モデル植物であるシロイヌナズナを用いて、光化学系I循環的電子伝達活性(CEF-PSI)の生育光環境応答の解析を行った。シロイヌナズナを、弱光(LL)下、3週間生育させた後に、強光(HL)環境に移した。光合成電子伝達活性は、クロロフィル蛍光測定による光化学系II(PSII)量子収率(QY(PSII))解析およびP700測定による光化学系I(PSI)量子収率(QY(PSI))解析により評価された。CEF-PSI活性は、QY(PSI) - QY(PSII)により評価された。HL遷移後、経時的(24, 48, 96 h)に、光合成電子伝達活性が評価された。HL遷移後96 hまで、経時的にFv/Fmの値が0.82から0.78へと低下した。定常状態の光合成条件下、チラコイド膜PQの酸化還元レベルを示すクロロフィル蛍光パラメーターqLおよび光化学系IIの熱散逸能を示すクロロフィル蛍光パラメーターNPQの値が増大した。P700の酸化型の割合([P700+]/[P700]total)が増加した。CEF-PSI活性の増大が観測された。さらに、最大のCEF-PSI活性を与えるqLおよび[P700+]/[P700]totalの値が増加した。これらの結果は、光合成電伝達系の酸化還元レベルがCEF-PSI活性を調節することを示唆する。

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主要作物であるイネを用いて、光化学系I循環的電子伝達活性(CEF-PSI)の窒素栄養応答の解析を行った。矮性イネ（豊雪）を、強光(HL)および弱光(LL)下、水耕栽培により3週間生育させた。水耕液の窒素濃度は、1 mM NH4NO3 (MN)および0.3 mM (LN)に設定した。光合成電子伝達活性は、クロロフィル蛍光測定による光化学系II(PSII)量子収率(QY(PSII))解析およびP700測定による光化学系I(PSI)量子収率(QY(PSI))解析により評価された。CEF-PSI活性の指標であるQY(PSI) / QY(PSII)の値はHLおよびLLともにLN条件で増大した。この結果は、光合成が抑制される条件でCEF-PSIの機能が発現していることを示す。弱光領域でのQY(PSII)の値は全イネで差はなかった。しかし、LNのQY(PSI)の値は、HLおよびLLともにMNよりも大きかった。ただし、その値は光前処理によりQY(PSII)の値と一致した。これらの結果は、低窒素生育条件で、弱光領域においてPSI電子伝達反応が活性化されること、そして高いCEF-PSI活性に貢献していることを示しており、新規な事実である。そのメカニズムおよび生理機能の解明を現在進めている。

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光合成リニアー電子伝達反応 (LEF)が、光化学系I循環的電子伝達反応 (CEF-PSI)に与える影響を調べるために、我々は、PSIIが光障害を被ったイネ生葉（矮性イネ（豊雪））を用いて、CEF-PSI活性を解析した。イネ生葉が、光合成が抑制された条件下, 強光にさらされた。光処理時間の経過とともに、Fv/Fmが低下した。QY(PSII)により見積もられたLEF活性および正味の光合成速度は、光処理の時間の経過とともに低下した。また、NPQの値も低下した。一方、プラストキノンの酸化還元レベルを示すqLの値は、光処理により、増大した。さらに、PSI反応中心クロロフィルP700の酸化型の割合が、光処理により増大した。これらの結果は、PSIIの光障害によりプラストキノンおよび電子伝達系の酸化レベルが増大していることを示す。LEF活性と異なり、QY(PSI)により見積もられたPSI電子伝達活性の光強度依存性は、光処理により影響されなかった。また、QY(PSII)に対するQY(PSI)の関係は、光処理により影響されなかった。つまり、LEF活性に対するCEF-PSI活性は影響されなかった。ただし、光障害を受けた生葉ではLEF活性が低下しているので、CEF-PSIの活性は上昇していた。CEF-PSI活性が維持されるあるいは強化されるメカニズムと生理的意義を議論する。

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植物の生産性増加の研究は、様々な環境変化やバイオエネルギー需要への要求を満たすために重要になってきている。我々は光合成反応に注目し、イネ完全長cDNAをシロイヌナズナにおいて発現させたイネーナズナFOXラインを用いて、有用な遺伝子の同定を目指した研究を行ってきた。クロロフィル蛍光を用いたスクリーニングの結果、FNRをコードする2つのイネ完全長cDNA(OsLFNR1, OsLFNR2)を発現させるとシロイヌナズナ形質転換体のクロロフィル蛍光に変化が生じることが確認された。これら2つの完全長cDNAの導入によりイネの過剰発現体においてもシロイヌナズナと同様な表現型が観察された。クロロフィル蛍光解析の結果、OsLFNR2過剰発現体はフェレドキシン依存の光化学系I循環的電子伝達と直鎖状電子伝達が阻害されていることが明らかになった。また、OsLFNR1過剰発現体は通常の生育条件では生育阻害を示すが、栄養豊富な条件で生育させると生育が回復した。また窒素制限培地での生育時においてOsLFNR1過剰発現体は野生株と比較して根の伸長が促進されていた。これらのことからOsLFNR1過剰発現体は窒素同化に影響が生じていることが示唆された。以上の結果により、2つのFNRにより窒素同化と光合成電子伝達が制御されている可能性が示唆された。

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シロイヌナズナゲノムには、光化学系II酸素発生系タンパク質であるPsbQの他、3つのPsbQパラログの遺伝子が存在する。昨年度本年会において、我々はmRNA共発現解析により、2つのPsbQ-Likeタンパク質（PQL1, PQL2）が、光合成循環的電子伝達鎖の一経路を担うNAD(P)H dehydrogenase（NDH）複合体機能に関与する可能性を報告した。本年度は、シロイヌナズナpql1、 及び、pql2変異株を用いた機能解析の結果を報告する。まず、PAMクロロフィル蛍光測定により、いずれの変異株もNDH活性を消失していることが明らかとなった。また、ウエスタン解析の結果、野生株チラコイド膜において、各PQLタンパク質はNDH-光化学系I超複合体に強く結合し、プロテアーゼ処理に対しても耐性を示した。これらの結果は、最近の葉緑体NDH複合体に関するプロテーム解析の結果と矛盾しない。一方、既知のNDH変異株において、PQL1とPQL2の蓄積量は顕著に減少しており、各PQLタンパク質はNDH複合体に結合していない状態では不安定であると考えられた。なお、pql1変異株においては、他のNDHサブユニットの蓄積が著しく減少していたのに対し、pql2変異株では、NDHサブユニットの蓄積が部分的に認められ、PQL1とPQL2の間で、NDH複合体における結合部位と役割が異なる可能性が示唆された。

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葉緑体NAD(P)H dehydrogenase (NDH)は、ミトコンドリアおよびバクテリアの呼吸鎖Complex Iのホモログであり、光化学系I循環的電子伝達(CET)およびChlororespirationに機能している。CETにおいて、NDHは葉緑体ストロマ中の還元力を用い、プラストキノンを還元するが、電子供与体は未だ不明である。最近、Pengら(2009)は、NDHはPSIと超複合体を形成し機能することを明らかにした。しかし、電子供与体の結合サブユニットは未知で、NDHの全サブユニット構成の理解に至っていない可能性がある。今回、シロイヌナズナより新規なNDH関連タンパク質を同定し、その機能解析を行ったので報告する。
このタンパク質のホモログはシアノバクテリアに存在するが、NDHを欠くクラミドモナスには見出されなかった。このタンパク質は膜貫通ドメインおよび既知の機能性モチーフを有さないが、チラコイド膜に局在し、シロイヌナズナの欠損株はNDH活性を失っていた。またBN-PAGEにより、NDH-PSI supercomplexと相互作用していることが明らかとなったが、このタンパク質の欠損は、NDH-PSI supercomplexおよび他のNDHサブユニットの安定性には影響を与えなかった。
Peng et al. (2009) The Plant Cell in press.

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Type I chaperonins are large double-ring assemblies present in bacteria (GroEL), mitochondria and chloroplasts (Cpn60) and they are involved in the efficient protein folding. In E. coli, GroEL consists of 14 identical subunits and 85 substrates exhibit an obligate dependence on GroEL for folding, suggesting a broad range of GroEL substrates. In contrast, chloroplasts comprise two different Cpn60 isoforms, α and β. Two Cpn60α and four Cpn60β subunits were found in Arabidopsis chloroplasts and they were assembled into mixed Cpn60α7β7 oligomer. While cpn60α and cpn60β1β2 mutants are lethal, cpn60β4 was only defective in NDH activity. Consistent with the phenotype of cpn60β4, an NDH subunit, NdhH, was detected in the chaperonin complex containing Cpn60β4 as a substrate by mass analysis. Cpn60β4 has an additional C-terminal extension compared with other 3 Cpn60β subunits and this extension was shown to be critical for the specific function of Cpn60β4 on the NDH assembly. These facts imply that Cpn60β4 has acquired some structure features during the evolution to accomplish the folding of the specific substrate NdhH.

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光合成の明反応は、2つの光化学系で駆動され水からNADP⁺へ電子伝達されるリニア電子伝達と光化学系I（PSI）のみで駆動されるPSIサイクリック電子伝達から成る。前者はATPとNADPHの両方を生成し、光合成明反応を説明するのに一般的に用いられてきたが、ATPのみを生成する後者の生理機能は長い間未知であった。近年、リニア電子伝達だけではCO₂固定にATPを充分に供給できない事が明らかになった。不足のATPはPSIサイクリック電子伝達により作られる。高等植物において、PSIサイクリック電子伝達は、2つの経路から成る。主な経路はPGR5タンパク質に依存し、葉緑体NDH複合体はストレス緩和に主に機能する経路を触媒する。PGR5依存のサイクリック電子伝達はアンチマイシンAで阻害されることが知られているが、アンチマイシンAの作用機構は未知である。我々は、クロマツ(Pinus thunbergii)PGR5遺伝子をシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)に導入した植物がアンチマイシンAに耐性を示すことを明らかにした。シロイヌナズナとクロマツPGR5の間では8残基が異なるが、置換実験を行うことで、アンチマイシンA耐性を付与するアミノ酸を決定した。この結果は、アンチマイシンAがPGR5あるいは、その近傍に位置するタンパク質に結合することを示唆している。

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光化学系I(PSI)サイクリック電子伝達は光合成と光防御に不可欠である。被子植物ではPSIサイクリック電子伝達は部分的に重複する二つの経路からなる。メインの経路はPGR5依存、アンチマイシンA感受性の電子伝達でATPの合成に寄与する。
私たちは以前PGR5の過剰発現が葉緑体の発達に影響を与えることを報告した。PGR5の過剰蓄積はPSIサイクリック電子伝達を活性化し、その結果としてPQプールの還元レベルが高くなり、葉緑体の発達に影響を与えたと考えられる。
シロイヌナズナの突然変異株、immutansはPTOX（Plastid Terminal Oxidase）の欠損のためカロテノイドの合成が阻害され、葉が斑入りの表現型を示す。葉緑体のPTOXはミトコンドリアのAOX（Alternative Oxidase）のホモログで、チラコイド膜でPQから酸素への電子伝達を仲介する。葉緑体分化初期にPQプールがPTOXにより酸化されることがカロテノイドの合成とその後の葉緑体分化に重要であると考えられる。以上のことから、PSIサイクリック電子伝達とPTOXの両方の活性が、葉緑体分化に関与していることが示唆された。
本発表では、野生株の解析ではわからなかったPTOXと二つのPSIサイクリック電子伝達経路の間の複雑な相互作用について変異株の表現型から考察する。

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Peroxisomes are organelles present in most of eukaryotic cells and participate in the metabolism of fatty acids and other metabolites. Unlike chloroplasts or mitochondria, peroxisome proteins are synthesized in the cytosol and imported across their membranes. Thus there must be a peroxisome-specific protein transport system which is classified as peroxisome membrane protein transport and matrix protein import. Pex16 is a peroxisomal membrane protein that has been shown to regulate peroxisome biogenesis and membrane morphology. Pex7 is a soluble import receptor that recognizes peroxisomal targeting signal type 2 (PTS2)-containing proteins in the cytosol and transports them into peroxisomes across peroxisome membranes. Using transgenic plants overexpressing green fluorescence protein (GFP) tagged PEX7 and PEX16, we analyzed protein complexes of PEX7 or PEX16 proteins. By combination of co-immunoprecipitation technique and Orbitrap MS analysis, we identified 31 and 6 candidate proteins as binding partners of Pex7 and Pex16, respectively. Functional analysis of each candidate protein including the localization is under investigation for understanding peroxisomal biogenesis.

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真核生物の細胞にはオルガネラと呼ばれる膜で囲まれた細胞内器官が存在する。ペルオキシソームというのは真核生物に普遍的に存在するオルガネラであるが、その役割は生物種ごとに異なる。高等植物では、脂質のβ酸化、光呼吸、植物ホルモンの合成など最適な生存に重要な代謝反応に関わっている。そのため、これらの代謝反応に関与する酵素の変異株は矮小や胚性致死など顕著な表現型を示す。本研究で紹介する変異株peup1(Peroxisome unusual positioning)は、光合成器官である葉肉細胞においてペルオキシソームの凝集を引き起こす。しかしながら、peup1変異株は植物個体として顕著な表現型を示さなかった。原因遺伝子を決定したところ、peup1がコードするタンパク質はペルオキシソームタンパク質ではなく、オートファジータンパク質であった。オートファジーは不要なものを分解する機構として知られているが、野生株と比較してpeup1変異株におけるペルオキシソームの数が増加し、ペルオキシソームタンパク質が過剰に蓄積していることがわかった。本研究の結果は、ペルオキシソームがオートファジー様分解経路によって分解され、ペルオキシソームの適正な数と品質の管理がなされていることが示唆している。本発表では、植物に特異的なペルオキシソームに及ぼすオートファジーの役割を議論したい。

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ペルオキシソームは真確細胞に普遍的に存在するオルガネラである。高等植物のペルオキシソームは脂肪酸の代謝や活性酸素種の除去といった動物にも共通した機能に加え、植物ホルモンの生合成、光呼吸といった代謝系を担う重要なオルガネラであり、その機能は外的環境の変化や植物組織によって転換し得る柔軟性を備えている。ミトコンドリアや葉緑体とは異なりペルオキシソームは独自のゲノムをもたず、ペルオキシソームの機能、形態維持に必要な遺伝情報は全て核にコードされている。そのため、サイトゾルからペルオキシソームへの新生タンパク質の輸送は、ペルオキシソームの柔軟な機能制御において重要な機構である。我々は、ペルオキシソームの形態形成を制御する因子を明らかにするために、ペルオキシソーム可視化形質転換体を用いたスクリーニングを行い、種々のaberrant peroxisome morphology （apm）変異体を単離してきた。このうちのひとつ、apm9変異体はペルオキシソームへのタンパク質輸送に異常を示す変異体として単離され、原因遺伝子の同定によりAPM9遺伝子は植物ゲノムにのみ保存された機能未知遺伝子であることが明らかとなった。今回はAPM9タンパク質の機能解析を通して示唆された、高等植物におけるペルオキシソームタンパク質輸送機構の仕組みについて報告したい。

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ゴルジ体は、真核生物の細胞において、新規に合成されたタンパク質を小胞体から受け取り、糖鎖修飾を施した後、いくつもの細胞内輸送経路へと仕分けして送り出す、いわば配送センターとしての役割を担う重要なオルガネラである。一般的に扁平な袋状の膜（槽）が複数重なった構造（層板構造）をとることが知られており、哺乳類の細胞ではこのゴルジ層板が微小管によって中心体付近に集められ、互いにつながり合って巨大なリボン状構造をとる。これに対して植物細胞では、個々のゴルジ体が独立して細胞質中に散在し、その動きはアクチン繊維に依存していることが知られている。本研究では、この植物のゴルジ体の動態をライブイメージングによって詳細に解析するため、光変換タンパク質Dendra2によりゴルジ体を可視化し、光変換を起こしたゴルジ体と光変換を起こしていないゴルジ体との相互作用の観察を行った。その結果、ゴルジ体同士で物質のやりとりが行われていることが示唆された。また、GFPやmRFPでゴルジ体を可視化したシロイヌナズナでは，細胞内に非常に小さいながら層板構造を持ったゴルジ体が存在することがわかった。我々はこれを新しく生まれたばかりのゴルジ体ではないかと考え、現在解析を行っている。本大会では，植物細胞におけるゴルジ体のシス槽とトランス槽のそれぞれに着目したダイナミクスとbiogenesisについて議論したい。

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トランスゴルジネットワーク（TGN）は，小胞体からゴルジ体へと輸送されたタンパク質が，液胞，細胞膜等の目的地別に選別・輸送される際の分岐点となる重要なオルガネラである。植物においては，TGNはエンドサイトーシス経路の最初のコンパートメントとして初期エンドソームの機能を有するという報告もあり，TGNの構造・機能についての理解はあまり進んでいない。我々は，高等植物におけるTGNの構造・機能を明らかにすべく，TGNマーカーとして，動物・酵母においてTGNに局在するQa-SNARE分子のオルソログ，SYP43にGFPを融合させたタンパク質を用いて，ライブイメージングによるTGNのダイナミクスの解析を行った。その結果，根の分裂域の細胞ではTGNはゴルジ体のトランス側に存在するが，分化域の細胞ではゴルジ体とは独立したTGNも存在しており，組織・細胞の種類によってTGNの挙動が異なることを見出した。次に，TGNの高次機能を明らかにするため， SYP4グループについて変異体の解析を行った。その結果，それぞれの単独変異体(syp41，syp42，syp43)及び二重変異体（syp41syp42，syp41syp43）では目立った表現型は観察されなかったが，syp42syp43二重変異体では植物の矮化など多面的な表現型が観察された。これらの結果より，TGNの高次機能についても議論したい。

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細胞内膜交通を担うオルガネラの一種であるトランスゴルジ網（trans-Golgi network, TGN）は，植物細胞内においてはエキソサイトーシス経路に加え，エンドサイトーシス経路でも機能する可能性が示唆されている。しかしながら，植物のTGNに関するこれまでの研究では，TGNとエンドサイトーシスの関係は間接的に言及されているに過ぎない。TGNがエンドサイトーシスにおいて果たす役割を証明するためには，実際にエンドサイトーシス経路の可視化を行うことが必要である。そこで，本研究では，細胞膜の受容体である FLAGELLIN SENSITIVE2 (FLS2) をマーカーとして利用し，エンドサイトーシスの観察を行った。まず，リサイクリングエンドソームとTGNに局在すると報告されているRab11を用いて，TGNとエンドサイトーシス経路との関係について解析を行った。続いて，Rabのなかでその機能が最も明らかになっているRab5を用い，TGNを経由するエンドサイトーシスと，Rab5が局在するエンドソームとの関係について解析を行ったのでその結果を報告する。

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双子葉植物の葉の表皮細胞はジグゾーパズルのような複雑な形をとるが、その形態形成過程における細胞内の動態に関しては未解明の部分も多い。私たちはゴルジ体トランス層膜に局在するSialyl Transferaseの細胞質側の部位に蛍光タンパク質mRFPを融合したタンパク質ST-mRFPを発現するシロイヌナズナの形質転換体を観察する過程で、ST-mRFPの興味深い局在を見出した。ST-mRFPはこれまでの報告と同様にゴルジ体トランス層を標識していたが、これと同時に葉の表皮細胞の形を縁取るような局在が観察された。また、孔辺細胞ではゴルジ体トランス層以外に細胞端部で強いRFP蛍光が観察された。蛍光色素FM4-64による細胞膜の生体染色と原形質分離時の観察から、ST-mRFPはアポプラストに局在することが確認された。また、葉の成長段階を追って観察した結果、細胞の成熟に伴ってアポプラストへの局在が顕著になることが明らかになった。さらに、ジグゾーパズル型表皮細胞の輪郭の曲率とST-mRFPの蛍光輝度を定量的に調べた結果、両者に強い相関が認められ、細胞の湾曲部にST-mRFPが顕著に局在することが統計的に確認された。以上の結果から、多胞体などの細胞内構造を介し細胞質成分を細胞外へ輸送する経路が、葉の表皮細胞の形態形成に関与する可能性が示唆された。

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近年，細胞生物学的な過程を網羅的・経時的に追跡するための顕微鏡画像のハイスループット取得・解析技術の進展は目覚しい．このような状況において，細胞内構造の多様性を指向した画像データベースの構築と解析は，来たるべき網羅的生物画像解析に向けての礎と位置づけられる．私たちはこれまでに各種細胞内構造が蛍光標識されたシロイヌナズナ孔辺細胞を撮像対象に連続光学切片を多数取得し，取得画像群を気孔画像データベースLIPS（Live Images ofPlant Stomata）として公開・解析を進めてきた．本発表ではLIPSデータベースの解析例として，統計的な手法による各種細胞内構造の局在解析について紹介する．まず取得画像において孔辺細胞の向きや位置は様々であったため，半自動的な画像処理によりこれらを補正した．補正後，各構造につき100-120細胞の平均輝度投影像を得て，主な細胞内分布を可視化した．さらに，これらの共局在性を定量評価するため，平均輝度投影像の輝度相関によるクラスタリングを行った．一連の解析から，孔辺細胞の腹側には微小管とミトコンドリアが，背側にはアクチン繊維とエンドソームの局在が密になっていることが示唆された．また，細胞対の連結部ではアクチン繊維と小胞体の局在が確認された．現在，気孔開度の測定も進めており，本発表では気孔開閉と各種構造の分布・動態との関連についても議論する予定である．

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真核生物において核と細胞質を分断する核膜は、細胞核の構造形成や機能発現において重要な役割を果たす。しかし、植物では、核膜を構成する膜タンパク質やその裏打ち構造についての知見が乏しい。高等植物における細胞核形成の分子機構を知るために、核の形状が異常になったシロイヌナズナの変異体kakuを複数系統選抜することを目指した。最初に核を可視化するために、核膜孔構成タンパク質とGFPとの融合タンパク質を過剰発現する形質転換体を作成した。この形質転換体の種子をEMS処理し、得られたM2個体を用いて蛍光顕微鏡下で核の形状が異常になった変異体を探索した。野生型の核と比較して、kaku変異体では球状に変形したものや、より細長くなったものが観察された。核が球状化かつ小型化したkaku2変異体においてマップベースドクローニングを行ったところ、LINC1遺伝子に塩基置換変異が見つかった。LINC1は核周縁部に局在するコイルドコイルタンパク質で、その欠損変異体の核は球状化かつ小型化することが既に報告されており、核形成に重要な骨格タンパク質であると予測される (Dittmer et al. 2007、2008)。kaku2を含む変異体の解析結果を報告する。

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植物脂質は生体膜成分としてだけでなく，種子の貯蔵物質，ストレス応答におけるシグナル分子，菌に対する防御物質として，植物にとって重要な生理機能を担っている．オイルボディはリン脂質単層に包まれた特殊なオルガネラであり，中性脂肪やステロールを中心とした植物脂質を貯蔵している．オイルボディは種子，葯，葉など，様々な器官に蓄積する．葉型オイルボディはサイトゾルに存在し，葉緑体内に存在するプラストグロビュールとは異なる．葉型オイルボディは老化や菌感染といった様々なストレスにより蓄積量が増える．アブラナ科野菜類炭疽病菌（Colletotrichum higginsianum）は，シロイヌナズナを含むアブラナ科植物を宿主とする病原菌である．興味深いことに，アブラナ科野菜類炭疽病菌をシロイヌナズナに感染させると，病斑の周辺部で葉型オイルボディ関連タンパク質の発現が誘導されることがわかった．さらに葉型オイルボディ関連タンパク質がアブラナ科野菜類炭疽病菌に対する抵抗性反応に寄与していることが示唆された．このことから，葉型オイルボディや葉型オイルボディ関連タンパク質が，病斑周辺部において菌の拡大を防いでいることが考えられた．オイルボディを介した菌の侵入後抵抗性について考察する．

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ERボディはシロイヌナズナ幼植物体の表皮細胞に見られる小胞体由来のオルガネラであり，耐虫性，耐病性に関与すると考えられている．ERボディ形成には，転写制御因子NAI1と，ERボディに局在するNAI2が必要である(1,2)．NAI1はNAI2とERボディの主要な成分であるβグルコシダーゼ，PYK10の発現を制御している．私たちは，ERボディを持たないタマネギにシロイヌナズナのPYK10やNAI2遺伝子を導入し，ERボディを形成するかを調べ，PYK10とNAI2を同時に発現させるとERボディがされることを見いだした．このことから，ERボディ形成はPYK10とNAI2の発現で十分であることが明らかになった．nai1変異体を用いたトランスクリプトーム解析から，ERボディの膜タンパク質，MEB1，MEB2を見いだした．タマネギにGFP-MEB2を導入すると小胞体に局在するが，ERボディ作らせたタマネギにGFP-MEB2を導入するとERボディに局在する．このことから，NAI2とPYK10はERボディの形成とMEB2のERボディ膜への局在を制御していることが明らかになった．
(1) Matsushima et al., (2004) Plant Cell. 16, 1536-1549.
(2) Yamada et al., (2008) Plant Cell. 20, 2529-2540.

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葉緑体はオートファジーにより進行するRCB経路により部分分解を受ける。これまで私たちはシロイヌナズナ切離葉において栄養要因がRCB形成に及ぼす影響を解析し、葉の糖含量がRCB形成を制御する重要な栄養要因となること、RCB形成を特異的に制御する機構が存在することを示唆した。本研究では糖がRCB形成に及ぼす制御作用をより詳細に解析するために、デンプン合成が不能な変異体(pgm, adg1)、デンプンを過剰蓄積する変異体(sex1, mex1)の葉を用いてRCB形成を解析した。これら変異体は明暗周期環境では生育遅延を示し、その遅延は連続光下では見られないことが知られている。そこで連続光及び明期14時間の2条件で評価を行った。連続光条件ではsex1、mex1で野生体の約5倍のデンプンが蓄積しており、pgm、adg1では検出されなかった。このような葉を切離しRCBを検出、測定すると、sex1、mex1で有意に減少、pgm、adg1では増加した。明期14時間条件では展開期から老化葉まで生育を通したRCB形成を評価した。sex1、mex1におけるRCB形成が野生体を上回ることはなく、pgm、adg1では展開期から成熟葉にかけて野生体を大きく上回るRCBが検出され、最大値の比較においても有意に上昇していた。以上の結果は糖含量がRCB形成の重要な制御要因となることをより明らかに示す結果である。

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糖は生物にとって主要な炭素源でありエネルギー源であり、また、成長を制御するシグナルの重要な一つである。しかしながら、糖シグナル伝達と応答のための分子機構は解明されていないことが多い。今回、イネの核のプロテオーム解析で同定したタンパク質のin silicoスクリーニングにより、イネとシロイヌナズナの間で保存されており、糖によって発現が誘導されるタンパク質として、2つのWD40タンパク質（NuGWD1と2）を選抜し、解析を行った。イネ、シロイヌナズナの両方で、グルコースの添加によってNuGWD1と2のmRNAレベルは上昇し、この上昇はヘキソキナーゼの変異により部分的に抑制された。シロイヌナズナのAtNuGWD1遺伝子の破壊株は配偶子形成異常もしくは胚致死であった。また、イネのOsNuGWD1タンパク質を用いたGST pull down assayの結果、いくつかのリボソームタンパク質がOsNuGWD1タンパク質と結合することが示唆された。NuGWD1と2のホモログは酵母からヒトまで進化的に保存されており、酵母では18S rRNAの生合成や40Sリボソーム小サブユニットの形成に関わっていることが知られている。これらのことから、植物では、糖レベルの上昇はNuGWD1と2の発現を誘導して発生・成長に不可欠なリボソーム形成を促進することが示唆された。

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新規のmonogalactosyldiacylglycerol (MGDG)合成酵素遺伝子を緑色硫黄光合成細菌Chlorobaculum tepidum (近年Chlorobium tepidumより改名)から単離した。この遺伝子mgdAは、分子量約49kDaのタンパク質をコードしており、緑色硫黄細菌に広く保存されていた。大腸菌で発現したMgdAは、UDP-Galactoseを基質としたMGDG合成活性を示した。MgdAは現在までに同定されたMGDG合成酵素とは一次構造上相同性が無く、新規のMGDG合成酵素と考えられた。C. tepidumのmgdAの変異体は単離できず、この遺伝子は生育に必須の遺伝子と考えられた。
葉緑体局在配列を付加したMgdAをシロイヌナズナのMGDG合成酵素変異体に導入したところ、MGDG量が野生型ほどに回復した。しかしながらその相補体は、クロロフィル量の減少、葉緑体構造の異常、不稔性、頂芽優勢の破綻、花の形態の異常等の表現型を示した。このことは植物型MGDG合成酵素の、未知の機能の存在を示唆している。その機能を議論する。

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カルジオリピン(CL)は、真正細菌から動植物のミトコンドリアにまで広く存在する特徴的な構造をもったリン脂質である。私たちは真核多細胞生物で初めてCL合成酵素遺伝子CLSをシロイヌナズナにおいて同定し、その遺伝子にT-DNAが挿入されたタグラインclsを解析している。cls/clsは胚発生を中心として生育速度が遅延し、CLが局在するミトコンドリアの形態が異常であった。また、生育遅延及びミトコンドリア形態異常の両方について、 cls-1/cls-1よりもcls-2/cls-2で異常の程度が大きかった。そこで、これらの変異体の芽生えを[³³P] Piを用いて長時間ラベルすることで、CL量を測定した。その結果、全リン脂質中に占めるCLの割合は、WT, CLS-2/cls-2, cls-1/cls-1, cls-2/cls-2の順に低下していた。また、外来エストロゲンの投与によりCLSの発現を誘導できるpER8:CLSをcls-2/cls-2に導入した変異体では、根の伸長が外来エストロゲン濃度依存的に回復したが、この変異株のカルスでは、エストロゲンの投与によりCL量のみが上昇した。以上の結果は、CLSが植物体におけるCL量を制御可能であり、CL量が一定量以下となることが様々な異常の原因であることを示唆している。また、今回の研究によりclsがCLの機能解析に有用であることが明らかとなった。

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ステロールはグリセロ脂質と並ぶ代表的な脂質分子種であり、細胞質のメバロン酸経路で生合成されるイソプレノイド型脂質である。我々はステロール生合成遺伝子の解析を通じて、伸長生長、老化、雄性配偶体の形成、葉緑体分化など様々な段階でステロールが重要な役割を果たしていることを見出してきた。そこで、植物の生長生理におけるステロールの機能を包括的に理解するために、シロイヌナズナのステロール生合成変異体を網羅的に収集し、脂質分析とマイクロアレイによる遺伝子発現解析を現在行っている。
ホモ個体が得られた19遺伝子の変異体についてステロール分析とマイクロアレイ解析を行った。強い矮性を示すhmg1, sqe1, det2, dwf4のうち、hmg1とsqe1は全ステロール量が野生型の約半分であったが、ステロール組成に大きな変化は見られなかった。det2とdwf4はブラシノステロイド欠損変異体であり、ステロールの量に影響は無かった。個々の変異体をマイクロアレイ解析し、そのデータを統計解析した。いずれかの変異体で有意に変動した遺伝子を選抜して階層的クラスター解析（HCA）を行った。表現型解析、ステロール分析の結果と合わせて考えると、ステロール量の減少はブラシノステロイド欠損同様に植物細胞に大きな影響を与えること、C27, C28, C29ステロールのバランスが遺伝子発現に影響することが示唆された。

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About 120 glucosinolates (GSLs) are predominantly synthesized in the plant family of the Brassicaceae. GSLs are sulfur-containing secondary metabolites and their breakdown products confer e.g. resistance to herbivores and pathogens or exhibit anticarcinogenic properties in humans.
Synthesis of GSLs is tightly connected with the synthesis of amino acids in the primary metabolism, mainly methionine, phenylalanine and tryptophane.
These amino acids form the skeleton of the GSLs. Side-chain elongation, core GSL biosynthesis and side-chain modification lead to the final products of aliphatic, aromatic and indole GSLs.
Integration of transriptomic and metabolomic data of S-deprived Arabidopsis plants led to the identification of many genes in GSL biosynthesis. Intriguingly, this approach also uncovered changes of genes in primary amino acid metabolism.
We aim to unveil the impact of the primary amino acid metabolism in glucosinolate biosynthesis by characterizing candidate genes identified by coexpression analysis and metabolic profiling. Furthermore, we want to elucidate missing steps in GSL biosynthesis by this approach. Our latest results will be presented.

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カンプトテシンは、数種の植物が生産するテルペノイドインドールアルカロイドであり、トポイソメラーゼIを阻害剤して細胞毒性を有することから抗がん剤原料として利用されている。その生合成の初期段階は、他のテルペノイドインドールアルカロイドと同様にトリプタミンとセコロガニンの縮合により生ずるストリクトシジンを中間体として生合成されるが以降の生合成経路は不明である。演者らは、アカネ科チャボイナモリ(Ophiorrhiza pumila)においてカンプトテシン高生産毛状根培養系(HR)を確立した。この毛状根から誘導した懸濁培養細胞(CSC)ではアルカロイド生産が消失した。そこでHRとCSC についてInfusion FT-ICR-MSによるノンターゲット分析を行いHR特異的質量イオンピークをプロファイリングした。さらにこれらの質量イオンピークについてトリプトファン脱炭酸酵素(TDC)ならびにセコロガニン合成酵素(SLS) の遺伝子発現をRNAi法により抑制した毛状根での変動をLC-FT-ICR-MSを用いて分析し、抑制遺伝子の発現量と相関を示すイオンピークの精密質量から生合成に関連する候補化合物を推定した。

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マメ科植物には、潜在的医薬品資源として重要な化合物群である多様なトリテルペノイドサポニンが含まれることが知られているが、生合成に関わる遺伝子解析はこれまであまり進んでいなかった。マメ科薬用植物カンゾウが生産するグリチルリチンの生合成経路において、出発物質であるbeta-amyrinの11位の酸化に関わるP450; CYP88D6と、30位の酸化に関わるCYP72AサブファミリーのP450(仮称CYP-A21)が明らかにされている。そこで、タルウマゴヤシの公開ESTデータベースを参考にCYP88D6およびCYP-A21ホモログの全長cDNAを単離した。これらのcDNAをbeta-amyrin合成酵素遺伝子とともに導入した酵母の酢酸エチル抽出物をGC-MSにより分析し、beta-amyrin酸化物の有無を調べた。その結果、CYP-A21と75.5%のアミノ酸配列同一性を示すCYP-A21ホモログの一つを導入した酵母では、beta-amyrinの30位水酸化体である30-hydroxy-beta-amyrinおよびカルボン酸である11-deoxoglycyrrhetinic acidが検出された。また、CYP-A21ホモログとCYP88D6を同時に導入した酵母からは、グリチルレチン酸も検出された。現在、他のP450との組み合わせによる天然・非天然トリテルペノドの創成に取り組んでいる。

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アジア原産のヨモギ属植物Artemisia annuaは、抗マラリア薬として利用されるセスキテルペノイド、アルテミシニンを産生する。A. annuaから、アルテミシニン合成関連遺伝子として、アモルファ-4,11-ジエン合成酵素(ADS)遺伝子、アモルファ-4,11-ジエンからアルコールを経てアルテミシニン酸を生成するシトクロームP450(CYP71AV1)遺伝子が既に単離されている。我々はまず、アルテミシニン非産生ヨモギ属植物2種において、ADS相同遺伝子は発現しないものの、CYP71AV1と94％以上のアミノ酸相同性を示すホモログ（CYP71AV1ホモログ）が発現していることを明らかにした。そこで、ADSとCYP71AV1ホモログを酵母で同時発現させ、アモルファ-4,11-ジエンを基質としたCYP71AV1とこれらホモログの酵素機能の比較を行った。
酵母培養液の酢酸エチル抽出物をGC-MSを用いて分析した結果、ADS/CYP71AV1ホモログ同時発現酵母から、セスキテルペン様アルコール物質が検出された。この物質は、ADS/CYP71AV1同時発現酵母ならびにCYP71AV1ホモログのみの発現酵母からは検出されなかった。このことから、CYP71AV1ホモログはアモルファ-4,11-ジエンを基質とし得るが、CYP71AV1とは異なる部位の酸化を触媒することが示唆された。

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植物におけるNADとその関連物質の代謝の多様性について40種以上の植物を用いて検討した．植物では、NADはアスパラギン酸を開始物質とするde novo経路により合成され，分解産物として生じたニコチンアミドは、植物に特有なnicotinamidaseによりニコチン酸になりサルベージされる．NADの分解と再合成は，ピリジンヌクレオチドサイクル（PNC）によるが，植物には，動物には存在しないPNCVIIが働いている．これ以外に，演者らにより存在が確認されたNaR kinaseや，NR deaminaseによるバイパス経路も存在する．植物では，PNC由来のニコチン酸から，トリゴネリン（TG）かニコチン酸グルコシド（NaG）が必ず作られる．どちらの物質がつくられるかは，植物種，器官により異なる．植物界では、TGをつくる種の方が多く、特にマメ科植物やコーヒーでは多量のTGが種子に見られた。TG蓄積植物では，TGは、PNC 経由ではなく，de novo経路由来のニコチン酸から生産される可能性が高い．NaGは，ジャガイモ塊茎，アラビドプシス、カノーラなどのアブラナ科植物などで合成が認められた．これらニコチン酸抱合体の生理学的意義についても考察する．

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Lysine decarboxylase (LDC) is the key enzyme involved in the first step of quinolizidine alkaloids (QAs) biosynthesis. We have cloned the lysine/ornithine decarboxylase (L/ODC) from alkaloid-containing cultivar of L. angustifolius by using PCR-select-subtraction and 5'/3'-RACE techniques. The purified recombinant protein expressed in E. coli exhibited decarboxylase activities towards both L-ornithine and L-lysine with similar K_m value. The decarboxylase activities toward both substrates were competitively inhibited by DFMO, which is a specific inhibitor of ODC. We also characterized L/ODC genes from Sophora flavescens and Echinosophora koreensis which produce QAs. Kinetic study of these two purified recombinant L/ODCs showed the decarboxylase activity toward both substrates with similar K_m as same as L/ODC from L. angustifolius. The comparison of the catalytic efficiency (k _cat /K_m) of these three L/ODCs revealed that the preference for L-ornithine over L-lysine is only 0.5-1.5 times. This is the first report on an L/ODC presumably involved in QAs biosynthesis having almost equal decarboxylase activities towards both L-ornithine and L-lysine from plants.

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多くの高等植物の赤色はアントシアニンがその発色源であるのに対し、一部を除くナデシコ目植物はアントシアニンを合成せず、その赤色はベタシアニンにより発色されている。我々は、ナデシコ目植物にはなぜアントシアニンが存在しないかという問題に対しアプローチを試み、これまでにアントシアニン合成のlate gene (DFR、ANS)の発現制御がその一因である可能性を示唆した。そこで今回は、ナデシコ目植物のANSの発現制御を、シス領域およびトランス因子の両者に注目し解析を行った。
ナデシコ目植物のANSプロモーターの下流にuidAレポーター遺伝子を融合したコンストラクトを作製し、これをシロイヌナズナに導入した。形質転換体より得た種子を高スクロース条件下で発芽させ、アントシアニン合成を誘導したうえでGUS染色を行ったところ、子葉や上胚軸のアントシアニンが蓄積した部位で染色が見られた。このことより、ナデシコ目植物のANSは、シロイヌナズナにおいてはアントシアニンの合成・蓄積部位で発現することが示された。
次に、ナデシコ目植物のANSプロモーターを活性化する転写因子を検索した。その結果、シロイヌナズナのアントシアニン合成関連遺伝子群の転写制御に関わるPAP1が、ナデシコ目植物のANSプロモーターを活性化することが、トランジェントアッセイにより明らかとなった。

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高等植物において、赤色の多くはアントシアニンにより発色されている。それに対し、ナデシコ科、ザクロソウ科を除くナデシコ目植物ではアントシアニンは合成されず、その赤色はベタシアニンによって発色される。我々はナデシコ目植物のベタレイン生合成に注目し、ベタシアニン生合成系においてDOPAからベタラミン酸への反応を触媒するDOPA dioxygenase (DOD) について解析を行った。
ナデシコ目植物であるヨウシュヤマゴボウから2つのDOD遺伝子（PaDOD1、PaDOD2）を単離し、その発現を調べたところ、これらはベタシアニンを合成しない器官でも発現していることがわかった。さらにこれらの組換えタンパク質を作製し、機能解析を行った結果、PaDOD1はDOPAからベタラミン酸への変換を触媒したが、PaDOD2ではその活性は見られなかった。両者の酵素活性の違いについてさらに検討するため、PaDOD1とPaDOD2のN末側とC末側を入れ替えたキメラタンパク質の作製、ベタレイン合成植物のDODに特有の保存配列部分に注目したsite-directed mutagenesis等による生化学的解析を行ったところ、DOD活性に必須な複数の部位の存在が示唆された。

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フラボノイド合成は、周囲の環境からのストレスや発達段階、器官、組織による違いなど、さまざまな要因によってその発現が制御されている。マメ科植物ではフラボノイド合成に関与する酵素群は多重遺伝子族を形成しており、より精密な生合成制御が行われていることが考えられる。我々はこれまでにマメ科モデル植物であるミヤコグサより、プロアントシアニジン生合成酵素遺伝子のプロモーターを活性化するMYB型転写因子LjTT2a、b、cを単離し、これらがゲノム上でタンデムに配列し多重遺伝子族を形成することを見出した。これらのアミノ酸配列は高い相同性を示すのにもかかわらず、その転写活性化能は大きく異なっていた。3つのLjTT2のN末端側のR2R3-MYBドメインとC末端側の配列を入れ替えたキメラタンパク質を使ったアッセイにより、活性の違いはLjTT2のR2R3-MYBドメインに起因することが分かった。そこでさらに、R2R3-MYBドメインの中で特に活性の低いLjTT2b特有の3アミノ酸に注目し、これらのアミノ酸に変異を挿入した変異タンパク質を細胞内で発現させ、その活性を測定した。その結果、LjTT2bの3アミノ酸をすべてLjTT2aのものに置換すると活性が高くなることから、これらの3アミノ酸がLjTT2の活性において重要な役割を果たしていることが示唆された。

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縮合型タンニン（CT）はアントシアニン生合成の中間体であるフラバン-3,4-ジオールとその誘導体フラバン-3-オール（カテキン類）の重合体で、抗菌作用や昆虫に対する防御作用、食品成分として健康増進に役立つなど、様々な生理活性が注目されている。発表者らはCT生合成調節機構の解明を目的として、アントシアニンとCTがともに欠失しているマメ科モデル植物ミヤコグサ（Lotus japonicus）のviridicaulis1（vic1）およびvic2変異体を解析している。昨年の本大会ではVIC1がbHLH型転写因子をコードすることを発表した。今回、vic2遺伝子のポジショナルクローニングを行い候補遺伝子の塩基配列を調べたところ、WD40リピートタンパク質をコードするシロイヌナズナのTTG1オルソログの354番目の塩基にナンセンス変異が見つかり、翻訳産物のWD40リピートドメインが欠失していることが推定された。野生型遺伝子を用いてvic2の相補実験を行ったところ、アントシアニンとCTの蓄積が確認された。リアルタイムPCRによる発現解析の結果、vic1およびvic2変異体ではジヒドロフラボノール4-還元酵素とアントシアニジン合成酵素をコードする遺伝子の転写物レベルが大きく低下し、相補株では回復しており、VIC1とVIC2がこれら酵素遺伝子の調節因子であることがわかった。

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種子は，内部の胚を紫外線から保護するために，種皮に二次代謝産物であるフラボノイドを集積している．シロイヌナズナは内珠皮第1層の細胞の液胞内に大量のフラボノイドを蓄積しており，そのため種皮は通常茶褐色を呈している．フラボノイド集積に異常を示す変異体は，種皮が白くなることからtransparent testa（tt）と呼ばれ，これらの変異体の解析からフラボノイド合成の主要経路が解明されてきた．しかし，フラボノイドの最終産物を液胞に集積するための分子機構については不明な点が多い．我々は，液胞へのタンパク質の選別輸送変異体の効率的な選抜方法GFS (Green fluorescent seed)法を開発してきた(1)，原理は，小胞体で合成された液胞型GFPが，輸送装置の異常によって細胞外に分泌されると種子が緑色蛍光を発するという発見に基づいている．このgfs変異体プールの中から，種皮の色が薄くなっている変異体を選抜し，gfs9変異体と命名した．gfs9変異体は，種子貯蔵タンパク質の液胞選別輸送にも異常を示した．これまでに，色素フラボノイドの蓄積と液胞選別輸送の両方に関与する遺伝子は報告されていない．GFS9は新規液胞選別輸送因子として，フラボノイド集積に関与すると考えられる．
(1) Fuji et al. (2008) Plant Cell, 19, 320-332.

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ハマヒルガオ(Calystegia soldanella)、ハマゴウ(Vitex rotundifolia)、ハマエンドウ(Lathyrus japonicus)などは本来、海岸に生育している植物であるが、淡水の琵琶湖にも隔離的に自生している。海岸は海水や強い紫外線のような環境ストレスに絶えずさらされている場所でもある。このような環境条件にある植物にとって、どのように各種ストレスに対処するかは生育の大きな要因となっている。植物がフラボノイドのような抗酸化能の強い成分を合成することによって、このような環境に適応している例はいくつか報告されている。本研究では、ハマヒルガオ、ハマゴウ、ハマエンドウなどを材料として、異なる環境条件下に生育する集団間で、含有するフラボノイドが質的あるいは量的に変化しているかを調査した。その結果、これらの植物はそれぞれ多様なフラボノイドを有していることが明らかとなった。このうちハマヒルガオでは、フラボノイドは質的に変化がなかったが、量的には変異が生じていた。すなわち、海岸のものではQuercetin型のフラボノイドがKaempferol型に対して約4.5-10.5倍も含まれていたのに対して、琵琶湖のものでは0.8-1.8倍程度しか含まれていなかった。またハマゴウにおいては質量ともに変化がなく、ハマエンドウでは明らかに質的に変化していることが判明した。

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水生植物のオオカナダモは、エロデニンと呼ばれるアントシアニンを生成する。茎からはずした葉（切断葉）をショ糖溶液中、明所で培養するとアントシアニンを生成し、クロロフィルが減少して紅葉が誘導されることから、オオカナダモは紅葉現象を解析するためのモデル実験系である。オオカナダモの黄化切断葉を0.6 Mショ糖溶液中で培養すると、原形質分離が強く起こり、細長い細胞では2個のプロトプラストに分かれる。溶液の濃度を変えないで3日間培養すると、原形質分離復帰が起こらないまま、有核部はアントシアニンを生成し、無核部は生成しない。両プロトプラストが赤くなった細胞では、両者をつなぐ細い原形質糸が観察される。この結果は、アントシアニン生成には核が必要であることを示している。また切断葉を蒸留水で培養すると、紅葉が誘導されないが、適度な紫外線を切断葉に部分照射し、蒸留水で培養すると、照射部分だけでなく葉全体の紅葉が誘導される。このことから、紫外線照射によって生じたアントシアニン生成に関わる何らかのシグナル要因が、葉内を移動するものと考えられる。さらに、切断葉を1cmの長さの茎切片とともに、蒸留水中で培養すると、切断葉の紅葉が誘導される。この現象は、茎切片から切断葉の紅葉を誘導する何らかのシグナル分子が水中に放出されていることを示している。今後この物質を純化し、解析したいと考えている。

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我々は早春に開花するゴマノハグサ科オオイヌノフグリ(Veronica persica)の青色花弁から主アントシアニン色素としてDelphinidin 3-O-(2-O-(6-O-coumaroyl)-glucosyl)-6-O-coumaroyl-glucoside-5-O-glucosideと主コピグメントとしてApigenin 7-O-(2-O-glucuronosyl)-glucuronideを単離同定した。この主コピグメントはこのアントシアニン色素に対して顕著なコピグメント効果を示すことが認められた。これらのフラボノイド色素の生合成に関わる配糖体化酵素遺伝子の同定を試みた。逆遺伝学的手法により単離したVpUGT94F1はアサガオのIn3GGT(UGT79G16)遺伝子と相同性を有し、Delphinidin 3-O-glucosideのグルコースの2位に対するグルコシル化活性を示し、Delphinidinアグリコンには活性を示さなかった。またVpUGT88D8はキンギョソウのAmF7GAT(UGT88D4)と相同性を有し、Apigeninの7位に対するグルクロノシル化活性を示した。VpUGT94F1とVpUGT88D8遺伝子は共に花弁において強く発現しており、それぞれアントシアニンと補助色素の生合成を介して花弁の青色発現に関与していると示唆された。

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アントシアニンは、糖やアシル基により種特異的な修飾がなされている。アントシアニンの配糖化において、ウリジン二リン酸 (UDP)-糖を基質とした UDP-糖依存型配糖化酵素 (UGT) による糖転移反応が数多く報告されているが、未だメカニズムが解明されていない糖修飾反応が存在する。カーネーション花弁の主要色素は、3 位と 5 位が配糖化され、糖にさらにリンゴ酸が結合して環状化したアントシアニンであることが明らかにされている。3 位の糖は UGT により転移されることが報告されている一方で、5 位配糖化に関しては植物体からの粗抽出における酵素活性、酵素遺伝子ともに見出されていない。今回、カーネーション花弁の粗抽出中において、cyanidin 3-O-glucoside を受容体、カーネーション花弁の 50% エタノール抽出液を供与体として酵素反応を測定したところ、アントシアニン 5 位配糖化酵素活性を検出することに成功した。酵素反応液を HPLC で解析した結果、生成物のリテンションタイムとスペクトルは cyanidin 3,5-diglucoside のそれと一致した。この結果は、カーネーションン花弁のアントシアニン配糖化において、UDP-糖とは異なる糖供与体が存在することを示唆した。この研究は生物系産業創出のための異分野融合研究支援事業により行った。

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花色の発現にはカロテノイド、ベタレイン、フラボノイドの3種が関与している。中でもフラボノイドの1種であるアントシアンは赤から青までの広い範囲の色調を発現している。この色素は基本骨格であるアグリコンの状態において化学的に不安定であり、植物細胞中で容易に退色してしまう。その為、アントシアンにおける糖転移反応は色素の安定化、さらに多様化に関して非常に重要な反応である。本研究で用いたアメリカデイゴ (Erythrina crista-galli L.) は南米原産のマメ科木本植物であり、6月から10月にかけて大型で深紅色の花をつける。アメリカデイゴ花弁はcyanidin 3-O-sophoroside、萼はpelargonidin 3-O-glucoside、また花柄はcyanidin 3-O-glucosideがそれぞれの主要色素である。このように、花の器官ごとに発現する主要色素が異なるのは、アントシアン生合成系における上流での制御とともに、これらに働くアントシアン糖転移酵素（AnGT）の酵素化学的諸性質がそれぞれ異なるためだと考えられる。そこで、本研究ではアメリカデイゴの花の各器官(花弁、萼、花柄)におけるAnGTの酵素化学的諸性質について比較検討し、アメリカデイゴの花の器官分化に伴い、発現している糖転移酵素の酵素化学的諸性質、特に基質特異性において異なる傾向を示すことを明らかにした。

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古典的な外科手術実験により、植物の茎頂分裂組織の重要性や茎頂分裂組織と原基の間でのシグナル伝達の重要性が示されている。近年のシロイヌナズナにおける遺伝学的な研究により、頂端分裂組織の形成や維持及び葉原基の形成や成長に関わる鍵分子の同定がなされ、発現パターンや遺伝子機能が明らかになっている。しかし、茎端分裂組織から葉原基へのシグナル伝達のタイミングやシグナルの空間的な伝達経路の解明には至っていない。このような時空間レベルでの分子機能を解明するためには、発生中の組織において部分的な細胞破砕を行い、その影響を分子レベルで観察することが非常に有効な手段である。これまで、トマトではレーザーアブレーション系が確立されているが、器官特異的な発現マーカーが揃っておらず特異的な細胞の破砕には適さない。そこで、本研究ではシロイヌナズナを用いレーザーアブレーション系の開発を試みた。アブレーションはUVパルスレーザー(波長：349nm)を搭載した共焦点レーザー顕微鏡を新たに組み立て実現した。現時点ではUVレーザー照射により一細胞レベルでの破砕に成功している。本発表ではGFPマーカーライン(FILAMENTUS FLOWER promoter::GFP及びCLAVATA3promoter::GFP)において、茎頂分裂組織の特定の位置にレーザーを照射した場合の発生への効果について報告予定である。

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維管束のパターン形成機構や維管束細胞列の数を制御する仕組みを理解するために、維管束形成に異常のあるシロイヌナズナ突然変異体を単離し、維管束形成に関わる遺伝子の同定と解析を行っている。no vein (nov)変異体では葉に維管束の減少がみられ、葉脈の無い葉も観察される。根端分裂組織の幹細胞の維持や胚発生過程における子葉原基の発達と分離などにも異常がある。これまでに、NOV遺伝子が、胚、葉、根においてオーキシンに依存した協調的な細胞の分化やパターニングに重要な役割を持つこと、植物に特異的な分子量約306 kDの新規核タンパク質をコードすることを明らかにしている（Tsugeki et al., Plant Cell, 2009）。vascular hyperplasia (vah)変異体では、葉脈パターンの異常と葉脈維管束細胞列数の横方向への増加が観察される。根では、木部形成の異常や内皮細胞列で異所的な分裂が観察される。また、オーキシン極性輸送阻害剤のある条件で芽生えを生育させると、野生型で観察される葉と根における維管束細胞列の増加や根端コルメラ細胞の増加が、vahでは更に促進された。一方、novではそれらの増加がほとんど起こらなかった。本発表では、維管束形成や根端分裂組織におけるNOVとVAHの役割について報告する。

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維管束分化において、NAC型転写因子であるVND6、SND1/NST3は木部道管および繊維細胞それぞれのマスター因子であることが分かっている。しかし、これらの因子が制御する下流因子の詳細はわかっていない。そこで、VND6およびSND1が制御する因子を明らかにするために網羅的な発現解析を行うことにした。そのためにまず、シロイヌナズナ培養細胞を用いた系を構築した。エストロジェンにより発現誘導可能な形でVND6およびSND1を形質転換した細胞株を作製した。VND6過剰発現株では、細胞は後生木部様の二次壁を形成し細胞内容物を失った。SND1過剰発現株では、模様のない二次壁を形成した。次に、このような植物体内での細胞分化を反映した培養細胞を用いてマイクロアレイ解析を行った。その結果、VND6とSND1は主に二次壁形成に関わる因子を共通の下流因子として制御していることが分かった。また、プログラム細胞死に関わる因子はVND6のみにより制御され、リグニンモノマー前駆体の合成に関わる因子はSND1のみにより制御されることが分かった。

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ペプチドリガンドとレセプターを介したシグナリングは、植物細胞間の相互作用においても多様な役割を担うと考えられる。シロイヌナズナに32個あるCLV3/ESR-related (CLE) ペプチド遺伝子からはいくつか、分裂組織や細胞分化の制御において機能する因子がみつかってきたが、未だシグナリング機構の全貌はわからない。その様な機構を解析する上で、ペプチドの受容体装置を探し出すことは大変重要である。そこで私達は、シロイヌナズナ花粉管培養系を利用したアプローチを試みた。初めに合成CLEペプチドを添加して培養したところ、数種のペプチド存在下では花粉管がより伸長することがわかった。花粉のみ存在する培養系なので、合成CLEペプチドが花粉で発現する受容体様キナーゼに作用したと想定される。したがって次に、既知のCLEペプチド受容体に類似し、かつ花粉での発現が予想される受容体様キナーゼ遺伝子の変異体について、花粉管培養におけるCLEペプチド応答性を調べた。その結果これまでに、2種類のCLEペプチドについてそれぞれ1つおよび2つの非応答性変異体が検出された。すなわち、CLEペプチドシグナリング機構で機能する受容体様キナーゼ遺伝子候補を新たにみいだした。

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土壌中の窒素源を効率的に吸収するために、植物には窒素栄養条件に応答して根の形態を制御する機構が備わっている。シロイヌナズナを用いたこれまでの解析から、局所的な硝酸イオンに応答した側根の伸長を促進する因子としてMADS-box転写因子ANR1が同定されている。
ANR1は4遺伝子からなる遺伝子ファミリーを形成している。このうち、根で特異的に発現し、窒素欠乏誘導時に発現量が増加するAGL21遺伝子について機能解析を行った。AGL21遺伝子の破壊株は0.03 mMから0.1 mMの硝酸イオンおよび0.1 mMのグルタミンを窒素源として与えた条件下において、側根の伸長が野生型株と比較して抑制された。逆に、AGL21遺伝子の過剰発現株は窒素栄養条件によらずに側根の伸長が促進された。AGL21プロモーター-GFP融合遺伝子を持つシロイヌナズナでは、主根および側根の分裂領域において強いGFP蛍光が観察された。以上の結果から、ANR1とは異なり、AGL21は低窒素条件で側根の伸長を促進する転写因子であると考えられる。本研究では、遺伝子ファミリーを形成している4遺伝子のうち、根で特異的に発現するANR1、AGL17およびAGL21遺伝子の3重破壊株を用いた解析を進めている。本研究発表では、プロモーター-GFP遺伝子を用いた局在解析とあわせて結果を考察する。

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CLEファミリーはC末にCLV3と相同性の高いペプチド配列を持つ遺伝子群であり、分裂組織のサイズ調節やその分化に関与していると考えられているが、多くのCLE遺伝子について、その詳細な機能は不明である。本研究では、根で発現することが知られているシロイヌナズナのCLE1-7遺伝子に注目し、その発現パターンを解析するとともに、過剰発現株の根を観察することで、CLE1-7遺伝子の根の形態形成における役割を明らかにすることを目的とした。
低硝酸培地で栽培した個体の根ではCLE1, 3, 7遺伝子の発現量が高かった。promoter-GFPの観察から、CLE1, 2, 3, 4, 7遺伝子が根の内鞘細胞で発現していることがわかった。CLE1, 2, 3, 4, 5, 7の各遺伝子の過剰発現株では、側根が野生型株と比較して短くなる傾向が見られた。
一方、CLV3のレセプターであるCLV1遺伝子の変異体では側根が長く、CLV1がCLE1-7ペプチドのレセプターとして働いている可能性が示唆された。CLV1 promoter-GFPの観察から、CLV1は根の篩管伴細胞で発現していることがわかった。本研究発表では、clv1変異体でCLE3を過剰発現させた株の解析を行い、CLV1とCLE1-7遺伝子の関係について議論する。

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分泌型ペプチドホルモンには，特有の翻訳後修飾やプロセシングなどによる構造の複雑化を伴うものが多いが，翻訳後修飾の種類や位置は，生理活性に決定的な影響を与える．これまで知られている分泌型ペプチドホルモン特有の翻訳後修飾のひとつとして，細胞増殖に関与するPSKとPSY1ペプチドに見られるチロシン硫酸化がある．この修飾は，ゴルジ体に局在する酵素（tyrosylprotein sulfotransferase（TPST））により付加されるが，TPST遺伝子破壊株では，根端メリステム（RAM）活性が顕著に低下することが知られている．興味深いことに，TPST遺伝子破壊株のRAM活性は，PSKおよびPSY1の外的投与ではほとんど回復しなかったことから，未知の硫酸化ペプチドがRAM形成に重要な役割を担っていることが示唆された．我々は in silico 遺伝子スクリーニングと成熟型ペプチド構造解析およびTPST遺伝子破壊株への投与実験により，PSKおよびPSY1の存在下においてRAM活性をほぼ野生型にまで回復させる新規硫酸化ペプチドを同定した．このペプチドはQC付近で発現しており，拡散性のシグナルとしてRAM活性の制御に関与していると考えられる．

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植物の根端に存在する「根冠」は、分裂組織の形成や保護、根の重力感受などを担う重要な組織である。シロイヌナズナの根冠は細胞系譜の異なる2種類の幹細胞が協調的に分裂・分化することで形成され、その後急速な成熟を経て数日で剥離する速いターンオーバーを繰り返している。我々は酵母の転写因子GAL4とその結合配列であるUASを用いた独自のアクティベーションタギング法により、根冠細胞の形成と分化に異常を示すシロイヌナズナ変異体urp7-Dを単離した。この変異体ではNACドメイン型転写因子SOMBRERO (SMB)が異所的に発現し、根冠の幹細胞が失われると同時に、表皮に根冠様の性質が付与されていた。反対にSMBの機能欠損変異体では根冠の幹細胞活性が亢進し、根冠の剥離が遅れていた。SMBは根冠の幹細胞では発現せず、その娘細胞が根冠に分化すると弱く発現し、根冠の成熟に従って強く発現していた。これらの結果は、SMBが根冠の分化と成熟を制御する調節因子であることを示している。

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維管束植物の根系構築において、側根形成の果たす役割は大きい。我々は側根形成の分子機構を明らかにする目的で、シロイヌナズナにおいて側根形成能が顕著に低下するfewer roots（fwr）変異体を単離した。fwrでは、単一劣性変異によって側根形成の開始頻度が顕著に低下し、また外生オーキシンによる側根形成誘導能も野生型に比べて低下する。精密マッピングの結果、fwrゲノムでは小胞輸送で機能するGNOM遺伝子に1アミノ酸置換を引き起こすミスセンス変異が見つかった。そして、fwrとGNOM T-DNA挿入変異体のアレリズムテストにおいて互いに相補しなかったことから、fwrの原因遺伝子がGNOMであることが明らかとなった。GNOMは、オーキシン排出輸送体PIN1の細胞内局在を制御するARF GTPaseのグアニンヌクレオチド交換因子（ARF-GEF）であり、胚発生での頂端-基部軸の確立や、オーキシンを介した形態形成に重要な役割を持つ。これまで胚性致死や芽生え致死となるgnom変異体アリルが複数報告されているが、fwrのように側根形成特異的に欠損を示し、かつ稔性のあるgnom変異体はほとんど報告されていない。本発表では側根形成におけるGNOMの機能について、fwrにおけるオーキシン関連マーカーの発現解析などの結果をふまえて議論する。

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