまでに，この酸性配列を有するシロイヌナズナVAMP72分子，VAMP727がエンドソームを中心としたポストゴルジ輸送ネットワークで機能することを明らかにしてきた．現在はさらに，この種子植物特異的なR-SNAREの進化において挿入配列が果たした役割を解明すべく研究を進めている．本講演では，VAMP727からの酸性配列の欠失や，祖先型VAMP72分子への酸性配列の人為的挿入が，それぞれの分子機能に及ぼす影響について報告するとともに，種子植物の様々な系統から単離したVAMP72の機能解析の結果を報告する．

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シロイヌナズナゲノムには4種類のSYP2ファミリーSNAREタンパク質がコードされている．過去に，VAM3/SYP22 及びPEP12/SYP21の単独変異体は致死性を示すことが報告されている．しかしながら，我々はこれまで，vam3/syp22変異体を単離することに成功し，変異体の解析から，VAM3/SYP22が植物の成長・維管束パターンの形成・ミロシン細胞分化に関与していることを報告してきた．このことから，SYP2ファミリーの機能について再検証が必要であると考えられる．今回，我々はplp/syp23の変異体を確立することに成功し，加えて，vam3/syp22との多重変異体を作製した．さらに，artificial microRNAによる遺伝子抑制法により，vam3/syp22変異体背景でPEP12/SYP21の遺伝子発現を抑制することに成功した．これらの変異体の表現型の解析から，VAM3/SYP22，PEP12/SYP21，PLP/SYP23が冗長的に機能していることを発見した．興味深いことに，GFP融合タンパク質を用いた細胞内局在の解析により，PLP/SYP23が膜成分に局在することなくSNAREタンパク質として機能している可能性を見出した．そこで，本大会ではSYP2ファミリーの機能について議論したい．

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種子貯蔵タンパク質は小胞体で前駆体として合成された後，小胞輸送によりタンパク質蓄積型液胞に運ばれ，液胞内で成熟型に変換されて蓄積する．私達は，液胞タンパク質の細胞内輸送機構を解明する目的で，貯蔵タンパク質を前駆体として異常蓄積するシロイヌナズナmaigo変異体を単離してきた．新規変異体であるmaigo3 (mag3)の種子細胞には，直径約 500 nmの電子密度の高いコアを含む構造体が多数蓄積していた．この構造体はリボソームに覆われていることから，小胞体由来であることが示唆された．マップベースクローニングにより同定したMAG3遺伝子は，約200 kDaの機能未知のタンパク質をコードしていた．MAG3タンパク質は，コイルドコイル領域を多く含み，C末端に膜貫通領域を1つもつと予測された．解析の結果，MAG3タンパク質は小胞体に局在すること，膜貫通領域が小胞体への局在化と小胞輸送機能に必須であることが判明した．MAG3タンパク質は，構造的に小胞膜を標的膜に繋留するための因子に類似していることから，小胞体―ゴルジ体間の小胞輸送において繋留因子として機能している可能性が浮上した．これまでに私達は，小胞体に局在する繋留因子としてMAG2複合体を明らかにしているが(1)，MAG3はMAG2複合体には含まれない．新規繋留因子様タンパク質MAG3の機能について考察する．

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小胞体は，非常に複雑なネットワーク状の構造をとりつつ，ダイナミックに運動するオルガネラである．このような形態の複雑性は小胞体機能の多様性に関与しているが，これらの構造を形成・維持する分子機構は未解明の部分が多い．我々はこれまでに小胞体の形態異常を示す3種類のシロイヌナズナ変異体を単離している (ermo1, ermo2, およびermo3)．このうちermo1とermo2の表現型は部分的に類似しており，GNOM-LIKE1 (GNL1) とSEC24aをコードする遺伝子に変異がみつかった (1)．これらの因子はともに小胞体―ゴルジ体間の輸送に関与すると考えられている．我々は，ERMO1およびERMO2によって特異的に輸送される未知の因子が小胞体の形態において重要な働きを担っていると考えている．一方，ermo3ではGDSL-motif lipaseと呼ばれるリパーゼをコードする遺伝子に変異を同定した．この酵素は液胞内腔に局在されると予測されている．我々の解析結果は，小胞体の形態と脂質代謝経路とをつなぐ全く新しい経路の存在を示唆している．
(1) Nakano, R.T. et al, Plant Cell, 10.1105/tpc.109.068270 (2009).

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小胞体には，新規に合成されるタンパク質の高次構造形成を監視し，失敗した異常タンパク質を修復，分解する「品質管理」とよばれる機構が存在する．哺乳動物では，Hsp40，であるERdj3がHsp70 (BiP)の補助因子として，小胞体品質管理において中心的な役割を果たしている．われわれは，植物の生育における小胞体品質管理の役割を明らかとするため，ERdj3のシロイヌナズナホモログであるAtERdj3Bに注目し，解析を行なってきた．AtERDJ3B遺伝子の欠損株は通常条件では野生株と同様に生育したが，29°Cでは種子を付けず不稔となった．これは、葯から柱頭への花粉の放出の欠損によるためであることが示された。29°Cで栽培したaterdj3b欠損株の葯では、樹脂切片の光学顕微鏡観察や走査型電子顕微鏡観察の結果、花粉の生存率の低下や花粉同士の癒着が起こることが明らかとなった． この異常は、BiPと相互作用できないaterdj3b(H54Q)変異体の発現によって抑圧されないことから，AtERdj3BとBiPとの相互作用が重要であることが示された．また，糖タンパク質の品質管理の分子装置であるUGGTの欠損株もaterdj3b欠損株と同様に29°Cで不稔となった．これらの結果は，シロイヌナズナでは高温での花粉形成に小胞体品質管理が重要であることを示している．

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シャペロンタンパク質であるBiPは小胞体において、タンパク質翻訳後の未熟タンパク質と結合し、そのフォールディングを補助するだけでなく、フォールディング遅延、若しくは不能となったタンパク質が増加した状態、すなわちERストレス時において、異常タンパク質を翻訳抑制や分解へと誘導する。
我々は、イネ胚乳に有用タンパク質やペプチドを蓄積した組換え米の開発を進めている。その際導入産物によっては、しばしば種子の粉質化、白化といった死米様表現型を呈すると同時に、種子貯蔵タンパク質の低下およびBiPの増加が認められる。その後の解析から、このような種子では胚乳細胞にERストレスが起こっていることが示唆された。このことから、イネ種子でのBiPの変動とERストレスとの関係に着目し、両者の関係を調査した。
BiP (AK065743) 過剰発現系統および発現抑制 (RNAi) イネ系統を作製した。様々なBiPレベルの系統を選抜し、それらの表現型や種子貯蔵タンパク質 (グルテリン、グロブリン、プロラミン)、シャペロン遺伝子や転写因子を中心とした、ERストレス関連遺伝子 (BiP の別ファミリー、HSP70、PDI、calnexin、bZIP型転写因子)の発現を調査した結果から考察された、種子における BiP の役割について報告する。

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The messenger RNA of the rice seed storage protein prolamine is targeted to the endoplasmic reticulum (ER) membranes surrounding prolamine protein bodies via a mechanism which is dependent on both RNA sorting signals and the actin cytoskeleton. In this study we have used an RNA bait corresponding to the previously characterized 5'CDS prolamine zipcode sequence for the capture of RNA binding proteins (RBPs) from cytoskeleton-enriched fractions of developing rice seed. In comparison to a control RNA, the zipcode RNA bait sequence captured a much larger number of proteins, eighteen of which have been identified by tandem mass spectrometry. Western blots demonstrate that several of the candidate proteins analysed to date show good to excellent specificity for binding to zipcode over non-zipcode RNA bait. The protein expression profile of RBP-A, an hnRNP, closely follows prolamine gene expression and in addition to being present in nuclei, RBP-A also co-localizes with microtubules and is associated with cortical ER membranes. Immunoprecipitation studies show that RBP-A is bound to prolamine and glutelin RNAs in vivo, supporting a direct role in storage protein gene expression.

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イネ種子グルテリン前駆体のプロセッシングを制御する酵素の機能を明らかにするために、同前駆体を貯蔵型液胞 (PSV) 内に多量に蓄積するglup3 突然変異体を解析した。glup3 変異体3系統の登熟種子では、液胞プロセッシング酵素(VPE)活性が野生型と比べて顕著に減少していた。野生型種子においてPSVは不定形で、PSV内にはα-グロブリンとグルテリンが偏って集積する。glup3 変異体では、PSVは球状を示し、α-グロブリンとグルテリンがPSV内に均一に分布していた。さらに、野生型のPSV内のグルテリンのみが集積している部位ではグルテリンの結晶性格子構造が観察されるが、glup3 変異体において同構造は認められなかった。これはイネ種子において、VPEによるグルテリン前駆体のプロセッシングが、貯蔵タンパク質の区画化とPSVにおけるグルテリンの結晶性格子構造の形成に重要な役割を果たしていることを示唆している。さらに、glup3 幼苗の生育の遅れが観察された。これはグルテリン前駆体のプロセッシングが幼苗の生育に影響を及ぼすことを示しており、幼苗の初期生育のための窒素源としてグルテリンの迅速な利用にとって、結晶構造を有するグルテリンのPSV内への貯蔵が重要であることが考えられる。

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我々は、イネ NPP について研究を進めている。イネにおいては、6つのNPP遺伝子が存在し、これらNPP遺伝子の過剰発現イネ細胞を作成し、生合成されたレコンビナントNPPをレクチンおよび陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを用いて精製し、酵素学的諸性質を調べた。NPP1 とNPP6はデンプン生合成の前駆体であるADP-グルコースの分解活性を有していた。解析したすべてのNPPアイソザイムは、コンカナバリンAレクチンに結合することからN－結合型糖鎖を持つ糖タンパク質であることが分かった。さらに、各NPPとGFPとの融合遺伝子をイネ細胞に導入し、共焦点レーザー顕微鏡によりその細胞内局在を観察したところ、NPP1-GFP、NPP2-GFP、NPP6-GFPのGFP蛍光の70%以上がプラスチドに局在していた。これまで、糖タンパク質はER―ゴルジ体で合成されることからプラスチドに存在することは考えられてこなかった。そこで我々は、このプラスチドに局在する糖タンパク質NPP1を、グライコブロット法により糖鎖構造解析を行った。その結果、プラスチドに局在するNPP1の糖鎖は、27種類のN-結合型糖鎖を有し、高マンノース型糖鎖が14.9%、複合型糖鎖は、53.8%、少マンノース型が31.3%含まれていた。このことから、NPP1がゴルジ体を経由してプラスチドに局在していることが示唆された。

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Sec-translocase は進化的に広く保存されたタンパク質輸送経路であり、タンパク質輸送・分泌及び膜タンパク質挿入に機能している。輸送・分泌機構には、モータータンパク質である SecA が中心的な役割を果たしており、ATP 加水分解エネルギーとタンパク質輸送を共役させている。植物細胞にも SecA ホモログが存在しており、ストロマからチラコイド内腔へのタンパク質輸送に機能している。Mycobacteria や Listeria には SecA が2つ存在し、基質タンパク質による使い分け機構が報告されているが、植物細胞では現在のところ知られていない。
単細胞性紅藻 Cyanidioschyzon merolae の全ゲノム配列の解読結果から、核と色素体ゲノムの両方に secA 遺伝子がコードされていることが明らかとなった。この2つの secA 遺伝子は共に発現しており、何かしらの機能をもつことが示唆された。また、この2つの secA 遺伝子は分子系統学的に異なっていた。核コードの SecA 間及び色素体コードの SecA 間には相互作用があり、さらに核コードと色素体コードというヘテロな SecA 間にも相互作用が存在した。これら2つの SecA は ATPase としての至適温度が異なっており、温度による使い分け機構という SecA の新たな可能性が見えてきた。

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光合成の炭酸固定酵素RubiscoはC3植物の成熟葉において最も多いタンパク質である。Rubiscoは、核ゲノムのRBCSにコードされる小サブユニットおよび、葉緑体ゲノムのRBCLにコードされる大サブユニット、それぞれ8つずつからなる計16量体である。このうちRBCSは高等植物においてmultigene familyを形成していることが知られているが、その役割は未だ明らかではない。そこで本研究では、イネ (Oryza sativa L.) においてRBCS各分子種のRubiscoタンパクの生合成への貢献度を調査することとした。イネにおいてはOsRBCS1から5の5分子種のRBCSが存在するが、葉身で主に発現しているのはOsRBCS2から5であったため、これら4分子種をRNAi 法によって個別に発現抑制した形質転換体を作製し、葉身Rubisco量を測定した。形質転換当代において、葉身Rubisco量はOsRBCS2から5の個別発現抑制により、それぞれ野生型と比べて35%、25%、16%、32%減少していた。また、これらの系統において発現抑制した分子種のmRNA量は、それ以外の分子種の発現量には大きな影響を与えることなく著しく減少していた。これらの結果から、イネにおいてはOsRBCS2から5の全ての分子種がRubisco生合成に寄与しており、それらは互いに相補されないことが示唆された。

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Rubiscoは、光飽和および現在の大気CO₂分圧下での光合成の律速因子であり、C₃植物の葉における最大の窒素の投資先である。しかし、高CO₂分圧下では光合成速度がRubisco以外の因子に律速され、Rubisco量は光合成全体のバランスの中で過剰になることが明らかにされている。そこで本研究ではイネにおいて葉のRubisco量を適量化し、他の光合成因子へのN分配を増加させることで、高CO₂分圧下での光合成および個体成育の窒素利用効率を高めることを目的とした。RNAi法によってRBCS multigene familyを個別に発現抑制したイネを作製したところ、OsRBCS3を発現抑制した当代においてRubisco量が野生型の70％となった形質転換体が2系統得られた。このT₁世代を用い、はじめに現在の大気条件下での個体成長を経時的に調査した。草丈、葉齢、分蘗数には、野生型との間に有意差はみられなかったものの、播種後70日目の乾物重は形質転換体で小さかった。これは栽培期間の後半にあたる播種後42-70日目の間の相対成長率が形質転換体で低下したためであり、その理由は播種後42-70日目の間の純同化率の低下であった。よって、OsRBCS3発現抑制イネは大気条件下での成育時に、形態はほとんど変化しないがバイオマス生産量は減少することが分かった。 現在、高CO₂分圧下での個体成育を解析中である。

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植物のフルクトース-1,6-ビスリン酸アルドラーゼ(FBA)は、解糖系やカルビン回路に必須の酵素であり、細胞質型と色素体型が存在する。シロイヌナズナの色素体型FBAは、FBA1 (At2g01140)、FBA2 (At2g21330)、FBA3 (At4g38970)の三種類がゲノム上で発見されている。これらのアミノ酸配列を、他の植物種の色素体型FBAとともに系統樹解析を行うと、FBA1型とFBA2/3型の二つに分かれる。我々の研究グループでは、シロイヌナズナのFBA1をグルタチオン化タンパク質として単離し、グルタチオンによる光合成活性の制御機構において中心的な役割を果たすことを報告した。本研究では、色素体型FBAのアイソザイムの酵素特性を解析するために、FBA1、FBA2、FBA3をそれぞれ過剰発現させたシロイヌナズナ形質転換株を新規に作製した。これらの形質転換株では、各アイソザイムの過剰発現によって色素体型FBA蓄積量が、野生型株の三倍以上になるものが得られ、さらにアルドラーゼ活性も蓄積量に応じて上昇していた。そして、FBA四量体の構造特性が、アイソザイムの存在比によって変化することがNative-PAGE解析で示された。これらの解析結果をもとに、色素体型FBAアイソザイムの酵素特性や、それらの存在意義について考察する。

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我々はこれまでにグルタチオン結合タンパクとしてカルビン回路酵素フルクトース-1,6-ビスリン酸アルドラーゼ(FBA)を同定し、CO₂固定反応にはFBA活性が重要でその活性制御にはグルタチオンが関わることを報告した。シロイヌナズナでは葉緑体型FBAには3種のアイソザイムが存在する。そこで、各アイソザイムの発現量が低下したシロイヌナズナ変異体を用いて、葉緑体でのFBAアイソザイムの機能の解析を行なった。野生型植物において、葉緑体FBAの全アイソザイムのタンパク量を定量したところ、その存在比は、従来からカルビン回路酵素とされてきたFBA2とFBA3がそれぞれ0.28と0.70であったのに対し、FBA1が0.02であった。FBA1が野生型の60%に減少した変異体fba1-1では糖の蓄積量とCO₂固定速度の低下が認められた。FBA1のC末57アミノ酸残基が欠失した変異体fba1-4では糖の蓄積量、CO₂固定速度の著しい低下が認められた。FBA3の欠損変異体では糖の蓄積量は低下したがCO₂固定速度に影響は認められなかった。FBA2の欠損変異体では糖の蓄積量とCO₂固定速度にほとんど影響はみられなかった。以上から、FBA1は葉緑体において重要な機能を果たすことが示唆された。本発表では、グルタチオンとFBA活性との関係を調べた結果を合わせてFBA1のカルビン回路における機能について考察する。

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ラン藻の炭酸同化はCO₂濃縮機構（CCM）を介して極めて効率的に行われる。また、CCMはCO₂欠乏に応答して活性化される。Synechococcus elongatus PCC 7942においては、LysR型転写制御因子CmpRが、高親和性HCO₃^-輸送体BCT1をコードするcmpABCD、Na⁺依存性高親和性HCO₃^-輸送体SbtAをコードするsbtA、NDH-I3脱水和酵素複合体をコードするndhF3D3chpYなど、CCMに関わる遺伝子の転写を調節する。cmpABCDオペロンの制御領域は950bpの長大なもので、CmpRがこの領域に複数の結合部位をもつことがゲルシフトアッセイによって示されている。また、この領域にはCmpRのホモログであるCbbRの結合モチーフが7つ(cmp1～cmp7)あり、そのうち3ヶ所(cmp3,5,6)の塩基置換はCO₂欠乏への応答を阻害する。今回、cmp3,5,6とCmpRの結合を、塩基置換とゲルシフトアッセイによって調べたところ、cmp3,6の改変はCmpRの結合に影響を及ぼさなかった。このことからCmpRはCbbRモチーフ以外のDNA配列を認識していることが示唆された。

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海洋性珪藻は現大気圧CO₂濃度環境下において、細胞内に無機炭素 (Ci) を濃縮する機構（CCM）を持つ。濃縮されたCiは細胞内カーボニックアンヒドラーゼ (CA)によって効率よくRubiscoに送り届けられると考えられている。海洋性珪藻Phaeodactylum tricornutum では2つの葉緑体型CA、PtCA1及び2が同定されともにピレノイドに局在することが強く示唆されている。しかしP. tricornutum ゲノムにはこの他に6つのCA候補遺伝子があるが局在は明らかではない。一方で海洋性珪藻のCCMにはC₄型光合成経路が含まれるという説もある。単細胞の海洋性珪藻がC₄型光合成を行うならばHCO₃^-固定酵素PEPCは細胞質に、脱炭酸酵素のPEPCK、MEは葉緑体に局在するはずだが、その証拠はまだ得られていない。本研究ではP. tricornutumのCAとC₄型光合成関連酵素の局在を調べた。これらの遺伝子をゲノムデータベースから探索し、クローニングした。RT-PCRによってCO₂と光に対する応答性を調べた。また、これらの遺伝子とegfpを融合し局在を解析した結果6つのCA候補タンパク質は4重膜包膜系に集中して局在した。これらの酵素の局在から海洋性珪藻の炭素獲得機構について議論する。

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円石藻Emiliania huxleyi（ハプト植物門）は，海洋に生息する単細胞藻類であり，紅藻の二次共生により生じたため，4枚の葉緑体包膜を持つ．我々は先行研究により，E. huxleyiがC₃型の光合成経路を持つが，同時にβ-carboxylationによりC₄化合物を生成することを示した．さらに，β-carboxylation酵素であるピルビン酸カルボキシラーゼ（PYC）の転写産物が，明条件下で顕著に増加することを示し，光合成時のC₄化合物生成にPYCが関与することを示唆した．緑色植物はPYCを持たないため，PYCによるC₄化合物生成経路はE. huxleyiの特徴の一つであると考えられる．
PYCのN末端移行シグナル解析では，4重膜葉緑体を持つ生物に特有の葉緑体移行シグナルが予測された．そこで本研究では，E. huxleyiでPYCが葉緑体で機能するかを調べるために，PYCの局在解析と酵素活性の検出を試みた．抗PYC抗体を用いた免疫染色（間接蛍光抗体法）では，PYCは葉緑体に局在することが示唆された．また，PYCの活性測定では，細胞破砕法を検討することで，細胞破砕液中にPYC活性を検出することができた．今後はゲノム上に存在するアイソザイムを考慮し，細胞破砕液中で検出されたPYC活性が，葉緑体型PYCに由来するものかを確認する必要がある．

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植物の葉において、細胞は向背軸における位置に応じてさまざまな分化をすることが知られている。現在までに、遺伝学的な解析から向軸側、あるいは、背軸側特異的に発現する発現制御因子がそれぞれの発現領域において細胞分化を促していると考えられている。しかしながら、これらの発現制御因子自身が向背軸にそって極性を持って発現する機構については明らかでない。
我々は、向背軸にそった極性形成機構を明らかにするためにenf1突然変異体を材料として解析をおこなっている。enf1突然変異体は向背軸にそった極性をもった遺伝子発現パターンの頑強さを欠く変異体であった。enf1突然変異体の原因遺伝子はGABA代謝経路のコハク酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードしていることを明らかにした。ENF1以外のGABA代謝経路の酵素をコードするGABAT1遺伝子を欠いた突然変異体について向背軸にそった極性をマーカー遺伝子を用いて解析したところ、gabat1突然変異体は弱い背軸側化変異体であることが明らかとなった。また、enf1 gabat1二重突然変異体の解析からENF1遺伝子とGABAT1遺伝子とは向背軸にそった極性に関して逆の効果を持っていることが明らかとなった。これら遺伝学的な解析結果と生理学的な実験結果とを合わせて、いかにGABA代謝経路が向背軸にそった極性を制御しているかについて論じたい。

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多くの植物の葉では、柵状組織と海綿状組織など、向軸側(表側)と背軸側(裏側)で異なる細胞分化が見られる。これらの細胞分化は、葉原基の段階から向軸側または背軸側の領域でのみ特定の遺伝子群が発現することで制御されている。しかし、その発現領域がどのように決まるかについては理解が進んでいない。我々は背軸側だけで発現する遺伝子の一つFILAMENTOUS FLOWER (FIL )を用いて、向軸側／背軸側に特異的な遺伝子発現の制御機構を解析している。
シロイヌナズナ突然変異体 enlarged fil expression domain2 (enf2 )では FIL の発現領域が異常に広くなっていた。この原因遺伝子ENF2 を同定したところ、葉緑体局在タンパク質をコードしていることがわかった。enf2 変異体の葉原基において葉緑体を観察したところ、内部構造の発達に異常が見られた。そこでFIL の発現領域と葉緑体発達の関係を調べるため、エリスロマイシン処理によって野生型植物の葉緑体の発達を阻害したところ、enf2 変異体と同様にFIL の発現領域が広くなった。これらの結果から、葉原基におけるFIL の発現領域制御において葉緑体の正常な発達が必要な要因であると考えられる。

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葉の表側と裏側それぞれの領域に特異的に発現する遺伝子が葉の横方向への成長に重要であることがこれまでの研究から明らかにされている。しかしながら、それらの遺伝子がどのようにして適切な領域で発現し、どのようなしくみを介して横方向への成長を制御しているのかは明らかになっていない。
これまでにわれわれはWOXファミリー遺伝子の1つであり、葉の発生初期に周縁部特異的に発現するPRS遺伝子とそのホモログであるWOX1遺伝子が葉の横方向への成長と周縁部の組織の形成において重複した機能を持つことを明らかにしている。
さらに発現解析により、WOX1遺伝子が横方向への成長が開始する以前の若い葉原基ではPRS遺伝子と同様周縁部で発現すること、横方向への成長が進んだ葉では表側と裏側の接する領域(境界部)で発現することが明らかとなった。また、prs wox1 二重欠損変異体において周縁部での異常に加え、葉脈パターンが単純化する異常が見られた。葉脈を構成する維管束は表と裏の境界部に形成されることが知られており、かつ周縁部は表皮における表と裏の境界部にあたる。これらから、PRS遺伝子とWOX1遺伝子は表と裏の境界部で発現し、横方向への成長と境界部の組織形成に関与していることが示唆された。現在、PRS遺伝子とWOX1遺伝子が表側や裏側で発現する遺伝子とどのように関わるかを解析中である。

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葉は茎頂メリステムから発生し、三つの軸、すなわち基部先端部軸・向背軸・中央側方軸に沿って成長する、扁平で左右相称的な器官である。シロイヌナズナのasymmetric leaves1 (as1)とas2変異体はこの三つの軸すべてに異常を示し、左右非対称的な葉身の切れ込みや上偏成長、弱い背軸側化、基部先端部軸方向の成長抑制が認められる。我々はこれまでに、マイクロアレイとクラスタリング解析からAS1とAS2がBP、ETT、YAB5を抑制していることを明らかにした。さらにAS1とAS2は、class 1 KNOXやETTに機能欠損変異があってもBP、ETT、YAB5を抑制することを報告した。今回、YAB5の機能欠損変異体を得たのでその解析結果を報告する。yab5、as1 yab5、as2 yab5におけるBP、ETTの発現レベルをreal-time PCRによって調べた結果、YAB5に変異があってもAS1とAS2はBPとETTを抑制しているという結果を得た。これらの結果はAS1とAS2が独立の経路でBP、ETT、YAB5を抑制していることを示している。変異体の表現型を調べたところ、yab5変異はas1やas2の葉の表現型異常に大きな影響を及ぼさなかった。YAB5の過剰発現植物を作成したところ、葉身の向背軸異常が認められた。これらの結果もあわせて報告したい。

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ASYMMETRIC LEAVES2 (AS2) gene is one of key regulators of morphogenesis of leaves in Arabidopsis thaliana. It encodes a plant-specific nuclear protein with a AS2/LOB domain that consists of the C motif which containing four cysteine residues, the conserved glycine residue and the leucine-zipper-like sequence in its amino-terminal half. The AS2/LOB domain includes a short stretch of basic residues (RRK) in the C-motif. The AS2 protein localizes to a sub-nuclear body that is adjacent to nucleoli and we designated this body as the AS2 body. In order to identify the signal in AS2 that is required for the localization to the AS2 body, we have made DNA constructs that encoded mutant AS2 proteins with various deletions and amino acid substitutions in the AS2/LOB domain such as the cysteine residues in the C motif, the basic strech RRK and the deletion of the leucine zipper like sequence. We have investigated sub-nuclear localization of these mutant proteins. We also have examined whether the localization to the AS2 body might be required for the function of AS2 in morphogenesis of leaves. We will present latest results of these experiments.

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asymmetric leaves1 (as1) およびas2変異体では、葉身に左右非対称に切れ込みが形成され、葉、特に葉柄が基部先端部軸方向に短くなる。またこれら変異体を特定の条件下で生育した場合には、葉の向背軸性異常も示す。今回我々はAS1、AS2と葉の向背軸性の確立に遺伝学的に協調して機能する新規因子の同定を目指し、as1変異体の葉の向背軸性異常を亢進する変異体の探索を行った。スクリーニングの指標として用いた棒状やはす状の葉の形成頻度が最も高かった1系統の解析を現在進めている。この系統には第5染色体下腕の1遺伝子座に変異が生じていた。この変異をenhancer of asymmetric leaves1 and asymmetric leaves2 (eal)と名付け解析を進めている。eal変異はas2変異体の葉の向背軸性異常も亢進した。いくつかの実験結果からas1 ealおよびas2 eal 二重変異体で形成される棒状の葉は背軸側化していることが示唆された。EAL遺伝子はNuclear distribution gene C (NudC) と呼ばれるタンパク質において高度に保存された配列を含むタンパク質をコードしていた。今回は、eal変異の細胞分裂に与える影響について調べたのでその結果を報告する。

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多くの葉は扁平で左右相称な形をしており、向背軸、中央側方軸、および基部先端部軸の3つの軸に沿って形成される。シロイヌナズナasymmetric leaves2 (as2) 変異体は葉の形成に様々な異常が現れる変異体である。これまでの研究から、AS2 は3つの軸全ての確立に関わっていると考えられている。#16 変異体は、我々のスクリーニングで得られた as2 変異体の向背軸性の異常を亢進する変異体である。#16 as2 二重変異体は、向背軸形成が不全の場合に観察される棒状やはす状の葉を形成し、#16 単独変異体は、幅は狭く先端が尖った葉を形成した。いくつかの実験結果から、#16 as2 の葉は背軸側化していると考えられる。#16変異体においては、rRNA前駆体のプロセシングに関わる蛋白質遺伝子に変異が見つかり、実際に変異体では前駆体が蓄積していた。これらの結果は、向背軸の確立においてAS2が関わる経路とrRNA前駆体のプロセシングが遺伝学的に相互作用していることを示唆する。最近、我々は、 in vitro での根の再生能が TS になった rid2 変異（rRNA 前駆体のプロセシングが異常）の as2 変異におよぼす影響を調べ始めた。この解析結果についても報告する。

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ポリアミンの一種であるサーモスペルミンの合成欠損株acaulis5（acl5）は、茎の著しい矮化を示す。サーモスペルミンと茎の伸長の関係について調べるため、この変異を抑圧し、茎の伸長を回復させる抑圧変異、sac変異の解析を行った。これまでの研究により、SAC51はbHLH型の転写因子、SAC52はリボソームタンパク質L10をコードしていることが分かった。SAC51 mRNAはメインORFの5’側に5つの小さなupstream ORF（uORF）を持つ。サーモスペルミン非存在下では、このuORFの1つにリボソームが捕捉され、SAC51の翻訳量が減少した結果、著しい茎の伸長欠損が引き起こされたと予想される。一方、SAC52は、リボソームタンパク質の変異によるリボソームの構造変化によって、uORFに捕捉されなくなった可能性がある。さらに、半優性を示すsac53-d、sac56-dの原因遺伝子を同定したところ、SAC53は活性化型Cキナーゼ受容体RACK1を、SAC56はリボソームタンパク質L4をコードしていた。これらもリボソームを構成する要素である。しかし、sac52-dとsac56-dはSAC51の翻訳を促進する一方、sac53-dでは翻訳促進効果は見られなかった結果から、sac53-dとsac52-d、sac56-dは異なる機構を介してacl5の茎伸長欠損を回復すると推測される。

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