シロイヌナズナの側根形成は内鞘細胞の不等分裂によって開始される．この過程はSLR/IAA14を始めとするAux/IAAタンパク質と，オーキシン応答転写因子ARF7, ARF19を介したオーキシン応答性遺伝子発現によって制御されており，その下流でLBD (Lateral Organ Boundaries-domain)/ASL (Asymmetric Leaves2-like)ファミリーに属するLBD16/ASL18の発現誘導が重要なことが示されている (Okushima et al., 2007)．しかし、LBD16を含む 5つのオーキシン誘導性LBD/ASLメンバー(LBD16, 17, 18, 29, 33)が側根形成部位で発現すること、およびLBD16の単独欠損変異体が顕著な表現型を示さないことから，このメンバーは重複して機能していることが示唆される．そこで，LBD16ゲノム制御下で転写抑制ドメインを融合させたLBD16を発現させたところ，側根形成開始が特異的に阻害され、内鞘細胞の分裂は観察されなかった．また，LBD16は核に局在し，側根形成開始前の内鞘細胞から発現を開始していた．このことから，LBD16を含むこれらのLBD/ASLメンバーは，転写制御を介して内鞘細胞の分裂開始に関与していると考えられる．

抄録全体を表示

維管束植物において、根端メリステムの活性を維持することは根系の発達にとって重要である。我々は根端メリステムの維持機構を明らかにすることを目的として、シロイヌナズナから根の成長・発生に異常を示す劣性変異体LR11-4を単離し、解析を行った。LR11-4変異体では、1）主根長が野生型の約50％と短い、2）側根形成頻度は野生型と同程度だが、側根がほとんど伸長せず停止する頻度が高い、といった表現型を示す。精密マッピングの結果、LR11-4変異体ではカルビン回路やデンプン合成に関わるプラスチド局在型Fructose-1,6-Bisphosphate Aldolase1 (FBA1) 遺伝子（At2g01140）にナンセンス変異が起きていた。FBA1プロモーター制御下でFBA1を発現させる遺伝子（pFBA1::FBA1）の導入によってLR11-4変異体の表現型が部分的に相補したことから、LR11-4の原因遺伝子がFBA1であることが明らかとなった。また、FBA1ゲノム配列の制御下でFBA1-GFP融合タンパク質を発現させたところ、根冠や葉のプラスチドに局在が見られた。これらの結果から、シロイヌナズナの根端メリステムの維持にFBA1が関与する可能性が強く示唆された。

抄録全体を表示

多細胞生物におけるある種の細胞群では、発生の過程において細胞内DNA量の増幅がキープロセスの一つとなる。細胞分裂を伴うmitotic cell cycleでは細胞が増殖し、endocycleでは分裂が起こらずに染色体の増幅のみが行われDNA量が増大する。幹細胞は細胞そのものが小さいまま維持されるが、endocycleを経た細胞では一細胞あたりのDNA量と相関するように細胞容量を拡大させることからこの細胞周期の切り替えは分化制御の重要な過程の一部であると考えられる。この二つの細胞周期を発生段階に応じてどのように切り替えているのかは細胞分化を理解する上で重要な問題である。我々はシロイヌナズナを用いた最近の研究から、TIR-AUX/IAA-ARFによるオーキシンシグナル伝達機構がこの制御を担っていることを明らかとした。すなわち、mitotic cell cycleの維持には高レベルのオーキシンシグナルが必要であり、オーキシンシグナルの低下によりendocyleへの移行が起こる。さらに、根端メリステムでは高レベルのオーキシンシグナルが細胞周期制御因子群の活性を支持し分裂組織を維持していることを明らかとした。これらの結果は、オーキシンシグナルが細胞周期関連因子の活性制御を通じた分化状態の切り替えを行い、これが細胞分化の最終的な発露に必要な細胞内過程であることを強く示唆するものである。

抄録全体を表示

我々は、CC-NB-LRR型のドメイン構造を持つUNIタンパク質が恒常的に活性化する機能獲得型変異のために、茎頂分裂組織(Shoot Apical Meristem; SAM)の維持の異常と腋性分裂組織(Axillary Meristem; AM)の異所的な形成という分裂組織に関わる二つの異常を同時に示すユニークなシロイヌナズナの変異体uni-1Dを利用して、分裂組織の全く新しい制御機構の発見を目指した研究を行ってきた。本学会では、この過程で明らかとなってきた、ERECTA(ER)レセプターキナーゼファミリー因子群の分裂組織制御への関与について報告する。
今までに、ERの機能欠損によりuni-1D変異体のSAMの異常が回復すること、及び、uni-1D変異体のSAMの異常にはSAM外部でのERの機能が重要であることを示してきた。今回、ERとファミリーを構成するERL1(ERECTA-LIKE1)及びERL2の機能をERの機能とともに欠損させると、uni-1D変異体のAMの異常もまた抑圧されることが明らかとなった。この結果を受けて、次に、uni-1D変異体背景ではなく野生型背景において、ERファミリー遺伝子群が分裂組織に対して作用する仕組みに関して解析を進めた。その結果、野生型背景においても、分裂組織外でのERファミリーの機能が分裂組織の制御に関わることが示唆された。

抄録全体を表示

植物ホルモンであるオーキシンは、オーキシン極性輸送とよばれる細胞間輸送システムによりその生合成部位から方向性をもって輸送され、組織および器官内に偏差的な分布を形成する。オーキシン極性輸送には、オーキシン排出担体であるPIN-FORMED (PIN)タンパク質が細胞膜上で極性をもって局在し、その極性が細胞間で揃うことが重要であると考えられている。しかし、PINタンパク質の細胞内極性形成機構および細胞間の配向制御機構について、未だほとんど明らかにされていない。そこで、我々はオーキシン極性輸送に関与するNPH3様タンパク質MAB4およびその類似タンパク質MAB4/ENP-LIKE (MEL)に着目し、その機能解析を行った。まず、器官形成に重篤な欠損を示すmab4 mel1 mel2三重変異体および根の重力屈性に異常を示すmel1 mel2 mel3 mel4四重変異体において、PINタンパク質の局在解析を行った。いずれの変異体においても、細胞膜上のPINタンパク質の存在量の減少とともに極性の減衰が見られた。また、MAB4およびMELタンパク質は細胞膜近傍で極性をもって局在化し、その極性はPINタンパク質のものとほぼ同等であった。これらのことから、MAB4およびMELはPINタンパク質の局在を調節することで器官形成および根の重力屈性を制御していることが示唆された。

抄録全体を表示

我々の研究室ではシロイヌナズナ、半優勢変異体uni-1Dについて研究を進めている。UNI遺伝子は病原菌感染時その認識と抵抗応答シグナル伝達に関与すると言われているCC-NBS-LRRタンパク質をコードしている。 そして、機能獲得型uni-1D変異体では、抵抗性反応マーカ遺伝子が恒常的に発現しているだけではなく、様々な形態異常、例えば異所的腋生分裂組織の形成、初期のSAM活動の停止、葉の形態異常などがみられた。しかし、uni-1Dがこれらの現象を引き起す分子機構は不明である。その活性メカニズムを明らかにするため、まず、yeast two hybrid screeningを行ったところ、UNIと相互作用するタンパク質として26s proteasomeサブユニットの一つであるRPT2aが単離された。rpt2aの変異体は単独でも葉序の乱れ、根の成長の遅延などの形態異常が見られた。一方、uni-1D変異体と交配させたところ、ヘテロ接合体に対しては、特に初期の異所的腋生分裂組織の形成に対し抑制効果を示した。さらに、栄養生長期の初期段階で致死に至るuni-1Dホモ接合体に対しては、致死を抑え強い形態異常を部分的に回復させた。現在、RPT2との相互作用がどのようにuni-1D変異体での形態異常に影響するかについてさらに詳しく解析中である。

抄録全体を表示

補償作用とは、葉原基において細胞増殖能に欠損をきたした場合に、細胞肥大が昂進する現象である。この現象は、空間的に異なる場所で同時進行する細胞の増殖と分化が、統合的に制御されている可能性を示唆している。そこで私達は、この補償作用に着目し、細胞の増殖と分化をつなぐ機構の理解を試みている。これまで、サイクリン依存型キナーゼインヒビターの一種をコードするKRP2の過剰発現体では、補償作用が個々の細胞単位で進行することを明らかにしてきた。では、この細胞自律性は、葉の発生において細胞の増殖と分化をつなぐ機構に共通の性質なのか？この問いに対して私達は、KRP2過剰発現体と同じく、顕著に補償作用を示すan3変異体に関してクローン解析を行い、an3変異体でみられる補償作用の細胞自律性について検討した。
本研究では、熱処理依存的にCre/Loxが機能する系を用いて、an3背景にAN3過剰発現細胞群をキメラ状に持つ葉を誘導し、クローン解析を行った。その結果、キメラ葉では、an3細胞のみならずAN3過剰発現細胞でも異常な細胞肥大が観察された。このキメラ葉に含まれる細胞のサイズを定量的に解析したところ、AN3過剰発現細胞のサイズはan3細胞と同等であった。以上の結果から、an3変異により誘導される補償作用は、KRP2過剰発現体の場合とは異なり、細胞間コミュニケーションを介して進行していると考えられる。

抄録全体を表示

補償作用とは、様々な遺伝的異常により葉に含まれる細胞の数が減少した際に、個々の細胞が大型化する現象である。このことは葉の形態形成において、細胞増殖と細胞伸長との間に何らかの相互作用が存在することを示唆しているが、その実態は明らかになっていない。我々はこれまでに、補償作用誘導時における細胞肥大の実態の解明を目的として、細胞伸長に特異的な欠損を示すxs変異株を単離し、顕著な補償作用を示すan3変異株との間で遺伝学的解析を行なってきた。その結果、いくつかのxs変異がan3に見られる細胞肥大を抑制することを見いだしている。今回、最も顕著な補償作用抑制能が確認されたxs2の原因遺伝子のクローニングを試みた。その結果、第一染色体上に座乗するカチオン輸送関連遺伝子のエキソン領域内に、8塩基の欠損を見いだした。また、xs2はその表現型が恒常的な病害応答を示す変異株に酷似していたことから、サリチル酸（SA）応答に関わる遺伝子群の発現を調べたところ、xs2ではWTに比べて顕著に発現が上昇していることを見いだした。またSA処理によって、an3に見られる細胞肥大が顕著に抑制されることを見いだした。以上のことから、xs2における補償作用抑制能はSA情報伝達系と関連していることが示唆された。本発表では以上の結果を基に、xs2、SAと補償作用の関係について議論したい。

抄録全体を表示

シロイヌナズナの葉において、何らかの遺伝的変異によって細胞増殖能が低下すると、細胞数の減少を補うかのように細胞伸長が昂進し、葉に含まれる細胞が大型化する現象が知られている。この現象は補償作用と呼ばれている。補償作用は器官レベルでのサイズ制御機構の存在を示唆しており、この現象を解明することの意義は大きい。我々はこれまでに、補償作用を示すfugu変異体を5系統単離し、解析してきた。今回はfugu2を用いた逆遺伝学的解析について報告する。補償作用の分子機構の解明を目的としてマイクロアレイ解析を行ったところ、fugu2の葉においては、46遺伝子の発現が誘導され、39遺伝子の発現が抑制されていることが明らかとなった。これら85遺伝子の葉の発生における機能を解析するために、それぞれの遺伝子のT-DNA挿入系統を取得し、ホモライン化を進めている。これまでに27系統のホモラインを単離し、その葉の表現型を細胞レベルで解析した。その結果、fugu2同様に、葉に含まれる細胞の数が減少する系統を複数見出した。またこれとは逆に、葉に含まれる細胞の数が増加している系統も見出された。現在、これらの遺伝子の補償作用における機能を解析するために、T-DNA挿入系統とfugu2との二重変異体を作出し、その葉の表現型を解析中である。本発表ではこれらの結果を統合し、fugu2における補償作用の分子機構について議論したい。

抄録全体を表示

有性生殖をする植物において、受精は子孫を残すために鍵となるイベントである。雄の精細胞を含む花粉が雌しべの柱頭に付着したのち、花粉管が発芽し、雌しべ内部を伸長し、精細胞は胚珠へと運ばれる。花粉管は胚珠からのシグナルをうけて伸長することが知られている。また、花粉管は同種の胚珠にのみ誘引され、近縁種の胚珠には誘引されないことから、花粉管と胚珠との認識が受精の成功と種の維持とを保証する分子メカニズムの1つとなっていると考えられている。近年我々は、ゴマノハグサ科の植物Torenia fournieri より、花粉管誘引物質としてシステインに富んだ低分子量分泌型タンパク質LUREs を同定した。LUREs の属するDifensin-like スーパーファミリーのタンパク質は一般に進化速度が速く配列の多様性に富むことが知られているため、LUREs の配列の多様性が種間認識を担っている可能性が指摘された。このことを明らかにするため、我々はT. fournieri の近縁種より、LUREs の相同遺伝子を単離した。ある遺伝子は発現が見られず、その構造に重要なアミノ酸が置換されていたことから、偽遺伝子化していることが示唆された。また他のLURE 遺伝子については、T. fournieri 同様、胚珠特異的な発現が確認された。現在、これらの遺伝子産物を精製し、その花粉管誘引活性について検討している。

抄録全体を表示

被子植物が受精を行うためには、花粉管が雌しべの中を伸長して胚嚢に到達しなければならない。花粉管を胚嚢まで誘導する一連の仕組みを花粉管ガイダンスというが、その分子的実体の多くは未だに明らかでない。このような中、当研究室のトレニアを用いた研究により、助細胞に由来し、培地上で花粉管を誘引するcysteine-rich peptides (CRPs; LURE1, LURE2) がトレニアの誘引物質として同定された。
本研究は、シロイヌナズナにおいて花粉管誘引物質を同定し、雌しべの中での機能を解析することを目的としている。これまでに、シロイヌナズナの胚嚢で発現する遺伝子の情報やLUREsの配列情報をもとに誘引物質を探索し、有力な候補遺伝子群を得た。これらの候補に対してsemi in vitro系を用いた誘引アッセイを行ったところ、花粉管を誘引することが示された。また、発現抑制実験により、これらが胚珠の珠孔部における精確なガイダンスに重要な役割を果たしていることも明らかにした。既知の花粉管ガイダンス変異体との関連や、ゲノム中での誘引物質の動的な変化についての考察も交えて紹介したい。

抄録全体を表示

被子植物の受精において，助細胞から分泌される花粉管誘引物質は，花粉管が正確に胚嚢へ到達するのに最も重要な鍵因子である．これまでに我々は，トレニアの単離助細胞を用いたEST解析により，システイン残基に富み分泌性の低分子量タンパク質と予測されるTfCRPsを多数同定した．そして，助細胞特異的に発現するTfCRP1, TfCRP3に花粉管誘引活性があることを明らかにし，それぞれをLURE1, LURE2と名付けた(Okuda, Tsutsui et al., Nature, 2009)．
誘引物質LUREsが明らかとなり，花粉管ガイダンスを分子レベルで直接的に解析することが可能となったことから，LUREsの作用機序の解明や，その受容体の分子的実体に興味が持たれる．本研究は，花粉管がいかにしてLUREsを受容するかを明らかにするために，花粉管側の受容体を同定することを目指している．まず，精製LURE2を花粉管に与え，花粉管のどの領域に結合するかを解析した．また，抗LURE2抗体を用いたウェスタンブロット解析により，LURE2と直接相互作用する花粉管タンパク質の存在を示唆する結果を得た．LURE1とLURE2では誘引される花粉管の挙動が異なることから，その受容体が異なる可能性が考えられる．各LUREをリガンドに用いた，生化学的手法による受容体の解析について紹介したい．

抄録全体を表示

植物の有性生殖において、助細胞は、花粉管誘引や精細胞放出など、受精の各段階に不可欠な細胞である。当研究室のトレニア助細胞のEST解析から見出された助細胞特異的な分泌性タンパク質LURE1, LURE2に、培地上で花粉管誘引能が示された。また、レーザーインジェクション（LTM）法でモルフォリノアンチセンスオリゴ（MO）を胚嚢に導入してLUREsそれぞれを単独で発現阻害すると、花粉管誘引率の有意な低下が見られた(Okuda, Tsutsui et al., Nature, 2009）。しかし、LUREsが単独で働くのか協調的に働くのかは明らかになっておらず、助細胞で発現する他の遺伝子群の機能も未だ不明のままである。
これらの疑問を解決するため、まず、LUREsの同時発現阻害により、それらが冗長的に働くのかを調べた。MOによるLUREsの発現抑制は、新規に開発した胚珠1個（助細胞は2個しか含まれない）という微小組織からの効率的なRNA抽出法を用いて行った定量的RT-PCRにより確認した。さらに、全ESTを詳細に見直した結果、助細胞特異的に高い発現を示す遺伝子が新たに見つかり、同一ファミリーの遺伝子が助細胞で6つ高発現していることも明らかとなった。これらの遺伝子については、LTM法でMOを導入することで発現阻害を試みた。
以上の解析から、助細胞で発現する遺伝子やその機能について考察する。

抄録全体を表示

被子植物の生殖において、雌雄の両配偶体が相互作用することによって種子形成に至るまでの過程は、形態学的な観察により明らかにされてきている。雌雄配偶体の各細胞の機能的な知見は広がってきているとはいえ、どのような遺伝子産物がこの配偶体の相互作用に関与しているのかという分子生物学的な知見はほとんど存在しなかった。しかし笠原ら（Plant Cell, 2005）によってMYB98遺伝子が同定され、雌雄配偶体のインタラクションを分子レベルで理解するためのスタートラインが築かれた。MYB98の発見以来、花粉管ガイダンスの分子生物学的なアプローチが世界的に行われるようになったが、現在演者らは雌雄配偶体の発生や機能に関わる遺伝子のスクリーニングを行っている。スクリーニングには助細胞で強く発現するMYB98::GFPのラインを使用しT-DNAを変異原として変異体を得る順遺伝学的手法を用いている。このスクリーニングでは、胚嚢が形成された後の受精過程に異常のある変異体も単離することができる。実際このスクリーニングにより雌雄配偶体のインタラクションに非常に重要であると考えられる変異体、G21を獲得することが出来た。G21変異体は野生型で2つ形成されるはずの精細胞が1つしか形成されない雄性配偶子の変異体であることが分かった。今回はこの変異体について議論すると共に、今後のストラテジーについてもお話したい。

抄録全体を表示

ホウ素は植物の必須栄養素で、雄性不稔はホウ素欠乏症状の一つである。ホウ素トランスポーターBOR6およびBOR7は花粉管で特異的に発現している。本研究では、BOR6およびBOR7の花粉管伸長における役割について検討した。
まず、in vivoでの花粉管の伸長を観察した。ホウ素欠乏条件では、野生型株では雌ずい下端まで花粉管が到達した後、雌ずい下部の胚珠に花粉管の侵入している例が多かった。一方、BOR6およびBOR7の両方にT-DNA挿入を持つ二重変異株では花粉管が野生型より短く、雌ずい上部で伝達組織を出て胚珠に到達しているものが多く観察された。このような異常は通常のホウ素濃度で栽培した二重変異株では見られなかった。BOR6またはBOR7 に挿入されたT-DNAをヘテロに持つ系統をホウ素欠乏条件下で生育させると、後代でT-DNAをホモに持つ植物の出現頻度が低く、T-DNAを持たない植物の出現頻度が高かった。T-DNAを持つ個体は鞘の上部に実った種に高頻度で見られた。BOR7 のT-DNA挿入変異株にBOR7とGUSの融合遺伝子を導入したところ、分離比の偏りは回復した。以上からBOR6、BOR7が機能することで花粉管が十分に伸長し、雌ずい内の全ての胚珠に到達することを可能にしていると考えられる。

抄録全体を表示

雌性配偶体の中央細胞は2個の極核をもつ．シロイヌナズナなどでは雌性配偶体の形成過程で極核が融合して二次核をする．われわれはこの過程、中でも核膜融合の過程が、小胞体のHsp70であるBiPの機能を必要とすることを明らかにしてきた．Hsp40ファミリーのタンパク質は、Hsp70の機能発現に必須の役割をはたす制御因子である．われわれは、シロイヌナズナの小胞体に存在する可溶性のHsp40ファミリータンパク質として、AtP58^IPK，AtERdj3A、 AtERdj3Bを同定している．これらを単独に欠失した株や、AtERdj3AとAtERdj3Bをともに欠失した株は極核融合の欠損を示さなかったが，AtERdj3AとAtP58^IPK（3a p58）またはAtERdj3BとAtP58^IPK（3b p58）をともに欠失した株は、極核融合に欠損を示した．雌性配偶体の電子顕微鏡解析の結果，3a p58の胚珠では2つの極核が外膜においても融合していないが，3b p58の胚珠では2つの極核の外膜同士が小胞体膜を介してつながっているが，内膜は融合していないことが示された．この結果は，BiPは極核融合において、外膜融合と内膜融合それぞれの過程で異なるセットのHsp40をパートナーとして利用していることを示唆している．

抄録全体を表示

イネ雌性配偶体を構成する各細胞は, 正常な生殖および胚発生等に関して各々極めて重要な機能を持つと考えられている. しかしながら, これらの細胞が雌蕊の奥深くに存在するという物理的な障害と細胞の絶対数が少ないという理由から, 現在にいたるまでそのトランスクリプトームレベルの解析は行われておらず, これらの細胞の持つ機能についてはほとんど明らかになっていなかった.
本研究では, イネ雌性配偶体構成細胞の遺伝子発現プロファイリングにより各細胞の機能を解明することを目指し, まず卵細胞, 助細胞をそれぞれ生細胞の状態で多数単離し, 抽出したそれぞれのRNAを用いてマイクロアレイ解析を行った. その結果, シロイヌナズナ卵細胞および助細胞で高発現する遺伝子と相同性の高い遺伝子が, イネ卵細胞および助細胞においても高発現していること, およびプロモーター発現解析の結果から, 本研究におけるマイクロアレイ解析には高い信頼性があることが示された. 現在中央細胞および反足細胞においても同様に細胞単離を行い, マイクロアレイ解析を行っている. 今後本研究から明らかになった各細胞特異的発現を示す遺伝子の機能解析を進めることで, 雌性配偶体構成細胞の機能の詳細が明らかになることが期待される.

抄録全体を表示

イネ栽培種の亜種間交雑では種分化に重要な役割を担うと考えられる様々な生殖的隔離が存在する。我々は日本型イネの日本晴 (N) とインド型イネのKasalath (K) 間で生殖的隔離を引き起こす2つの遺伝子DOPPELGANGER (DPL) 1とDPL2 の単離を行った。両者は高い相同性を持つパラログ遺伝子であり、高度に保存された植物特異的なタンパク質をコードしている。発現解析と遺伝学的解析から、機能欠損型である第1染色体のK型アリルDPL1 (DPL1-K)と第6染色体のN型アリルDPL2 (DPL2-N)の両方を併せ持つ雑種花粉の不発芽がこの隔離を引き起こすことが分かった。また、系統学的解析から植物の進化の過程でDPLの重複と機能欠損が起こった時期を特定することが出来た。

抄録全体を表示

接合藻ヒメミカヅキモの有性生殖は2種類の性フェロモン（PR-IP、PR-IP Inducer）による調節を受けて進行する。また、この過程で特異的に発現する数十種類の機能未知遺伝子群も単離されている。これら遺伝子群が有性生殖にどのように関わるかを検討するにあたり、我々はパーティクルガンを用いた遺伝子導入系の開発を進め、これまでにフレオマイシン耐性遺伝子bleを薬剤選択マーカーとした形質転換体の作出法について報告してきた。今回、機能未知遺伝子の過剰発現株作出を最終目標とし、その第一段階としてPR-IP Inducer過剰発現株の作出を試みた。PR-IP Inducerは窒素飢餓条件下で－型細胞特異的に発現し、＋型細胞でのPR-IPの発現を誘起する。そこで、内在性の高発現プロモーター（pCpCAB1）の下流でPR-IP Inducerを過剰発現させ、かつフレオマイシンで選別可能なベクターを新たに作製し、＋型細胞への形質転換を試みた。得られた薬剤耐性株では窒素源の有無にかかわらず野生型株に対して6～18倍のPR-IP Inducerの発現を示した。また、これらの株ではPR-IPの転写量は8～80倍に高まっていた。以上の結果から、これらの株がPR-IP誘導能を持つインタクトなPR-IP Inducerを過剰発現しており、本実験系が機能未知遺伝子の逆遺伝学的解析に有効である事が示唆された。

抄録全体を表示

シロイヌナズナ PROTODERMAL FACTOR 2 (PDF2) は HD-ZIP type IV (HD-GL2 型) 遺伝子ファミリーに属す転写因子をコードし、茎頂分裂組織における L1 層の細胞分化・維持に重要な役割を担うことが明らかとなっている。一方、PDF2 過剰発現体 (35S::PDF2) では、表皮に顕著な異常は見られないが、遅咲きの表現型を示す。この遅咲きの表現型は長日条件下でのみ見られることより、35S::PDF2 は光周性過程に欠損があると示唆された。そこで、35S::PDF2 において光周性過程に属す遺伝子の発現解析を行ったところ、概日時計の出力系に位置する CO の発現周期における昼間のピークが欠損していた。
35S::PDF2 の遅咲きに関与する因子を探すために、酵母ツーハイブリッド法を用いて PDF2 と直接相互作用する因子をスクリーニングした。L1 層での機能に関係する因子を除いた 14 の候補遺伝子のうち、PTF1、SGR5 について解析を行った。ptf1 変異体は短日条件下で遅咲きになるという知見があり、花成誘導への関与が考えられた。SGR5 では、相同性の高いトウモロコシ ID1 やイネ Ehd2 の機能欠損株が遅咲きになるという知見があるため、SGR5 とそれとホモログな IDD14、IDD16 の花成誘導への関与が予想された。

抄録全体を表示

We identified those mutants, related with two genes, FLORAISON TARDIVE1 (FLA1) and FLA2, that showed a late flowering phenotype (about three more leaves than wild type).
FLA1 is described as a C2 domain-containing protein with an enzymatic domain. FLA1 is expressed in leaves and flowers. fla1 mutants flowered late only in long day conditions (LD). This phenotype indicates that FLA1 belongs to the photoperiodic pathway. However, FLA1 expression is constant over the time. CO expression was not affected by mutation of FLA1 suggesting that FLA1 acts downstream of CO or in a CO-independant pathway inside the photoperiodic pathway.
FLA2 seems to have a transcriptional factor activity. FLA2 expression has been detected only in flowers. In both long and short day conditions (LD and SD), fla2-1 and fla2-4 were late-flowering. These observations indicate that FLA2 belongs to the autonomous pathway.
Moreover, fla2-1 mutation negatively regulates most of the autonomous pathway genes. fla2-1/flc double mutant flowered as early as flc mutant suggesting that FLA2 is upstream of FLC.

抄録全体を表示

シロイヌナズナにおける概日時計の主要な構成因子であるLATE ELONGATED HYPOCOTYL（LHY）と CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1) の二重欠損変異体（lhy;cca1）は、恒明条件下において、花成遅延や胚軸長・葉柄長の短縮形質及び、顕著な濃緑色葉の形質を示す。我々はこれまでの研究により、花成遅延及び胚軸長・葉柄長の短縮形質があらわれる分子メカニズムを明らかにしてきた。しかし、これらの知見からのみでは、恒明条件下のlhy;cca1で見られる濃緑色葉形質については十分には説明されない。本発表では、この濃緑色葉形質に着目し、概日時計によるクロロフィル含量の制御メカニズムの解明を目指して研究を行った。
明期長が異なる光周期下で生育させても、野生型のクロロフィル含量は明期の長さに関わらずほぼ一定であった。一方、lhy;cca1では明期の長さに依存してクロロフィル含量が増加した。また、lhy;cca1ではクロロフィルa/b比の値も顕著に変化していることが分かった。この制御メカニズムを明らかにするため、lhy;cca1で見られるクロロフィル含量、及びa/b比の変化に影響する因子を探索し、遺伝学的解析を行った。これらの結果をもとに、概日時計の下流で機能する因子と、その分子メカニズムについて議論する。

抄録全体を表示

開花時刻は種によって様々であり、朝、花を咲かせる種もあれば、夜咲きの種もある。機械式の時計が一般的でなかった時代、リンネはこうした様々な花の咲き具合によって時刻を知ることができる花壇「花時計」のアイデアを記している。また近年種形成における生殖の時間的隔離の観点からキスゲの開花時刻の研究も始まっている。今回我々は開花時刻の分子基盤を明らかにするために、シロイヌナズナの開花時刻を花弁の屈曲のレベルを指標として、時間生物学の観点から研究した。シロイヌナズナは朝方に咲くことが研究者の間では知られているが、その詳細は明らかではない。我々は、まず16時間明、8時間暗の日周的明暗サイクルにおいて、花弁の屈曲を調べた。明期が開始されると花弁は伸長し背軸側に展開した。そして花弁は3時間後に最大となった。4時間をすぎるとそれまでとは逆、すなわち向軸側に曲がり始めた。暗期では花は咲かなかった。この結果から、ナズナの花弁運動は、光刺激によって起きる光傾性であることが示唆される。次にこの日周運動が概日時計による調節を受けているかどうかを調べるために、ナズナに4日間の日周的明暗サイクルを経験させたのち、連続明条件下で花弁運動を調べた。すると花は主観的明期に相当する時刻に開花する概日リズムを見せた。またこのリズムの周期は23時間であった。

抄録全体を表示

シロイヌナズナの概日時計は時計関連遺伝子群の24時間周期の転写フィードバックで成り立つと考えられている。疑似レスポンスレギュレーター「PSEUDO―RESPONSE REGULATOR（PRR）」は生物時計に関連した機能を持つ事が示唆させているが、PRRの分子機能は不明であった。
今回私たちは、PRR9、PRR7、PRR5タンパク質がCIRCADIAN CLOCK―ASSOCIATED1（CCA1）とLATE ELONGATED HYPOCOTYL （LHY）遺伝子の転写抑制因子であることを報告したい。グルココルチコイドで機能誘導されるPRR5―GRは直接的にCCA1とLHYの発現を抑制した。さらにシロイヌナズナの一過的遺伝子発現系によって、PRR9、PRR7、PRR5のCCA1とLHYのプロモーター活性に対する抑制効果が発見され、PRR9、PRR7、PRR5の転写抑制モチーフも同定された。またクロマチン免疫沈降法により、PRR9、PRR7、PRR5は植物体内でCCA1とLHYのプロモーター上に存在することが分かった。これらPRRがCCA1とLHYプロモーターに存在している時間帯と、CCA1とLHYが発現抑制される時間帯は一致（午前から夜半）していた。以上の結果とprr多重変異体などの解析を踏まえて、PRR9、PRR7、PRR5の時計機構での働きを考察したい。

抄録全体を表示

本研究で用いるカラマツは北半球に広く生育し、成長が非常に速く、土地要求性の低い優れた樹種である。そのため、これら有用形質をさらに活用し、資源として利用しやすい、新しい樹種の育種が試みられている。しかし、カラマツの着花は不定期で、従来の着花促進技術の効果も低いため、計画的な交配が困難である。カラマツでは毎年花が咲く変異体、「本間FL」が知られており、この変異体と野生型個体との比較解析から、カラマツ花芽形成機構の解明と新しい着花促進技術の開発が可能になると考えられる。本研究は、形態学的手法が主流であったカラマツ花芽形成の研究に対し、分子生物学的手法を用い、花芽形成遺伝子の機能を上記2系統間で比較する事により、花芽形成機構の一端を明らかにすることを目指した。
まず、本研究は他の植物種の研究結果から、花芽形成に大きな影響を与えると予想される遺伝子として、FLOWERING LOCUS T （FT）、LEAFY、NEEDLY、CONSTANS に注目し、これらに関して、定期的にサンプリングした組織（葉、枝）ごとに半定量的RT-PCR、リアルタイムPCRによる解析を行った。その結果、FT遺伝子の発現には2系統間に有意な差が認められた。現在、変異体のつぼみ切片を作成し、花器官の形態的変化と花芽形成遺伝子の発現との相関を調べている。

抄録全体を表示

短日植物であるキクは日長の短縮により花成が誘導され、暗期中断によって花成が抑制される。キクの花は多数の小花からなる集合花であり、中心部の管状花と外側の舌状花からなる。我々は二倍体野生ギク、キクタニギク（Chrysanthemum seticuspe f. boreale）を用いて、花芽分化開始ならびに、花芽分化開始後の花器官の発達における短日要求性に着目した。キクタニギクは4回の短日処理後、暗期中断（花芽非誘導）条件下においた場合、花芽分化を開始し、花芽分化節位が決定された。しかし、花芽分化開始後の発達は暗期中断によって抑制され、小花の分化はみられなかった。12回以上の短日処理によって暗期中断条件下においても小花の発達が進み、開花する個体がみられたが、8回の短日処理では小花が分化した段階で発達が停止した。AP1と相同性を示すCsM111および、LFYと相同性を示すCsFLの発現は8回以上の短日処理によって誘導され、AGと相同性を示すCsAGの発現誘導には12回以上の短日処理が必要であった。以上の結果からキクタニギクにおける、花芽分化開始と花器官の発達における日長要求性について考察する。

抄録全体を表示

短日要求性植物であるキクの花成誘導反応は、限界日長以下の短日処理によって誘導され、反対に長日処理や短日暗期中の光中断 (NB)によって著しく阻害される。キクの花成誘導反応における光シグナルの役割を明らかにするため、様々な光質および光周期条件下における花成反応を調査した。主明期に白色光を用いた場合のNBに有効な波長域を解析したところ、赤色光が最も抑制効果が強く、青色光や遠赤色光はほとんど抑制効果を示さず、光質によるNB効果の違いが認められた。このことから、フィトクロムを介した赤色光シグナルが光中断による花成抑制において主要な役割を果たしていることが示唆された。また、赤色、青色および赤色＋青色光をそれぞれ光源に用い、短日（12L/12D）、長日（16L/8D）、連続明、NB処理における花成反応を調査したところ、光質による日長反応の差はみられず、短日条件でのみ花芽分化が認められた。さらに、主明期の光質の違いによる青色光NB効果の相違に着目して解析した結果、主明期が青色光のみの場合と比較して、主明期に赤色光を加えた場合には青色光によるNB効果が抑制されることを見いだした。これら条件下における花成関連遺伝子の発現解析結果をふまえ、キクの花成誘導における光シグナルの役割について考察する。

抄録全体を表示

花成は主に光周期やバーナリゼーションによって誘導されるが、短日植物であるアサガオ、品種ムラサキは低温、貧栄養、強光などのストレスにも応答して、長日条件下で花成を誘導される。一方、品種テンダンは貧栄養ストレスには応答しない。貧栄養ストレスで花成を誘導されたムラサキは開花、結実し、形成された種子は正常に発芽して生育した。このことから、この花成は個体の生存が危うくなったストレス下で緊急に次世代を残すという生物学的意義があると考えられる。貧栄養ストレスに応答するムラサキと応答しないテンダンを用いた接木実験により、貧栄養ストレスで誘導された花成には輸送可能な花成刺激が関与することがわかった。貧栄養ストレスで誘導された花成はフェニルアラニンアンモニアリアーゼ阻害剤であるアミノオキシ酢酸で阻害され、この阻害はサリチル酸（SA）で回復した。しかし、外生SAは単独では花成を誘導しなかった。このことは、SAはストレス応答花成にとって必要条件ではあるが、十分条件ではないことを意味する。貧栄養ストレスでムラサキの花成を誘導したとき、花成遺伝子FLOWERING LOCUS T (FT)のアサガオの相同遺伝子であるPnFT2が発現した。しかし、もう一つのFT相同遺伝子であるPnFT1は発現を誘導されなかった。このことから、ストレス応答花成にはPnFT2が関与することが示唆された。

抄録全体を表示

特定の種における複数の環境型を同時に解析することにより、これらのゲノムで共通な仮想的なゲノムの構造を知ることができる。これらのゲノムは、「ゲノムコア」と呼ばれるゲノム間で共通に保存されているシンテニー・ブロックと、HGTによる遺伝子の出入りが確認される、「ゲノムアイランド」領域のモザイク構造になっていることが知られているが、従来の遺伝子の隣接関係に基づく組み合わせ探索の方法では、非常に近縁であるこれらのゲノム間において、ゲノムアイランド領域とゲノムコアのゲノム上での再構成単位を同時に可視化することは難しかった。我々はこれらを可視化することが可能な「位置プロファイル法」を開発した。前回の報告では我々の開発した位置プロファイル法による、シアノバクテリア16種間の解析結果を報告した。本発表では、本手法の近縁ゲノム間の解析への活用事例として、拡張したデータセットによる手法の評価と既存法との比較、およびシアノバクテリア36種での解析と根粒形成菌の近縁種間の解析によって明らかになった、近縁ゲノム間のゲノムの構造的進化とその働きについて報告する。

抄録全体を表示

植物のストレス応答をゲノムレベルで理解するために、我々は緑藻クラミドモナスの遺伝子発現データベースの構築を進めている。米国JGIによりmating type(+)株の核ゲノムのドラフト配列が公開されているが、112 Mbのドラフト配列のうち15,3 Mbの領域が未解読であり、染色体に組み込まれないscaffoldも存在する。我々はmating type(―)の株C-9について，8×BAC及び7×Fosmidライブラリーを作製し、その末端配列をドラフトゲノム配列にマップした。22個のscaffoldがBac・Fosmidクローンのブリッジにより染色体構造のギャップ領域に組み込まれた。様々なストレス処理を施した細胞から完全長cDNAライブラリーを作製し、両末端配列を決定した。既知のESTと共にゲノム配列上にクラスタリングした結果、16,004クラスターが形成された。様々な栄養源欠乏ストレスや光合成基質であるCO₂の濃度変化に応答する遺伝子を同定するために，各種処理した細胞から単離したmRNAをIlumina GAIIxを用いて網羅的に解読した。これらのゲノムリソース及びトランスクリプトーム情報は、Kyoto Chlamydomonas Genome Database (KCGD)に搭載し、公開する予定である。http://chlamy.pmb.lif.kyoto-u.ac.jp/

抄録全体を表示

Knocking out a gene from a genome often causes no phenotypic effect. This phenomenon has been explained in part by the existence of duplicate genes. Here, we study whether it is also true for the knockout data in Arabidopsis. From the knockout data in Arabidopsis thaliana obtained in our study and in the literature, we find that duplicate genes show a significantly lower proportion of knockout effects than singleton genes. Because the persistence of duplicate genes in evolution tends to be dependent on their phenotypic effect, we compared the ages of duplicate genes whose knockout mutants showed less severe phenotypic effects with those with more severe effects. Interestingly, the latter group of genes tends to be more anciently duplicated than the former group of genes. Moreover, using multiple-gene knockout data, we find that functional compensation by duplicate genes for a more severe phenotypic effect tends to be preserved by natural selection for a longer time than that for a less severe effect. Taken together, we conclude that duplicate genes contribute to genetic robustness mainly by preserving compensation for severe phenotypic effects in A. thaliana.

抄録全体を表示

For a firm gene annotation, it is necessary to repeat experiments and obtain a robust result. With more stack observations of transcripts, the clearer gene structure would be seen. Then, we developed a statistical genome-wide gene prediction method ''ARTADE2.0'' from the discovery that the correlations matrix made with tiling array probes of many experiments shows transcription units clearly. However, the estimation result may be mixed gene model if an alternative splicing (AS) model exists since expressions of transcripts are observed from plural kinds of RNAs. We now proposed a method for a detection of AS part based on a factor analysis (as a statistical methods). The method can divide the gene region into part belonging to major AS isoform and part belonging to minor AS isoform or alternatively spliced region. For the method, we used tiling arrays results from eighteen conditions, including plants under various stresses or several organs. The method succeeded to elucidate some known ASs and other novel alternatively spliced regions in genes extracted through the ARTADE2.0.

抄録全体を表示

small RNAは20-25塩基の非翻訳性小分子RNAであり、miRNA、siRNA、ta-siRNAの3種のRNAの存在が知られている。そのうちmiRNAとta-siRNAは配列相同性を持つターゲットmRNAの切断に関与し、繰り返し配列から生成されるsiRNAは自身の配列あるいは相同配列を持つターゲットDNA領域の転写抑制に関与する。これまでの研究によって、環境ストレスに対して幾つかのmiRNAが遺伝子発現を制御することが報告されてきた。一方で、その他のsmall RNAがストレス条件下でどのように働いているか知られていない。私たちは、454 DNAシークエンサーを用いて、乾燥・低温・塩ストレスやABA処理下で発現するsmall RNAを大量に解読し下記の知見を得た。1)新規なストレス応答性のsmall RNAを12種同定した。2)乾燥、塩やABA処理によってta-siRNAの前駆体の発現が減少し、その結果ta-siRNAの生成量も減少していた。ta-siRNAの中には葉の形態形成に関与するものが存在することから、環境ストレス下での植物の形態形成の制御にta-siRNAの関与が示唆された。3）ストレス条件下ではメチル化されたトランスポゾン領域からsiRNAが大量に生成していた。以上の結果から、ストレス条件下での様々なsmall RNAの急速な発現変化が明らかとなった。

抄録全体を表示

環境ストレス下では多くの遺伝子が発現誘導され、環境ストレス耐性に関与していると考えられている。モデル植物であるシロイヌナズナ、イネ、ダイズは、全ゲノム配列が完全解読され、多くの完全長cDNAが単離されているため、転写開始点を推定してプロモーター領域を解析することができる。さらに、これらの植物は、44Kのオリゴアレイを用いて、網羅的に遺伝子発現解析を行うことができる。
本研究では、シロイヌナズナ、イネ、ダイズにおける低温及び乾燥誘導性遺伝子とプロモーターを比較解析して、遺伝子発現調節に関与すると考えられる遺伝子とプロモーターの保存領域を同定した。具体的には、1. ダイズゲノム情報を利用して新規44Kオリゴマイクロアレイを作製した。2. 低温及び乾燥処理したシロイヌナズナ、イネ、ダイズからRNAを抽出して、44Kオリゴアレイを用いて低温及び乾燥誘導性遺伝子を同定した。3. 同定した遺伝子を系統分類して比較解析を行った。4. 同定した遺伝子の転写開始点から上流の1000 bp（プロモーター）を選抜した。5. 選抜したプロモーターと無作為に選抜したプロモーターを比較解析して、低温及び乾燥誘導性遺伝子のプロモーター領域に特徴的な配列を同定した。これらの解析からモデル植物の低温及び乾燥誘導性遺伝子群の発現調節メカニズムを推測した。

抄録全体を表示

我々は、植物ゲノム比較データベースであるSALAD database（http://salad.dna.affrc.go.jp/salad/）を作成、公開してきた。SALAD databaseでは、進化において保存された連続アミノ酸配列（モチーフ）の組み合わせによりタンパク質を分類し、類似性を指標とした関係をビジュアルに表示することができる。最新のver.3では10種（イネ、ソルガム、シロイヌナズナ、グレープ、シダ、ヒメツリガネゴケ、緑藻（2）、紅藻、酵母）のデータの比較解析が可能である。このSALAD databaseは、マイクロアレイのデータの表示にSALAD on ARRAYsというビュワーを備えている。このビュワーは、Agilentアレイ解析での発現量を色の濃淡で表示し、ユーザーが注目する遺伝子とパラロガスな（もしくは類似性が高い）遺伝子間の発現比較が一画面で簡単に行えるという他のデータベースには無い特長をもつ。今回、グラフ作成機能、アレイセット選択機能、表示順序変更機能を追加したので、報告する。また、今回新たにAtGenExpress（Affymetrix）のシロイヌナズナの783公開マイクロアレイデータ（29実験）の追加表示を進めている。この表示にはAgilentとAffymetrixのプラットフォームの違いを検討する必要があり、現在、比較実験も含めて解析を進めている。

抄録全体を表示

イネアノテーション計画データベース（RAP-DB）はIRGSPゲノム配列に対する高精度なアノテーション情報や様々な有用情報を公開するためのデータベースである。我々は2008年に公開された新規ゲノム配列（build 5）に対するアノテーションデータを作成した。今回のアノテーション作業では、コムギやオオムギ等の近縁イネ科穀類のFLcDNAやたんぱく質情報のマッピング結果も遺伝子構造予測に利用している。その結果、34,902の転写証拠のある遺伝子座を決定し、遺伝子予測プログラムによる転写証拠のない遺伝子座も9,975予測した。また、MCLとBLASTを利用して遺伝子ファミリー情報を作成し、ソルガムとシロイヌナズナとの比較から種特異的遺伝子ファミリー情報も閲覧可能とした。更に、遺伝子の保存性をゲノムワイドに比較するため、ゲノム配列比較情報を作成しGbrowse_synを利用して、IRGSPゲノムとMSUゲノム、インディカゲノム、ソルガムゲノムとの比較データを公開している。本発表では、ユーザがマーカー間のアノテーションデータを取得できるといった新データ取得システムや手動による文献精査情報、ゲノム上のトランスポゾン情報やオルガネラ由来領域などの新アノテーション情報を含む新しいRAP-DBについて紹介する。

抄録全体を表示

我々はIllumina社のGenome AnalyzerとmRNA-seq法によって解読した大量のイネトランスクリプトーム由来のショートリードの解析パイプラインを開発した。本解析パイプラインでは、複数のマッピングプログラムに対応し、結果はタブ区切りのテキストやGFFなどのフォーマットで出力される。また、既知の遺伝子構造とともにSNPsやシーケンシングエラーなどの詳細なマッピング結果を視覚的に提供するショートリードビュアーを開発した。本解析パイプラインは、マッピングと同時にBowtie、TopHat、Cufflinksプログラムを用いて、ショートリード情報に基づいた新規遺伝子予測を行う。さらに、それぞれの既知・新規遺伝子について、補正された遺伝子発現量（number of Reads Per Kilobase of the exon models per Million of the mapped reads; RPKMs）を推定し、異なるサンプル間や遺伝子間での遺伝子発現プロファイルの比較を可能とする。本発表では、我々の解析パイプラインを用いて行った、非生物学的ストレス（塩ストレスなど）に応答して発現量が変化するイネ遺伝子の網羅的探索研究について紹介し、mRNA-seq解析の再現性や遺伝子発現量の測定にはどのくらいの配列情報が必要かという点についても議論する。

抄録全体を表示

ゲノミクスの進展により、数多くのマイクロアレイデータが蓄積してきており、生物システムの理解に役立っている。公的に利用可能なマイクロアレイデータを用いた遺伝子共発現解析は、細胞内トランスクリプトームの組織化原理を探る研究や機能未知遺伝子の特徴づけに関して有用であることが、多くの種で示されてきた。この中で、モデル作物のイネ (Oryza sativa) における遺伝子共発現クラスタ (共発現ネットワークノードの集まり) の包括的な検討はほとんどなされていない。本研究は230枚以上のマイクロアレイデータにわたった4,495個の遺伝子から構築したイネの共発現ネットワークをグラフクラスタリングに供した。そのネットワークトポロジーは、典型的なスケールフリー次数分布を示した。互いに密にリンクした遺伝子群を抽出するグラフクラスタリング手法 (DPClus) を用いて、1,220個の共発現クラスタが得られた。これらクラスタを遺伝子オントロジー解析によって特徴付けた。このようなアプローチは機能未知遺伝子の機能解析に向けた新たな実験仮説を容易に与え、作物種における共発現アプローチの重要性を示している。計算に用いた共発現データはウェブサイトPRIMeからダウンロード可能である (http://prime.psc.riken.jp/rico/index.html)。

抄録全体を表示

マイクロアレイ技術の普及に伴い、公共のデータベースには多くの遺伝子発現データが蓄積してきた。共発現する遺伝子間には機能的関連が期待できることから、共発現遺伝子群を用いて実験ターゲットを絞り、遺伝子破壊等で機能同定を行う研究手法が一般化しつつある。現在、様々な生物において遺伝子共発現を利用できるようになってきており、我々の構築しているATTED-II (http://atted.jp) においては2生物（シロイヌナズナ、イネ）、COXPRESdb (http://coxpresdb.jp) では7生物（ヒト、マウス、ラット、ニワトリ、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ、線虫）の共発現データを公開している。
新規に公開する共発現データは、概してマイクロアレイデータが不足気味であるが、どの程度のマイクロアレイの枚数があれば、実用に耐えうる共発現データが得られるかはハッキリしない。
我々は、計算に用いるサンプル数とそこから得られる共発現データの質との関係を、「サンプル重複度」と「非重複サンプル数」の観点から、ヒト、マウス、ラット、シロイヌナズナについて解析したので発表する。また、我々が共発現の計算に用いている重み付き相関係数との関係も併せて発表する。

抄録全体を表示

異なる種間での遺伝子の移行を遺伝子の水平伝播という。高等植物間における水平伝播の例は少なく、ミトコンドリア遺伝子の種間伝播や、トランスポゾンの近縁種間伝播などの報告がある。寄生植物は、ミトコンドリア遺伝子の水平伝播に関わることが報告されているが、核遺伝子の水平伝播への関与は明らかではなかった。今回我々は、寄生植物ストライガと宿主植物間の核遺伝子の水平伝播を示唆する結果を得たので報告したい。
ハマウツボ科寄生植物ストライガ(Striga hermonthica)はモロコシやイネなどのイネ科植物を宿主とする根寄生雑草である。ストライガは宿主植物の根に寄生し、維管束系を連結させ栄養分を奪って生活する。我々は、ストライガは真正双子葉類に属するが、その宿主が単子葉類に限定されることに着目し、ストライガEST配列中から単子葉類特異的な遺伝子配列を探索した。BlastX相同性検索により、真正双子葉類ゲノムおよびESTデータベース中にホモログを持たず、単子葉類にホモログを持つストライガEST配列を探索し、水平伝播候補遺伝子とした。そのうちの一つは、ストライガの宿主であるモロコシ遺伝子と最も近い系統関係を示した。この候補遺伝子の周辺ゲノム配列を決定したところ、タンパク質コード領域外にもモロコシゲノムと相同性を持つ領域を持つことが明らかになり、水平伝播の可能性が極めて高いと考えている。

抄録全体を表示

プロテオーム解析手法は、遺伝子の機能重複や変異体の致死性に由来する順遺伝学的手法による制約を受けず、また翻訳後修飾の解析に有効な手段であることより、未知のシグナル伝達機構を解析するための強力なツールになると期待されている。我々はこれまでに、代表的な翻訳後修飾の一つであり、植物免疫を含む広範囲の生命現象の制御に関与している「リン酸化」を効率よく大規模に解析するショットガン解析技術の確立を行ってきた。その成果として、数百マイクログラムのタンパク質を含む細胞粗抽出液より1000種類以上のリン酸化ペプチドを日常的に同定することが可能となり^1）、これまでにシロイヌナズナで4,000程度、イネでは5,000以上のリン酸化部位を同定することに成功した。
現在、安定同位体標識法を利用した比較解析法の確立と並行して、植物免疫シグナリングに関わっているリン酸化タンパク質の同定に取り組んでいる。本発表では、我々が取り組んでいるリン酸化プロテオミクスについて、そして植物免疫シグナリングにおけるリン酸化制御について得られた知見を紹介する。
1）Mol Syst Biol. 2008;4:193. Epub 2008 May 6.

抄録全体を表示

高等植物は光合成において2種類のクロロフィル分子を使い分けている。すなわち、光化学系反応中心複合体ではクロロフィル a のみが用いられる一方で、周辺アンテナではクロロフィル a と b の両方が用いられている。そのため、クロロフィルaの欠損は致死であるが、クロロフィルb欠損株は生育遅延を示すものの生存可能である。そこで、クロロフィルbの量的制御の重要性について調べるために、私たちはシロイヌナズナのクロロフィル b 過剰蓄積株とクロロフィルb欠損株からチラコイド膜を単離し解析を行った。
まず、BN-PAGEを用いてタンパク質複合体の解析を行った結果、過剰蓄積株においてはチラコイド膜の光合成の電子伝達複合体の形成に差は見られなかったが、欠損株においては光化学系IIの超複合体が見られず、光化学系I複合体の分子量が大きく減少するなどの大きな差が生じていた。これらの結果はクロロフィルbが欠損すると集光性アンテナタンパク質群 (Lhca, Lhcb) が光化学系IおよびIIに結合できないことを示唆している。
さらに現在、チラコイド膜の網羅的なプロテオーム解析を行っており、とりわけクロロフィル b 欠損株のチラコイド膜ではそのタンパク質組成にダイナミックな変化が生じていることが明らかとなってきた。
発表ではこれらの知見をもとに、クロロフィルbの量的制御の重要性について議論する。

抄録全体を表示

遺伝子組換え作物の実用化には、これにかかる法的規制をクリアするための様々なコストの低減と、組換え技術に対する国民理解（パブリック・アクセプタンス：PA）の促進が不可欠である。私たちは、CRES-T法や重イオンビーム照射などの最新技術を取り入れた形質改変手法の効率化により、花のモデル植物であるトレニア(Torenia fournieri)で多数の新形質花きの作出に成功する一方、これらをいち早く一般に提供するための手段として、花きの持つ色や形を損なわずに樹脂封入する体制を整備した。遺伝子組換え花きは水分を樹脂に置換する過程で不活化されるため、カルタヘナ法の規制の対象とはならず、即時流通させることが可能である。また、標本の持つ自然の色は長期間安定で、季節や時間を問わずあらゆる角度から観察することができるため、特に教材としての高い有用性を備えている。私たちは、この標本を利用した遺伝子組換え教材を20セット試作し、各種教育機関での利用を通じて活用方法や有効性、製品に対する要望等についての調査を進めている。PAの推進や事業化に必要な改良点などを踏まえた現状について報告する。本研究の一部は「農林水産研究高度化事業」、「生研センターイノベーション創出事業」および「農研機構産学官連携強化費」によるものである。

抄録全体を表示

mRNA・タンパク質・代謝産物の同定を行う場合、多くの場合は相対定量で行っている。ノーザンハイブリダイゼーションではトータルRNAやトータルmRNA当たりの特定遺伝子のmRNA量を測定しており、リアルタイムRT-PCRでは基準となる遺伝子の発現量に対する特定遺伝子の発現量を相対的に同定している。タンパク質や代謝産物の同定では多くの場合、総タンパク質量・組織の湿重量・乾燥重量や培養液当たりの量を相対的に同定している。比べるサンプル間でこれら基準となる値が変化していない場合は問題無いが、新規の変異体の解析や新しい処理区での解析の場合にはどの基準がサンプル間で変化していないかを事前に知ることは事実上不可能であり、用いた基準によっては間違った解釈をしてしまう恐れがある。今回我々は、細胞において数の変化が少ないと考えられるゲノムDNA当たりのmRNA・タンパク質・代謝産物の分子数の簡易同定法の開発を行ったので報告する。同時に、細胞にゲノムDNAが2コピー存在すると仮定した場合の細胞1個当たり、あるいは葉緑体1個当たりのmRNA・タンパク質・代謝産物の分子数を推定したのであわせて報告する。

抄録全体を表示

シロイヌナズナにおいて、ステロイドホルモン、エタノール、ヒートショック等による部分的な遺伝子発現誘導系を利用した研究は行われているが、「任意の細胞で」遺伝子を発現させるのは難しい状況にある。
生体内の単一細胞で「任意のタイミングで」、「任意の細胞で」目的の遺伝子を発現させることができれば、細胞のマーキングによる系譜解析だけでなく、遺伝子機能解析、細胞間シグナル伝達機構の解析なども可能となる。これを達成するために熱ショック応答機構を利用した新しい研究ツールInfrared laser evoked gene operator (IR-LEGO)が開発され、線虫をモデルにその有用性が報告された(Y. Kamei et al. Nat. Methods 2009) 。
IR-LEGOはすべての生物に共通するストレス応答機構である熱ショック応答を利用している。植物においても、加熱により熱ショックプロモーター（HSPプロモーター）下流の遺伝子を誘導可能であり、既に様々な研究に用いられている。
今回、我々はこのIR-LEGOがシロイヌナズナにも応用可能であるかを検討した。HSP 18.2 promoter : GUSのトランスジェニックシロイヌナズナ実生を用いて、様々な条件で赤外線レーザーを照射し、実生側根において、1細胞での局所的な遺伝子発現が可能であることを確認した。

抄録全体を表示

植物個体の色（広義には分光反射特性）は、形態と並ぶ主要な可視表現型であるとともに、個体の生理的状態を示す有用なバロメーターである。実際に、葉の主要色素であるクロロフィル、カロテノイド、アントシアニン等の代謝系は、発生段階や生育条件に応じて厳密に制御されており、植物の環境適応において重要な役割を果たしている。従来、植物色素を定量する際には、組織の破砕や抽出液の吸光度計測のため、多段階の実験操作が必要であった。また、これらは破壊的操作であるため、時系列的な色素組成の動態を解析することや、色素定量後の試料を他の生理的パラメーターの計測に用いることは不可能であった。近年のポストゲノム研究では、表現型の現出に至るゲノム機能の発現過程を解明するため、表現型を定量的に記述する手法の確立が望まれている。主要可視表現型の一方である形態については、3次元モデリングによる定量化手法の開発研究が進められ、その応用的成果も報告されているが、色を対象とした精密かつ組織的なフェノーム研究は未だ着手されていない。本発表では、色を非破壊的かつ効率的に定量化する手段として、ハイパースペクトル画像の利用可能性について紹介する。シロイヌナズナ研究における適用事例として、葉における主要色素の組成と分布を可視化するためのシステム開発の現況とともに、新規突然変異体のスクリーニングにおける同システムの利用実績について報告する。

抄録全体を表示

マメ科植物と根粒菌が共生を行う際に，感染糸と呼ばれる管状構造を通り根粒菌が根毛先端部から侵入する．ミヤコグサの実験系統であるB-129 GifuとMG-20 Miyakojimaでは感染糸数が異なる．また，両系統は茎色が異なっており，アントシアニン含量の違いにより赤色（B-129）または緑色（MG-20）を呈する．B-129とMG-20との組換え自殖系統（RIL）を用いた複合区間マッピングの結果，感染糸数を制御する量的形質遺伝子座（QTL）が第5染色体南側（QTL1）と第2染色体北側の茎色遺伝子座（VIC6）近傍（QTL2）に見出された．また，各RIL系統の感染糸数，莢幅，一莢粒数，茎色との間に有意な相関関係がみられた．B-129のEMS処理により得られた茎色遺伝子座の変異体（vic6-1）は，野生型B-129との比較において，感染糸数，莢幅，一莢粒数，茎色いずれもMG-20と類似した性質を示した．すなわち，感染糸数の系統間差の一部はVIC6の遺伝子型で説明できることが明らかとなった．エチレン生合成阻害剤および前駆物質処理が与える影響を両系統で比較した結果，感染糸数を最大にする至適処理濃度が異なり，また，MG-20のエチレン内生量がB-129と比べて低いことが示唆された．QTL1およびQTL2の遺伝子型が与えるエチレン内生量への影響についても報告する予定である．

抄録全体を表示

マメ科植物は根粒菌と共生し根に根粒という器官を形成する。根粒の形成数は宿主植物によって制御されおり、ミヤコグサでは地上部で機能すると考えられる HAR1 を介した遠距離シグナル伝達による抑制機構が存在することが示されている。
ミヤコグサ klv 変異体は har1 変異体同様に根粒過剰着生の表現型を示す。KLV はHAR1 同様 LRR-RLK に属する遺伝子をコードしており、変異体を用いた接ぎ木実験によって地上部で機能し根粒の形成を抑制すると考えられている。
二重変異体を作成したところ、klv har1 二重変異体は klv 変異体と比べ相加的な根粒形成数にはならなかったことから、 KLV は根粒形成の遠距離制御において HAR1 と同一経路で機能することが示唆された。
また LjCLE-RS1、-RS2 は根粒菌の感染に応答して発現し、根で過剰発現させることによって HAR1 依存的な根粒形成の全身的抑制を誘導することから、その遺伝子産物は根粒形成の遠距離抑制において根で生成される遠距離シグナルの候補と考えられている。LjCLE-RS1、-RS2 を毛状根形質転換法によって klv 変異体の根に導入しても根粒形成抑制の効果は見られなかった。このことから、LjCLE-RS1、-RS2 過剰発現による根粒形成の抑制には HAR1 だけでなく KLV が必要なことも明らかになった。

抄録全体を表示

菌根共生は植物の陸上への侵出と同時期に成立したとされる植物－微生物間相互作用であり、この共生による栄養供給は植物の生育、環境適応に貢献している。さらにマメ科植物は菌根共生システムの一部を流用することで、根粒菌との相互作用による根粒共生を成立させ、窒素固定能を獲得した。近年の研究から、根粒共生システムを構成する遺伝子群の発見など様々な知見が得られ、その知見は根粒共生と共有される菌根共生システムの解明にも適用されている。しかし、この共生の起源となった菌根共生特異的システムに関する知見は乏しく、研究ツールなどの整備が待たれている。我々はマメ科植物ミヤコグサをモデルとして菌根共生の指標となる分子マーカーの確立を目的に、菌根共生特異的に誘導される遺伝子SbtM1の解析を行った。SbtM1は菌根菌感染の初期段階から誘導され、宿主内での共生器官の形成にかかわる遺伝子であることを証明した。SbtM1 promoter:Venus融合タンパク質は菌根菌感染細胞を示すマーカーとして用いることができ、SbtM1がもつ分泌シグナルを融合させたタンパク質SbtM1 promoter:SP:Venusでは分泌された蛍光タンパク質により宿主内の菌根菌を可視化することに成功した。われわれはこのマーカー遺伝子のプロモーターの特性を生かして菌根菌特異的なシス領域の探索を行い、同定した2つのシス領域の解析を行った。

抄録全体を表示

マメ科植物は根粒菌と菌根菌と共生することができる。2つの共生系を制御する宿主遺伝子群は共通シグナル伝達経路（CSP）と呼ばれている。CASTOR・POLLUXはミヤコグサのCSPに属するイオンチャネルであり、高い相同性を示しながら、それぞれの単独変異によりミヤコグサは共生能を失う。一方、タルウマゴヤシでは、POLLUXオルソログであるDMI1のみが共生遺伝子として同定されていた。新たにタルウマゴヤシESTライブラリより単離されたMtCASTORのRNAi解析から、MtCASTORは共生過程に関与しないことが示された。さらにDMI1はミヤコグサcastor pollux二重変異体を相補したことから、DMI1は進化過程において、CASTOR及びPOLLUXの機能を集約的に獲得したと考えられる。
チャネルフィルター領域のアミノ酸配列比較から、1アミノ酸残基の違い～CASTOR(Ser)、POLLUX(Ser)、DMI1(Ala)が見出された。当該残基をAlaに置換したCASTOR(Ala)とPOLLUX(Ala)による相補解析の結果、POLLUX(Ala) は単独でcastor pollux二重変異体を相補した。タルウマゴヤシdmi1変異体へのCASTOR・POLLUXの機能相補結果も併せ、CASTOR・POLLUX/DMI1・MtCASTORの機能進化と喪失についての仮説を提唱する。

抄録全体を表示