私たちの研究室では，イネを用いて高等植物の形態形成機構の解明を目的とした研究を進めている．現在，着目しているrod-like lemma (rol) 変異体では，小穂において外穎の棒状化や，葯の形態異常などの多面的な影響が観察される．これらの表現型は，側生器官の向背軸に沿った組織分化に異常が生じていることを示しており，rol変異体では向背軸に沿った極性形成が正常に行われていないと考えている．
向背軸に沿った器官形成には，向軸側と背軸側において，それぞれ特異的に発現する遺伝子の働きが重要であると考えられる．イネにおいても，シロイヌナズナETTIN/ARF3遺伝子のオーソログ, OsETTIN (OsETT) 遺伝子が側生器官の背軸側において特異的に発現している．rol変異体におけるOsETT遺伝子の発現解析を行った結果，その発現領域が広がっていることが観察された．このことから，OsETT遺伝子の異所的発現がrol変異体の形態異常の一部を引き起こしている可能性が示唆された．次に，この可能性を検証するため，RNAi法を用いたOsETT遺伝子の発現抑制をrol変異体において試みた．その結果，rol変異体の表現型が抑圧されたため，OsETT遺伝子の異所的発現がrol変異による影響の要因の一つであることが判明した．

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花序や花の形態は植物種により多様である。花器官のアイデンティティーの決定にはABCモデルが提唱され、真正双子葉植物に広く当てはまることが示されている。しかし、単子葉植物の花序や花は、真正双子葉植物とは大きく異なるため、その発生には独自の制御システムも機能していると考えられる。イネ科の花には、小穂と小花という花序の構造単位が存在する。イネの花は、外穎・内穎に包まれ、リンピ・雄蕊・雌蕊からなる1つの完全な小花が形成される。また小花の外側には1対の護穎と副護穎が形成され、これらを小穂と呼ぶ。これまで我々は、植物花器官の発生に関わる新たな知見を見出すことを大きな目標として、イネにおける小穂と穂の形態形成とその発生機構に関する研究を行ってきた。小穂を構成する器官の発生に関する知見はまだあまり報告がなされていない。そこで本研究では、小穂の護穎・副護穎の発生に着目して、その形成メカニズムを明らかにすることを目的として、新規変異体 aberrant spikelet 1 (asp1) を単離し、その原因遺伝子の同定を試みた。asp1変異体の表現型の解析から、ASP1遺伝子は、イネ小穂に特異的な器官である護穎と副護穎の形態形成と花序のメリステム維持に関与している可能性が考えられた。今回は、単離した変異体の詳細な表現型解析と、同定したasp1変異体の原因遺伝子についての機能解析について報告する。

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頂端分裂組織の最も重要な機能のひとつは、植物の一生を通じて未分化細胞を維持することである。我々は地上部形態形成に異常をきたす変異として、劣性一遺伝子座変異であるmeristem disorganization1-1(mdo1-1)変異を分離した。mdo1-1変異体の地上部では葉序や葉間期の規則性が失われ、花茎が頻繁に帯化する。茎頂分裂組織(SAM)の組織学的な解析から、mdo1-1ではSAM表層において細胞が肥大化したり、SAMの規則的な層構造が崩壊していることがわかった。この領域では細胞の分裂活性が顕著に上昇していた。これらの結果は変異体において細胞の未分化状態が維持できていないことを示唆する。変異表現型はSAMのみならず根端分裂組織(RAM)にも認められる。各種マーカー遺伝子の発現解析結果から、変異体では静止中心やコルメラ始原細胞を維持できていないことが判明した。遺伝子クローニングと相補性試験の結果、MDO1遺伝子は既知の機能ドメインを有さない比較的小さなタンパク質をコードしていることがわかった。MDO1は陸上植物にのみ広く保存されており、mdo1-1変異はこれらオーソログ間で強く保存されたアミノ酸残基に生じたミスセンス変異である。以上の結果はMDO1遺伝子が、陸上植物にとって重要かつ共通した機能である頂端分裂組織における未分化細胞の維持に深く関わっていることを示唆する。

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リンは植物にとって生育に必須な栄養素であるが、自然状況下において植物が利用可能なリンの量は限られている。リン酸欠乏環境にある植物は、その環境に適応するために根系や代謝を変化させより多くのリン酸を取り込もうとすることが知られているが、その分子メカニズムは未だ不明な点が多い。最近の研究により、植物根系のリン酸欠乏応答には培地中の鉄濃度が大きく関わっている可能性が示唆されており、その作用機構を調べることは、リン応答の分子メカニズムを理解する上で重要であると考えられる。
本研究では、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）を用いてリン酸欠乏応答におけるリンと鉄のクロストークメカニズムを探ることを目的とし、生理学的、分子生物学的な解析を行った。リン酸欠乏条件下において、鉄濃度の低下に伴って主根伸長抑制、側根数増加といったリン酸欠乏様の根系変化がより顕著に観察された。しかし、培地中の有効リン濃度や根系のリン酸取り込み速度を測定したところ、培地中鉄濃度の変化による大きな影響はみられなかった。また、リン酸トランスポーターの発現量解析の結果、培地中鉄濃度の変化に応じて発現パターンに違いが見られた。これらの結果から、植物はリンと鉄を同時に感知し、根系構築を巧みに制御することで栄養塩吸収を有利に行っている可能性が示唆された。

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高親和型硫酸イオントランスポーターSULTR1;2は、シロイヌナズナの根における外界からの硫酸イオン吸収に主要な役割を果たす。SULTR1;2の遺伝子発現は環境中の硫酸イオン濃度の減少に応答して増加し、このことは硫黄欠乏下（-S）で植物が硫酸イオンの吸収を増すための適応機構であると考えられている。これまでに、SULTR1;2の-S応答がSLIM1転写因子により制御される事、SULTR1;2の-S応答シス因子がWRKY結合配列を含むことを見出した。SLIM1とSULTR1;2は組織局在性が異なるため、SULTR1;2の発現をSLIM1が直接的に制御しているとは考えにくい。そこで本研究では、SULTR1;2の-S応答を直接的に制御するWRKY転写因子の同定を試みた。シロイヌナズナのゲノム上に存在する72種のWRKY転写因子のうち、-Sで発現が上昇し、かつその発現上昇がslim1変異体で抑制されるものを探索したところ、3種が認められた。これらについて遺伝子欠損変異体を取得し、硫黄十分、-SにおけるSULTR1;2および硫酸イオンの吸収活性を調べたところ、どちらも-Sでのみ野生株と比較して有意に減少していた。この結果は、WRKY転写因子が硫黄欠乏に応じた硫酸イオン吸収活性の上昇に寄与していることを示している。現在、過剰発現体についても同様の解析を進めている。

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ケイ素の集積植物であるイネは、根から吸収したケイ素を地上部の各組織に沈積することによって、様々なストレスの軽減など有益な効果を得ている。我々はこれまで、イネのケイ酸吸収と分配に関わる3種類の輸送体Lsi1, Lsi2とLsi6を単離解析してきた。今回は新規輸送体Lsi3について機能解析を行った。
Lsi3はLsi2とアミノ酸配列で81％の相同性があり、アフリカツメガエル卵母細胞発現系ではLsi2と同様にケイ酸を排出する輸送活性がみられた。また、GFP融合タンパク質の一過性発現では、細胞膜への局在が観察された。Lsi3の発現は主に根と上位の節において検出され、節の発現は開花期にかけて一過的に増大した。免疫組織染色の結果、Lsi3は根では内鞘、節では肥大維管束と分散維管束の間の柔組織に局在していたが、Lsi2のような極性局在はみられなかった。Lsi3の発現が数倍に増大したenhance lineでは短期間のケイ酸吸収と導管液中のケイ酸濃度の増加がみられ、根の内鞘においてLsi3は導管へのケイ酸のローディングを担っていると考えられた。節では肥大維管束周縁部の木部転送細胞に発現するLsi6によって、葉へと向かう蒸散流からケイ酸がアンローディングされる。Lsi3の局在はこのケイ酸を上位の節や穂へと続く分散維管束へと再ローディングする過程に関与していることを示唆している。

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ケイ素の葉や穀粒等への集積は生物的及び非生物的ストレスから植物を守るのに重要である。オオムギでは、根によるケイ酸の吸収は内向きと外向きのケイ酸トランスポーターHvLsi1およびHvLsi2を介して行われることが明らかとなっているが、吸収されたケイ酸がどのようにして葉や穀粒に分配されるかについてはまだ明らかにされていない。本研究では、HvLsi1の相同遺伝HvLsi6の解析及びとHvLsi2のさらなる解析から、これらのトランスポーター遺伝子がオオムギでのケイ素の分配に関与している可能性を見出した。HvLsi6は根や葉身、葉鞘及び節で発現していた。根の先端では全ての細胞で発現し、葉身、葉鞘では導管に隣接する木部柔細胞、節では肥大維管束の導管に付随する転送細胞で発現していた。またHvLsi2はこれまでに報告された根での発現以外に、節の転送細胞の外側に隣接する柔細胞分散維管束側に偏った極性を持って発現していた。これらのトランスポーターの局在性から、HvLsi6は肥大維管束の導管からのケイ酸のUnloading、 HvLsi2はHvLsi6によって運ばれたケイ酸の分散維管束へのre-loadingに関与していることが考えられる。したがって、節におけるこの両トランスポーターの共同作業によってケイ酸が維管束間を輸送され、穀粒へケイ素沈積に機能していると考えられる。

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脂肪酸によるタンパク質の修飾は、膜への移行やタンパク質同士の相互作用の変化など、タンパク質の機能制御に重要な役割を果たしている。ミリストイル化は、脂肪酸の一種のミリスチン酸がタンパク質N末端に付加する真核生物の翻訳後修飾系の一つである。前回我々は、コムギ無細胞翻訳系を用いたタンパク質ミリストイル化修飾系の構築について報告したが、引き続き、この系を用いて植物ミリストイル化コンセンサス配列の特異性を明らかにする目的で研究を進めてきた。まずMGXAA(A/S)AAAA（Xは任意のアミノ酸残基）からなるミリストイル化コンセンサス配列を融合させたシロイヌナズナのGタンパク質γサブユニット（AGG1）をミリスチン酸存在下において無細胞翻訳系により合成し、コンセンサス配列の3番目と6番目のアミノ酸残基の関係を解析した。その結果、ミリストイル化が確認されたのは、6番目がAlaの場合は3番目がAsnとGlnのみであったのに対し、6番目がSerの場合は3番目の選択性が広がり、12種類のアミノ酸残基でミリストイル化が認められた。現在、他のアミノ酸残基の置換による選択性および開始メチオニン除去との関連をより詳細に調べており、これらの結果もあわせて報告する。

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ツベロン酸 (TA) およびツベロン酸グルコシド (TAG) は馬鈴薯の塊茎を誘導する化合物である．これらはジャスモン酸から合成され，多くの植物に存在しているが，代謝に関わる酵素はほとんど明らかになっていない．我々は，これらの酵素の解析を行うことにより，馬鈴薯以外の植物において TA および TAG の生理的役割を解明することを目指している．これまでに，イネにおいて TAG が TA に加水分解されていること見出した．さらに，TAG に特異性が高い TAG グルコシダーゼ (OsTAGG1) を同定した．本発表では，OsTAGG1 のアイソザイム (OsTAGG2) の酵素学的諸性質を明らかにし，OsTAGG1 と比較を行った．精製した OsTAGG2 は OsTAGG1 と 85% の同一性を持つグルコシダーゼであった．OsTAGG2 の基質特異性を調べたところ，OsTAGG1 と同様，TAG の類縁化合物以外に対してほとんど活性を示さなかった．これらの結果から，OsTAGG2 も TAG を加水分解するグルコシダーゼであると考えられた．OsTAGG1 および OsTAGG2 の生理的な役割を解明するために，傷害などのストレス応答時における発現解析を行っており，その結果についても併せて報告する．

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ナイアシン（ニコチン酸、ニコチンアミド）から合成される補酵素群（NAD(P)(H)）は細胞内の酸化還元反応に不可欠な因子であり、細胞の恒常性や環境適応性において極めて重要な役割を担っている。一方で、その生合成や代謝制御については詳細が明らかになっていない。我々のグループではこれまでにシロイヌナズナのAtNMNAT遺伝子はde novo（NaMN→NaAD→NAD）およびsalvage（NMN→NAD）の両合成経路に重要であることを明らかにした。さらに、その酵素活性は孔辺細胞においてアブシジン酸（ABA）誘導的に活性化することを前大会で報告した。これらの結果はNMNATがNAD生合成経路の鍵酵素として機能し、転写後調節を受けることを示している。そこで本研究ではAtNMNAT改変植物体を用いてNAD生合成制御機構におけるNMNAT活性制御の関与を調査した。GST-NMNATを用いた解析によって、NMNATは単量体では酵素活性を持たず、ホモ複合体を形成することで活性化することを見出した。さらに、欠失型NMNATをシロイヌナズナで発現させるとドミナントネガティブ様の表現型を示すことを明らかにした。さらに、ABA応答性経路との関連を見出したので合わせて報告する。

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GDP-マンノースエピメラーゼ(GME)は、GDP-マンノースのD-マンノース残基の3位と5位の水素、水酸基の立体配置を反転させ、L-ガラクトース残基に変換する酵素である。生成したGDP-L-ガラクトースはL-ガラクトースを経て、主にL-アスコルビン酸(Asc)の合成に利用されると考えられている。この経路は植物と一部の藻類に特異的であり、GMEの反応はAsc合成への分岐点の反応として重要であると考えられる。
モモのGMEは満開40日目ころの果実で転写産物が多かった。今回、モモのcDNAをタバコSR1系統に導入し、過剰発現させた形質転換体を作出した。35個体のKm耐性個体のうち、10系統でRNAの過剰発現が見られた。一部について、培養植物の葉から硫安分画した抽出物に¹⁴CラベルされたGDP-マンノースを与え、2時間反応後加水分解し、薄層クロマトグラフィーで糖を分離し、放射活性を検出することでGME活性を検討したが、薄層クロマトグラフィーの分離がサンプル間で均一ではなく、正確な結果を得られなかった。大腸菌で発現させたHATタグ付与組換えGMEを同様に反応させたところ、マンノースより移動度が小さいガラクトースの放射活性スポットが検出され、GME活性が確認できたが、その比は約6:1で平衡はマンノース側に偏っていた。GMEタバコの葉のAsc含量はSR1と同程度であった。

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植物特異的な蛋白質へのO-結合型糖鎖修飾の最初のステップは、蛋白質中のプロリン残基のヒドロキシプロリンへの変換であり、その反応には、1型または2型のプロリン水酸化酵素（P4H）が関与する。また、植物を用いて異種蛋白質を効果的に合成させるためには、蛋白質への植物特異的糖鎖修飾の抑制が必要である。そこで本研究では、O-結合型糖鎖修飾を一カ所受ける蛋白質スポラミンを発現する形質転換タバコを用い、P4H阻害剤の処理や、P4Hの発現抑制が、植物の生育と、スポラミンへのO-結合型糖鎖修飾に与える影響について解析した。
P4H阻害剤であるα,α’-dipyridyl処理により、植物体の生育は大きく阻害された。一方、P4Hの恒常的な阻害を図る目的で、1型P4Hに対するRNAiコンストラクトと、2型P4Hに対するRNAiコンストラクトを発現させた植物体を作成したところ、部分的にこれらの発現が抑制されている植物体を獲得することが出来た。これらの植物体では、阻害剤処理と異なり、植物の生育阻害は認められなかった。次いで、これらの植物体とスポラミン発現植物体を掛け合わせた個体を作成した。本報告では、これら処理の生育に対する影響及び、阻害剤処理やRNAiコンストラクトを導入した個体における、スポラミンの修飾程度を指標とした、O-結合型糖鎖修飾への影響について報告する。

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ショ糖は高等植物において炭酸同化産物の転流で用いられる必須の物質である。こうした転流の過程でショ糖輸送体が重要な役割を果たしていると考えられている。植物細胞内でのショ糖輸送の制御機構を解析するため、タバコのショ糖輸送体NtSUT2とNtSUT4の細胞内局在の解析を、タバコ培養細胞BY－2株を材料として行った。まず始めにそれらの抗体を作製し、ショ糖密度勾配遠心を用いた細胞分画法により局在を解析すると、NtSUT2はゴルジ体と同様の分布を示したのに対し、NtSUT4は液胞膜に相当する画分に回収された。またこれらとGFP、RFPの融合体をタバコ培養細胞内で発現させたところ、NtSUT2はTGNのマーカーであるSYP41と、NtSUT4は液胞膜のマーカーであるSYP21と共局在を示した。また、NtSUT2は糖、窒素、リン酸飢餓で分解されるのに対し、NtSUT4は糖飢餓のみで分解されることから、これら2種の糖輸送体は異なった分解制御を受けていると考えられた。さらにNtSUT2の分解はオートファジー阻害剤であるE-64や3-methladenine存在下で分解が抑制されたことから、その分解にオートファジーが関わる可能性がある。現在、この分解機構に関して詳細な解析を進めている。

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アグロバクテリウムを用いたイネ形質転換系はHieiら以降、多数の効率改善の報告がなされている。しかし細胞数当たりの形質転換効率は低く効率の高いイネ、日本晴培養系を用いてもカルス塊当たり数個の形質転換細胞が得られるにすぎなかった。液体振とう培養細胞は活発に増殖しており形質転換効率が固体培地上のカルスよりも高い事が予想され、また細胞塊が小さいことから数千の細胞塊を一度に取り扱うことができる利点がある。しかし継代培養、共存培養に液体培地を用いると形質転換効率が著しく低下する事が報告されていた。我々はアグロバクテリウム感染後、液体培地を吸収した濾紙上でカルスを共存培養することにより飛躍的に形質転換効率が向上することをすでに見いだしている。しかし相同組換え実験等で求められる10⁴～10⁵の形質転換細胞を一度に作出する事は未だ困難であった。そこで振とう培養系を用いた形質転換効率の改善を試みた。我々は培養条件、特にアグロバクテリウムとの共存培養条件を詳細に再検討することにより、N6液体培地中で約3週間振とう培養した細かい細胞塊を用いた効率的な形質転換系作出に成功した。振とう培養細胞を用いることによりカルス重量当たりの形質転換効率は既報と比較し、10倍以上向上し、培養細胞1g (fresh weight)当た10⁴以上の形質転換細胞を得ることができた。形質転換細胞の再分化率は約60%であった。

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オジギソウは接触や電気などの刺激に反応し、葉を約5秒で折り畳む。このお辞儀運動の分子メカニズムはほとんど明らかになっておらず、適応進化における意義も不明である。これらの問題を遺伝子レベルで解明するため、我々はオジギソウの形質転換技術を開発した。まずオジギソウの再分化系を確立するため、分化した組織からのカルス誘導とカルスからのシュート誘導条件を検討した。その結果、切断した子葉をNAA 0.01 mg/l、BAP 2 mg/lを含む1/2 MS培地で培養するとシュートを誘導できることがわかった。さらにこのシュートを切断し、植物ホルモンを含まない1/2Hoagland培地に差し込み、培養することにより、根を誘導できることがわかった。次に、アグロバクテリウムの感染方法について、菌株、植物体の育成条件、感染時の処理条件の検討を行った。その結果、菌との共培養開始時に、子葉にメスで傷を付けて超音波処理を行い、スーパーバイナリーベクターpSB111を保有するLBA4404株を感染させた場合に、最も高効率で感染が起こることがわかった。現在までに、GFP遺伝子を導入したオジギソウのカルスを作ることに成功し、顕微鏡下における観察でGFPの蛍光を確認できた。以上の成果を組み合わせ、遺伝子導入されたカルスからシュートおよび根を誘導することによって、形質転換オジギソウの作出を試みており、その結果を報告する。

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全ゲノムショットガン法により多くの生物のゲノム解読が進むようになったが、どこにどのような遺伝子があるかのアノテーションについては困難であった。
セン類のヒメツリガネゴケPhyscomitrella patensは約480 Mbの概要ゲノムが公開され、約3万6千の遺伝子モデルが予測されている(Rensing et al 2009)が、遺伝子モデルの多くは、予測のみによって構築されており、実際にcDNAを単離すると違いを見いだす事が多い。我々は、これまで完全長cDNAライブラリーのシーケンシング、オリゴキャッピングによる5’SAGEタグ、454システムを用いた3’ 末端配列データを蓄積して来た。さらにSOLiDシステムを用いて、テンプレートスイッチによるmRNA 5’末端データ(25-nt, 3億6千万配列以上)と平均化cDNAライブラリーのランダムシーケンシングによる内部データ(50-nt, 1億4千万配列以上)とを大量に取得した。
SOLiDによる内部50ntの配列データを直接、参照ゲノム配列にGap入りアラインメントすることによりイントロンを同定することが可能な事がわかった。このデータを用いて遺伝子モデルを構築するシステムのプロトタイプを作成した。このシステムを発展させて、他のデータとも組み合わせて、ゲノム全域の処理を行なうことが可能なシステムの開発を目指している。

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個々の遺伝子の発現を制御している転写制御因子を同定するには、酵母ワンハイブリッド法がよく用いられる。これには、まず対象遺伝子のプロモーター解析を行ってシスエレメントを絞り込み、これらを上流領域に複数個連結したリポーター遺伝子を用いて、これに結合する転写因子をcDNAライブラリーからスクリーニングするのが一般的である。しかし成功するかどうかはライブラリーのクオリティに依存するところが大きく、またcDNAライブラリーの8割以上は転写因子以外の遺伝子で構成されているため、大規模なスクリーニングが必要であるなどの問題点も多い。そこで本研究では、転写因子のcDNAのみからなるライブラリーを作成することで、このような問題点がどの程度解決できるか検討した。その結果、線虫などでの先例と同様に、シスエレメントの絞り込みを行うことなしに、500-1000bpのプロモーター領域をそのまま用いた場合でも、従来法より100倍以上の高効率で目的の転写制御因子を同定することができた。しかし酵母を用いた方法は、偽陽性や偽陰性を生じやすいこともわかり、植物を利用した新しい方法も検討している。本発表ではこれらの方法を比較検討した結果を報告したい。

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植物プロモーターの総合的解析の一環として、我々はプロモーター上の位置情報に着目しプロモーター構成配列を総括的に抽出することに成功している（山本らBMC Genomics 8: 67, 2007）。しかし、抽出された転写制御様配列（Regulatory Element Group: REG）の中には生理学的な役割が分からないものも数多く含まれていた。こういった配列の機能解明、そしてこれまでの解析から漏れていた位置依存的な出現パターンを示さない（=非REG型の）転写制御配列の新規予測を目的としてマイクロアレイデータの解析から転写制御配列の同定を行うことにした。我々の内部データ及び公開されているマイクロアレイデータをもとに転写制御配列を予測し、合成プロモーターを用いてin vivoで機能検定する、という解析の一連の流れにそって、マイクロアレイデータの外部データベースからの取り込み、予測手法の検定、解析フローを構成するプログラム類の開発、ルシフェラーゼレポーターを用いた新規ベクターの開発、測定機器のセットアップ、等の解析環境を整備している。現在は種々の環境・生物ストレス応答に関して転写制御配列予測の作業を進めている。

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代謝制御に関与する遺伝子機能の解明を加速するため、我々はこれまでに、トランスクリプトームとメタボロームのデータを代謝経路マップ上で統合解析するためのウェブツールKaPPA-Viewを開発してきた。本発表では、最近リリースした最新バージョンであるKaPPA-View4について報告する。
1）劇的な処理速度の向上：内部データを全面的に見直し、すべてのステップでほとんどストレスのない解析環境を実現した。
2）Macintoshへの対応：マップ描画においてSVGプラグインのインストールが不要となったため、Windows, Macintosh, Linuxのいずれからも、解析が行えるようになった。
3）ユーザーマップの利用：フリーの描画ソフトInkscapeを使ってユーザーが任意に作成したマップを用い、解析が可能になった。
4）外部システムからのビューワーとしての利用：ホームページ上でのログイン操作を経ずに、外部データベースやアプリケーションから直接データをアップロードしてその結果をマップ上で表示できる機能を設けた。これにより、トランスクリプトームデータを蓄積しているデータベース等の開発者は、KaPPA-View4を外部ビューワーとして直接利用し、蓄積したデータをマップ上に表示させることができるようになった。
KaPPA-View4: kpv.kazusa.or.jp/kpv4/

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キャピラリー電気泳動-質量分析装置CE-MSによる主要代謝物質のプロファイリングに有効に利用できるフューズドシリカキャピラリーカラムを用いた陰イオン性代謝物質測定のための2つの分析条件を検討した。第一は糖リン酸、有機酸、ヌクレオチド及び補酵素などの代謝物質を網羅的にかつ短時間に測定することを目標にした分析条件であり、泳動用緩衝液にギ酸アンモニウム(pH8.0)を用いることにより、一般的なポリマーコーティングキャピラリーを用いた場合に近い17分以内で35物質から成る標準試料の測定が可能であった。この分析条件において、質量電荷比m/z=229と259における構造異性体由来の複数のピークの分離が十分に得られないシグナルを対象に、高解像度で分離検出するための第二の分析条件を設定した。泳動用緩衝液に酢酸アンモニウム(pH10.0)とメタノールの混合溶液を用いた条件によりこれらの構造異性体（R5P、Ru5P、F6P、G1P、G6P、Gal1P、M6P）を分離同定することが可能であった。後者の分析条件でのヒメツリガネゴケの抽出液の測定においては、m/z=259に連続して検出された3つのピークが、M6P、G6P、及び未知物質のものであることを同定した。これらの結果とシロイヌナズナの葉の抽出液を測定した結果を基に、陰イオン性代謝物質のプロファイリングにおける2つの分析条件の有効性と実用性を議論する。

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我々は、UPLC-TQMS を用いた大規模な標準化合物の高感度検出条件 (multiple reaction monitoring, MRM) の取得および代謝産物の一斉解析手法の確立に成功している [1]。現在、さらに発展させた高速、高感度、広範囲分析系を構築し、植物バイオリソースに適用している [2,3]。一方、多くの代謝産物は標準化合物が入手できない。そこで共著者の松田は、多様な植物代謝産物に対応できる非ターゲットのMS/MS情報 (MS2T) 取得法を構築した (http://prime.psc.riken.jp/) [4,5]。この MS2T から最適な MRM 条件を推定すれば、標準化合物に依存しない広範囲分析が可能になる。本発表ではシロイヌナズナの各器官から取得された2,788個の MS2T から合計50,184条件の推定 MRM を作成した。UPLC-TQMS で測定した結果7割以上の MS2T が検出可能な MRM 条件として同定できた。この結果から標準化合物およびMS2Tから得られた MRM を統合した超広範囲解析が可能であることが示唆された。
[1-3] Sawada et al., PCP2009a-c, [4] Matsuda et al., Plant J 2009, [5] Akiyama et al., In Silico Biol 2008

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実質的同等性とは、食用としての安全性の評価が可能とされる遺伝子組み換え(GM)作物と、これまで食用として用いられてきた作物とを比較・判断する際の基準概念である。代謝物群の変化を捉える研究であるメタボロミクスはあらかじめ測定対象を特定せずに行う分析方法であるため、本評価への利用が世界中で試みられている。そこで我々は、3種類のクロマトグラフ技術に飛行時間型－質量分析計（TOF-MS）を組み合わせた装置によるMS-based metabolomicsにより、GMトマトの実質的同等性評価法を確立し、本法を用いてGMトマトの実質的同等性評価を行った。
評価対象として、栽培種トマト（cv. Moneymaker）、本品種にミラクリン遺伝子を導入したGMトマトを使用した。評価期間は3年、栽培法は2種類を適用した。なお、評価に用いる部位は可食部である果実とした。異なるプラットフォームから得たデータを自動的に統合するため、データ統合プログラム「MetMask」を開発・利用した。それぞれの収穫年で得られたサンプル群に対して統計解析を行い、遺伝子導入により起こった代謝物群の変動幅を検定した。その結果、ミラクリン過剰生産トマトの代謝プロファイルは、Moneymakeのものと有意差が認められず、Moneymakerと実質的に同等であると見なすことができると結論した。

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細胞内における化合物の局在性は，代謝酵素や受容体などのタンパク質の局在情報から推測されているに過ぎず，実際にこれを直接検出した例は少ない．我々は昨年までの大会で，巨大な細胞であるオオシャジクモ節間細胞から単離した液胞及びサイトプラズムを，イオン性化合物の悉皆的解析に優れたCE-MS（キャピラリー電気泳動/質量分析装置）を用いたメタボローム解析に供することによって，単一細胞内における液胞とサイトプラズムでの化合物の局在について報告した．本大会では，様々な環境条件下における細胞内化合物の局在性について報告する．光条件を変化させると細胞内の化合物濃度が変化するが，リンゴ酸などの化合物は液胞内では濃度が変動する一方，サイトプラズムではほとんど濃度が変わらなかった．これはこれらの化合物が必要に応じて液胞膜を移行し，サイトプラズムにおける化合物濃度を調整していることを示唆しているのかもしれない．また，顕微注射技術を用いることによって，細胞内における化合物の移動を直接検出することが出来た．今後は温度やpHなどの環境条件の変化が細胞内での化合物の挙動に与える影響を調べる予定である．以上の研究により，化合物が細胞内のオルガネラに局在していること，および必要に応じてオルガネラ間を化合物が移動していることを直接証明できると考えられる．本研究は，イノベーション創出基礎的研究推進事業の支援を受け実施された．

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液胞は植物細胞体積の約8割を占めるオルガネラであり、膨圧形成、無機イオンや代謝産物の蓄積、不要となったタンパク質の分解など細胞内恒常性の維持に重要な役割を果たしている。その機能から液胞内にはさまざまな物質が存在すると考えられる。我々は、植物細胞より液胞をインタクトな状態で単離し、CE-MSとFT-ICR-MSを用いて、液胞に含まれる物質について網羅的な解析と物質の同定を行ってきている。その結果、これまで液胞には存在しないと考えられていたリン酸化合物の存在が示唆された。また、シロイヌナズナの培養細胞を用い、液胞膜のプロテオーム解析より同定された機能未知膜タンパク質について、過剰発現させた細胞の作製を行い、形質転換細胞より単離した液胞と、野生型の液胞との代謝物質の比較解析を行うことで、機能未知な液胞膜タンパク質のはたらきについて、解析を進めている。その中で、特にリン酸化合物に注目し、液胞内にどのようにリン酸化合物が取り込まれているかについて検証を行っており、その結果について報告したい。

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質量分析装置の技術躍進に伴って、生体内のタンパク質、あるいはアミノ酸や有機酸などの低分子化合物を網羅的に分析し、新たな知見を見いだそうとする「プロテオーム」や「メタボローム」が進められている。
現在、メタボローム解析に用いられている技術は、アサイメントの容易さやデータベースの充実性から、ガスクロマトグラフィー質量分析装置(GC-MS)や液体クロマトグラフィー質量分析装置(LC-MS)が主流になっている。
本研究では、植物体内に含まれる多くの物質がイオン性物質であることに着目し、CE-ESI-QTOFを用いて、アミノ酸や有機酸、リン酸化合物などの一次代謝物質、さらには、内生量の極めて少ない植物生理活性物質を部位ごとに分析し、定量的に一斉解析することを目的とした。
ポジティブモード分析によるノンターゲット解析では、地上部で548、根で603のピークが確認され、地上部で25種類、根で23種類のアミノ酸やヌクレオシドが同定された。一方、ネガティブモード分析によるノンターゲット解析では、地上部で199、根で214のピークが確認された。そのうち、代表的な一次代謝物質をターゲット解析した結果、地上部で7種類、根で10種類の有機酸やリン酸化合物が同定された。さらには、植物ホルモンの一つであるインドール-3-酢酸 (IAA)も、これらの代謝物質と同時に解析できるようになった。

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液胞は植物に普遍的なオルガネラであり、細胞全体積の90%を占める。液胞内には細菌などの外敵の侵入に備えて、抗菌物質や分解酵素を多量に蓄積している。一方、侵入した細菌は細胞間隙で増殖し植物の生命を脅かす。これまで、どのように植物が細胞内の抗菌物質を使って細胞外の細菌を攻撃しているのかは謎であった。私達は、非病原性の細菌をシロイヌナズナの葉に感染させた際に誘導される防御応答を解析し、感染を受けた細胞が積極的に液胞膜と細胞膜を融合させることによって液胞内の抗菌物質を細胞外に放出し細菌を攻撃するメカニズムを見出した。このとき同時に液胞内の分解酵素を放出し細胞は過敏感細胞死を起こす。健全葉の細胞では液胞に局在する分解酵素が、細菌の感染を受けた葉では細胞間隙液からも検出された。また、細胞間隙液の抗菌活性と細胞死誘導活性を調べたところ、感染葉では健全葉に比べてどちらの活性も優位に高い値を示した。感染に伴う膜融合と細胞死がプロテアソームのRNAi株において阻害された。興味深いことに、プロテアソームのRNAi株ではプロテアソーム活性とともにカスパーゼ-3様活性も低下していた。この結果は、植物で見出されていたカスパーゼ-3様活性の正体がプロテアソームであることを示している。以上の結果から、植物はカスパーゼ-3様活性をもつプロテアソームを介して膜融合をともなう防御戦術を発達させてきたことが示唆される。

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バクテリアは，エフェクターと呼ばれる病原因子タンパク質を宿主細胞に注入することにより，植物の抵抗性を阻害し自身の増殖を行う．一方，植物はこのエフェクターを感知し，より強力な抵抗力を発揮する．本研究では Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst.) が分泌するエフェクターの一種であるavrRpt2 をDEX誘導により発現するシロイヌナズナ形質転換体を親株として，これをEMS変異原処理して，過敏感細胞死に異常をきたす変異体を単離し，解析した．
約1,000系統の形質転換体から，過敏感細胞死に異常を示し，病原性細菌Pst. DC3000に対して，野生型並みの抵抗性をもった1系統を単離した．この変異体に，非病原性細菌Pst. DC3000/avrRpm1 もしくはavrRpt2 を接種しても過敏感細胞死は認められなかった．興味深いことに，この変異体は，Pst. DC3000/avrRpm1 に対して高い罹病性を示すが，avrRpt2 に対しては正常な抵抗性を発揮することが分かった．我々は，この変異体を avrRpt2 specific resistance with no cell death 1 （anc1）と名付けた．現在までに，このような表現型を示す変異体は報告されておらず，菌感染に対する植物の応答機構の研究に新たな知見をもたらすと考えられる．

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植物の感染応答分子機構の解析を目的に，Ralstonia solanacearum（Rs）接種タバコよりRs応答性遺伝子の単離・機能解析を進めている．本研究では酵母の脂質代謝に関わるSec14Pと相同性を持つNbsec14P（Nicotiana benthamiana sec14P）に着目した．Nbsec14Pの発現は非病原性Rsの接種で強く誘導された．Nbsec14Pは酵母の温度感受性変異株の生育能の欠損を相補した．Nbsec14Pサイレンシング植物では，過敏感細胞死への影響は認められなかったが，病原性・非病原性Rsの増殖および，病原性Rsで誘導される萎凋症状の発現が促進された．サイレンシング植物では，非病原性Rs接種で誘導される防御関連遺伝子であるPR-4，EREBPの発現が抑制された．また、Nbsec14Pサイレンシング植物では，Phospholipase C，D活性が有意に低下した。以上の結果から，Nbsec14Pはリン脂質代謝を介して，Nicotiana植物の病原細菌に対する防御応答を正に制御していることが示唆された．

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病原菌認識後に誘導されるオキシダティブバーストは，主に細胞膜に存在するNADPHオキシダーゼの活性化により引き起こされると考えられている．これまでに，ジャガイモのNADPHオキシダーゼであるStRBOHBは，カルシウム依存型タンパク質リン酸化酵素（StCDPK5）によりN末端領域がリン酸化されて活性化されることを明らかにしてきた（Kobayashi et al. 2007 Plant Cell）．今回，StCDPK5による活性化機構を調べるために，StRBOHBに対する活性化能が低いCDPKとStCDPK5との間でdomain swappingを行った．トマトのSlCDPK2は，エチレン合成に関与するSlACS2をリン酸化するCDPKであり，Nicotiana benthamiana葉においてアグロバクテリウムを介して一過的にStRBOHBと共発現させても活性酸素生成は観察されなかった．そこで，StCDPK5とSlCDPK2との間でdomain swappingを行った結果，StCDPK5のvariable domainとkinase domainをSlCDPK2に導入した場合においてのみStRBOHBに依存した活性酸素生成が確認された．この結果は，StCDPK5のvariable domainおよびkinase domainがStRBOHBの活性化に重要であることを示唆している．

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ジャガイモのファイトアレキシンであるリシチンはイソプレノイドであり，PVS (potato vetispiradiene synthase) は生合成における鍵酵素である．これまでに，分子レベルで感染におけるリシチンの役割が調べられた例はない．PVSは多重遺伝子族を形成しており，PVS1～4を単離している．RNAi法によってこれらPVS1～4をノックダウンした遺伝子組換えジャガイモを作出した．この塊茎にジャガイモ疫病菌非親和性および親和性レースを接種したところ，野生株と比較して非親和性レース接種ではHR細胞死が塊茎全体に広がり，親和性レース接種では菌糸の著しい蔓延が観察された．両レース接種区において塊茎からファイトアレキシンを経時的に抽出したところ，RNAi個体では蓄積が認められなかった．葉組織に親和性レースを接種したところ，RNAi個体では病徴が早く現れる傾向が観察された．非親和性レース接種葉では，野生株において菌侵入直下の表皮細胞でHR細胞死が観察されたのに対し，RNAi個体では二次菌糸が伸長して葉肉細胞でHR細胞死が観察された．以上の結果から，ジャガイモ葉組織においてリシチン蓄積が報告された例はないが，ファイトアレキシンは塊茎のみならず葉組織においても防御応答の一端を担っており，他の防御関連因子と複合的に作用することで抵抗性を発揮するものと考えられた．

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病原菌は植物に感染する際、エフェクターと呼ばれるタンパク質をType III secretion system (TTSS)を用いて直接植物細胞内へと分泌し、植物の抵抗性反応を抑制し、宿主に感染することを可能にしてきた。本研究ではエフェクターの標的が植物免疫因子であると考え, イネ白葉枯病菌T7174R株のエフェクターを用いてイネ免疫機構を解析することを目的としている。
これまで我々は10種類のエフェクターをそれぞれイネで過剰発現させた形質転換体を作出し, TTSSを欠損したイネ白葉枯病菌HrpX変異株の接種実験をおこなった。その結果、野生型イネでは、宿主のPAMPs抵抗性によりHrpX変異株による病徴が観察されないのに対し, 4種類のエフェクターを過剰発現させたイネにおいて病徴の拡大が確認された。そこで、この4種類のエフェクターに対象を絞り、その機能を詳細に解析することとした。これまでに解析により、エフェクターが、エリシターによって誘導される防御遺伝子の発現を抑制することが明らかとなった。更に、酵母ツーハイブリッド法により、エフェクターのイネ相互作用因子を探索し、その候補として転写因子や受容体型キナーゼなどを同定した。本発表ではこれら4種類のエフェクター過剰発現植物並びにエフェクターの解析結果について報告する。

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イネのRac/Ropファミリーに属する低分子量Gタンパク質OsRac1は、病害抵抗性反応においてNADPHオキシダーゼの活性化や活性酸素種の生成、リグニン合成、PRタンパク質の発現、ファイトアレキシンの生成など様々な防御応答に関与する分子スイッチであると示唆されている。しかし、その動態が生細胞内でされた解析例は少ない。 そこで我々は、OsRac1の活性化を生細胞内においてモニタリングするために、Raichu-OsRac1と呼ばれるFRETバイオセンサーを開発した。このセンサーによって、イネ培養細胞内において、病原菌の細胞壁の構成成分であるキチンによりOsRac1が活性化されることが明らかとなった。また、FRETの変化を経時的に観察することにより、キチン添加後非常に素早くOsRac1が活性化されることも明らかとなった。さらに、酵母two-hybrid法によって、OsRac1の活性化因子としてGuanine nucleotide exchange factor (GEF)を同定した。興味深いことに、このGEFは受容体型キナーゼと相互作用することが確認された。本発表では、受容体によるキチンの認識から、OsRac1活性化までの一連の経路について、OsGEF7の活性化調節機構を含めて主にイメージング技術を用いて報告する。

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Plants have evolved innate immunity systems to fight pathogen infection. Pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) receptors are receptor-like kinases (RLKs) in plants. However, the maturation and transport of PAMP receptors are not well understood. Here, we characterize the Hsp90 co-chaperone Hop/Sti1, a novel OsRac1 interactor. Hop/Sti1 and cytoplasmic Hsp90 bind the rice chitin receptor OsCERK1 in the endoplasmic reticulum (ER). The OsCERK1 complex is then transported to the plasma membrane (PM) via the Sar1-dependent trafficking system. Impairment of Hop/Sti1 and Hsp90 function reduces the efficiency of OsCERK1 transport to the PM. Hop/Sti1a acts in chitin-triggered defense and rice blast resistance. Our results suggest that Hop/Sti1 and Hsp90 may function to link PAMP receptors and Rac/Rop GTPases. The Hop/Sti1a-Hsp90 chaperone complex appears to have a highly conserved role in the maturation and transport of receptors and ion channels in plants and animals.

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イネにおいて、低分子量Gタンパク質であるOsRac1は植物免疫反応を制御していることが明らかにされている。これまでにOsRac1の相互作用因子を同定し、シグナリングネットワークを解明してきた。本研究では、OsRac1がイネ細胞内で複合体として存在しているのか、その複合体が植物免疫反応にどのように関わっているかを解明することを目的とした。
恒常活性型又は恒常非活性型OsRac1を発現するイネ培養細胞のタンパク質を抽出後、ゲルろ過によって分画した。その結果、恒常非活性型に比べて恒常活性型では大きな複合体を形成することが確認された。また、野生型OsRac1にエリシター処理を行ったところOsRac1は処理後3-10分で高分子量側にシフトし、20分以上処理し続けると低分子量側の複合体が多くなることを確認した。OsRac1と相互作用し、植物免疫に関与するタンパク質について解析を行ったところ、OsRac1の活性型及びエリシター処理に関わらず、常に同じ大きさの複合体を形成していた。そして、エリシター処理によって野生型OsRac1が活性化していくことを生化学的に証明した。
以上のことから、OsRac1は活性型としてDefensome複合体中に存在し、植物免疫シグナルを下流に伝達していくという可能性を示唆している。

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植物の抵抗性遺伝子産物（以下、Rタンパク質）は、病原体を認識する細胞内レセプターとして働くことが知られている。現在、Rタンパク質がどのような複合体を形成し、下流のシグナル伝達系を制御しているかはほとんど明らかになっていない。我々はこれまでに植物免疫の分子スイッチである低分子量GTP結合タンパク質OsRac1がイネのRタンパク質を介した抵抗性反応において重要な役割を果たしていることを明らかにしている。最近、OsRac1の相互作用分子の探索を行ったところ、いもち病菌の抵抗性タンパク質であるPitを同定した。Pitによる抵抗性にOsRac1が関与するか OsRac1の発現抑制イネを用いて検討したところ、OsRac1 発現抑制イネではPitを介した抵抗性が抑制され、顕著にいもち病の病斑が大きくなっていることが確認された。活性型のPitやOsRac1をタバコで過剰発現すると、過敏感反応やROSの産生などの耐病性特有の反応が観察された。この活性型 Pitによる過敏感反応やROSの産生は、ドミナントネガティブ型OsRac1によって抑制された。OsRac1の活性化をモニタリングした結果、Pit活性化型変異体は、OsRac1を活性化することが明らかになった。以上の結果から、OsRac1はPitの下流で過敏感反応死やROSの産生を制御することにより、耐病性を制御することが示唆された。

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イネが病原菌を認識して誘導する免疫反応の一つに活性酸素の発生が知られている。イネに非病原菌を接種すると速やかな活性酸素発生が認められるが、Ca²⁺阻害剤、リン酸化阻害剤の処理によって抑制された。そこで、免疫反応誘導時における細胞内Ca²⁺の変動をYellow cameleon 3.6を用いて調べたところ、非病原性菌株接種後、急激な細胞内Ca²⁺濃度の上昇が認められたが、病原性菌株ではCa²⁺の上昇は認められなかった。この様に免疫反応誘導時の活性酸素発生にはCa²⁺の変動とリン酸化が必要なことから、CPK（calcium-dependent protein kinase）が関与している可能性があると考え、イネゲノム上に存在する29個のOsCPKの発現パターンを解析したところ、6個のOsCPKが免疫反応誘導時特異的に発現誘導されることが示された。そこで、これらのOsCPKについてRNAi形質転換体を作製したところ、OsCPK12のRNAi形質転換体で活性酸素発生が抑制された。次に、OsCPK12と活性酸素発生に関与しているOsrbohとの相互作用をBiFC法で確認したところ、OsrbohAのN末端との相互作用が見られた。このことから、OsCPK12はCa²⁺依存的にOsrbohAのN末端をリン酸化することで、活性酸素発生を制御している可能性が示唆された。

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過敏感細胞死は、植物が非病原性菌株を認識したときに誘導される免疫反応の一つであり、核DNAの断片化や膜の透過性喪失などを伴うプログラム細胞死である。我々はこれまでに、イネの過敏感細胞死はOsNAC4によって誘導されることを明らかにした。そこで、OsNAC4による過敏感細胞死誘導の機構を明らかにすることを目的とし、過敏感細胞死誘導時のOsNAC4の局在について調べた。その結果、過敏感細胞死誘導時にOsNAC4はリン酸化されることで核に移行することが示された。また、このOsNAC4の核移行には、分子内のNACドメインのN末端とC末端の領域で制御されることが示された。次に、OsNAC4のRNAi形質転換体を用いたマイクロアレイ解析によって、OsNAC4が139個の遺伝子の発現を制御することが明らかになったので、OsNAC4による転写制御機構について調べた。まず、酵母two-hybrid法を用いてOsNAC4と相互作用するタンパク質の探索を試みたところ、同じサブファミリーに属するOsNAC3と相互作用することが確認された。そこで、OsNAC3が過敏感細胞死誘導に関与するかを一過的発現によって調べたところ、OsNAC3も過敏感細胞死を誘導することが明らかになった。以上の結果から、OsNAC4がOsNAC3と二量体を形成し、過敏感細胞死誘導に関与する遺伝子の発現を制御している可能性が示された。

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シス型ゼアチン（cZ）は、高等植物において、トランス型ゼアチン（tZ）やイソペンテニルアデニン（iP）と比べて活性が低い、もしくは不活性型と考えられてきたサイトカイニン（CK）分子種である。しかし近年、いくつかの植物種におけるcZ型CKの蓄積や、cZを認識するトウモロコシのCK受容体が報告された。イネでは、cZ型CKがプレニル側鎖の酸素原子において配糖化（O-グルコシル化）されたcZOGやcZROGが、高蓄積する。本研究では、イネにおけるcZ型CKのO-グルコシル化酵素の同定と生理機能の解明を目的とした。データベース検索および組換えタンパク質を用いた活性測定により、イネのUDP-グルコシル転移酵素族に属する3つのタンパク質が、in vitroでcZおよびcZRのO-グルコシル化を触媒することが明らかになった。また、そのうち1つにはtZを基質とする同活性も認められた。これらの遺伝子を各々異所的に過剰発現する形質転換イネの葉身では、cZOGまたはcZROG蓄積量の増加傾向が認められた。以上より、過剰発現させた3遺伝子の発現産物は、in vivoでcZ型CKのO-グルコシル化を触媒すると考えられる。また、これら3つのうち、2つの過剰発現イネでは、地上部の半矮性や矮性などの表現型が観察された。遺伝子発現解析の結果とあわせ、cZ型CKのO-グルコシル化機構の役割について考察する。

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シロイヌナズナ発達種子におけるアブシシン酸（ABA）の蓄積量を、LC-MS/MSを用いて詳細に解析した。野生型とABA欠損変異体aba2の掛け合わせF₂種子におけるABA量を個別に分析することにより、発達中期に種子中に蓄積するABAは主に母体由来組織で合成されることを明らかにした。しかし、この時期にはABAは主に胚に蓄積することから、胚以外の組織で合成されたABAが胚へ移動している可能性が考えられた。一方で種子形成後期には、中期に比べると少量ではあるが、ABAは主に胚もしくは胚乳で合成されることが明らかになった。マイクロアレイ解析により発達種子中で内生ABAにより発現が制御される遺伝子を同定し、ABA欠損の程度が組織間で異なる変異体における発現量を比較した。その結果、種子全体におけるABA量と遺伝子発現が必ずしも一致せず、異なる組織で合成されたABAが下流の遺伝子発現を特異的に制御している可能性が考えられた。

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植物ホルモンは、それぞれ固有の機能を持ちながらも、互いに拮抗的あるいは協調的に作用し合い、植物の形態形成や環境応答を精密に制御している。本研究では、ホルモンが制御する代謝物や代謝経路を網羅的に明らかにするために、代表的な7つの植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ジャスモン酸、ブラシノステロイド）について、シロイヌナズナのホルモン生合成やシグナル伝達の異常が報告されている28変異体を収集し、トランスクリプトームおよびメタボローム解析を行った。
シロイヌナズナを1/2MS培地で生育させ、マイクロアレイによる遺伝子発現量データおよびLC-Q-TOF/MS、GC-TOF/MS、LCMS-IT-TOF/MS、CE-TOF/MSによる代謝物プロファイルデータを取得した。各変異体は野生型と比較し、トランスクリプトーム、メタボロームデータによるプロファイリングを行った。また、植物ホルモンが制御する代謝経路を明らかにするため、変動しているホルモンや表現型で変異体を分類し、各グループに共通した遺伝子発現や代謝物の蓄積傾向を明らかにした。さらに、本研究で取得した大規模なオミクスデータを用いて遺伝子と代謝物の共発現解析を行い、ホルモン変異体で協調的な蓄積パターンを示す遺伝子と代謝物を調べた。本発表では、これらの解析で得られた新しい知見について報告する。

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Raphanusanin (Ra) is a light-induced growth inhibitor involved in the inhibition of hypocotyl growth in response to unilateral blue-light illumination in radish seedlings.
Knowledge of the roles of Ra still remains elusive. To understand the roles of Ra and its functional coupling to light signaling, we constructed the Ra-induced gene library using the Suppression Subtractive Hybridisation (SSH) technique and present a comparative investigation of gene regulation in radish seedlings in response to short-term Ra and blue-light exposure. The comparative analysis showed that, among the transcriptional profiles of 33 highly Ra-inducible genes, 25 ESTs were commonly regulated by different intensities and duration of blue-light irradiation. The transcriptional profiles, coupled with the transcriptional regulation of early blue light, have provided the functional roles of many genes expected to be involved in the light-mediated defence mechanism. The biological role of Ra in plant resistance will be discussed.

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【目的】シロイヌナズナ( Arabidopsis thaliana )から単離された新規オキシリピンArabidopside A～Gは、傷害や感染応答に関与することが明らかになっている。一方、傷害や感染応答時には、膜脂質由来の不飽和脂肪酸から生合成されるC6化合物が直ちに放出され、植物の防御応答に関与することが報告されている。そこで本研究では、C6化合物がArabidopside類の生成に及ぼす影響について調べる目的で実験を行った。
【方法】4週間育てたシロイヌナズナ植物体を trans -2-hexenal等のC6化合物で処理し、植物体に含まれるArabidopside類の内生量をHPLCを用いて定量した。また、ジャスモン酸(JA)シグナリングおよび生合成酵素の欠損変異株についても同様の方法で内生量を比較した。
【結果】C6化合物処理したシロイヌナズナでは、Arabidopside類の内生量が急激に増加すること、C6化合物の構造の違いによって経時的な増減パターンが異なることが明らかとなった。また、変異体におけるArabidopside類の内生量を比較した結果、いくつかの欠損変異株ではArabidopside類が検出できなかった。本発表では、これらの結果とともにJAの生合成経路とArabidopside類の関連についても報告する。

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We performed proteome analyses on the pod husk of cacao (Theobroma cacao), a tropical tree which is cultivated primarily for its beans for making chocolate. Protein identification was done by de novo sequence similarity data searching approach due to incomplete genome database. Easy and yet unambiguous interpretation of MALDI-TOF PSD spectra was achieved with the aid of N-terminal sulfonation of tryptic peptides using 4-sulfophenyl isothiocyanate. Currently, we have identified 51 proteins from 89 major proteins analyzed. We also performed differential proteome analyses between two cacao clones, LAFI7 and ICS39. LAFI7 is a resistant clone against Conopomorpha cramerella, the most destructive insect pest of cacao in South-East Asian countries, while ICS39 is the most susceptible clone. Several spots in 2-DE have been found to be differentially expressed, specifically, L212 (24.7 kDa/6.3) in LAFI7 and i212 (21.4 kDa/6.4) in ICS39. We successfully de novo sequenced four tryptic peptides that are shared by both proteins. Database searches show that L212 and i212 have strong similarity to ASR proteins.

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樹木がまだ若い時期にひし形金網のフェンスを通り抜け、その後の肥大成長によって樹幹が網目のサイズより大きくなり、ついに金網を飲み込むようにしながら成長を続ける様子はしばしば目撃される。しかしこのような樹幹に関する詳しい研究は未だないようである。われわれはこのような部分を含む切り株（アキニレ）を入手した。直径は約25cmで、幹と金網の面との角度は約38°であった。まず、1）X線写真では、幹の内部の金網はまったく失われたり腐食されたりしておらず、木は表皮の切断と再結合を繰り返しながらフェンスの針金を飲み込むように成長したことが初めて確認された。2）X線CT法によって、金網の面に直角の方向から1mm間隔で撮影した断層写真では、針金を飲み込んだあとの年輪の乱れとその数年後の回復の様子が示された。3）機械工学の手法である「3点曲げ試験法」により、最初に金網を通り抜けた幹がフェンスの針金（（JIS G 3543V-GS2）を変形させるのに発揮した力は、表皮が切断され始めた時点で最大約190 N (19.4 kg重)、それまでの変形に要した仕事量は約2.3 Jと推定された。

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シロイヌナズナの側根は発生後しばらく傾斜した方向へ伸長するが、その後下方へ伸長する。演者らは、突然変異体hy5でこの転換が遅れていることに着目し、側根の伸長方向の制御機構を解析した。まず、側根の伸長方向が傾斜重力屈性によることを確かめるため、根系を90度回転させた後の側根の伸長方向の経時変化を測定した。これに、屈曲速度が重力の放射軸外側への成分と頂端側への成分の線型結合に依存するとする数理モデルがあてはまることを見出した。このモデルを用いて根が維持しようとする伸長方向(GSA)を推定し、野生型とhy5の側根の伸長方向の違いが根の伸長に伴うGSAの減少の遅れによることを明らかにした。側根の伸長方向とオーキシン信号伝達との関係を解析するためアンチオーキシンを与えると、hy5と野生型の側根はより下方へ伸長した。一方、長さや伸長方向によって根端のオーキシン濃度に有意な差はなかった。側根の伸長とともに未知の因子がオーキシン応答性を弱めることで下方への伸長を誘導していると考えられる。最後に、側根の伸長方向を制御する分子機構を明らかにするため、hy5の抑制突然変異体を探索し、FtsH11を原因遺伝子の候補として同定した。FtsH11は葉緑体とミトコンドリアに局在する膜結合型金属タンパク質分解酵素であり、コルメラで働いているとすると、アミロプラストと細胞内構造の相互作用に関わっていると考えられる。

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植物は、重力・水分・光などの複数の環境刺激を感受し、これらの情報を統合して根や茎などの伸長方向を変え、生存に有利な環境に器官を伸長させる。これまで、我々はエンドウ、キュウリ、シロイヌナズナなどを用いた研究により、根の重力屈性は水分屈性に干渉することを明らかにしてきた。本研究では、重力屈性が水分屈性に干渉する機構を明らかにすることを目的として、浸透圧の異なる寒天培地を張合わせて水分勾配刺激を根に与える実験系を用いて、シロイヌナズナの重力屈性が異常な突然変異体の根の水分屈性を解析した。オーキシン誘導性遺伝子の転写の抑制因子をコードしているAXR2/IAA7の機能獲得型突然変異体であるaxr2突然変異体、およびオーキシン受容体を欠損したtir1 afb1 afb2 afb3四重突然変異体の根では、正常な水分屈性の発現が認められなかった。したがって、重力屈性と水分屈性の発現にはオーキシン応答が必要であることが示された。一方、細胞内へオーキシンを取込むキャリアを欠損したaux1突然変異体では、水分勾配刺激を与えて6時間から24時間後までの屈曲角度は野生型に比べて有意に増加した。したがって、両屈性は細胞内のオーキシン量を介して干渉している可能性が示唆された。

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シロイヌナズナ花茎の重力屈性に関しては変異体解析により多くの関連因子が単離されているが、胚軸及び花茎で内皮アミロプラストの沈降方向を感受する分子や重力感受以降のシグナル伝達に関しての詳細は不明である。MSG2/IAA19はオーキシン応答に関わる転写抑制因子である。IAA19の発現調節因子を単離する目的で、IAA19promoter::NLS-GFPと IAA19promoter::GUSを保持する形質転換シロイヌナズナをEMS処理し、その次世代集団をスクリーニングして、GFPシグナルが減少する突然変異体A78を得た。IAA19の発現低下は、定量的PCR法によっても確認されたが、そのオーキシン応答性は保たれていた。A78は花茎が垂直上方に成長できず、既知の負の重力応答変異体eal1（Fujihira et al. 2000）と類似した表現型を示したが、eal1で観察された内皮アミロプラストの形成不全はA78では起こっていなかった。ポジショナルクローニング法、及びT-DNA挿入変異体との相補性試験により、A78の表現型は機能未知の新規遺伝子AT5G14090上のナンセンス変異により生じたことが判明した。また、この遺伝子に一つ存在するパラログAT3G27025のT-DNA挿入変異体は葉柄が捩れる表現型異常を示した。

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発芽直後のキュウリ芽生えは、重力刺激に応答し、胚軸と根の境界領域にペグと呼ばれる突起を形成する。すなわち、種子を垂直に置いて発芽させると境界領域の両側に2つのペグを形成するが、種子を水平置きにして発芽させると境界領域の下側にのみ1つのペグを形成する。我々はこれまで、ペグ形成はオーキシンにより誘導されること、水平置き芽生えでは境界領域の上側でオーキシン濃度が減少することで、ペグ形成が抑制されること、さらに、オーキシン排出阻害剤TIBAを用いた解析から、境界領域の上下におけるオーキシンの濃度勾配の形成には、オーキシン排出キャリアが関与している可能性を見出した。そこで本研究では胚軸と根の境界領域の重力感受細胞である内皮細胞において発現するオーキシン排出キャリアCsPIN1の局在パターンを免疫組織化学的に解析した。その結果、垂直置き芽生えでは、左右両側のペグ形成部位におけるCsPIN1の局在パターンが対称であったのに対し、水平置き芽生えでは非対称で、CsPIN1はペグ形成が抑制される境界領域上側の内皮細胞下側の細胞膜上に局在していた。このことより、内皮において発現するCsPIN1の膜局在が重力刺激によって制御され、境界領域上側では内皮細胞内からより多くのオーキシンが排出されることでオーキシン量が減少し、上側でのペグ形成を抑制する可能性が示唆された。

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光化学系タンパク質複合体（PS）が光環境変化に適応するための機構の一つとして，ステート遷移が知られている．これまでに，我々はステート遷移の実態を明らかにするため，緑藻クラミドモナスを用いて，PSIの精製と生化学的解析を行い，LHCIIがステート2状態でPSIに結合していることを明らかにしてきた（PNAS, 2006年）．本研究では，より無傷のタンパク質超複合体を得るため，界面活性剤トリデシルマルトシドを使い，ショ糖密度勾配による精製を試みた．その結果，得られた精製産物には，PSI, LHCI, LHCIIに加えて, Cyt b₆f, FNR,そして PGRL1が含まれていることがウェスタンおよびMS解析により明らかになった．ゲルろ過などの解析によって，得られた精製産物が一つのタンパク質超複合体であることが示唆された．野生型の他，3種類の変異体（PSI-His変異体，PSI欠損株，Cyt b₆f欠損株）の解析も，野生型でのタンパク質超複合体の存在を支持した．本研究で初めて結合が示されたCyt b₆f, FNR, PGRL1は，サイクリック電子伝達に必須との報告があり，今回得られた新規タンパク質超複合体上においてサイクリック電子伝達が行われている可能性は高い．本演題では，この新規タンパク質超複合体の生化学的解析について報告し，次の演題でサイクリック電子伝達の活性測定について報告する．

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光合成電子伝達系の二つの反応中心（PSI、PSII）の励起バランスを調節するステート遷移と、PSIIを介さずにPSI単独で循環的な電子伝達を行うサイクリック電子伝達は共に光合成を制御する環境応答機構として重要である。緑藻クラミドモナスにおいてステート遷移とサイクリック電子伝達活性の間に相関があることは以前から示唆されていたが、我々の最新の生化学的解析結果により、ステート2誘導によりCytb₆fおよびFNRを含むサイクリック電子伝達経路の構成要素がPSIと超複合体を形成することが明らかとなった（前演題）。本研究では，分光学的手法を用い，このPSI-Cytb₆f-FNRタンパク質超複合体の電子伝達活性をinvitroで確認すると共に、in vivoにおける超複合体の形成過程を検討した。単離したPSIタンパク質超複合体はプラストシアニン、フェレドキシンの存在下でPSIの光励起によりルーメン側及びストロマ側の電子伝達活性を示し、サイクリック電子伝達活性を保持していることが確認された。またin vivo実験により、ステート遷移に伴うPSIIからPSIへのアンテナの移動がサイクリック電子伝達の活性化に先行して起こることが示された。これらの結果から、ステート遷移に伴うPSI-Cytb₆f-FNRタンパク質超複合体の形成がサイクリック電子伝達を制御していることが示唆される。

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