マメ科植物の根には、根粒菌による窒素固定共生系とアーバスキュラー菌根菌による菌根共生系が見出される。2つの共生系の有り様は異なるが、それぞれの共生初期過程は共通の宿主遺伝子を介したシグナル伝達経路（common symbiosis pathway：CSP）により制御されている。共生菌の感染シグナル分子を受容した根毛細胞ではCa2+ シグナルが誘導される。CSPの中核的因子であるCCaMK（Calcium Calmodulin-dependent protein kinase）は、この共生特異的Ca2+ シグナル依存的に活性化すると考えられるが、その詳細な機構は不明である。根粒菌及び菌根菌との共生初期過程におけるCCaMKの活性化機構の解明を目的として、我々はCCaMKの機能ドメイン（EFハンド、CaM結合ドメイン）の欠失、及び、ドメインへの点変異導入による変異型CCaMKコンストラクトを作成し、ccamk-3変異体への相補実験による変異型CCaMKの機能解析を行った。本発表では、根粒菌・菌根菌感染過程におけるCCaMKの活性化モデルとその差異について紹介する。

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マメ科植物－根粒菌の共生では、土壌中の根粒菌を根粒内に導くための感染経路を構築する「感染糸形成」と、根の皮層細胞分裂によって始まる「根粒器官形成」の両プログラムが同調的に進行することにより、窒素固定の場となる根粒が形成される。
近年、マメ科モデル植物ミヤコグサより、根粒菌との共生に必須な遺伝子が単離されている。これらの共生遺伝子は、表皮における「感染糸形成」、皮層における「根粒器官形成」の両局面において重要な役割を果たすと考えられているが、各過程における共生遺伝子の機能様式の詳細を明らかにするためには表皮および皮層の分離解析系が不可欠であった。
我々は、表皮と皮層の分離解析を可能にする「表皮特異的発現系」の確立を目指し、シロイヌナズナ根毛細胞で特異的に発現するExpansin遺伝子、AtEXPA7およびAtEXPA18遺伝子のミヤコグサホモログを単離し、表皮特異的発現を規定する特徴的なシス配列を含む領域を表皮発現プロモーター候補とし、ミヤコグサ根表皮において、表皮特異的な発現を示すプロモーター領域を選定した。同プロモーターを用いて構築したミヤコグサ表皮特異的発現系を用いて、様々な共生遺伝子の変異体について相補性試験を行うことにより、当該遺伝子の「感染糸形成」過程への関与について検証した。解析結果を基に、根粒菌感染初期過程を制御する共生遺伝子の機能様式について議論する。

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高等植物の根には菌根共生系と根粒窒素固定共生系の2つの共生系が見出される。そして、それら菌根菌と陸上植物との共生、根粒菌とマメ科植物との共生は、その初期過程において共通の植物側因子によって支配されている。それは、細胞内カルシウム濃度の周期変動であるカルシウムスパイキングを中心とした、微生物シグナルの受容から共生遺伝子発現に至る植物細胞内シグナル伝達経路の構成因子であり、近年のマメ科モデル植物を用いた研究により、そのシグナル伝達経路に関わる構成因子がつぎつぎに明らかになっている。その結果、マメ科植物は菌根菌と根粒菌に対し同じシグナル伝達構成因子 (common sym) を使い回していることが明らかになってきた。さらに、非マメ科植物であり根粒菌との共生能を持たないイネにおいても、common symが菌根菌共生に必須であり、それらイネの菌根菌共生因子である遺伝子群は、マメ科植物における菌根菌、根粒菌との共生能を機能的に相補することもわかってきた。
本発表では、イネとミヤコグサのcommon sym下流に位置する根粒菌共生特異的な遺伝子群の比較解析を通して、その機能的な保存性について報告する予定である。

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感染糸は、根粒菌が感染した根毛に形成される管状の構造で植物細胞に由来する。根粒菌はこの管状構造を通って皮層内部へ侵入し根粒を形成する。ミヤコグサalb1変異体は感染糸の伸長が抑制され、皮層への感染糸の侵入も起こらない。ALB1遺伝子がロイシンリッチリピートを細胞外ドメインに持つ受容体キナーゼ様タンパク質をコードすることを前大会で報告した。ALB1のキナーゼドメイン（KD）は活性に重要なアミノ酸残基に置換があることから、構造的にはキナーゼ活性を持たないと予測された。今回、大腸菌で発現させたALB1のKDを用いてin vitroリン酸化反応を行ったが、タンパク質リン酸化活性は検出されなかった。さらに、ATP結合部位に変異を導入してキナーゼ活性を積極的に欠失させた変異型ALB1は、野生型ALB1と同様にalb1変異体の表現型を抑圧した。これらの結果から、ALB1の機能にリン酸化活性は必要ないと結論づけた。しかし、KDを欠除したALB1はalb1表現型を抑圧しないことから、KDはALB1の機能に必須な構造であると考えられる。また、ALB1-GFP融合タンパク質を用いて細胞内局在を観察した結果、ALB1は感染糸の原形質膜に局在することが分かった。以上の結果から、ALB1は感染糸膜に局在し、キナーゼ活性非依存的に感染糸の形成を正に制御していると考えられる。

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マメ科植物は根粒菌との共生窒素固定によって、大気中の窒素を栄養源として活用できることが広く知られている。この共生が成立するためには、グラム陰性菌である根粒菌の表層に存在するリポ多糖（LPS）が関与していることが分かり始めており、マメ科植物と根粒菌の共生系を理解する上で、植物のLPS認識機構の解明が重要である。しかし、植物のLPS認識機構に関する知見は少ない。そこで、動物の免疫系でLPSと結合活性があると報告されているリポ多糖結合性タンパク質（LBP）に注目した。動物のLBPはLPSと結合し、単球/マクロファージ上に存在するCD14（LPS受容体）へのLPS結合を促進させることで、免疫応答を増強する。菌体成分であるフラジェリンの受容体などは動植物に共通して存在することから、植物に動物LBPのオルソログが存在することは十分に考えられる。モデルマメ科植物であるミヤコグサのゲノム上にLjLBP遺伝子と予想される4遺伝子（LjLBP1, 2, 3, 4）を同定した。本研究では、ミヤコグサ－根粒菌共生系でのLjLBPの機能解明に向け、LjLBPのLPS結合活性とLjLBP遺伝子の発現を解析した。また、LjLBPの各種形質転換毛状根に着生した根粒の形態観察結果も合わせて報告する。

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フランキアは窒素固定を行う放線菌であり、アクチノリザルと呼ばれる植物の根に共生し、根粒を形成する。アクチノリザル植物は8科にわたる植物種を含み、そのほとんどは樹木である。我々はマイクロアレイを用いて、窒素栄養を含む培地で単生培養を行ったFrankia alniの細胞と、宿主植物Alnus glutinosaの根粒中の細胞においてトランスクリプトーム解析を行った。根粒中で発現が誘導された遺伝子の多くは他のフランキア株と高いシンテニーを示す領域に位置していた。一方、根粒中で発現が抑制された遺伝子は、ゲノム全体に分布していた。既知の共生関連遺伝子（nif、hup2、suf、shc）の多くは根粒中で高い発現を示した。アンモニアの同化と輸送に関わる遺伝子は緻密な発現制御を受けており、フランキア細胞内でのアンモニア同化を制限していることが示唆された。転写制御やシグナル伝達、タンパク質輸送、細胞表層多糖の生合成などに関わる遺伝子の発現変動も観察され、これらの遺伝子の共生への関与が示唆された。根粒内での発現パターンは遠縁の宿主植物でも非常に似通っていた。根粒菌のトランスクリプトーム解析との比較により、フランキアは根粒内でエネルギー代謝や翻訳に関わる遺伝子を数多く活性化していることが見出された。この結果から、フランキアは植物細胞内においてより自律性を保っていることが示唆された。

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青枯病菌(Ralstonia solanacearum)は、根から植物に侵入し、導管内を移動・増殖しながら閉塞させることで植物を枯死させる病原細菌である。本研究では、GFP標識した青枯病菌の動態を観察し、植物内での移動・拡散様式の解析、及び青枯病菌に感染するバクテリオファージが植物に及ぼす影響について解析した。当研究室において、青枯病菌に感染する線状バクテリオファージφRSS1のゲノムを改変し、プラスミドベクター化することに成功している(pRSS11)。pRSS11は薬剤選抜を行わなくても菌体内で安定に保持され、植物体内で菌の解析に好適である。R. solanacearumをGFPで標識し、モニタリング用の菌株として確立した。青枯病菌感受性のトマトの品種である大型福寿の幼植物では根端からシュートまで、短時間で菌の移動・増殖が確認された。耐性のトマト品種であるB-バリアでは、根における菌の増殖は確認されたが、茎の中での増殖は抑制された。蛍光標識したファージφRSS1を感染させたR. solanacearumを用いて植物体内での菌の追跡を行ったところ、プラスミド標識と同様の移動様式が観察された。興味深い事に、φRSS1を感染させたR. solanacearumが感染した植物では、側根に類似の器官が根に誘導された。この側根様の器官の起源について現在解析している。

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植物生育促進菌類であるPenicillium simplicissimum GP17-2株は、植物根と共培養することで植物に生育促進効果をもたらす。また、GP17-2株の培養濾液はシロイヌナズナに全身的抵抗性（ISR）を誘導する。ISRには、サリチル酸、ジャスモン酸、あるいはエチレンなどの植物ホルモンを介したシグナル伝達経路が関与している。我々は、GP17-2株の培養濾液応答のマイクロアレイ解析を行った。シロイヌナズナでは現在までに、ストレス応答性、病害虫応答性、植物ホルモン応答性、栄養応答性などの遺伝子発現のマイクロアレイ解析のデータが公開されている。その中で、ISRと深く関わっている病害応答、植物ホルモン応答、過酸化水素応答ならびに傷応答とGP17-2株の培養濾液応答のマイクロアレイデータの比較解析を行った。その結果、GP17-2株の培養濾液応答はアブシジン酸応答と最も近い関係にあった。植物の先天的な免疫機構の一つとして病原菌感染時における気孔閉鎖誘導があり、気孔閉鎖誘導にはアブシジン酸を介したシグナル伝達が関係することが知られている。GP17-2株の培養濾液を根に浸漬処理した後、地上部に病原菌を接種したシロイヌナズナにおける気孔口径を調べたところ、気孔閉鎖が顕著に誘導された。この結果より、GP17-2株の培養濾液によるISRには気孔閉鎖誘導が関与することが示唆された。

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我々は東アジア、東南アジアに発生する8種のウイルス（RDV, RRSV, RBSDV (以上dsRNA), RSV, RGSV, RTYV (以上ss-RNA), RTSV (ss+RNA), RTBV(dsDNA)）感染による宿主遺伝子のトランスクリプトーム解析を行っている。感染後の病徴が激しいのはRDV, RSVであり、逆に病徴が殆ど観察されないのはRTYV, RTSVであった。発現が変化する遺伝子の数は病徴の激しさと良く相関していた。遺伝子と代謝経路、転写・翻訳・修飾関連、転写因子のファミリー、ホルモン合成・応答系といった観点から整理すると、細胞周期関連の遺伝子はウイルス感染後、ほぼ全てのケースで発現が抑制されているが中でもG2=>Mに関与するサイクリンBタンパク質の遺伝子発現が抑制されていた。転写因子ではストレス、防御応答に関与すると思われるAP2-EREBP, Tify, WRKYなどの転写因子がウイルス感染後活発に動いており、WRKY遺伝子群の場合ウイルスの種類と、その挙動から新たに3つのサブファミリーに分けられることが明らかとなった。IRRIとの共同研究でRTSV, RTBV感染に感受性の宿主TN1と抵抗性の宿主TW16を用いて解析を行っている。両宿主間での比較解析結果も報告する。

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病原体に攻撃された植物は、基本免疫応答を発動する。例えば、気孔は病原菌が感染する際の主要な侵入経路であるが、植物は病原体を認識すると素早く気孔を閉じてその侵入を阻止する。植物は、病原体に保存された分子パターン(MAMPs)を細胞膜上のレセプターでまず認識し、続いて活性酸素種(ROS)、一酸化窒素(NO)、ABAなどを介して、気孔閉鎖を起こすと考えられている。葉緑体はROSやABAの生成に深く関係するオルガネラであるが、基本免疫応答における役割はよくわかっていない。我々は，MAMPの一種であるflg22やキチン等のエリシターが、葉緑体ストロマCa2+濃度の一過的上昇を数分内に引き起こす事を見いだした（小森他 2009年度植物生理学会年会）。これは葉緑体が非常に早い段階で細胞外の病原体の存在を認識できる事を意味する。本研究では、葉緑体局在Ca2+結合タンパク質CASに注目し、MAMP誘導の気孔閉鎖と防御関連遺伝子群の発現応答における葉緑体タンパク質CAS の役割を評価した。その結果、cas変異体では、MAMP誘導の気孔閉鎖が大きく抑制される事、更にPR-1等の防御関連遺伝子の発現が異常になる事を見いだした。これらの事実は、葉緑体が気孔閉鎖などのMAMP誘導の基本免疫応答に重要な役割を果たしている事を示唆している。

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MAPKカスケードは真核生物に広く保存されているシグナル伝達系の一つである。植物でも、環境ストレスや病原菌応答、ホルモンシグナル、細胞分裂のシグナル伝達において、重要な役割を果たす事が報告されている。シロイヌナズナにはMAPKが20遺伝子存在し、4つのグループ(A-D)に分類される。中でもグループDはもっとも大きいサブグループを形成する。グループDのMAPKは、MAPKKによるリン酸化部位が植物にしか存在しないTDYモチーフを持ち、C末端が長いという特徴的配列を持つ。本研究では、グループDの一つであるMPK8に着目して解析を行っている。酵母mpk1変異株を用いた解析から、MPK8がMAPK活性を持つことを明らかとした。またYeast two-hybrid、BiFC assay、in tube assayの結果からMPK8はカルモジュリン(CaM)と特異的に結合し、カルシウム依存的に活性化されることを明らかとした。さらにCaMによるMPK8の活性化には、TDYのリン酸化は関与しないことをin vitroにおいて示した。一方、MPK8は既存のMAPKKであるMKK3によっても活性化され、CaM,MKK3-MPK8は傷害シグナルに関与することも明らかとした。CaMとMKK3の両方で活性化されるMPK8の制御機構について議論する。

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植物の食害防御シグナル伝達系においては植物細胞内のカルシウムのダイナミックスが初期シグナルとして重要な役割を担うことが示唆されつつある。本研究では、昆虫の食害によって活性されるカルシウム依存性タンパク質リン酸化酵素（Calcium-Dependent Protein Kinase: CPK）とCPKと相互作用する転写制御系に着目し、それらのシグナル伝達系を介した遺伝子転写制御機構の解明を試みた。
シロイヌナズナCPK遺伝子のT-DNA挿入変異体を取得し、ヨトウガ幼虫に被食された変異体における防御遺伝子の発現誘導を解析した。19系統の変異体の中でCPK3とCPK13の変異体は、野生株と比べ、防御遺伝子PDF1.2の発現誘導が著しく抑制されていた。コムギ無細胞タンパク質合成系を用いて作成された植物転写因子ライブラリーから、CDPKによりリン酸化される基質ターゲットに探索した結果、CPK3とCPK13がHsfB2aなどの転写制御因子に対してリン酸化活性を示した。また、CPK3あるいはCPK13を植物にHsfB2aと一過的に共発現することにより、PDF1.2の転写制御は促進された。しかし、シロイヌナズナの高温ストレス応答においてHsfB2aは抑制因子として機能したことから、CPK-HsfB2aの相互作用は食害ストレスと高温ストレスでは異なるメカニズムにより機能することが示唆された。

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タバコモザイクウイルス（TMV）抵抗性遺伝子Nを有するタバコ（NNタバコ）は、TMVに対して抵抗性を示す。我々は、TMV抵抗性に果たすWIPKとSIPKの役割の解明を目的として、RNAiにより両MAPKを抑制した形質転換NNタバコ（WIPK/SIPK抑制NNタバコ）を作出した。前本学会において、WIPK/SIPK抑制NNタバコのTMV接種葉におけるTMV量は減少する（つまり、TMV増殖に対する抵抗性が増大する）ことを報告した。そこで今回、WIPKとSIPKによるTMV増殖の制御機構の解析を行ったので報告する。
まず、TMV増殖制御に抵抗性遺伝子Nが必要か否かを、Nを持たないタバコ（nnタバコ）を用いて検証した。WIPK/SIPK抑制nnタバコでは、接種葉におけるTMV量は非抑制体と同程度であった。次に、WIPK/SIPK抑制NNタバコのTMV接種葉では、非抑制体と比較して高レベルのサリチル酸（SA）が蓄積することから、TMV増殖抑制におけるSAの関与を調べた。WIPK/SIPK抑制NNタバコにSA加水分解酵素をコードするNahGを導入してSA蓄積を抑制すると、接種葉におけるTMV増殖抑制が部分的に打破された。以上の結果から、野生型タバコではN遺伝子の下流で活性化されるWIPKとSIPKによってSAの蓄積が抑制されることにより、感染部位でのTMV増殖が促進されると示唆された。

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昆虫による食害は、干ばつなどの環境要因、病原菌などによって引き起こされる病害と並び、植物の生育を脅かす重大な要因の一つである。近年、植物のストレス応答に植物ホルモンが深く関わっていることが分子レベルで明らかになり、その重要性が再認識されるに至っている。我々はシロイヌナズナと食害様式が全くことなる2種類の微小害虫、ミカンキイロアザミウマ（Frankliniella occidentalis）、マメハモグリバエ（Liriomyza trifolii）を用いて、植物の虫害応答に植物ホルモンがどのように関わっているのか解析を行なっている。ミカンキイロアザミウマ、及び、マメハモグリバエは共に広範囲な野菜やそして花等を加害する難防除害虫として知られている。世界的に施設栽培で特に問題となっており、その防除法の開発が切望されている。
本年会では、ミカンキイロアザミウマあるいはマメハモグリバエの食害を受けたシロイヌナズナにおける遺伝子発現レベルでの応答性の違いについて防御応答に関わるジャスモン酸、エチレン、サリチル酸に着目して発表すると共に、ジャスモン酸によって制御されている防御応答と害虫の繁殖や行動との関わりについても報告する。

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植食者の被害を受けた植物からは健全株とは異なるブレンドの揮発性物質が放散されるという現象が様々な植物種で知られている。被害植物特異的な匂いブレンドは、植食者の天敵を誘引する機能があることが知られている。さらに被害植物の周囲に生育している健全植物が、その匂いブレンドを受容することによって植食者に対する誘導防衛反応を示す例が報告されている。これは被害植物由来の匂いブレンドを介した植物間コミュニケーションと位置づけられる。しかし、受容植物における防衛の物質的基盤に関する研究はほとんどない。本研究では健全トマト株にハスモンヨトウ食害トマト株が放散する揮発性物質を曝露し、その後の曝露植物でのハスモンヨトウ食害抵抗性と葉の代謝物を調べた。食害量の指標として、今回はハスモンヨトウ2齢幼虫の24時間での体重増加を測定した。その結果、健全植物からの匂いを曝露したコントロール株の葉を食べたハスモンヨトウと比較して、被害植物からの匂いを曝露した株の葉を食べたハスモンヨトウの体重増加は有意に抑制されていた。続いて曝露植物での代謝変動を明らかにするために、LC-MS,GC-MSを用いたメタボローム分析を行った。その結果、曝露植物では配糖体様化合物が有意に蓄積していることが明らかになった。現在この配糖体様化合物を同定し、その生理・生化学的機能を明らかにするために、この化合物を単離・精製を行っている。

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アブラナ科野菜類炭疽病菌に感受性を示すCol-0と抵抗性を示すWs-0を交雑して得たF2植物を用いて、SSLPマーカーによるマッピングを行った結果、5番染色体下腕に R-遺伝子が存在することが示唆された。さらに、SNPが明らかにされた19エコタイプを用いたnatural variation解析の結果、炭疽病に対するR-遺伝子は青枯病菌に対応するR-遺伝子RRS1のアリルである可能性が示唆された。次いで、Ws-0のT-DNA挿入変異体ライブラリーから炭疽病感受性変異株を得、そのうち5変異体はRRS1にT-DNAまたは塩基置換が認められた。これに対して、1つの変異体は RRS1に変異が存在せず、隣接するトマト斑葉細菌病菌(非病原力遺伝子AvrRps4を有する)に対応するR-遺伝子RPS4に5塩基の欠損が認められた。これら炭疽病感受性変異株について、青枯病およびトマト斑葉細菌病に対する感受度検定を行った結果、両遺伝子が異なる3つの病原菌の認識に関与することが明らかとなった。さらに、rps4-21とrrs1-1変異体から2重変異体を作製し、3つの病原菌に対する感受度検定を行った結果、2つのR -遺伝子が協調して3種の異なる病原体を認識することが示唆された。

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シロイヌナズナのDREBは、シス因子DRE/CRTに結合し、乾燥・高温・低温などの環境ストレス応答性遺伝子の発現を制御している転写因子で、高度に保存されたAP2/ERFドメインを持っている。我々は食料や飼料として重要な作物であるダイズの環境ストレス耐性能を高めることを目的として、ダイズのDREB遺伝子の機能解析を行っている。
ダイズのDREB様遺伝子を探索するため、ダイズの植物体に乾燥、塩、低温ストレスを与え、オリゴマイクロアレイ解析を行った。同定されたストレス誘導性遺伝子の中からAP2/ERFドメインを有するタンパク質をコードする6個の新規のダイズDREB様遺伝子を見いだした。シロイヌナズナ葉肉細胞を用いたトランジェント発現解析により、このうち2つの遺伝子が転写活性化能を持つ転写因子をコードしていることが示され、これらをGmDREB1A、GmDREB2Aと名付けた。ダイズ茎細胞を用いたトランジェント発現解析を行った結果、この2つの転写因子はダイズ細胞中で核に局在し転写活性化能を持つことが示された。GmDREB2Aの植物中での機能を解析するため、シロイヌナズナ過剰発現体を作製し表現型を解析した。その結果、熱ストレス誘導性遺伝子の発現が上昇し、熱ストレス耐性能が向上していることが示唆された。現在、この過剰発現体を用いて、他の環境ストレスに対する表現型について解析を進めている。

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近年、SNF1-related protein kinase 2（SnRK2）と呼ばれる一連のプロテインキナーゼファミリーが植物の環境ストレス応答やABAシグナル応答に重要な役割を果たしていることが明らかになった。シロイヌナズナに10個あるSnRK2はIからIIIまで3つのsubclassに分類されるが、そのうち3個のsubclass III SnRK2については、ABAシグナル伝達の全般で重要な役割をしている事が明らかになった。一方で、他のsubclass のSnRK2に関する情報は限られている。そこで、本研究では2個のsubclass II SnRK2の機能を調べるために、SRK2C/SnRK2.8とSRK2F/SnRK2.9についてT-DNA挿入変異体を単離し、2重変異体（srk2cf）を作製した。乾燥処理におけるマイクロアレイ解析によりRD29Bを含む多くの乾燥ストレス誘導性遺伝子の発現がsrk2cfで野生型に比べて減少していた。これらのsrk2cfで発現が減少した遺伝子のほとんどは、ABA誘導性に分類される。ところが、これらの遺伝子のsrk2cfにおけるABA応答性は、野生型と比較して大差がなかった。したがって、subclass II SnRK2は乾燥ストレス応答に特異的なシグナル伝達に寄与しており、ABA依存的経路における働きは限定的であることがわかった。

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乾燥ストレスを受けると、植物細胞内のアブシシン酸（ABA）濃度が上昇し、それによって多数の乾燥ストレス応答性遺伝子の発現が誘導されると考えられている。ABA存在下では、ABA受容体であるPYR/PYL/RCARファミリータンパク質がグループA プロテインホスファターゼ2C（PP2C）と複合体を形成し、これによってPP2Cによる負の制御が解除されSnRK2プロテインキナーゼが活性化される。3個のSnRK2プロテインキナーゼ（SRK2D/SnRK2.2、SRK2E/SnRK2.6およびSRK2I/SnRK2.3）はAREB1などの多数の転写因子を正に制御し、また、AREB1などのAREB/ABF転写因子（AREB1/ABF2、AREB2/ABF4およびABF3）はABA応答（ABRE）配列を介して多数のABA/乾燥ストレス応答性遺伝子の発現を制御していることを示してきた。本研究では、ABA処理時に2種類の機能欠損三重変異体srk2d srk2e srk2iおよびareb1 areb2 abf3において野生型植物に比べて顕著に発現誘導が抑制されていたグループA PP2C遺伝子のうち、特に栄養成長期の野生型植物においてABA処理により強く発現誘導がみられた遺伝子をHAI（highly ABA-induced PP2C）1、HA12およびHAI3と名付けてその機能解析を行った。

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乾燥ストレス下の植物において、アブシジン酸（ABA）は細胞内シグナル伝達や多くの遺伝子の発現誘導、気孔の閉鎖、さらにストレス耐性の付与に重要な働きを行う植物ホルモンである。我々は、遺伝子発現のネットワーク解析に基づく共発現予測アルゴリズムを、野生型シロイヌナズナとABA合成関連遺伝子NCED3の欠損変異体（nc3-2）におけるトランスクリプトームデータに適用して、乾燥ストレス下の遺伝子間の相関関係について解析した。抽出され120の共発現グループ中、ストレス応答性遺伝子群が高い相関関係を結ぶグループに注目し、そのプロモーター上に共通に存在するモチーフの検索を行った。乾燥ストレスに応答して増加する遺伝子群が共発現したグループには、ABA応答性遺伝子が占めるグループとJA応答性遺伝子が占めるグループが存在した。ABA応答性遺伝子のプロモーター上には既存のシス配列ABREとG-boxが高い確率で存在し、新規のシス配列が存在する確率は低いことが示唆された。一方、JA応答性遺伝子が多く存在するグループのプロモーター上にも、ABREとG-boxが高い確率で存在したが、未知のモチーフも多く検出された。現在、乾燥ストレスに応答して減少する遺伝子群が共発現するグループに関しても同様の解析を行っており、新規の乾燥ストレス応答に関わる制御因子の探索を試みている。

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野生種スイカはカラハリ砂漠に自生する砂漠植物で、乾燥ストレスに対し強い耐性を示す。野生種スイカは乾燥ストレスを受けると一過的に根の成長を促進させ、根系が発達することが知られている。これは乾燥ストレス下において、土壌深部の水分を効果的に吸収するための応答であると考えられる。一方、野生種に比べて乾燥耐性能の劣る栽培種スイカではこの現象は見られない。このことから、乾燥ストレスに応答して根の成長を促進させる分子機構が、野生種スイカに特異的に存在すると考えられる。この分子機構に関与する遺伝子群を探索するために、マイクロアレイ解析により野生種と栽培種スイカの根における遺伝子発現プロファイルを比較した。その結果、8,069遺伝子の中から野生種において特異的に、乾燥ストレス時に発現量が上昇する79遺伝子を単離した。この遺伝子群の中には、zinc finger型やmyb型の転写因子が含まれていた。定量的PCR解析により、これらの転写因子は根の伸長促進に先駆けて発現が上昇することが見出された。これらの転写因子は、乾燥ストレスに応答して根の伸長促進を制御する分子機構に関与している可能性が示唆される。現在、野生種および栽培種スイカの毛状根を用いて、上記因子の機能解析を試みている。

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シトルリンは、活性酸素ヒドロキシルラジカルの消去に優れる適合溶質であり、乾燥強光耐性の野生種スイカにおいて、ストレス時の葉に高蓄積する。野生種スイカ葉の粗抽出液を用いたこれまでの解析により、シトルリン生合成の律速酵素と考えられるN-acetylglutamate kinase (AGK)の活性が、ストレス下の葉において上昇することが判明している。しかしながら、本酵素の構造や諸性質については不明であった。そこで、野生種スイカ葉よりAGKのcDNAを単離し配列を決定した。得られたCLAGKの予想アミノ酸配列は、シロイヌナズナ相同遺伝子のアミノ酸配列と79%の配列相同性を有していた。またCLAGKは、そのN末端領域に葉緑体移行シグナルと予想される付加配列を有していた。さらに、AGK触媒活性の制御因子と示唆されているP_IIタンパク質のcDNAを単離すると共に、ウェスタン解析によりその蓄積量を解析した。その結果、乾燥強光下の野生種スイカ葉において、CLP_IIタンパク質の蓄積量が顕著に増大することが判明した。現在、CLAGKの酵素学的諸性質とCLP_IIによる制御様式を解明するため、両者の組換体タンパク質を用いて生化学的特性を解析している。

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イネはグリシンベタイン(GB)をほとんど蓄積しないが、GB合成経路の最終段階を触媒する酵素であるベタインアルデヒド脱水素酵素（BADH）をコードする遺伝子のホモログを2つ持つ（OsBADH1およびOsBADH2）。イネのリコンビナントBADHタンパク質を作製し精製した酵素を用いたところ、OsBADH1がアセトアルデヒドを効率良く酸化することを発見したが、それに比べてOsBADH2の活性は極めて低かった。OsBADH1 mRNA蓄積量は冠水処理により減少したが、脱冠水処理により迅速に回復した。またGFP-OsBADH1融合タンパク質をタマネギ表皮細胞で発現させたところ、ペルオキシソームにおいてGFP蛍光が検出された。これらの結果から、OsBADH1はイネのペルオキシソームに局在し、カタラーゼにより生成されるアセトアルデヒドの酸化に関わることが示唆された。

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本研究ではイネのオゾンによる収量低下に関与する遺伝子座を同定する目的でササニシキとハバタキに由来する染色体断片置換系統群（CSSLs）を用いてQTL解析を行った。39系統のCSSLs及び両親品種を、外気区（平均オゾン濃度32ppb）及びオゾン添加区（平均オゾン濃度77ppb）において栽培した。QTL解析に先立ち親系統の解析を行った。葉のオゾンによる可視障害はササニシキでのみ観察することが出来た。また光合成速度、気孔コンダクタンス、蒸散速度の値に対するオゾン影響は見られなかった。登熟後、イネの収量を比較したところ、ハバタキにおいてオゾン暴露により精籾数が有為に低下していた。またオゾン暴露により桿長、一次枝梗数、登熟歩合、種子1000粒重がハバタキにおいて有為に低下していた。以上の結果、オゾン暴露によりハバタキにおいて収量が低下すること、その原因として桿長、一次枝梗数、登熟歩合及び種子1000粒重の減少の関与が示唆された。これらの要素のうち桿長、一次枝梗数ついてCSSL系統群を用いたQTL解析を行った。その結果、第6染色体上にハバタキの一次枝梗数の増加に関与し、オゾンによりその影響が現れなくなるQTLを同定することが出来た。現在、登熟歩合、種子1000粒重に関与するQTLの同定を行っているところである。本研究は環境省地球環境研究総合推進費（Ba-086）の一環として行われた。

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活性酸素種（ROS）はシグナリング因子として環境ストレス応答に必須の役割を担っている。高等植物において、主要なROSの発生源である葉緑体には、ストロマおよびチラコイド膜にアスコルビン酸ペルオキシダーゼ（sAPXおよびtAPX）が局在している。葉緑体型APXのH₂O₂を介した環境ストレス応答への関与を明らかにするため、tAPXおよびsAPXの遺伝子破壊シロイヌナズナ（KO-tAPX、KO-sAPX）を単離した。強光ストレス下において、両破壊株では野生株よりも顕著なH₂O₂の蓄積が見られたが、H₂O₂応答性遺伝子群の発現レベルは抑制されていた。よって、葉緑体由来のH₂O₂はそれらの遺伝子群の強光応答をネガティブに制御する可能性が示された。次に、エストロゲン誘導型RNAi法を用いてtAPX発現の一過的抑制系を構築した。通常条件下において、tAPX発現を一過的に抑制（36～48 hr）させたところ、葉緑体タンパク質の酸化損傷が認められた。さらに、マクロアレイを行ったところ、種々の植物ホルモン、耐病性および細胞死に関連する遺伝子群がtAPXの一過的抑制に応答した。よって、葉緑体型APXはH₂O₂を介した植物ホルモン／環境ストレス応答の制御因子であることが示唆された。現在、KO-tAPXにおけるH₂O₂応答性遺伝子発現への植物ホルモンの影響について解析している。

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当研究室では、シロイヌナズナから強光（HL）応答性のNAC転写因子(ANAC078)を単離した。これまでに形態形成や環境ストレス応答などに関与するいくつかのNAC遺伝子の報告があるが、ANAC078の機能は明らかではない。そこで、HL下におけるANAC078のターゲット遺伝子の同定を試みた。
マイクロアレイ解析により、HL下におけるANAC078過剰発現株（Ox-ANAC078）で野生株に比べ、フラボノイド生合成の制御因子であるPAP1,TT2,AtMYB4の発現が誘導されていた。これらの遺伝子のHL応答性を解析した結果、野生株に比べOx-ANAC078で顕著に高く、ANAC078ノックアウト株（KO-ANAC078）で低下していた。また、他のフラボノイド生合成制御因子の多くはPAP1,TT2,AtMYB4と同様の発現パターンを示した。さらに、これらのフラボノイド生合成制御因子の発現に伴い、生合成経路に関与する酵素遺伝子群の発現も変化していた。また、アントシアニン量は、野生株に比べOx-ANAC078では有意に増加しており、逆にKO-ANAC078では低下していた。以上のことから、ANAC078はHL下においてフラボノイド生合成制御因子の発現制御を介し、アントシアニン合成の制御に関与することが明らかになった。

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これまでに我々は強光応答性の熱ショック転写因子(HsfA2)を同定し、この因子が種々の酸化的ストレス応答・順応を制御するキーレギュレーターであることを明らかにした(Plant J. 2006)。本研究ではHsfA2の発現制御機構を解明するため、HsfA2プロモーターに存在するストレス応答性のシス配列と制御因子の同定を試みた。まず、種々の長さに切断したHsfA2プロモーターにルシフェラーゼ遺伝子を連結し、シロイヌナズナロゼッタ葉を用いた一過的レポーターアッセイを行なった。その結果、HsfA2の転写開始点から-191 bpから108 bpの領域の欠損で強光応答性のルシフェラーゼ活性の増加が顕著に抑制された。この領域にはHsfの認識配列である熱ショック配列(HSE)が存在していたことから、HsfA2は他のHsfに制御されていることが示唆された。そこで、転写活性化能を有する種々のクラスA Hsfキメラリプレッサー過剰発現株(CRES-T)を用いて、HsfA2の強光応答性の発現に及ぼす影響を解析したところ、HsfA1dおよびHsfA1eのCRES-T株のHsfA2の強光応答は著しく抑制されていた。現在、HsfA1dおよびHsfA1eのHSEを介したHsfA2の制御機構と、これらの欠損あるいは過剰発現が表現型に及ぼす影響を解析している。

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植物を環境基準濃度の二窒素酸化物（NO₂）を含む空気中で栽培（+NO₂）すると、NO₂を含まない空気中での栽培（-NO₂）に比べ、植物の生育やバイオマス量が顕著に増加する。このNO₂ の植物バイタリゼーション作用（Takahashi et al., New Phytologist 168:149-154, 2005）は、シロイヌナズナを含め各種植物種で認められた。この原因遺伝子を明らかにするために、シロイヌナズナのトランスクリプトーム解析を行った。本発表では、+NO₂で発現量が増加（2倍以上）する遺伝子の T-DNA 挿入変異体の解析結果について報告する。
T-DNA 挿入変異体を<5 ppb NO₂、22 ± 0.3^oC、相対湿度70 ± 4%、人工照明下（40 μmole photon m^-2 s^-1）、360 ppm CO₂の制御条件下で1週間栽培した後、NO₂を含む（50 ppb）または含まない（<5 ppb）空気中で3週間栽培した。その後、各個体のバイオマス量を測定し、バイタリゼーション指数を求めた。その結果、バイタリゼーションが消失した変異体（vita1）が見いだされた。この遺伝子についてさらに解析を進めるため、過剰発現および発現抑制した 35S:VITA1 および amiR-VITA1 植物を作出した。これらの植物の解析結果について報告する。

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温帯性植物の凍結耐性は、低温に一定期間曝されると増大する（低温馴化）。低温馴化機構は非常に複雑であるが、細胞膜の脂質組成変化が凍結耐性の増大と密接に関わっていることが明らかになっている。最近、我々は、細胞膜に存在するステロール脂質とスフィンゴ脂質に富んだマイクロドメインの脂質およびタンパク質組成が低温馴化に応答して大きく変動することを明らかにした（Minami et al., 2009）。本研究では、低温馴化に応答してマイクロドメイン画分で増加するダイナミン様タンパク質1E（DRP1E）に注目し、低温馴化過程における凍結耐性増大に関わる機能を解析した。DRP1Eはシロイヌナズナに16個存在するダイナミンファミリータンパク質の一つであり、その転写産物量も低温馴化過程で増大する。DRP1E::GFP過剰発現体を用いてDRP1Eの細胞内分布を調べたところ、細胞膜付近にパッチ上に分布する様子が観察された。さらに、drp1e T-DNA 挿入変異体の凍結耐性を調べたところ、野生株と比較して低温馴化能力が有意に小さくなっていることが明らかになった。また、低温馴化後の細胞膜タンパク質組成についても、野生型とdrp1e T-DNA 挿入変異体の間で相違が観察された。以上の結果は、DRP1Eは低温馴化過程における凍結耐性増大に必要な細胞膜の改変に関与していることを示唆している。

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越冬性植物は低温馴化過程において高度な耐凍性を獲得する．越冬後，植物は脱馴化と呼ばれる過程で耐凍性を解除し，生長を再開する．脱馴化過程は馴化過程と比較して短期間で起こる早い応答であり，そのメカニズム解明は植物の生長・発達を理解する上で重要である．しかし，脱馴化の分子メカニズムについては不明な部分が多い．そこで本研究では脱馴化メカニズムを解明するために，翻訳調節機構に着目し，RNAマスキング機構の探索と機能解明を目指した．RNAマスキングとは翻訳抑制によりmRNAを保持し，刺激により翻訳を開始する制御である．まず，RNAマスキングのターゲットを探索・同定するために，低温馴化時及び脱馴化時における遺伝子，タンパク質発現の比較解析をマイクロアレイ，2D-DIGEを用いて行った．ターゲットmRNAは、低温馴化時に転写されるが翻訳されずにmRNAの状態で保持され，脱馴化時に即座に翻訳されるものと考えられる．そこで，脱馴化特異的に発現量の増加するタンパク質の中から、対応するmRNAの発現パターンがタンパク質のそれと一致しないものを選抜した．その結果，幾つかのRNAマスキングのターゲット候補を見いだし，その中には1次代謝に関与するものが含まれていた．これは，植物が脱馴化時に生長・発達に必要なエネルギーの供給を即座に再開するシステムを有し，それが翻訳レベルで制御されていることを示唆している．

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ヒルムシロ属（ヒルムシロ科：単子葉類）はアマモ科の姉妹群で，水生の被子植物のなかで最も大きな群のひとつである．淡水域に分布するササバモは表現型可塑性を持ち，水中でも陸上でも生育できる．一方，その近縁種で淡水から汽水域に分布するヒロハノエビモは水中でしか生育できない．栽培実験より，これら2種では高温に対する耐性が異なり，ヒロハノエビモは高温馴化の能力がないことが明らかとなった．
熱ショック転写因子HsfA2はシロイヌナズナHsf遺伝子のうち最も強く高温ストレスで発現し，高温耐性(basal thermotolerance)および馴化による誘導耐熱性(acquired thermotolerance) の獲得に重要な働きをしている．ササバモとヒロハノエビモにおいてこの遺伝子を単離したところ，HsfA2aとHsfA2bの2種類が存在した．熱処理によってHsfA2aは両種で強く発現したが，HsfA2bの発現の有無には種差が見られた．ヒロハノエビモHsfA2bが発現しないのは，熱ショックエレメント（HSE）の配列などプロモーター領域の変異に起因する．馴化条件で長期間栽培したときのRT-PCRの結果より，ヒルムシロ属では，HsfA2aは高温耐性に，HsfA2bは誘導耐熱性に機能分化している可能性がある．

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Plants are directly and strongly affected by abiotic stresses that relate to water, temperature, light and nutrients. Plant reproductive development is more sensitive to abiotic stresses than vegetative growth. Especially high temperatures cause male sterility due to abortion of anther development in several plant species. We have studied high temperature injury to male reproductive development using barley and Arabidopsis. These previous data indicate that anther tissue-specific auxin reduction is a cause in high temperature injury, which leads to the abortion of pollen development and the short filaments. It has been well known that importance of cross talk and interaction between phytohormones. In this study, we focused the ethylene signaling in developing anther cells and its response to high temperature stress. The ethylene insensitive mutant showed tolerance to increasing temperatures and suppressed the reduction of filaments. Promoter analysis implied some of ACS genes and ERF1 gene constitutively expressed in anther layer cells. These results suggest that high temperature injury to anther development occurs through ethylene signaling.

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シアノバクテリアは酸素発生型の光合成を行う原核生物であり、光化学系複合体の集光装置としてフィコビリソームを持つ。一部の種のフィコビリソームでは、赤色光を吸収するフィコシアニンと、緑色光を吸収するフィコエリスリンの組成が緑・赤色光に応答して調節され、補色順化と呼ばれている。我々は、フィコエリスリン含量のみが調節されるタイプの補色順化（2型）を示すNostoc punctiforme ATCC 29133において、シアノバクテリア独自のフィトクロム様光受容体（シアノバクテリオクロム）の1つであるCcaSが、CcaRのリン酸化を介してフィコエリスリンの発現調節を行なうことを明らかにした。一方、CcaSとよく似た色素結合ドメインを持つシアノバクテリオクロムであるRcaEは、フィコシアニン含量とフィコエリスリン含量の両方を調節するタイプの補色順化（3型）を制御することが示唆されている。RcaEの色素結合ドメインの解析を行ったところCcaSと同様の緑・赤色可逆光変換を示した。つまり、CcaSもRcaEも同様の光変換を示し、どちらもフィコビリソーム遺伝子群の発現調節に関わることが明らかとなった。しかし、RcaEよりもCcaSのほうがドメイン構成やシグナル伝達経路が単純である。このことは、過去にCcaS→RcaEへの進化が起こり、その結果、2つのタイプの補色順化が成立したことを示唆している。

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我々はシアノバクテリアがもつ新しい光受容体シアノバクテリオクロムの解析を進めている。シアノバクテリオクロムは開環テトラピロールを結合し、可逆的な光変換を示すが、植物のフィトクロムと異なる分光特性を示す。我々は Thermosynechococcus elongatus がもつシアノバクテリオクロム TePixJ が青色光と緑色光の光可逆変換を示すこと、 TePixJ の発色団がフィコビオロビリン (PVB) であること、PVB は TePixJ 自身がフィコシアノビリン (PCB) を異性化し作り出すことを報告してきた。今回、重要と思われる残基をアラニン残基に点変異導入したTePixJ の解析結果を報告する。E497A 変異体は青緑色光可逆変換を示し、その PVB 異性化効率、光変換効率は野生株と変化なかったが、光変換時に少なくとも2成分の不活性成分が生じた。 D492A 変異体は青緑色光可逆変換を示したが、光変換活性成分は野生株より低く、PVB 異性化効率も悪かった。 H523A変異体の PVB 異性化効率に変化はなかったが、H523A 変異体は青色光 (～430 nm) と橙/赤色光 (560～630 nm) の光可逆変換を示すようになった。これらの結果から、各アミノ酸残基が TePixJ の機能にどのように関わっているか議論する。

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多くのシアノバクテリアは開環テトラピロールを結合した光受容体（シアノバクテリオクロム）をもち、様々な光応答を示す。本研究では、好熱性シアノバクテリアThermosynechococcus elongatusの推定光受容体Tlr0924の解析を行った。Tlr0924は色素結合GAFドメインの他に、cyclic dimeric guanosine monophosphate（c-di-GMP）を合成するGGDEFドメインをもっており、その活性の光調節が予想された。本研究ではTlr0924全長をシアノバクテリアと大腸菌で発現・精製した。これらは色素を結合し、光照射によって可逆的に青色光吸収と緑色光吸収を示した。また、GTP添加で、c-di-GMP生成の副産物であるピロリン酸の生成を確認した。c-di-GMPの生成は現在質量分析によって確認中である。これらのジグアニル酸サイクラーゼ活性の光調節についても検討中である。また、青色光、緑色光の照射下での野生株とtlr0924破壊株の表現型の解析を試みている。

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AnPixJはシアノバクテリアAnabaena (Nostoc) sp. PCC 7120が持つ新種の水溶性光センサータンパク質:シアノバクテリオクロムである。フィコシアノビリンを結合し、543 nmに吸収極大を持つ緑色吸収型(Pg)と、648 nmに吸収極大を持つ赤色吸収型(Pr)が暗所安定型で、緑色、赤色光照射で室温では可逆的に相互変換する（1）。Pr状態の分子構造のみが決定されている（2）。AnPixJのもつ色素結合GAFドメイン（AnPixJ-GAF、約20 kDa）にHisタグをつけ、フィコシアノビリン産生大腸菌内に発現させ、Niアフィニティ－カラムで精製した。この光変換機構を調べるために、77 Kで光照射し、温度を上げながら吸収スペクトルを測定し、光変換過程の赤→緑、緑→赤の変換過程でともに2つの中間状態、合計4中間状態のトラップに成功した。これらの状態の低温吸収スペクトルはいずれも異なり、室温での時間分解測定で確認された中間体のスペクトルと似ていた。これに基づいて光変換反応のメカニズムを議論する。

(1) Narikawa J.Mol.Biol. (2008) 380, 844-855
(2) Narikawa Acta Cryst. (2009). F65, 159-162

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現在、我々はグルココルチコイド受容体を利用した機能誘導系を用いて、全転写因子の過剰発現体系統の作出を試みている。本変異体系統は各転写因子を一種類ずつ過剰発現させたものであり、DEX処理により導入された転写因子の機能が誘導される仕組みになっている。我々はこれら変異体系統より、可視光に対する応答が異常になった変異体を単離した。この変異体は長日条件下で野生型よりも胚軸が徒長するものとして単離され、胚軸の徒長以外にも子葉面積の減少等の表現型が観察される。これらの表現型はDEXを添加する事により増強する事から、導入された転写因子の機能誘導が表現型の原因であると考えられる。本変異体の表現型のDEX濃度依存性を確認したところ、胚軸伸長は低濃度で徒長が見られるが、高濃度では野生型と変化がなくなった。しかしながら子葉面積はDEX濃度依存的に減少し、その後回復する事はなかった。本変異体の単色光及び、暗黒下における胚軸の表現型の観察を行ったところ、青色光、赤色光、遠赤色光条件下において、同様の表現型が確認された。しかしながら、これらの表現型は暗所では観察されなかった事から、本変異体は光特異的に矮化の表現型を示す変異体であると考えられる。本変異体には新奇のZinc fingerタイプの転写因子が導入されており、この転写因子は抑制因子であった。本発表では光シグナルにおける本転写因子の役割について議論する。

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海洋性珪藻Phaeodactylum tricornutumの葉緑体局在carbonic anhydraseの1つPtCA1の発現は環境CO₂濃度及び光に転写レベルで応答しており、高CO₂環境下及び暗闇環境下では抑制されている。現在までにptca1プロモーター(Pptca1)のCO₂応答性コア領域から3つのCO₂応答性配列CO₂/cAMP response element (CCRE1-3)が同定されており、さらに、Pptca1におけるCO₂応答がcAMPをセカンドメッセンジャーとしていることが明らかとなっている。しかし、光応答に関わる配列はまだ同定されていない。本研究では、Pptca1における光応答配列を同定した。先行研究においてCCRE2, 3近傍領域に光応答配列が存在することが示唆されていたため、CCRE2, 3近傍の1塩基置換によるGUSレポーターアッセイを行った。その結果CCRE2, 3が光応答配列であることが明らかとなった。さらに上流において光応答配列を探索した結果、CCRE1も光応答配列であることが明らかとなり、Pptca1における光応答配列はCO₂応答配列と完全に一致するという結果となった。また、cAMPのアナログであるdbcAMPを用いて光応答におけるcAMPの関与を検討した結果、光応答においてもcAMPがセカンドメッセンジャーであることが示された。

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フィトクロムは植物の主要な光受容体の1つである。フィトクロムを介する光シグナル伝達経路を解明するため、本研究では基部陸上植物である苔類ゼニゴケを用いた。これまでにゼニゴケフィトクロム遺伝子（MpPHY）を単離し、Mpphyが一分子種しか存在しないこと、光可逆性を備えていること、さらに1アミノ酸置換したMpphyY241Hが光可逆性を失うことを明らかにしている。さらにMpphyにより胞子発芽後の細胞分裂、無性芽からの生長、葉状体切断面における再生が促進されることを見出している。今回ヒストンのH2Bサブユニットに蛍光タンパク質を融合させることで染色体動態を可視化した株を作出し、分裂組織の形成や細胞分裂頻度の増加が赤色光依存的であることを確認した。さらに野生株及びMpphyY241H発現株について細胞の核相を評価することで、MpphyがG2期からM期の移行を正に制御している可能性を示した。またMpphyの細胞内局在解析を行い、Mpphyが赤色光により主に核へと移行すること、MpphyY241Hが光非依存的に核及び細胞質に局在することを明らかにした。さらにRNAi干渉法によるMpphyノックダウン株は野生株とは異なり、遠赤色光非依存的に生殖生長相に移行した。このように、苔類ゼニゴケのフィトクロムが主として核で機能し、細胞分裂の間接的／直接的制御を通して形態形成を制御することが示唆された。

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フィトクロムは多岐にわたる光形態形成・光生理反応を担う主要な光受容体で、イネでは3つの遺伝子が存在する。フィトクロム3重変異体は野生型イネに比べて節間や葉身等の形態に著しい変化を示し、通常は節間伸長が抑制される幼苗期においても節間が伸長する。また、フィトクロム3重変異体はエチレン生合成関連遺伝子であるACCオキシダーゼ遺伝子ACO1の転写量が顕著に高いことがわかっている。今回我々は、野生型イネの出穂期節間伸長におけるACO1の機能について調べるために、ACO1欠損変異体及び過剰発現体を用いて解析を実施した。その結果、ACO1過剰発現体は親系統と比べて第1節間では顕著な違いがみられないが、下位節間が長くなることがわかった。一方、ACO1欠損変異体は親系統と比べて下位節間の長さに変化がみられないが、第1節間が短くなることがわかった。しかし、ACO1の欠損が節間伸長に与える影響は予想よりも小さかった。そこで、ACO1の上流及び下流で機能するエチレン関連遺伝子の発現について解析したところ、ACO1欠損変異体において親系統よりも高い発現量を示す遺伝子があることがわかった。以上の結果から、ACO1が関与する節間伸長制御機構について考察する。

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暗黒で発芽した双子葉植物の芽生えは胚軸上部にフック状屈曲を示すが、光を受けるとフックは開いて胚軸は立ち上がる。これはよく知られた現象である。しかし我々は、トマトの暗黒芽生えのフックが光によって更に巻き込むことを見出し、この反応にフィトクロムの弱光反応と極弱光反応が関与することをフィトクロム分子種欠損変異体等を用いて既に明らかにした。今回は、光によるフック巻込みがトマトだけの例外的現象ではなく種皮の堅い種子を付ける他の植物種でも見出されるので、その意義を見出すためフィールドシミュレーション実験や微速度撮影による解析を行った。その結果、1）地表近くで発芽したトマトの芽生えを完全暗黒で育てると、フックは巻き込まず種皮を付けたまま地表に現れ、その後地上で乾燥した種皮が子葉より外れなくなり成長が阻害された。2）しかしこのプロセスに光を加えると、芽生えはそのフックを巻き込み、その間に種皮を地中に脱ぎ捨てて地表に現れ、その後順調に成長した。3）このフック巻込みは、芽生えの地表への出現を遅らせた。これらのことから、光によるフック巻込みは、発芽時未熟な子葉が地中で乾燥を防ぎつつ十分成長し強固な種皮を脱ぎ捨てるのに貢献していることが推定された。またフック巻込みには、光だけでなく、種皮（胚乳を含む）の存在が必要であり、そこから供給される物質が重要な役割を果たしていると推定された。

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赤色光（R）/遠赤色光（FR）の光受容体であるフィトクロム( phy )は、ほとんど全ての組織や器官で発現している。よって、植物体の様々な部位で感知された光シグナルは、個体レベルで適切な光応答が起こるように統合・調整されなければならい。しかし、光応答時における異なる部位間の情報交換の仕組みはほとんど分かっていない。そこで本研究では、「避陰応答」に注目し、器官間の情報交換の仕組みを調べた。「避陰応答」とは、R/FR比が低い(他の植物の陰)環境下でphyの光平衡がPfr型からPr型に傾くことでおきる生理応答である。この応答は、24時間の明暗周期の暗期開始直前に短時間FR処理を施すこと（EOD-FR処理）によっても観察される。以上を前提に、LEDによるFR部分微細照射をシロイヌナズナ芽生えにほどこし、胚軸伸長促進の光受容部位を調べた結果、光受容部位は胚軸ではなく子葉であることが示された。また、FR照射後、一定時間をおいてRを照射し、FRの効果が打ち消されるかどうか調べたところ、FR照射後4時間目で打消し効果が見られなくなった。従って、4時間以内に光不可逆的な変化が子葉内で起きたと考えられる。一方、ビデオ観察の結果から、実際に胚軸が伸長するのは、上記の不可逆的変化が終了後、数時間が経過してからであることがわかった。現在、芽生えを部位ごとに分けて、遺伝子発現レベルの解析を進めている。

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葉は光合成遂行の主要器官であるため、葉の光形態形成は重要であり顕著である。本葉を構成する葉身は、平面的に広がった形態が特徴的であり、その本葉の扁平性は光の影響を大きく受ける。これまで、青色光により扁平性は促進され、この青色光応答はフォトトロピン制御であることが報告された。一方、赤色光下で生育した植物では葉が裏側方向へ強く丸まる傾向が見られる。しかし、この現象に赤色光受容によって活性化されたフィトクロムが関与するか不明であった。
本研究では、葉の扁平性を抑制するフィトクロムの生理機能について調べた。シロイヌナズナ本葉は裏側方向へ若干丸まるが、phyB 機能欠損変異体及び、End-Of-Day Far-Red 処理によりフィトクロム活性が減衰した野生株本葉では扁平性が増加した。さらに、PHYB とフォトトロピンとの相互関係を調べるため phyBphot1phot2 三重変異体を作出したところ、phot1phot2 二重変異体が示す本葉が強く丸まる表現型は完全に抑圧された。これらの結果は、フォトトロピンによる扁平性の促進制御において、PHYB が抑制的に機能する可能性を示唆する。またphyB 変異体の影響は、35S::PHYB-GFP の導入によって回復した。以上の結果を踏まえて、葉の扁平性を制御するフィトクロムとフォトトロピンとの拮抗的相互作用について議論したい

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イネの環境ストレス応答機構は、未解明の部分が多く残されている。我々は、マイクロアレイ解析によりイネの環境ストレス応答性遺伝子を数多く見出した。本研究ではそれらの内、乾燥ストレスによって発現量が著しく減少し、シロイヌナズナのPhytochrome Interacting Factor (PIF)と高い相同性を示すOsPIF1遺伝子に関して解析を行っている。これまでに、OsPIF1遺伝子の非ストレス条件下での明期における発現上昇が乾燥ストレス処理によって消失すること、OsPIF1過剰発現イネでは節間伸長が促進されること、逆にリプレッションドメインを利用したOsPIF1機能欠損イネでは節間伸長が抑制されること等を示してきた。これらの結果は、OsPIF1が乾燥ストレス応答機構においてイネの節間伸長を制御している重要な因子である可能性を示唆している。最近、形質転換イネの局所的な部位を用いたオリゴマイクロアレイ解析により、OsPIF1の下流遺伝子の探索をおこなった。見出された下流候補遺伝子の多くは乾燥ストレスによって発現が減少し、それらのプロモーター上にはE-boxシスエレメントが存在した。E-boxシスエレメントを含むプロモーターをGUS遺伝子に繋いだレポーターとOsPIF1遺伝子をイネ葉肉細胞中で一過的に発現させて解析を行った結果、レポーター遺伝子の発現上昇が認められた。

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シロイヌナズナの外部形態は生育環境に応じて適切に変化する。なかでも光条件と生育温度は、胚軸伸長ならびに葉柄伸長に大きく影響する環境要素である。近年、細胞伸長の正の制御因子である Phytochrome Interacting Factor4 (PIF4)が光シグナル伝達経路と温度シグナル伝達経路の共通因子として機能することが明らかとなった。我々は、光と温度による PIF4の機能制御機構を解明することを目的として研究を行っている。
PIF4タンパク質がPhytocrome依存的に赤色光照射によって分解されることはよく知られた現象であるが、本発表では、青色光条件下および低温（16℃）条件下においてもPIF4タンパク質が不安定化することを報告する。恒常的に PIF4を発現させたシロイヌナズナを用いた実験から、これらの不安定化は 26Sプロテアソームを介した分解によるものであることが分かった。また、青色光による分解は光量依存的であり、赤色光による分解と同様に PIF4の Active Phytocrome Binding (APB)ドメインを必要とした。一方、低温による分解には APBドメインを必要としなかったことから、光による分解と低温による分解は異なるメカニズムによって引き起こされると示唆された。

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BLUF (sensor of Blue Light Using FAD) ドメインはFlavin Adenine Dinucleotide (FAD) 分子を発色団として持ち、光合成遺伝子の発現調整、走光性、光驚動性の制御を行う青色光センサータンパク質として機能する。Synechocystis sp. PCC6803 のBLUFドメインタンパク質であるSyPixDの結晶構造は1.8Åの分解能で解明され、環状5量体が2つ重なった10量体構造が報告された。会合体形成にはPixEタンパク質が重要であり、PixE存在下暗条件でPixD : PixE = 10 : 5 の重合体が形成され、光照射でPixD 2量体とPixE 単量体に分解される。このような光分解反応がシグナル伝達を制御している可能性があるが、詳しい分解過程やシグナル伝達機構は不明である。暗順応させたSyPixDに150 Kで青色光を30分間照射し、その後光照射下で50 Kまで冷却した。10 Kで電子スピンエコー測定を行うとpeak-to-peak幅75 Gの1対の共鳴線をもつ対称的な信号（Pake’s doublet信号）が得られた。PixD内のFADH-Tyr間ラジカル対の形成を示している。PELDOR法を用いてラジカル対間の相対距離や相対角度を解析しSyPixD会合体内で各単量体がどのように配置するかを議論する。

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光受容体フォトトロピン1, 2(phot1, phot2)は、シロイヌナズナにおいて胚軸の光屈性、葉緑体の光定位運動、気孔の光開口運動などに関与している。イネは4塩基のみが異なる2つのPHOT1遺伝子ホモログ(OsPHOT1a, OsPHOT1b）と1つのPHOT2遺伝子ホモログをもつ。Tos17挿入によるOsPHOT1a欠損変異体の幼葉鞘は野生型とほぼ同様の光屈性を示した。この結果を受けて、PHOT1aとPHOT1bの両方の発現を抑えたRNAi形質転換体を作出し、またγ線を照射したPHOT1a欠損変異体からphot1a/phot1b二重変異体を分離して、光屈性へのphot1の関与を調べた。これらの系統は、片側からの連続青色光照射(0.01-100 μmol m^-2 s^-1）に対して、幼葉鞘と幼根の光屈性を全く示さなかった。また、PHOT1a/PHOT1b欠損二重変異体の戻し交配により分離したPHOT1b欠損変異体は野生型に近い光屈性を示した。これらの結果は、イネ芽ばえの光屈性には冗長的に働く2つのphot1ホモログが関与すること、また、phot1が光屈性のほぼ唯一の光受容体であることを示している。イネ幼植物の第2葉身は、葉身接続部の屈曲により、青色光に応答した光傾性運動を行うことが知られている。phot1はこの光運動の主要な光受容体であることも明らかになった。

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トウモロコシ幼葉鞘などを用いた研究で、光屈性は青色光パルス照射で誘導される1次・2次正光屈性と照射時間に依存して反応が増大する時間依存光屈性が同定されている。本研究では、シロイヌナズナ胚軸の光屈性を高精度で測定する方法を確立し、突然変異体を用いることによって、光受容体・シグナル因子と胚軸光屈性の関係を解析した。まず、野生型シロイヌナズナ(Col-0)を用いて、1回のパルス照射で誘導される1次正光屈性と3分を超える照射で誘導される時間依存光屈性、および高光量のパルスで誘導される弱い2次正光屈性を同定した。次に、フォトトロピン1, 2(phot1, phot2)が欠損した突然変異体(phot1, phot2)および両者が欠損した二重突然変異体(phot1/phot2）を用いて、phot1が全ての反応成分の光受容体であることを明らかにした。更に、シグナル因子NPH3およびRPT2の欠損変異体を用いて、NPH3は全ての反応成分に必須のシグナル伝達因子であること、RPT2は照射時間光屈性の発現に特異的に関与していることを明らかにした。さらに、連続青色光照射に対する反応の解析結果から、phot2は、phot1が存在しない条件では強光に反応した弱い光屈性を引き起こすことができるが、野生型胚軸の光屈性には関与していないと考えられた。

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フォトトロピンはAGCVIIIキナーゼ群に属するSer/Thrキナーゼであり、N末端側に光受容領域をもつ植物特有の青色光受容体である。シロイヌナズナは23ヶのAGCVIIIキナーゼをもち、その発現パターンや生理機能は様々である。キナーゼ領域の構造はよく保存されていることから、幾つかのAGCVIIIキナーゼが同じ経路で情報伝達を行っている可能性がある。そこで本研究では、フォトトロピンの情報伝達に関する新しい知見を得るために、代表的なAGCVIIIキナーゼを人為的に過剰発現させ、それらが示す生理活性の比較を行った。具体的には、PHOT1、PHOT2、AGC1-3、KIPK、PID、OXI1の6因子について解析を行った。各々のキナーゼ領域とGFPの融合タンパク質を熱誘導型プロモーターの制御下で発現する形質転換植物体を作製し、フォトトロピン応答について調べた。葉緑体光定位運動と光屈性に関して興味深い結果が得られ、前者についてはAGC1-3, KIPK, OXI1キナーゼが、後者についてはPIDキナーゼが、PHOTキナーゼと類似の生理活性を示した。これらの結果から、AGCVIIIキナーゼは、部分的にPHOTキナーゼと同じ機能を保持していると考えられる。現在、気孔開口についても解析を進めており、これらの結果も合わせて報告する。

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フォトトロピン(phot)は光屈性・葉緑体運動・気孔開口等を制御する青色光受容体である。photは青色光依存的にキナーゼ活性を示すが、どのような分子のリン酸化／機能制御を担うのか不明である。我々は、photとキナーゼ領域において高い相同性を示す、出芽酵母のFpk1 (Flippase kinase 1)およびFpk2に着目した。Fpkはリン脂質トランスロケース”Flippase”をリン酸化により活性化すると示唆されている。Flippaseは、生体膜脂質二重層間におけるリン脂質の非対称分布を形成・調節することで、多彩な細胞機能に寄与する。
本研究ではまず、photが出芽酵母におけるFpkの機能を相補するか調べた。出芽酵母のfpk1fpk2欠損変異株は、アミノリン脂質結合ペプチドによる致死作用に対し高感受性を示す。またFlippaseのサブユニットをコードするCDC50遺伝子の欠損変異と合成致死を示す。これらの表現型は、シロイヌナズナのphotを導入することで相補された。一方、シロイヌナズナにおいてはFlippase遺伝子としてALA1～12が報告されている。そこでこれらの欠損変異体の幾つかを調べたところ、ala3変異体において青色光による気孔開口が見られなかった。これらの結果から、photがALA3の機能を制御することで気孔開口シグナルが伝達されると仮説を立て、解析を進めている。

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