We present digital imaging system (Hitachi Rice Imaging System; HIRIS) for phenotypic profiling of various mutant and transgenic plants. Our new software measures the expansion profile of a growing rice shoot automatically at high temporal resolution. It traces the growing shoot apex on the sequential images and leaves the position of orthographic projection on a data set. The data promptly showed us the overall elongation procedure versus time in coleoptile, first leaf and second leaf in early rice seedling development. Similarly, we measured the overall expansion procedure versus time in each leaf of a rice plant in the active tillering stage. Here we report that a brief light irradiation hastened the first leaf protrusion from coleoptile in etiolated seedling. In tillering stage, photoperiod affected the cycle of leaf appearance and maximum velocity of leaf elongation. This work was supported by grants of Rice Genome Project (SY-1108 and IP-1006).

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We are investigating the regulatory mechanism of cytoplasmic motility in plant cells. Using a custom-made dynamic image analyzer, the cytoplasmic motility was efficiently quantified as the deviation of changes in the brightness of individual pixels on digitized images sequentially taken by infrared light microscopy. These procedures enabled us to detect a rapid, localized induction of cytoplasmic motility in epidermal cells of the aquatic angiosperm Vallisneria gigantea. The cytoplasmic motility were photoreversibly regulated by type II phytochrome. The induction of cytoplasmic motility took place in a patchy manner in whole irradiation and only in the exposed region in microbeam irradiation. The induction became detectable a few seconds after the start of light irradiation. This response can be categorized as one of the most rapid responses under the control of type II phytochrome reported to date. Analyses in other plants will be briefly mentioned.

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Organelles in the plant endomembrane system are connected by vesicular transport and maintain dynamic membrane traffic. Proteins are actively selected and transported along the secretory, vacuolar and endocytic pathways. We have been studying the roles of small GTPases as molecular switches in these trafficking processes and are now trying to elucidate mechanisms of their regulation. Live cell imaging turns out to be very powerful in such studies. We are now developing a new very-high-performance confocal laser miscroscopic system in collaboration with Yokogawa, NHK, and Hitachi Kokusai, which enables real-time color imaging. With this technology, we are now able to observe dynamic behaviors of multiple organelles simultaneously. In this symposium, we will present our new results indicating 1) differentiation of endosomes, 2) role of endocytosis in cell polarization, 3) involvement of actin filaments in endosomal movement, 4) dynamic behavior of vacuolar membranes, and so forth.

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電子線トモグラフィー法は、最近のそれを目的とした透過型電子顕微鏡(TEM)の開発と画像処理ソフトウェアの発展によって、急速に利用されるようになって来た。この再構成法の原理は、医用X-線CTと同様に、ラドン変換と投影切断面定理によっている。しかし、医用CTと比較して、TEM-CTでは、幾つかの異なった状況と問題点がある。例えば、TEM-CTでは、自動焦点、自動ドリフト補正の他、試料回転の100枚程度にも及ぶ投影像の自動位置合わせも必要になる。いままでの画像処理技術の改良によって、概ねそうした問題は解決しつつある。ただ、こうした改良によってもまだ実際上解決出来ていない問題点がある。TEMによる試料回転には装置上の制約から、通常約±60°～±70°に制限される。さらに、TEM用試料は一般に平面に広がっているため、その平板性のためと、回転角が大きくなるにつれ電子線透過の線形性が狂い、同様の回転角制限を受ける。こうした投影情報の欠損は、一般に、歪んだ再成結果をもたらし重要な問題点となって来た。我々は最近、この問題を克服する有力な手法を考案した。マルチステレオ計測法と、独自の投影膜厚連立方程式の解法手法により、再構成領域を実験的に求めるものである。領域の近似解が一旦求まれば、従来から開発されてきた拘束領域に基づく反復再構成法が利用でき、飛躍的な改善が見られた。

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高等植物の微小管は、間期には細胞表層に並び細胞の伸長方向を、G2から前期には、分裂準備帯（preprophase band）として、細胞分裂面の挿入位置を決定する。そのため、細胞表層での微小管の配向機構を解析することは、植物の形態形成の研究に重要である。蛍光プローブを使った分子追跡の技術の進歩により、微小管の動的性質がいくつか分かって来たが、光学顕微鏡による観察には限界があり、微細構造レベルでの情報が不足していた。そこで、我々は高圧下で組織の凍結が可能な加圧凍結法と、高分解能での3次元的解析の可能な2軸電子線トモグラフィー法を組み合わせることにより、瞬時に凍結したタマネギ表皮細胞における細胞骨格の立体的な配置を定量的に解析することを可能にした。加圧凍結後の凍結置換の方法の工夫により、マイクロフィラメントを安定的に保存することに成功し、分裂準備帯形成と消失に伴うアクチン繊維の挙動を微細構造レベルで追跡することができた。また、微小管が重合、脱重合する時にとると考えられている独特の微小管端の構造を定量的に観察することができるようになった。また、γチューブリンの複合体が微小管形成の核となっているところを捉えたと思えるキャップ構造も見つかった。これらの頻度を調べることで、どの程度微小管のダイナミックスが想像できるか議論する。

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分裂準備帯（PPB）は植物細胞の分裂直前に出現する微小管の帯である。PPBは前中期に消失するが、PPBの存在していた位置に細胞板が挿入されるため、細胞板の挿入に必要な因子がPPBの位置に蓄積されると考えられている。PPBにおいては古くから輸送小胞が観察されている。PPBの発達や位置情報が蓄積される仕組みの解明には、これらの小胞を解析する必要がある。我々はまず加圧凍結した試料を用いて超薄切片法によりPPBの微細構造を観察したところ、観察された小胞の多くは電子密度の高い内容物を持っており、またPPBの位置においては小胞の分布密度が他の位置と比べ有意に高いことがわかった。特異的な分子マーカーがない現状では、小胞の機能を知るためには、小胞の形態を解析し形態学的特徴をマーカーとして用いながら分布を詳細に解析することが有力な手法となる。そこで加圧凍結および超高圧電顕を用いた電子線トモグラフィーにより、PPBに存在する小胞を詳細に調べた。その結果、PPBに存在する小胞には大きくわけて、クラスリン被覆小胞および明確な被覆を持たない小胞の2種があることがわかり、後者は前者と比べて直径が大きくまた細胞膜から遠い位置まで分布することなどがわかった。また後者がmultivesicular bodyと融合していると考えられる像も観察された。これらの結果からそれぞれの小胞の役割について議論する。

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In plant syncytial cells the position of the new cell walls is determined by microtubule systems radiating from the nuclear envelopes. Using a combination of high-pressure freezing/freeze substitution and dual-axis electron tomography we have studied the organization of cytoskeletal elements and membranous cell plate intermediates in two syncytial systems, the cellularizing endosperm and the post-meiotic microsporocytes of Arabidopsis. In both systems, cytokinesis involves the assembly of clusters of microtubules called mini-phragmoplasts and specific types of cell plates. However, whereas endosperm cell plates assemble first in the central part of the division plane, post-meiotic microsporocyte cell plates assemble across the entire division plane simultaneously. This fact, together with a particular pattern of callose synthesis, determines that post-meiotic cell plates mature centripetally, and not centrifugally. In conclusion, cytokinesis in different tissues of higher plant cells involves the formation of different types of cell plates but never cleavage furrows.

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The water-water cycle in chloroplasts is the photoreduction of dioxygen to water via superoxide and hydrogen peroxide in PSI by the electron derived from water in PSII, and its prototype was acquired already by cyanobactertia. The primary function of W-W cycle is immediate scavenging of reduced species of oxygen prior to their interaction with the stromal enzymes, inhibiting CO2 fixation. The scavenging complex of ROS on PSI complex is designed well to satisfy above requirements. As far as W-W cycle operates without leak of ROS, it functions as alternative route of the linear electron transport, allowing fine adjustment of the photoproduction ratio of ATP/NADPH and dissipation of excess electrons or photons. The requirement of oxygen to the start of CO2 fixation in maize, and to the suppression of photoinhibition in Symbiodinium in coral, suggests the participation of W-W cycle in photosynthetic processes other than rapid scavenging of ROS.

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We describe a novel experimental strategy that makes use of the conditional flu mutant of Arabidopsis thaliana, which makes it possible to induce the release of singlet oxygen in a controlled and noninvasive manner.
The flu mutant accumulates protochlorophyllide in the dark. Following a dark-to-light shift generation of singlet oxygen starts within the first minute of illumination and was shown to be confined to plastids. Immediately after the shift mature plants stopped growing, while seedlings bleached and died. These responses do not result merely from physicochemical damage. Instead they reflect the activation of distinct stress response programs, as indicated by the recovery of more than 30 second-site suppressors mutations that abrogate the reactions. Two distinct signal transduction pathways were defined, which diverged from a single genetic locus, Executor 1 (Ex1), that is indispensable for the processing and transmission of the initial stress signal.

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Historically, target enzymes of thioredoxin (Trx) were identified by biochemical studies of the enzymes. However, recent progress of the genome sequencing projects for various organisms made it possible to survey the candidates, by comprehensive and systematic efforts. In 2001, we reported a new method to capture the target candidates of Trx comprehensively using immobilized Trx mutant, which is able to form stable mixed-disulfide intermediate with target protein but not to facilitate the reduction of the disulfide bond of the target (Motohashi et al. PNAS, 98, 11224). This way we identified three potential target proteins (Prx-Q, cyclophilin, and rubisco small subunit) together with five known proteins for chloroplast Trx-m. Balmer et al. recently analyzed target proteins in spinach chloroplasts using the immobilized Trx-f and Trx-m mutants and suggested 26 proteins as potential targets for chloroplast Trx. Thus the redox cascade in the plant cell and the physiological significance are now revealed.

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Plants defend themselves against environmental stresses by invoking a network of protective mechanisms. It is widely accepted that changes in redox-signalling and regulation resulting from stress-induced increases in oxidative load play an important role in such responses. Recent evidence shows that constitutive tolerance to pathogens can be achieved by modifying the plants endogenous *redox-stat*. Two ways in which enhanced pathogen resistance has been achieved by manipulation of the plants redox sensing and defences will be discussed. The first involves low antioxidant buffering capacity due to diminished ascorbate accumulation. The second mechanism involves modulation of the redox state of the apoplast by manipulation of apoplastic ascorbate oxidase activity Pignocchi C & Foyer, CH (2003).

Pastori, GM, Kiddle, G, Antoniw, J, Bernard, S, Veljovic-Jovanovic, S, Verrier, PJ, Noctor, G & Foyer, CH (2003). The Plant Cell. 15: 939-951.
Pignocchi C & Foyer, CH (2003). Current Opinion in Plant Biology, 6: 379-389.

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Within the genus Populus, Populus euphratica is highly salt tolerant. Under salt stress leaves develop succulence and the wood acquires anatomical changes. Furthermore, H₂O₂ is produced in roots indicating that salt stress results in oxidative stress. Based on this observation, we hypothesize that H₂O₂ is a second messenger in differentiation processes under oxidative stress. To test this assumption thematic arrays containing 449 ESTs from Populus euphratica were hybridized to RNA from roots of different developmental stages under salt stress. We focused on those genes which are related to H₂O₂ production and oxidative stress (e. g. oxidases, peroxidases, catalases) and those related to lignification (e. g. cinnamyl alcohol dehydrogenase, 4-coumarate CoA ligase) to get first hints for links between oxidant production and anatomical changes. Furthermore, to get further insights into the regulation and to identify new candidate genes microarrays studies with arrays haboring a unigene set (7745 ESTs) are currently underway.

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Reduced glutathione (GSH), an abundant antioxidant, is associated with bolting and flowering, the key steps of the life cycle of rosette plants. Chilling, an oxidative stress, accelerates bolting and flowering followed by senescence, this effect being enhanced by GSH and blocked by an inhibitor of GSH biosynthesis. Other thiol compounds such as dithiothreitol have no inductive/enhancing effect on bolting. These suggest that GSH specifically regulates the termination of life rather than protects the plants from oxidative stresses. In Arabidopsis, three flowering-determinant genes, FT, LFY and SOC1, are highlighted, but the transcript levels of these genes have no relation with rosette GSH levels, indicative that the accelerating effect of GSH on bolting, flowering and senescence are provoked through an unknown mechanism. We here propose a mechanism explaining the paradoxical action of GSH on life span. This mechanism would provide a general explanation for many physiological phenomena regarding flowering.

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The boreal forest (N 45 *70 degrees) occupies about 1/3 of the total world forest area. It is assumed that the boreal forest is most sensitive to global climate change such as global warming. We are conducting a molecular, physiological, biochemical and ecological study on the mechanisms of boreal forest regeneration. The characteristics of the cryosphere where the boreal forest exists are low precipitation and low temperature. We assume that photooxidative stress plays a key role in forest regeneration under such environmental conditions. For example, we have found that the gap regeneration that occurs in tropical or temperate forests does not occur in boreal forests, that is, seedlings can survive under the canopy of adult trees but not in gaps in boreal forests. I will be talking about the mechanisms of how photooxidative stress affects forest regeneration.

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　好熱性らん藻由来光化学系II膜蛋白質複合体（PSII）の結晶化の成功により、PSIIの立体構造は原子分解能に近いレベルで明らかにされつつある。X線結晶解析より得られた構造から、PSIIの機能について何がわかったのだろうか？本講演では、X線結晶構造を基に新たに解明されたPSIIの機能について、演者らが行っている構造解析の最近の結果と他のグループが報告した結果を比較しながら議論したい。特にPSII反応中心クロロフィルの配置から、従来言われていたような反応中心4量体モデル、あるいは多量体モデルが、中心に位置する2量体のクロロフィル間の距離が明らかにより近いことから正しくないことが示された。しかし、PSII反応中心の2量体クロロフィル間の距離が好色硫黄細菌やPSI反応中心より長いことから、その間の相互作用がより弱いものであることも明らかになった。また、表在性タンパク質のうち、33 kDaタンパク質の構造がOmpファミリータンパク質と相同する点があることから、該当タンパク質が低分子量物質を輸送する機能を持つ可能性があることが示唆された。さらにMnクラスターの構造的特徴とその配位環境について報告する予定である。そしてこれまでの結果を基にPSII構造解析・機能解析の将来について展望したい。

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近年、X線結晶解析により、光化学系II蛋白質複合体の三次元構造が次第に明らかとなってきた。しかしながら、系IIが行う種々の電子・プロトン移動反応のメカニズムの解明のためには、各色素・金属コファクターの結合部位における、水素結合状態やプロトン化構造などの、X線構造解析では得るのが困難な、より詳細な構造情報が必須である。フーリエ変換赤外分光法（FTIR）は、そうした、蛋白質の活性部位における、詳細な構造や分子相互作用を調べるのに適した手法であり、蛋白質中の分子の大雑把な位置関係が明らかになった後に、その真価を発揮できるといえる。また、FTIRは、酸素発生系における各S状態遷移やコファクターのラジカル生成反応をモニターし、その際のコファクター及び近傍蛋白質の構造変化を検出することにより、反応の分子機構を明らかにするために有効である。本講演では、FTIRによる光化学系IIの構造と反応の研究について、最近の結果を紹介する。

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To understand the mechanism of photosynthetic oxygen evolution, it is indispensable to know the chemical natures of the interactions between the Mn cluster and substrate water molecules, and how respective interaction changes during the successive proceeding of the 4-step (S₀-S₁, S₁-S₂, S₂-S₃ and S₃-S₀ with O₂ evolution) oxidation of water molecules to evolve oxygen. Low frequency (1000 - 350 cm^-1) region vibrations can include the modes for direct interaction between metal and its ligands, and only available method to access this subject. Therefore, we applied this method to monitor the changes in interactions between the Mn cluster and its ligands including substrate water molecule during the S-state cycling. S-state dependent changes of low-frequency FTIR difference spectra, effects of universal ¹⁵N/¹³C labeling and ¹⁸O-water on the spectra will be presented. Furthermore, impact of modification of C-terminal Ala of the D1 protein on the spectra will be shown also.

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　酸素発生光化学系II(PSII)は数多くの膜内在性蛋白と数種の表在性蛋白からなる。膜内在性蛋白は植物種を越えて保存されているが、表在性蛋白は植物種により異なる。表在性33 kDa蛋白は共通に存在するが、他の表在性蛋白は異なる。高等植物や緑藻には23 kDaと17 kDa蛋白が結合しているが、紅藻やラン色細菌にはこれらの蛋白は結合してなく、その代わりに12 kDa蛋白とcyt c550が存在する。紅藻にはさらに新規な20 kDa蛋白が結合している。また、各表在性蛋白の再構成実験の結果から、表在性蛋白の結合様式が植物種により異なることも明らかになっている。本講演では、主として表在性蛋白の分布と結合様式の違いから酸素発生系の進化について議論する。高等植物、紅藻、ラン色細菌の各表在性蛋白の抗体を作成し、それらの抗体との反応から表在性蛋白の分布を種々の植物種で調べた。その結果、緑藻、ユーグレナ藻、クリプト藻は高等植物型の表在性蛋白を有し、紅藻が2次共生した褐藻、珪藻、ハプト藻は紅藻型の表在性蛋白が存在することが明らかになった。また、紅藻に存在する新規な20 kDa蛋白のアミノ酸配列は緑藻の表在性17 kDa蛋白に有為な相同性がみられ、psbQ familyの一員であることが判明した。これらの結果と結合様式の植物種間の違いから酸素発生系の進化について議論する予定である。

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　近年の構造生物学の発展を背景に光化学系2複合体の立体構造の解明が進み、それに伴って表在性蛋白質に関しても知見が集積しつつある。表在性蛋白質のサブユニット構成は、ラン藻と高等植物・緑藻との間で異なるが、それらの中でも関連する立体構造の情報が全くないのは、高等植物・緑藻に特徴的に存在するPsbPサブユニット（別名：OEC23）を残すのみとなっている。
　PsbPは水分解反応の補欠因子であるカルシウムと塩素イオンを、反応中心近傍へ局在させるのに必要な蛋白質である。また高等植物、ラン藻にはPsbPと弱い相同性を示すパラログやオーソログ（PsbPドメイン蛋白質）が存在しているが、それらの分子機能は全く未知である。よってPsbPの立体構造は、PsbPによるイオン保持の分子機構のみならず、他のPsbPドメイン蛋白質の機能やPsbP自身の分子進化を考える上でも重要である。最近、我々はタバコのPsbPを材料に、その結晶化と立体構造の決定に1.6 Åの分解能で成功した。β-シートを基本とするPsbPの立体構造に類似した構造を示す蛋白質はラン藻の光化学系2複合体構造中には存在せず、高等植物が進化の過程で新奇な構造をもつ蛋白質を表在性蛋白質として獲得した事を示唆していた。本シンポジウムでは、このPsbPのX線構造解析から得られる情報に基づいて推定される機能についても紹介する。

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Recent advances of genomics continue to yield a vast information on the generality as well as the diversity of organisms. Along with the accumulating genomic data, the proteomics, which depends on genomics on one hand, is now giving a novel approach to analyze the function of expressed proteins and the functional linkage between them. Through the proteomic analysis of photosystem II complexes purified from Synechocystis 6803 HT3 using optimized electrophoresis, 21 distinct proteins were detected in the region below 20 kDa. Some of those were known as PS II components, but detected for the first time in cyanobacterial PS II. Besides such known small subunits, 4 novel proteins were also detected. One of them was found to be homologous to plant PsbQ, and furthermore, homologous genes were found in all other analyzed cyanobacterial genomes. The effective dialogue between genomics and proteomics will be discussed.

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シアノバクテリアから藻類、高等植物までの酸素発生生物はすべてクロロフィル a （Chl a)を光化学系I、IIの中核アンテナと反応中心のスペシャルペアとして用い、他のChl b, Chl cなどはアンテナ色素としてのみ働く（例外は系IのP700の片割れのChl a'、プロクロロンのdivinylChl a）。これは、800nm光を使うBchl a でなく、高エネルギー短波長の670nm光を吸収するChl a が酸素発生成立に必須だと示唆する。
しかし、宮下らが発見した新型シアノバクテリアAcaryochloris marinaは 710nm光を使うChl d を主要色素とする。この光化学系IではChl d の2量体P740が反応中心クロロフィルとなる。系IIの主要色素もChl d だが少量のChl a も存在し、活性な反応中心は単離されていない。系IIから発せられる Ch l d の遅延蛍光、熱発光、蛍光、吸収変化, ESRなどの最新の実験事実にもとづき、Chl d の吸収する低エネルギー遠赤色光で酸素発生をする機構と、系IIの進化過程を考察する。

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It is known that Gloeobacter violaceus PCC 7421 was branched off at an early stage in the phylogenetic tree of cyanobacteria on basis of the SSU rRNA sequences. This suggests that the organism still retains old properties in photosynthesis. The photosynthetic systems are localized in cytoplasmic membranes. Oxidation of water is carried out in the periplasmic space. In 2003, the whole genome sequence of this organism was reported (Nakamura et al., DNS Res., 2003). Four genes corresponding to minor subunits of PS II RC complex are absent, and several components engaging in water oxidation are not conserved in their amino acid sequences. We observed a few unique properties of PS II and found several defects, for example, this species was not able to grow under strong light. Based on these observations, we will discuss the basics and developments of PS II in cyanobacteria.

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光化学系IIの機能維持のためには、光化学系II の品質管理 (quality control) が重要である。光ストレス下では、損傷を受けた光化学系II 反応中心D1タンパク質は、特異的プロテアーゼにより分解される。その分解過程にはチラコイド膜結合プロテアーゼが関与していることが示されている。また、光損傷を受けたD1タンパク質は周辺タンパク質との架橋産物を生じ、この架橋産物はストロマに存在するプロテアーゼにより分解される。光化学系II では主にD1タンパク質が光損傷の標的になるが、最近私たちは過剰な光照射ではチラコイドルーメンに存在するPsbOタンパク質も損傷を受け、その損傷タンパク質はSDS/urea-PAGE および2次元電気泳動でスメアなバンドとして検出されることを見いだした。このタンパク質損傷はヒドロキシルラジカルにより引き起こされる可能性が高い。光ストレス下で酸素発生系から遊離したMnが遊離PsbOに結合し、それがフェントン反応のmediatorとなってヒドロキシルラジカルを産生しPsbOに損傷を与えるものと思われる。　熱ストレス下でもD1タンパク質が特異的に分解されるが、その分解はZnで大きく促進され、EDTAで完全に阻害された。熱ストレスによるD1タンパク質の一次分解にはZn-依存プロテアーゼであるFtsHが関与している可能性が高い。

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　2000年にシロイヌナズナのゲノムシークエンスが99．99％の高精度で国際研究チーム（日本ではかずさDNA研が25％を決定）によって決定された。植物では初めてのゲノムシークエンスの決定であり、その後の遺伝子の機能研究の基礎となる大きなマイルストーンであった。その後、アメリカでは2010年プロジェクトが始まり機能解読のためのリソースの整備と機能解析システムの開発などが本格化した。26，000個あるすべての遺伝子の機能を解析するためのT-DNAやトランスポゾンによる遺伝子破壊型変異体の作成と変異遺伝子の同定が精力的に進められつつある。現在、T-DNA遺伝子破壊変異体は世界では数十万株に達しており、大部分の遺伝子にT-DNAが挿入したラインがアメリカ、日本、ヨーロッパで作成されている。これらの遺伝子破壊系統を用いて遺伝子を破壊した系統を集めて網羅的に表現型を観察するフェノーム解析もはじめられている。さらに、我々はmRNAのコピーである完全長cDNAの収集を進めており、すでに18，000個（全遺伝子の70％）収集した。完全長cDNAはゲノム上の遺伝子の位置と転写開始部位を正確に決定するために必要である。さらに遺伝子発現プロファイルを解析するために利用した。また完全長cDNAはタンパク質の機能や構造を解析するための重要なリソースである。現在、これらのゲノムリソースを用いてすべての遺伝子の機能解読が本格化している。

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理研BRCはナショナルバイオリソースプロジェクトにより「シロイヌナズナ」及び「植物培養細胞・植物遺伝子」の課題を遂行している。本課題では、ゲノムリソースを中心としたシロイヌナズナ変異体の種子や植物の完全長cDNA及び培養細胞などを収集、保存、提供している。事業の実施に際しては、リソースの信頼性、サービスの多様性、事業の国際性の各点について特に注意を払っている。現在8万個以上のリソースを保有し、5千個以上のリソースを国内外の研究者に提供した。当面の事業目標としてはシロイヌナズナの野性株及び近縁種のリソースの整備と植物の完全長cDNAリソースの充実を目ざしている。またリソースの保存提供業務と平行して、新たなリソースの開発につながる技術やリソースを解析する技術の開発も進めている。今後は開発した技術を用いて先導的なリソースを整備するとともに、共同研究や技術研修によりリソース関連技術を研究者に提供していきたい。また外部機関と協力してリソース関連情報の集約化を図り、研究者の利便性を高めることも目標としたい。リソース、技術、情報の3種類の支援により我が国の植物研究の発展に貢献したいと考えている。

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A large-scale genome analysis of a model legume Lotus japonicus is in progress. The program includes collection of ESTs, genome sequencing, and generation of DNA markers and a high-density genetic linkage map. Up to present, a total of 93,000 5' and 3' ESTs have been accumulated from whole young plants, flowers, buds, pods, roots and nodules. Approximately 30 Mb of genomic sequences together with the gene information have already been released to the public. By using the determined sequences, more than 700 DNA markers have been generated and located onto the genetic map which is comprised of 6 linkage groups. Both material and information resources generated during the genome analysis, which include cDNA and genomic libraries, primer sequences and map locations of the DNA markers, and EST and genomic sequences, are extremely useful for acceleration of the analysis to understand the genetic system of this plant.

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　ミヤコグサは，野生の多年生マメ科植物で，ゲノムサイズが小さく（443Mb），ライフサイクルが短いなどの特徴からダイズ等のマメ科の作物にとってモデル植物となることが期待されている。これまで，国内に自生する野生系統が多数収集され，EMS変異体や培養特性の優れた実験系統等が多数開発されてきた。ミヤコグサがモデル植物として世界のマメ科植物のゲノム研究をリードするには，多様なリソースの収集・保存と提供を効率よく推し進めるシステムの確立が不可欠である。また，ミヤコグサリソースとその情報を最大限に利用するには，その恩恵の最大の受給者であるダイズのリソースを合わせて整備することが肝要である。ミヤコグサで収集・開発されるリソースとその情報は，根粒菌との共生による収量性の改良や栄養機能性の向上等，ダイズにおける多種多様な研究の効率化を図る上で欠かせない。また，ダイズの多様な研究がミヤコグサのリソースの整備や開発研究の多様化と方向性に強く影響を与えるのも事実である。わが国は，野生から栽培に至るダイズ遺伝資源の宝庫であるが，それらが整備され，多様な研究分野に安定的に提供されるならば，ダイズ研究の国際競争力の強化にもつながる。

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A collection of 50,000 Tos17-induced mutant rice lines carrying about 250,000 independent insertions was generated. Although transposon-tagging using Tos17 is feasible, tagging efficiency is relatively low, 5-10%. Several lines of evidence indicated that untagged mutations involve deletions caused by double-strand break repair. These mutations can be detected by PCR-based screening method, providing a new resource for functional analysis of genes. DNA pools derived from 50,000 lines have been produced for reverse genetic screening. For in silico screening of mutants of gene of interest, a large scale analysis of insertion mutants by sequencing the genomic DNA sequence flanking Tos17 insertions is in progress. As of December 2003, about 20,000 independent flanking sequences from 5,000 lines have been determined. In the symposium, we will discuss the current status of functional analysis of genes and future prospects.

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イネゲノム解析研究プロジェクトが農林水産省の主導のもとに開始されて12年が経過した。この間、約3000個のDNAマーカー、約1万種類のEST、イネゲノムの約63％を再現した酵母人工染色体（YAC）クローンによる物理地図が初期7年間で作出され、これらは農業生物資源研究所DNAバンクより配布されてきた。1998年に開始された第2期プロジェクトではゲノム全塩基配列決定と重要遺伝子機能解析を目的とし、PAC/BACクローンによる、ほぼイネゲノム全体を再現する物理地図、イネ内在性レトロトランスポゾンTos17による約50，000系統の遺伝子破壊イネ、日本型とインド型イネのいくつかの組合わせによる交配・戻し交配による染色体置換系統、さらに約30，000種類の完全長cDNAが作出されてきた。これらは今後のイネゲノム機能解析研究に欠かせないことから農業生物資源研究所ではこれらの資源の管理提供を平成14年度、ゲノムリソースセンターを開設して開始し、また、更に現在の資源品目を増やすことを目的にしたプロジェクトを平成14年度から開始した。これらのリソースに付随する塩基配列情報はDNAバンクサーバーで管理発信されている。今回のシンポジウムでは配布資源と提供条件の詳細を紹介する（http://www.rgrc.dna.affrc.go.jp/index.html）。

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　シロイヌナズナの根端分裂組織には一群の幹細胞が存在する。幹細胞の維持には静止中心（QC）と呼ばれる、幹細胞に取り囲まれた分裂活性の低い一群の細胞からのシグナルが必須である。QCの形成と幹細胞の維持には、放射軸パターンに関わる二つのGRAS転写因子SCR・SHRおよび植物ホルモンのオーキシンが重要であることがわかっている。我々はプロモータートラップにより、QCと幹細胞において主に発現する遺伝子PLETHORA1（PLT1）とそのホモログであるPLT2を同定した。これらの遺伝子はAP2/EREBPファミリーのAP2サブグループに属し、転写因子をコードすると考えられる。PLT1およびPLT2の挿入変異体の解析により、これらの遺伝子がQCとコルメラ幹細胞の分裂パターン、QCの分化、根端の幹細胞群の維持といった過程に機能することがわかった。また、これらの遺伝子がSCR・SHRとは独立の経路で幹細胞の維持に寄与し、オーキシンの下流で機能することが示唆された。さらに、異所的発現の実験により、両遺伝子が胚発生において胚軸と幼根の分化を促進することが示唆された。以上の結果をもとに、シロイヌナズナにおける根端幹細胞の形成と維持に関するモデルを提唱する。

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In higher plants, post-embryonic root growth depends on the activity of root apical meristem (RAM). The quiescent center (QC) in the RAM is essential to maintain the meristematic activity. To know the mechanism to maintain the QC activity, we are analyzing an Arabidopsis mutant, halted root (hlr). In hlr, the cellular organization of the RAM was disrupted, though its structure was normal in embryo. We showed that the normal QC identity was established during embryogenesis, but it was lost immediately after germination, whereas the specificity of differentiated tissues was maintained. These indicate that the HLR gene is required to maintain the normal QC identity. The HLR encodes a proteasome subunit, AtRPT2a. We showed that the HLR was expressed in the RAM including the QC, and that the proteasomal activity was reduced in hlr. We propose that proteasome-dependent programmed proteolysis is required to maintain the QC identity during post-embryonic root growth.

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　シロイヌナズナでは、根端メリステムの静止中心を核にした規則正しい細胞分裂によって、幾何学的に均整のとれた円柱状の根組織が連続して形成される。tonsoku (tsk)とSS93は、根端メリステムの随所で異常な細胞分裂が生じるために細胞列が乱れて短い根となる突然変異株であり、いずれの変異株も茎頂メリステムの構築にも異常が見られ、葉序の乱れや花茎の帯化を示す。
　TSKはタンパク質間相互作用に関わるLGNリピートとLRRリピートを持つ機能未知の核に局在するタンパク質であり、GFPとの融合タンパク質は核に局在し、タバコBY-2細胞のホモログは細胞周期依存的に発現する。SS93はショウジョウバエMUS308と相同なヘリカーゼドメインと原核生物型DNAポリメラーゼドメインを持つタンパク質である。mus308と同様にSS93変異株もDNA傷害剤に対する高感受性を示し、DNA二本鎖切断の増加に伴うと思われる種々の異常を示す。類似の表現型を示すfas1, fas2 はDNA複製・修復などに関わるクロマチンアセンブリー因子（CAF-1）ホモログの変異であることも合わせて、これら変異株の根端と茎頂メリステムに見られる表現型は細胞分裂時のDNA修復ひいては細胞周期調節の異常によりもたらされると考えられる。

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我々は双子葉植物の根系構築にとって重要な側根形成の分子機構を解明することを目的として、シロイヌナズナ変異体を用いた解析を行なっている。solitary-root(slr)変異体は、オーキシン誘導性タンパク質Aux/IAAファミリーのIAA14の機能獲得変異により、側根を全く形成しない。slr変異体では、本来不安定なIAA14タンパク質が変異により安定化し、その結果、側根形成に関わるオーキシン応答性転写調節因子ARFsの機能を相互作用により恒常的に抑制することによって側根形成を阻害していると考えられる。そこで側根形成に関わるARFsを同定する目的で、ARF遺伝子群の単一および二重変異体の側根形成能について調べた。その結果、ARF7とARF19の二重変異体 arf7 arf19において単一変異体では見られない顕著な側根形成能の低下が観察された。この結果からARF7とARF19が側根形成促進に必要なARFsとして機能することが新たに示された（米国カリフォルニア大学 Theologis研究室との共同研究）。一方、slr変異体の側根欠失表現型を抑圧するサプレッサー変異体ssl2の原因遺伝子はクロマチンリモデリング因子CHR6をコードする。ssl2単一変異体の表現型解析およびSSL2/CHR6遺伝子の発現解析の結果から、SSL2/CHR6は主根の内鞘細胞においてオーキシンに応答した側根原基形成を負に調節することが強く示唆された。本シンポジウムではこれらの知見をもとに側根形成の分子機構について議論したい。

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オーキシンを含む培地でシロイヌナズナの胚軸断片を培養すると不定根を生じる。私達はこの現象を器官新生の一種のモデルと把え、そこに内在する要素機構の遺伝学的同定に取り組んできた。本講演では、私達がこれまでに単離した不定根形成に関わる温度感受性突然変異体（rid1～rid5、rpd1、rgd1～rgd3）を紹介し、それらの解析結果をまとめて発表する。
　変異体の表現型については、不定根形成に加えて、側根形成やカルス形成の比較検討も行い、各変異の作用点を次のように推定した。すなわち、(1) rid1は増殖能獲得過程と根端分裂組織の確立に、(2) rid2は細胞周期再進入に、 (3) rpd1は不定根原基の発達に、(4) rgd1、rgd2は細胞増殖の維持に、(5) rgd3は不定根の成長の維持に、それぞれ特に強く影響する。また、rid5では、胚軸の不定根形成、カルス形成の開始が温度感受性であったが、その際オーキシン応答性の低下が見られた。染色体マッピング、塩基配列解析、相補性検定などの結果、rid5は微小管結合タンパク質MOR1の新規変異であることが判明した。このことは細胞増殖の再開(おそらくは増殖能の獲得)につながるオーキシン情報伝達過程において、微小管系が重要な働きをしていることを示唆している。これら温度感受性突然変異の作用点、その他の知見に基づいて、不定根形成の素過程の再整理を試みたい。

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　根は養水分の吸収や植物体の支持といった機能を持つが，その効率は個々の根の生理特性だけでなく，根系を構成する異なる種類の根の数，長さ，太さやそれらの土壌空間中における配置によって規定される根系構造の違いにより決定される．一般に，多くの双子葉植物では主根とそこから発生した側根が根系を構成するのに対して，イネ，コムギ，トウモロコシといった3大穀類が属するイネ科植物の根系は，その個体発生において順次発生してくる多くの冠根（不定根）によって特徴付けられ，例えば圃場で栽培されるイネの根系は，時には千本以上もの冠根を発生することが知られている．しかしながら，このようなイネ科植物の特徴である冠根形成の分子機構に関してはほとんど解析されていない．そこで我々は，イネを材料に冠根の発生数が著しく減少するcrl1 (crown rootless1) 突然変異体を同定し，その原因遺伝子をポジショナルクローニング法により単離した．その結果，本遺伝子は，シロイヌナズナにおいて葉や側根といった側生器官の基部領域で発現することが知られているLATERAL ORGAN BOUNDARIES（LOB）-domainを持つ遺伝子ファミリーに属するタンパク質をコードしており，根特異的に発現するLOB DONAIN16やLOB DONAIN29に高い相同性を有していた．本発表では，イネ科植物における根系の機能について概観するとともに，CRL1遺伝子の発現様式を解析した結果について報告する．

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品種・系統間に見いだされる変異（自然変異）は従来、複雑な遺伝を示すことから遺伝研究の対象になりにくかった。しかしながら、ゲノム研究の進展により、自然変異が遺伝子単離や遺伝子機能解析のための有用な研究資源として活用できるようになった。演者らは開花期（出穂期）をモデルとした一連の解析により、品種間変異に関与する量的形質遺伝子座（QTL）の染色体上へのマッピング、QTLの準同質遺伝子系統の作出およびマップベースクローニング法による遺伝子の単離・同定を進めてきた。これらの研究によって、品種間変異を決定している遺伝子が分子レベルで単離できることが立証され、その変異の原因となった塩基配列の違いを同定できるまでになった。単離された開花期関連遺伝子はいずれも開花制御における日長反応の遺伝経路を構成する要因であることから、自然変異の利用は日長反応の発現ネットワークの包括的解析に大きく貢献している。このような自然変異を活用したイネ複雑形質のゲノム遺伝学的研究解析手法は、環境ストレス耐性、病虫害抵抗性、形態変異および発芽特性などの品種間に内在する農業上有用な変異の分子遺伝学的解析にも応用可能である。モデル作物であるイネの遺伝子機能研究において、今後自然変異の解析が重要な役割を果たすことが期待される。

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　栽培イネOryza sativa L.はアジアを中心に広く栽培されているアジア原産の種であり，O. glaberrima Steud.は西アフリカで局部的に栽培されているアフリカ原産の種である．両栽培種のゲノム構成はAA（2n=24）であり，それぞれの祖先種を含めて同一ゲノム構成を有する野生種が数種存在する．これらAゲノム種の間では，複雑な生殖的隔離機構が存在するものの，交雑は容易であり，イントログレッション（Introgression）も可能である．
演者らは，有用育種素材と新規遺伝子資源の探索を目的として，数種のAゲノム種の染色体断片をO. sativaに導入する試みを行ってきた．具体的には，戻し交雑とDNAマーカー選抜によって，Aゲノム種染色体断片がゲノム全体をカバーするように染色体置換系統群（イントログレッション系統群）を育成してきた．これらの系統群には多くの自然突然変異が観察され，これまで，生殖的隔離機構や栽培化に関わる遺伝子群を中心に,マッピングを主体とする解析を行ってきた．ここでは，系統群の作出経過と解析を行ってきた生殖的隔離機構や栽培化に関わる遺伝子について紹介する．

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イネゲノムプロジェクトの成果の一つにDNAマーカーの蓄積があり、さらに全塩基配列の解読によって、ゲノム中の任意の場所にマーカーを作出することが可能となった。本講演では、染色体置換系統群（Introgression Lines, ILs）の育成によるDNAマーカーを利用した新しい育種システムについて概説する。ILsは、ある遺伝的背景の一部がドナー由来の染色体に置換された数十系統からなり、ドナー型染色体領域は系統間で重なりをもち、かつ系統群として全ゲノムをカバーする。ILsの利点に、比較的少ない系統数でQTL解析が可能であることが挙げられ、特に遺伝的貢献の評価が困難な形質では利用価値が高い。さらに、有用QTLが検出された系統は、そのまま育種素材となり、短期間で有用形質に関する準同質遺伝子系統(Near Isogenic Line, NIL)を育成できる。演者らは、日本型水稲コシヒカリの遺伝的背景をもつインド型水稲KasalathのILsを育成し、その解析から、着粒数増加、短稈化、玄米品質向上などの有用QTLを検出した。新育種システムは、在来種や野生種などが有する隠れた有用遺伝子を評価し、有望な遺伝資源として利用可能にするばかりでなく、品種育成と遺伝学的研究とを同時並行的に行なえるという点で従来の育種システムを根本から改革するものである。

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　日本を含む先進国では、食生活を含む生活スタイルや居住環境の変化から、高血圧、糖尿病、高コレステロールなどの生活習慣病、また花粉症やダニアレルギーといったアレルギー疾患の患者数が急増している。　高齢化社会を迎え、こうした生活習慣病によってもたらされる各種疾患により国民医療費は増加し、国家財政を圧迫することは確実であることから、予防医療の重要性が叫ばれている。こうした背景から、生活習慣病やアレルギー疾患の予防や緩和する機能を持つ作物が開発され、毎日の食事を通じて病気を予防できるようになれば、このような遺伝子組換え作物は消費者に利点があることから社会的な認知が得られ、同時に今後急激に増加すると予想される医療費削減にも貢献できる。そこで我々は、高コレステロールや高血圧といった生活習慣病に対して、食物由来の生理機能性タンパク質や生理活性ペプチドを、日本人の主食であるお米の可食部の胚乳中に、高度に集積させた組換えイネを作出している。また花粉症やダニアレルギーなど1型アレルギーに対しては、抗原（アレルゲン）特異的なT細胞の反応性を抑えるため、アレルゲンのT細胞抗原決定基を種子胚乳中に蓄積させることで、食べるペプチドワクチン米としての開発を進めている。すなわち、日本人主食である米を毎日食べることで、生活習慣病やアレルギー疾患を緩和・予防できるような健康機能性米の可能性を検討している。

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2002年12月のイネゲノム完全解読宣言を受けて、2003年3月から、16名のイネ若手研究者(イネ10年計画ワーキンググループ)が、これまでのイネ研究において日本の研究者が果たした役割を総括し、イネ研究の現状の再確認を行い、そして、今後のイネ研究のあり方について議論し、これからのイネ研究に関する提案書を作成した。本発表では、その活動を報告すると共に、シロイヌナズナ研究を相補する単なる「モデル植物」としてのイネではなく、農業形質に目を向けた基礎研究を推進し、その成果を社会に還元する応用研究をも包括した研究を進めていく材料としてのイネ、すなわち、「モデル作物」として、イネを位置づけるべきではというメッセージをいくつかの事例を挙げながら紹介したい。なかでも、これからのイネ研究における中核となる分野として、イネ属の多様性(品種間差を含む)に基づいた研究を位置付け、その基盤となる研究を早急に立ち上げていく必要性を提言したい。さらに、基礎研究と応用研究を有機的に結びつけるために、マニフェスト型プロジェクトを立ち上げ、従来の組織、体制、職責にこだわらず、組織横断的な研究チームを立ち上げ、計画的・効率的に研究を進める事が重要であることを提案する。

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　概日リズムと光は、光周性依存型の花成制御に強く影響を及ぼす。我々は、2つのMyb様転写制御因子であるLHYとCCA1が、概日リズム制御と花成時期のコントロールに深く関わることを明らかにしてきた。現在、多重変異体を用いた遺伝学的解析とマーカー遺伝子の詳細な発現解析を行っている。概日リズム制御因子LHYとCCA1が関わる花成制御における、GI、CO、FT、SOC1、FHA/CRY2が果たす役割について報告する。LHY、CCA1、LKP2などの概日リズム制御因子を恒常的に過剰発現させると、長日条件下で優性の花成遅延形質が生じる。花成制御に関する変異体を探索する過程で、長日条件下で優性の花成遅延形質が生じるという点でこれらと類似した変異体を2種（lhy-2、dll1）単離した。また、lhy cca1二重変異体の短日条件下での早咲き形質に関するエンハンサー変異(elc1)を同定した。これらの変異体の形質、原因遺伝子について報告する。
　概日リズム制御過程でリン酸化が重要な働きをもつことが明らかにされつつある。例えばLHYやCCA1はCK2と直接結合し、かつリン酸化され、CK2B遺伝子の過剰発現により時計制御遺伝子の発現周期が短縮することが報告されている。我々は、花成／概日リズム制御に関わるリン酸化酵素遺伝子の同定を目指し、トランスポゾン挿入型の遺伝子破壊株を用いてスクリーニングを行っている。現在までに単離されている変異体について報告する。

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我々は、短日植物イネを材料に用いて光周性花芽形成の分子機構を解析し、長日植物シロイヌナズナの花芽形成分子機構といろいろな側面から比較することで、高等植物が持つ花芽形成機構の多様性を理解しようと考えている。これまでに、進化的に保存された花芽形成経路、すなわち、概日時計 - CO転写因子 - FT花芽誘導因子からなる経路の後半がイネとシロイヌナズナで異なっていることを明らかにし、イネの日長認識機構の分子モデルを提唱している。本発表では、COやそのイネオーソログであるHd1のFT（およびイネオーソログHd3a）プロモーター転写制御のメカニズムを一過性発現解析系を用いて解析した結果を発表する。また、最近になって、QTL解析により同定されたイネの開花を制御する遺伝子Ehd1を単離した。Ehd1遺伝子はBタイプのレスポンスレギュレーターをコードしており、Hd3a等を転写制御すること、また、Ehd1の過剰発現により、イネの開花を促進できること、さらに、シロイヌナズナにオーソログと考えられる遺伝子がゲノム情報に存在しないことを明らかとした。これらの結果は、イネに特異的な光周性花芽形成経路が存在し、FT相同遺伝子の転写制御の段階で花芽形成信号が統合されていることを示唆している。今回、Ehd1経路を組み込んだ短日植物イネ花芽形成の制御を長日植物シロイヌナズナの分子機構と比較し、植物が持つ花芽形成機構の多様性に関して議論する。

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アサガオ（Pharbitis (Ipomoea) nil cv. Violet）は敏感な短日植物であり、光周性花成誘導機構の研究に広く用いられる。我々は双子葉植物の短日性花成誘導機構の解明を目的として、生化学的・分子生物学的手法を用いて短日性花成誘導機構に関与する遺伝子の単離・同定を行う一方、長日植物シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の光周性花成誘導機構との比較解析を行った。アサガオの葉からDifferential Display法を用いて単離されたPnC401は、暗期の後半に発現上昇を示す新規遺伝子であり、蛋白質間相互作用等に機能するpentatricopeptide repeat (PPR)ドメインをコードしていることが明らかになった。PnC401の発現はサーカディアン・リズム発現を示し、その位相が短日条件と長日条件で異なること等、花成誘導機構への関与が示唆される。PnC401のシロイヌナズナの相同遺伝子は2つあり、最初に単離したAtC401のC401ドメインはYeast Two-hybrid screeningではCONSTANS (CO)と作用することが示唆された。アサガオにおけるCO及びFLOWERING LOCUS T (FT)の相同遺伝子の発現解析を併せ、アサガオにおける光周性花成誘導機構について考える。

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花芽分化誘導に関与する過程は、光周期依存、春化依存、シベレリン依存、および、自律的の各促進経路と、これら4 つの促進経路からのシグナルを統御する過程が存在すると考えられている。阿部ら(2002)が単離、解析した PDF2遺伝子は、ホメオボックス遺伝子の中でもHD-GL2クラスに属する遺伝子で、ホメオ・STARTドメイン、Zipモチーフを持ち、FWA、ATML1、ANL2と同じクラスの遺伝子群に属している。また、PDF2遺伝子は茎頂分裂組織や器官原基の最外層(L1層)特異的に発現するという特徴をもつ。このPDF2遺伝子のcDNAをカリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーターの下流につなぎシロイヌナズナの野生型に導入し過剰発現させると、その形質転換植物は花芽分化誘導が遅れることが報告された。この知見は、前述した花芽分化誘導の統御過程で重要な役割を担っているFWA遺伝子の異所的な過剰発現による花芽形成遅延の表現型と一致することから、過剰発現したPDF2遺伝子が統御過程の遺伝子と相互関係し、花芽形成誘導を遅延させていると考えた。
そこで我々は、PDF2過剰発現体を用いて花芽分化誘導時における遺伝的統御過程の解析を進めた。PDF2過剰発現体における花芽分化誘導関連遺伝子の発現解析の結果、過剰発現したPDF2遺伝子は花芽分化誘導の統御過程において負の制御に関係していることがわかった。本発表では、これまでの知見を含め、現在までの進行状況を報告する。

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シロイヌナズナでは、様々な経路からの花成シグナルはFT、SOC1/AGL20、LFY（経路統合遺伝子）に統合され、花成の最終段階に伝えられる。我々は「経路統合遺伝子」FTの機能に関心を持って研究を進めてきた。弱い遅咲き表現型を示すfdは、35S::FTの早咲き表現型に対しては非常に強い抑圧効果を示す。このことから、FD活性は35S::FTの早咲き表現型に必要であると考えられる。fd;lfyでは花芽分裂組織遺伝子の発現が減少し、35S::FDではこれらの遺伝子の発現が上昇していることから、bZIP転写因子をコードしているFDがFTと花芽分裂組織遺伝子を結ぶ遺伝子であると考えている。優性の花成遅延変異体fwaは、プロモーター領域のDNAメチル化の低下により、FWAが異所発現している。遺伝学的解析の結果、FWAはFTあるいはFTよりも下流の経路を阻害すると推測された。そこで、FWAを用いることによりFTより下流の制御経路についての情報が得られると期待し、FWAによって機能が阻害されるような蛋白質の探索を行っている。

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細胞内共生によって獲得されたオルガネラ、ミトコンドリアと色素体（葉緑体）は分裂によってその数を維持してきているのであるが、その分裂機構は、進化の過程の中でバクテリア分裂様式と真核制御機構の融合体となっている。これら2つのオルガネラはまったく異なる機能性と形態を保持しているが、進化の初期の段階において、非常によく似た3つのリングからなる分裂機構を獲得していたことが、近年の研究から明らかとなった。原始的な紅藻、Cyanidioschyzon merolaeは、そのオルガネラが極めて単純な形態で、かつ同調的に分裂させることが出来、またそれらの分裂面に色素体分裂（PD）リングあるいはミトコンドリア分裂（MD）リングという構造体が観察できるという利点から、オルガネラ分裂の基本的なモデルとして確立されてきているが、このPD／MDリングに加えて、これらのオルガネラにはバクテリア細胞分裂因子であるFtsZと、真核生物特有のDynaminという2つのGTPaseがさらなる分裂リングとして重要な働きをしていた。これらの詳細な局在解析をもとに、それぞれのリング構造の機能は、分裂面の位置決定、収縮そして分断であろうと考えられる。

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葉緑体は原始真核生物への原始原核光合成細菌の細胞内共生によって生じたと考えられている。そのため、宿主である原始真核生物は原始原核光合成細菌の分裂を制御するために、共生後に新たな制御機構を発達させたと考えられる。この制御機構の解明を目的として、我々はシロイヌナズナの葉緑体分裂変異体arc3の遺伝子同定を行った。マッピングと相補実験からARC3遺伝子は742アミノ酸をコードしており、N末領域がバクテリアの分裂制御因子であるFtsZとのホモロジーがあり、C末領域は真核生物でよく知られているシグナル伝達因子のPhosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase (PIP5K)の一部とホモロジーがあった。抗体による解析からARC3タンパク質はFtsZ タンパク質と同様に葉緑体の分裂面に存在していた。また、ARC3タンパク質のPIP5K領域は高等植物のシグナル伝達因子として機能しているCDPKによってリン酸化され、ARC3タンパク質の活性はリン酸化によってネガティブに制御されている事が示唆された。これらの事よりARC3遺伝子は、真核生物が原核細胞由来の葉緑体の分裂を制御するために、真核型の遺伝子と原核型の遺伝子が融合して生じたためと考えられる。現在、ARC3遺伝子の発現制御機構の解析とARC3タンパク質と相互作用する因子の同定を行っており、植物細胞における葉緑体の分裂制御機構について現在までに解明されている事を示すと同時に、今後の展望について話題を提供する。

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シロイヌナズナのcrumpled leaf (crl)変異体においてはプラスチドの分裂が阻害され、プラスチドが大きくなり1細胞あたりのプラスチド数が減少する。さらにcrl変異体では細胞分裂方向、細胞分化にも異常が見られる。CRL遺伝子は核ゲノム上の遺伝子で、コケ、シダを含む様々な植物に保存されている。さらにCRLと有意な類似性を示すタンパク質がラン藻のゲノム上にもコードされている。CRLタンパク質は葉緑体外包膜に存在するタンパク質であるが、プラスチド分裂・ラン藻を含む原核生物の分裂に関与するタンパク質を含め機能既知のいかなるタンパク質とも有意な類似性をもたない。Rubisco 小サブユニットのトランジットペプチドをN末端に融合したGFPがcrl変異体の発生初期の葉原基や根の先端の細胞においてプラスチドへ輸送されないこと。および、抗CRL抗体を用いてCRLタンパク質を含むシロイヌナズナの膜タンパク質画分からCRLタンパク質を含むタンパク質複合体を精製すると、Rubisco 小サブユニットの前駆体タンパク質が回収されることとから、我々はCRLタンパク質はプラスチドの分裂に直接関与するというよりはむしろプラスチドへのタンパク質輸送に関与すると考えている。シンポジウムではプラスチドへのタンパク質輸送とプラスチドの分裂および植物の細胞分裂・分化との関連について我々が考えている作業仮説を紹介したい。

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高等植物のペルオキシソームは、脂肪酸代謝、光呼吸など植物の一生を通じて重要な機能を担っているが、その形成・分裂機構についてはほとんど明らかにされていない。我々は緑色蛍光タンパク質 (GFP)を指標に、シロイヌナズナにおいてペルオキシソームの形態が異常になった apm (aberrant peroxisome morphology) 突然変異体を選抜し、解析を進めている。得られたapm 変異体のうちapm1変異体は、ペルオキシソームの形が長くなり、細胞内の数が減少することから、ペルオキシソームの分裂が抑制された変異体と考えられる。マッピングにより、APM1 遺伝子は、ダイナミンファミリーの1つである ADL2A (Arabidopsis dynamin-like protein 2A) をコードしていた。興味深いことに、apm1変異体では、ペルオキシソームと同様、ミトコンドリアの分裂も抑制されており、ADL2A タンパク質はペルオキシソームとミトコンドリアの両オルガネラに局在することが明らかとなった。これらの結果は、APM1/ADL2A タンパク質はペルオキシソームとミトコンドリアという2種類のオルガネラの分裂に関与していることを示している。apm1 植物体では生長抑制が観察され、これはペルオキシソームとミトコンドリアの両オルガネラの協調する代謝系の活性が低下していることを示唆している。

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動物や酵母では、ミトコンドリアは分裂だけでなく融合も行い、このバランスによって形態を維持していることが知られている。しかしながら、これまで高等植物ではミトコンドリアの融合現象ははっきりと確認されていなかった。また、動物酵母で見つかったミトコンドリア融合関連遺伝子（Fzo1, Ugo1など）のホモログも、高等植物においては未だ見出されていない。そこで我々は今回、蛍光たんぱく質カエデを用いて、高等植物においてもミトコンドリア融合の現象を確認したのでこれを報告する。カエデは発現当初は緑色の蛍光をもつタンパク質であるが、350-400nmの光を短時間照射されることで、赤色の蛍光を持つタンパク質に不可逆的に変化するという特徴をもっている。ミトコンドリアプレシークエンスをもつカエデの植物用発現ベクターを製作し、これをタマネギ表皮細胞に一過的に導入した。これに通常の蛍光顕微鏡を用いて、細胞の一部分のみをUV光照射を行うことで、ひとつの細胞内に緑と赤に色分けされたミトコンドリアを共存させることに成功した。そして、この細胞内で緑と赤のミトコンドリアが融合し、黄色のミトコンドリアが出現する様子を確認することができた。高等植物においてもミトコンドリアが頻繁に融合が行われていること、またその融合とともに分裂が行われ、その形態が維持されているらしいことが確認できた。

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