Cucumber (Cucumis sativus) seedlings grown at 30^oC differed in morphology from those grown at 20^oC. Hypocotyl elongation over a period of 12 days showed a sigmoidal increase with time at both temperatures, although a greater final length of the hypocotyl was obtained at 30^oC. The temperature quotient, Q₁₀for hypocotyl elongation was 2.6. Apart from the difference in hypocotyl length, many other differences in morphological features were observed. Among these changes, trichome morphology at 30^oC was conspicuous. The present study focused on changes in trichome morphology at cellular level. We previously reported ethylene's involvement in its alteration (Plant Physiology, in press). A higher production of ethylene by cucumber seedlings grown at 30^oC than at 20^oC was observed . From these results, we discuss the relationship between high temperature-induced morphological changes in plants, and the involvement of ethylene in these responses.

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植物は環境ストレスに対して多くの酵素タンパク質を誘導することでそれぞれの環境に適応している。しかし、植物細胞内で常時発現している酵素タンパク質も種々のストレス防御に関与しているが、その発現量が少ないことからその生理的意義が明確でないものも少なくないと考えられる。そこで本研究では、アクティベーションタギング法を用いて酸化的ストレス耐性に関与するタンパク質遺伝子の単離・解析を試みている。現在までに、約8,500株のシロイヌナズナアクティベーションタグラインを作製し、そのうち2,750株を酸化的ストレスの指標としてパラコート(3 μM)添加によりスクリーニングを行った。その結果、酸化的ストレス耐性を示す2株の変異体（pqr-236、pqr-242）を選抜した。pqr-236はT3世代においてもパラコート耐性の表現型を示した。そこで、これら2株のT-DNA挿入位置を決定するため、TAIL-PCRにより解析を行った結果、pqr-236ではAt3g54920とAt3g54910の間に、pqr-242ではAt2g28660とAt2g28650の間にT-DNAが挿入されていた。現在、これら変異体におけるパラコート耐性の表現型の原因遺伝子を同定するために、T-DNA近傍遺伝子の発現量の解析およびそれぞれの過剰発現体の作製を行っている。

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　乾燥、高塩下におかれた植物の萎れ、枯死などの障害に活性酸素が関わっている可能性が高い。活性酸素消去において中心的役割を担っているスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)とアスコルビン酸ペルオキシダーゼ(APX)を葉緑体で高発現させた2種の形質転換タバコを作出し、乾燥、高塩等のストレス耐性について調べた。
　アラビドプシスのAPXcDNAの上流にアラビドプシスグルタチオン還元酵素の葉緑体トランジットペプチド遺伝子を付けることにより、APX葉緑体高発現型形質転換タバコを作出した。イネCu-Zn-SODcDNAを用いて同様な方法でSODを葉緑体で高発現させた形質転換タバコを作出した。これら両形質転換タバコへの活性酸素生成試薬パラコートと亜硫酸の影響を調べた。また両形質転換タバコを、水欠乏、0.3 M NaCl 、10% polyethylene glycol処理した時の光合成活性を調べた。
APX葉緑体高発現型形質転換タバコは対照タバコよりも3.8倍のAPX活性を示すとともに、2倍のSOD活性を示した。SOD葉緑体高発現型形質転換タバコは対照タバコよりも4.6倍のSOD活性、2.5倍のAPX活性を示した。両形質転換タバコの亜硫酸、パラコート、水欠乏、高塩、polyethylene glycol耐性について検討した結果、これら全ての光酸化ストレスに対して明らかな耐性の上昇が認められた

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植物のCuZn-SODは陸上植物と一部の藻類に分布し、葉緑体型および細胞質型のアイソフォームが存在する。我々は昨年度の本学会で緑藻Spirogyraの葉緑体型CuZn-SOD遺伝子は高等植物に比べイントロンを葉緑体移行シグナル領域に一つ余分に持ち、この位置が細胞質型遺伝子のイントロンと同じであることから、葉緑体型遺伝子から細胞質型遺伝子が生じた可能性を報告した。今回はCuZn-SODアイソフォームの分子系統進化関係を明らかにする目的でコケ植物Pogonatum inflexumよりCuZn-SOD遺伝子を単離しその構造を調べた。Pogonatumの葉緑体型 (sod-2) および細胞質型CuZn-SOD (sod-3)をコードするcDNAの塩基配列を基に、PCRによりそれぞれの遺伝子の中央部分を増幅した。さらにこれらの両端部位の配列より遺伝子特異的プライマーを作成し、GenomeWalker Kitを用いたPCRでそれぞれの遺伝子の5'上流および3'下流のDNA断片を得、最終的に7 .1 kbp (sod-2) および5.6 kbp (sod-3) の塩基配列を決定した。sod-2 は9個のエキソン、8個のイントロンがあり、藻類のものと同数であった。藻類で特徴的な第1イントロンはPogonatumでは5'-UTR領域にあり、Spirogyra遺伝子の場合の葉緑体移行シグナル領域よりやや上流に存在していた。一方sod-3 は高等植物のものと類似していた。これらの結果は、葉緑体型CuZn-SOD遺伝子からの細胞質型CuZn-SOD遺伝子の分岐はコケ植物の出現以前であることを示している。

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To study the differential responses of plant to the iso-osmotic conditions (-0.6MPa) of salt and drought stress, NaCl (150mM) and PEG 6000 (20%) were applied to young barley seedlings at the second leaf stage for 10 days.
Shoot fresh weight of barley was more severely reduced by NaCl (43%) compared to PEG (19%) after 10 days. Leaf water potential was slightly affected by PEG, but drastically decreased by NaCl. Malondialdehyde content was increased slightly by PEG but almost doubled by NaCl. Salt stress enhanced the activity of ascorbate peroxidase, catalase (CAT) and glutathion reductase, while only CAT activity was increased by drought stress. These results indicate that a different mechanism of barley might be involved in scavenging active oxygen species under mild iso-osmotic conditions of salt and drought stress, and that the CAT activity might be induced more promptly than other enzymes by a different subcellular environment under drought stress.

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　GLP-1はインスリンの分泌を誘導する活性を持つ30アミノ酸からなるホルモンペプチドであり、糖尿病の治療に効果があると期待されている。我々は改変型GLP-1（mGLP-1）を胚乳特異的で高発現を示すGluB-1プロモーターの制御下で発現する形質転換イネを作製した。しかし得られた形質転換体からはmGLP-1の蓄積は認められず、得られた約半数の形質転換体でグルテリンタンパク質の減少がみられた。2次元電気泳動やノーザン解析の結果、グルテリンタンパク質の減少はグルテリンBファミリーのmRNAレベルでの発現抑制のためであることが分かった。さらに発現抑制が起こっている系統で導入遺伝子のsmall RNAが検出され、RNAiが起こっていることが示唆された。
　そこでmGLP-1とGFPの融合タンパク質を発現する形質転換イネと5連結したmGLP-1を発現する形質転換イネを作製した。mGLP-1は融合タンパク質ではその活性が失われる可能性があるので、GFPとの間に自動切断配列である2A polyproteinの配列を導入した。それぞれの形質転換体を解析したところ、それぞれのmRNAが検出され、RNAiが起こっていないことが示された。しかし2A配列により切断された（切断効率は約90%）後のmGLP-1ペプチドの単体は検出されなかった。一方、mGLP-1を5連結した系統では約18.6 ug / 1粒のmGLP-1ペプチドの蓄積が認められた。

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我々は、樹木にマルチストレス耐性を付与することを目的として研究を進めている。
昨年度の本大会で、シロイヌナズナ由来のrd29A遺伝子のプロモーター領域とストレス応答制御遺伝子の1つであるDREB1A遺伝子から構築されたストレス耐性付与遺伝子をユーカリに導入し、ストレス耐性が向上することを報告した。しかしながら、rd29A遺伝子のプロモーターはユーカリに導入した場合、発現が非常に弱いことが明らかとなった。そこで、遺伝子組換えによる実用的なストレス耐性ユーカリを作出するために、ユーカリにおける効果的なストレス応答プロモーターを獲得することを試みた。
本研究では、塩ストレス処理区と無処理区においてサブトラクション法により塩ストレス応答遺伝子群を選抜すると共に、別に作製した各々の処理区由来cDNAライブラリーから任意のクローンを大量解析した。その結果、塩ストレス処理時において特異的であって、かつ検出頻度が高いcDNAクローンを3種、単離した。これらは既知データベース検索により、デハイドリンをコードする遺伝子、機能不明の塩ストレス応答遺伝子であることが示された。これら3種のユーカリ遺伝子についてストレス応答時の発現差異を認めたので、その結果を報告する。
　尚、本研究は独立行政法人農業・生物系特定産業技術研究機構、生物系特定産業技術研究支援センター、新事業創出研究開発事業からの支援を受けて行っている。

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RIKEN Genomic Sciences Center generated approximately 50,000 activation tagged lines. Seeds are preserved at T2 (segregated) generation. We are collecting seeds images from each lines and trying to pick up numerical data of seed shape, size and color. And we also try to set up conditions to distinguish between recessive and dominant mutation, simultaneously. Thirty seeds from each lines were put in a well which was inserted between two transparent plastic sheets. One set of sheets contains 50 lines and was subjected to a flatbed scanner. The collected images were cut into each wells and numerical data (seed size, shape and color) were extracted by WinSeedle. In this poster, we presents a model case of analysis of known seed morphological mutants.

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　我々は今までに、Gateway cloning法が利用できるバイナリーベクター、特にレポーターやエピトープタグとの融合を行うことが可能なベクターシリーズを作製してきた（pGWB）。これらを用いることでタグ付きタンパク質を植物で発現させることが容易にできるようになった。今回はこれらのベクターを発展させ、2つの遺伝子を同時にクローニングでき、またそれぞれにレポーター・タグが融合可能なバイナリーベクターシステムを開発することにした。遺伝子機能の研究において、2つの遺伝子の相互作用を細胞学的・生化学的に解析することは非常に重要である。そのため着目する2つの遺伝子に自在にレポーター・タグを融合し、1つのベクターに載せて同時に発現させることが可能なシステムは極めて有用であると考えられる。
　従来のpGWBシリーズではattR1とattR2配列を用いて1つの遺伝子のクローニングを行っていた。今回はもうひとつの遺伝子をクローニングするために、attR3、attR4という新しい組換え配列も有するベクターを構築した。このような構造のベクターを用いることで、2つの遺伝子を1ステップで同一ベクター上にクローニングすることが可能である。本ベクターの応用例についても紹介したい。

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植物特異的転写因子ファミリーであるNACファミリーは、PetuniaにおけるNo Apical Meristem（NAM）変異体の原因遺伝子として初めて単離された。シロイヌナズナでは100以上のNACファミリーに属する遺伝子が存在すると考えられているが、それらの大部分は機能が未知のままである。その原因のひとつとしてNACファミリーは機能重複した遺伝子が多数存在するため、1つの遺伝子に機能障害が生じても植物体に変異形質が現れないという可能性があげられる。例えば子葉の分離に関わるNAC遺伝子群はCUC1, CUC2, CUC3のうち少なくとも2つ以上に機能障害が生じないと変異形質が現れない。本研究では、転写因子のC末端に転写抑制化ペプチドを融合させた優勢的に働くキメラリプレッサーを植物体に過剰発現させる手法（CRES-T法）によりシロイヌナズナの全NAC遺伝子を解析している。その結果、子葉、がくなど植物の様々な組織の境界分離に関わるNAC遺伝子は、これまでに報告されたCUCファミリー(CUC1, CUC2, CUC3)だけではなく、多重に機能重複して存在していることが明らかになった。これまでの結果と植物組織の境界分離におけるNACファミリーの役割について考察する。

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　近年ダイオキシン類の環境汚染が社会問題となってきており、汚染の有効的な除去法として、植物を用いるいわゆるファイトレメディエーションが注目を集めている。そこで本研究では従来からダイオキシン類の生分解についての報告の多い白色腐朽菌の産生するリグニンペルオキシダーゼ(Lip)、マンガンペルオキシダーゼ(Mnp)、ラッカーゼ(Lac)の三種類のリグニン分解酵素群に着目し、これらの遺伝子を導入した組換え植物体を創製しダイオキシン類の生分解性を検討することを目標とした。まず白色腐朽菌のmRNAをテンプレートとしたRT-PCR法でいくつかのcDNA断片を釣ってきた。これらの塩基配列をDNAシークエンサーで解析し、DNAライブラリで検索したところP.chrysosporiumからLiP及びMnP、T.versicolorからLacのmRNAが何れも95％以上の高い相同性で得られた。そこでバクテリオファージラムダと大腸菌ゲノム間の相同組み換え反応を応用した遺伝子クローニングシステム(Gateway Technology/Invitrogen)を用いてLiP、MnPおよび Lac完全長cDNAのクローニングを試みた結果、各酵素cDNAの塩基長に相当するPCRバンドが得られた。 さらにシロイヌナズナ(A. thaliana )ゲノムへのLiP、MnPおよび Lacの各酵素遺伝子の導入を試みた。

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The RmpA and rmpB genes encoding 3-hexulose-6-phosphate synthase (HPS) and 6-phospho-3-hexuloisomerase (PHI) are the key enzymes of the ribulose monophosphate pathway for formaldehyde (HCHO) assimilation in Mycobacterium gastri MB19, a gram-positive facultative methylotrophic bacterium. These two genes were introduced into Arabidopsis and tobacco under the control of tomato rbcs-3C promoter with its transit peptide. The expression of the two genes was detected and active HPS and PHI was generated in both transgenic plants. The expression of the two genes enhanced the tolerance of the transgenic plants to HCHO and their ability to uptake evaporated and liquid HCHO. Tracer experiments showed that HCHO was assimilated through the reaction of the two enzymes in transgenic plants.

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RNAiによって葉緑体局在型ω-3脂肪酸不飽和化酵素遺伝子NtFAD7の発現が抑制されるかどうかを調べるために、NtFAD7二本鎖(ds)RNAを発現させた形質転換タバコを作製した。その結果、ノーザン解析レベルにおいて、内在性のNtFAD7 RNAの蓄積が観察されず、葉緑体膜脂質のMGDGやDGDG、PGのαリノレン酸が顕著に減少した形質転換タバコが得られた（2002年度年会報告）。これらの形質転換タバコにおいて、低分子RNA画分を精製し、NtFAD7 cDNAをプローブにノーザン解析を行ったところ、siRNAが検出された。葉緑体外膜脂質のPCやPE、PIのαリノレン酸は、主に小胞体局在型ω-3脂肪酸不飽和化酵素NtFAD3によって合成されると考えられる。NtFAD7 dsRNAを発現させた形質転換タバコにおいて、これらのαリノレン酸含量も減少していたので、NtFAD3遺伝子のノーザン解析を行ったところ、野生型の約30％から75％までに蓄積量が減少していた。以上のことから、NtFAD7 dsRNAまたはsiRNAは、ホモロガスなNtFAD7遺伝子の発現を強く抑制するばかりか、ヘテロガスなNtFAD3遺伝子の発現も弱く抑制することが示唆された。

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In vitro系は、遺伝子発現過程（転写、RNAプロセス、翻訳など）の解析に最も重要な手法である。我々は、タバコBY-2細胞の単離核よりin vitro転写系を開発した。この系は、植物RNAポリメラーゼI、II、III全ての転写を正確に行うことができる。更に、この系を改変して、pre-tRNAのスプライシングも行うことができる。この系を用いて植物固有の転写機構を解析した。ついで、単離タバコ葉緑体よりin vitro転写系、RNAエディティング系及び翻訳系をそれぞれ開発した。これらの系を用いて、核ゲノムコードの葉緑体RNAポリメラーゼの新しいプロモーターモチーフや数種の葉緑体mRNAの新しい翻訳開始機構を見出した。高等植物の葉緑体では、転写物の約30ヶ所にRNAエディディング（CからUへの変換）が起きることが知られている。In vitroRNAエディディング系を用いて、数種のmRNAのエディティングのシス配列を、エディットされるC残基の上流約10ntと同定した。ついで、各々のエディットされるC残基は、別々のトランス因子で識別されることを見出した。さらに、トランス因子がエディットされるC残基にも作用することを発見し、RNAエディディングの新しい機構モデルを提唱した。我々のRNAエディディング抽出液の調製法は、エンドウの葉緑体やミトコンドリアにも適用できる。

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植物は土壌中からの無機窒素栄養の供給量に応じて代謝レベルでの活性調節から形態的な変化にいたる多様な応答を秩序だてて示すことで、限られた窒素供給下での生育を可能にしている。我々は窒素情報伝達機構研究に分子生物学的手法を取り入れるべく、硝酸還元からアンモニア同化に関わる一連の窒素同化関連遺伝子群を単離・同定し、無機窒素源に対する発現応答様式を詳細に解析した。その結果、(i) 硝酸イオン特異的応答に関わる発現制御ネットワークがこれまでの認識よりはるかに広く及ぶこと、(ii) C4植物トウモロコシの2種類の光合成細胞（維管束鞘細胞と葉肉細胞）においてアンモニア生成の原因となる光と硝酸イオンに対してプラスチド型GS (GS2)遺伝子が細胞特異的な応答を示すことを明らかにした。さらに、(iii) トウモロコシのサイトソル型GS分子種の中からアンモニア特異的に根で発現誘導される分子種(GS1c, GS1d)を見出し、この分子種の酵素学的性質の解析から、根細胞内のアンモニア濃度の上昇への一時的な対応機構を明らかにした。現在では窒素情報の長距離伝達における硝酸イオンとサイトカイニンの果たす役割と生理的機能分化について明らかにするべく研究を展開している。本講演ではこれら研究経過の概要について紹介したい。

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ホウ素が植物の必須元素であることが発見されたのは80年前である。最近、ホウ素は動物でも必須であることが示されてきている。ホウ素は植物に受動的に吸収され蒸散流に乗って体内を移行すると考えられてきた。本研究においては、このような定説を覆し、植物がホウ素を積極的に輸送することを示すと共に、輸送を担うトランスポーターの同定と解析を行った。シロイヌナズナbor1-1変異株は正常な生育に比較的高濃度のホウ素を必要とする。bor1-1変異株においては地上部のホウ素濃度が野生型株より低く、トレーサー実験によって根から地上部への輸送に欠損があることが明らかになった。ポジショナルクローニングによってBOR1をAT2G47160と同定した。BOR1は10回膜貫通型のタンパク質と予想され、細胞膜に局在することを明らかにした。また、BOR1は主に根のpericycleで発現していた。BOR1を酵母で発現させると細胞内のホウ素濃度が低下することを見いだした。これらの結果はBOR1は排出型のホウ素トランスポーターであり、根の導管周辺で発現することで、地上部へ積極的にホウ素を輸送していることを示している。BOR1は生物界ではじめて同定されたホウ素トランスポーターであり、酵母の相同遺伝子YNL275wもホウ素輸送体であることを明らかにした。BOR1相同遺伝子は植物に限らず真核生物に広く存在しており、これらが生物界でのホウ素輸送を担っている可能性が考えられる。

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　感光性（日長反応性）はイネの開花（出穂）時期を決定する主な要因である。Heading date 3a (Hd3a) 遺伝子座は、イネの日本晴とKasalathの雑種後代により見出された感光性関連のQTL（量的形質遺伝子座 ）のひとつで、短日条件下でKasalathの対立遺伝子が日本晴に比較して出穂を促進することが知られている。我々はマップベースクローニングにより、Hd3a遺伝子がシロイヌナズナの花成促進因子FT遺伝子のオーソログであること、短日条件でHd3a mRNAの蓄積が誘導され、それにより出穂が促進されることを明らかにした。Hd3aは短日条件でHd1との遺伝学的相互作用が確認されており、発現解析の結果、Hd3aの発現は短日条件下でHd1による制御を受けることが明らかとなった。Hd1は、シロイヌナズナでFTの上流に位置するCONSTANS (CO)と相同な遺伝子である。以上の結果から、短日植物のイネと長日植物のシロイヌナズナでHd1とCOによりそれぞれHd3aとFTの発現が制御され、開花が促進されるという機構が保存されていることが明らかとなった。一方、短日および長日条件下でのHd1とCOのmRNA蓄積量の日周変動パターンは類似しているにもかかわらず、Hd3aは短日条件で、FTは長日条件で強く誘導され、その日長反応性は異なることも確認された。

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タバコ培養細胞BY-2にジャガイモ疫病菌の生産するタンパク質性エリシターINF1エリシチンを処理するとpleiotropic drug resistance (PDR)-type ATP-binding cassette (ABC) transporter like protein (NtPDR1)の遺伝子発現が誘導される。NtPDR1の発現は、エリシチンだけでなく細菌由来のエリシター フラジェリンや非特異的エリシターであるYeast Extractの処理あるいはメチルジャスモン酸の処理によっても誘導されたが、アブシジン酸やサリチル酸の処理では誘導されなかった。また、NtPDR1の発現は植物の代表的な防御遺伝子であるPALと同様、タンパク質リン酸化酵素の阻害剤やタンパク質合成阻害剤の処理により抑制された。NtPDR1遺伝子のプロモーターにはGCC box、as-1 box、ジャスモン酸応答性エレメントの他、複数のW Boxが存在していた。これらの結果はNtPDR1が塩基性PRタンパク質の一つであることを示唆している。植物の病原菌防御応答の一つとして抗菌性物質の合成蓄積が挙げられる。細胞膜に局在していると予想されるNtPDR1遺伝子産物は植物細胞・病原体双方に毒性を示す抗菌性物質を細胞外に輸送し、効果的に病原体の生育を阻害していると推定される。

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　ペルオキシソームは、脂肪酸β酸化、グリオキシル酸回路およびグリコール酸代謝などの代謝系を持ち、脂肪酸分解や光呼吸などの生理機能を担っている。我々は、2,4-dichlorophenoxybutyric acid耐性変異体の解析から、ペルオキシソームの脂肪酸分解に必須な3つの遺伝子（PED1、PED2、PED3）を同定した。
　これらのうちPED3遺伝子は、分子量140kDのペルオキシソーム膜タンパク質Ped3pをコードしている。このタンパク質は互いに類似性をもつドメインがタンデムに2つ繰り返された構造をとっており、典型的な"full-size" ABCタンパク質（ATP-binding cassete transporter）としての特徴をもつ。ped3変異体のペルオキシソームは脂質分解能を失っているものの形態異常は認められない。一方、脂肪酸β酸化酵素（3-ketoacyl CoA thiolase）を欠損するped1変異体のペルオキシソームは肥大化し、内部にチューブ状の構造が認められる。ped1/ped3二重変異体を作成したところ、本葉や花序の形態異常を示し、不稔であった。
　以上の結果をもとに脂質分解や形態形成に対するPed3pの役割について考察する。

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植物にとって光に対する応答はもっとも重要な環境応答の一つである。光応答のもっとも典型的な例としては、青色光に胚軸の光屈性があげられるが、赤色光が胚軸屈性に及ぼす影響はあまり研究が進んでいない。我々の研究室では、赤色光照射によって胚軸が屈曲するシロイヌナズナ突然変異体を単離し、flabbyと名付けた。Flabbyの胚軸屈曲方向は赤色光照射の方向によらないことから光屈性ではなく、また胚軸長は野生型に対し変化しないことから、赤色光照射によって胚軸の偏差生長に何らかの異常を起こすことが示唆される。また青色光による光屈性は野生型と同じく正常である。ファインマッピングによる原因遺伝子の単離を試みた結果、この遺伝子は動物の多剤排出トランスポーターMDR1のホモログをコードしていることが明らかになった。シロイヌナズナにおけるこの遺伝子（AtMDR1）は、PINを介したオーキシン輸送に関与し、さらにオーキシン輸送の阻害剤NPAの標的タンパク質であることがすでに報告されており、このことから発芽時の胚軸伸長において、赤色光がオーキシンの局在に、AtMDR1を介して何らかの影響を及ぼしていることが示唆された。今回は、FlabbyとphyA, phyBとの二重変異体の表現形など、最新の知見を紹介する。

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これまで多くのアルミニウム(Al)ストレス誘導遺伝子がコムギを含む植物から単離されている。我々はAl耐性および毒性の機構解明のために、稀少転写産物でも検出可能な簡易的なディファレンシャル・ディスプレイ法により、新たなAl応答遺伝子の検索を行った。材料としてAl耐性のコムギ品種Atlas66を用い、一つのAl誘導性遺伝子を単離した。この遺伝子から推測されるアミノ酸配列が、MDRタンパク質と高い相同性を示したことから、この遺伝子をTaMDR1と名付けた。遺伝子の発現特異性を半定量的PCR法により調べた結果、TaMDR1の発現はAtlas66だけでなく、Al感受性品種のScout66においてもAlにより誘導されることが明らかとなった。さらに、Scout66ではAtlas66よりも低いAl濃度で遺伝子誘導が見られたことから、TaMDR1の誘導はAlによる根の障害により引き起こされたものと考えられる。Al障害はカルシウムの代謝異常と連動することが知られている。そこで、TaMDR1発現へのカルシウムの影響を調べた。その結果、TaMDR1の誘導はランタンイオンなどのカルシウムチャネルの阻害剤の添加、そして培地中のカルシウム濃度の低下によっても促進されることが示された。このことからTaMDR1遺伝子の誘導は根におけるカルシウム代謝の異常により引き起こされたと考えられる。

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演者らは、高等植物の鉄欠乏ストレス応答機構の研究を行っている。鉄欠乏ストレスに耐性が高いオオムギの根において、鉄欠乏誘
導性遺伝子を単離する実験の中で、ABCトランスポーターをコードすると考えられる遺伝子のcDNA、IDI7(Iron Deficiency Induced)を
単離した。演者らはとくにABCトランスポーター研究の専門家ではないので、この講演では高等植物とくに単子葉植物の鉄欠乏ストレス
耐性機構の研究成果を紹介しながら、ABCトランスポーターIDI7の機能を考察する形で話題提供を行いたい。
　IDI7はATP結合部位と膜貫通領域を1つずつ持つhalf-transporterと考えられた。IDI7は、これまで知られている植物のABCトランス
ポーターよりも、動物のTAPトランスポーターとのアミノ酸配列の相同性が高かった。IDI7とGFPとの融合タンパク質の蛍光は、タバコ
BY-2で発現させると液胞膜に観察された。IDI7がどのような分子を液胞に輸送しているかは明らかでないが、オオムギの根における鉄
欠乏応答に、液胞への何らか輸送が関与していること示唆された。オオムギで得られた知見と、双子葉植物であるシロイヌナズナのオ
ルトログAtIDI7の単離および解析と合わせて、オオムギの鉄欠乏ストレス応答機構に関連した液胞膜局在性ABCトランスポーターIDI7の
機能について考察する。

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我々は、植物遺伝子の包括的な機能解析にむけてシロイヌナズナT-DNA Tag-lineの大規模な作製を行ってきた。導入するT-DNAの中にはレポーター遺伝子としてGUS遺伝子を挿入しており、ジーントラップ法による遺伝子の発現解析が可能である。根端でGUS遺伝子の発現が見られるラインのスクリーニングから、根の伸長が野生株に比べて抑制されているラインを単離した。T-DNAは可溶型のABCタンパク質遺伝子に挿入されており、このABCタンパク質遺伝子は酵母のGCN20という遺伝子と相同性が見られた。次に酵母でGCN20と結合することが知られているGCN1のシロイヌナズナオルソログを解析するため、Tag-lineから遺伝子破壊株の単離を行った。単離した8つの破壊株のうち、1つのラインでGUS遺伝子の発現が確認された。根での発現はABCタンパク質遺伝子と同様のパターンを示し、さらに地上部では茎頂部・雌ずいで発現が見られた。N末端側にT-DNAが挿入されているラインでは、根の伸長が著しく抑制されており、さらに不稔であった。またABCタンパク質とシロイヌナズナGCN1は酵母Two-hybrid法により相互作用することが確かめられた。以上のことから2つの遺伝子は根の伸長を制御していることが明らかとなった。シロイヌナズナの他の可溶型ABCタンパク質GCN20ファミリーの発現部位についても解析を行っているので、それらについてもあわせて報告したい。

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植物は様々なアルカロイドを生産するが，その細胞内輸送あるいは転流に関する分子機構はほとんど未解明である。我々は，イソキノリン系アルカロイドのベルベリンをモデルとし、これを大量に生産するオウレンにおけるその輸送機構を明らかにすることを試みた。オウレン培養細胞を用いた輸送実験の結果、ベルベリンの細胞内取り込みにABC蛋白質が関与することが示唆されたため、RT-PCRにより本細胞で発現しているABC蛋白質のcDNAをクローニングし、CjMDR1と命名した。この蛋白質は、multidrug resistance protein (mdr) サブファミリーに属する full-sizeのABCタンパク質で、分子内に2つのヌクレオチド結合ドメインと12回の膜貫通ドメインを有していた。この蛋白質をアフリカツメガエルの卵母細胞に発現させたところ、CjMDR1はベルベリンを内向きに輸送する活性を示した。またその活性は、ATPに依存的であり、vanadate や nifedipine など、ヒトMDR1で知られる阻害剤で強く抑制された。Cjmdr1遺伝子は、オウレン植物体のベルベリン高蓄積部位である根茎で強く発現しており、一方ベルベリン生合成酵素遺伝子は主に根組織で発現していた。このことからCjMDR1は、オウレンにおけるベルベリンの転流に関与していることが強く示唆された。

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　エチレンは植物ホルモンとして種子の発芽から器官のセネッセンスまでのさまざまな生理的なプロセスと生長プロセスに関与する。また、エチレンはストレス応答や病原菌によって誘導される防御遺伝子の発現において重要な役割を担うことも知られている。一方でグルコースも植物の生長に大きな影響を及ぼすことが知られており、遺伝学的解析はエチレンとグルコースの間の拮抗的相互作用を示唆していた。最近、我々はエチレンシグナル伝達系とグルコースシグナル伝達系のクロストークのメカニズムを明らかにした (1)。転写因子EIN3はエチレンシグナル伝達系で中心的役割を担うことが知られているが、エチレンは転写因子EIN3を安定化し、一方でグルコースはEIN3の分解を促進することがわかった。この知見に基づき、植物の生長を決定する環境ストレスと栄養代謝の相互作用について議論したい。
1. Yanagisawa, S., Yoo, S.-D., Sheen, J. (2003) Nature, 425, 521-525.

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植物においてプログラム細胞死は、発生過程で起こるだけでなく、植物免疫の過程、すなわち病原菌の感染領域の拡大を防止するための防御戦略過程に関与する。シロイヌナズナの”lesion mimic” 変異体群を用いた遺伝学的解析によって、植物免疫に関与するシグナル因子群が同定されつつある。私たちは、恒常的に壊死病斑を形成するシロイヌナズナ変異体cad1 (constitutively-activated-cell-death) を単離し、その解析を進めている。cad1の原因遺伝子は、哺乳類の補体やperforinタンパク質に存在するMACPF領域をもつタンパク質をコードしていた。npr1-1や35S-NahG 植物体を用いた遺伝学実験によって、CAD1は既存の細胞死・植物防御の活性化経路と異なる新規シグナル伝達経路に関与することが明かとなった。MACPF領域を持つタンパク質は哺乳類の自然免疫機構に関与する。CAD1を含めた植物免疫のシグナル伝達機構の現状と動物と植物における免疫関連遺伝子群の進化的関連性について解説したい。

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　我々は、植物病原細菌Acidovorax avenaeの菌株間における宿主特異性にイネによる病原菌認識と免疫システム誘導が関与することを明らかにすると同時に、イネの免疫システム誘導にA. avenaeの鞭毛を構成するフラジェリンが分子パターンとして関与することを示した。イネにおけるフラジェリン認識機構を明らかにするため、様々なフラジェリンフラグメントの免疫反応誘導活性について調べたところ、C末端部分を含む断片にのみ免疫反応誘導活性が認められた。一方、フラジェリンのN末端の保存配列から合成したflg22がFLS2受容体型キナーゼによって認識されることが知られているシロイヌナズナにおいて、C末端フラグメントは全く活性を示さず、イネはシロイヌナズナとは異なるフラジェリン認識システムを有していることが示された。また、フラジェリン認識の情報伝達機構についてもイネcDNAマイクロアレイを用いて解析を試みた。その結果、非親和性菌株接種によって特異的に発現変動する173遺伝子のなかで、69遺伝子のみがフラジェリン欠損株で発現変動が認められないことが明らかとなった。これは、フラジェリンはイネにおける分子パターンとして機能するものの、免疫システム誘導にはフラジェリン以外の分子パターンも関与することを示唆している。我々は現在、このようなイネ免疫反応誘導に関与する分子パターンは、この菌のType III分泌機構を介して分泌されることを明らかにしている。

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植物にウイルスが感染すると、同類のウイルスによる再感染から免れることが知られている。われわれはシロイヌナズナ-TMV Cgの系をもちいて、この干渉作用と呼ばれる分子基盤を解析している。まずTMV-CgからYDと名付けた人工弱毒ウイルスを作成した。このYDは増殖量は少ないがちゃんと全身感染し、無病徴で成長に影響を与えない。この状態に強毒TMV Cgが2次感染してもまったく受け付けない。病徴がでないのみならず、RT-PCRによる検出でもその2次感染は検出できない。干渉作用はRNAの配列レベルでの類似性に依存して起こる状況からposttranscriptional gene silencing (PTGS) 現象との類似性が示唆されてきた。しかし、いくつかのPTGSに関与することがしられた遺伝子の変異体シロイヌナズナでもこの干渉作用が観察されることから、PTGSとの相違点が明らかとなった。シロイヌナズナでは種々のmiRNAが合成され、通常の発生制御などに関わることが示唆されてきた。われわれはCgとYDが感染したシロイヌナズナにおいてmiRNAの量に変動があるのかを調べた。その結果、多くのmiRNAがCgの感染によってその蓄積が上昇することがわかった。それに対してYDが感染したアラビドプシスではmiRNA量に変動は見られず、miRNAの量の変動と病徴発現との関連が強く示唆された。

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カンキツleaf spot病菌（Alternaria alternata rough lemon pathotype）の生産するACR毒素とラフレモン間の宿主特異的相互反応は、ACRS (ACR-toxin Sensitivity gene)というカンキツミトコンドリアゲノム遺伝子に支配されている。本遺伝子はACR毒素に非感受性・感受性のカンキツミトコンドリアゲノムの双方に存在し、その配列には点変異もない。カンキツにおけるACR毒素感受性はACRSの存在・不在では決定されず、ACRS遺伝子転写物のprocessingの有無により決定されていた。次に、宿主特異的毒素に非感受性のカンキツに毒素生産菌を接種して抵抗性を誘導した葉から調製したcDNAと, 無処理葉から調製したcDNAを用いてsubtractive PCRを行い, 抵抗性誘導下でより強く発現する遺伝子の探索を試みた。得られた500クローンの配列を解析した結果, 約6％のクローンが抵抗性に関連すると既に報告されている遺伝子と相同性を示し, 約10％は病原菌以外のストレス応答性関連遺伝子と相同性を示した。これらの中の幾つかの遺伝子の各種ストレス下での発現様式について、さらに揮発性物質のvapor処理による誘導様式について解析を進めた。

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植物はイソペンテニル二リン酸 (IPP)を基本骨格として、多様なイソプレノイド化合物を生産する。植物のIPPは動物とは異なり細胞質におけるメバロン酸経路(MVA経路)だけでなく色素体中の非メバロン酸経路によっても作られる。HMG-CoAレダクターゼ (HMGR)はMVA経路の初期段階の反応を触媒する。この酵素は動物では単一遺伝子であるのに対して、植物では複数の遺伝子によってコードされ、シロイヌナズナゲノムにはHMG1とHMG2の2つ遺伝子が存在する。植物の生長における各HMGR遺伝子の役割を解明するために両遺伝子のT-DNA挿入変異体を単離した。hmg2変異体は通常の生育条件では表現型が現れなかったが、hmg1変異体は細胞伸長抑制に由来する矮性、早期老化、不稔という強い形質を示した。これらの形質はイソプレノイド型植物ホルモンであるブラシノステロイド(BR)やサイトカイニン(CK)の減少を予想させた。しかし、MVA 経路の阻害剤投与、細胞伸長・老化のマーカー遺伝子の発現、代謝物プロファイリングなどの解析結果、hmg1変異体はBR欠損変異体でもCK欠損変異体でもないこと、さらに、細胞伸長にはBR以外のステロール、老化にはトリテルペノイドの関与が示唆された。本シンポジウムでは、hmg2変異体、HMGR阻害剤に対する非感受性変異体などの結果も併せて、植物の生長におけるトリテルペンの機能について議論する。

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The characterization of genes encoding sterol biosynthetic enzymes and the isolation of novel plant lines affected in the expression of those genes have shed new light on the involvement sterols may have in biological processes such as embryonic development, cell and plant growth, and fertility. Arabidopsis or N. benthamiana lines affected in the biosynthetic segment leading from cycloartenol to Δ⁷-sterol intermediates display severe phenotypes such as seedling lethality. Genetic lesions occuring between Δ⁷-intermediates and the final products campesterol and sitosterol result in dwarfism which is rescued by exogenous supply of brassinosteroids. The ratio of campesterol to sitosterol is regulated by the expression of sterol methyltransferases and particularly a 24-methylene lophenol-C24-methyltransferase. This ratio modulates Arabidopsis morphology and development. Interestingly, certain organs or cell types are more sensitive than others to variations of this ratio. Regulatory components involved in the expression of these biosynthetic genes remain to be disclosed.

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ステロール類は製品および医薬原料バルク体としての市場規模が、世界的に見ると約7000億円にものぼる産業上極めて有用な物質である。たとえば医療用ステロイドは動植物から抽出したステロール類を化学変換することで生産されているが、動物原料の安全性、あるいは資源の枯渇の問題から、望むステロール・トリテルペン類を植物で安価に製造するプロセスの開発が急務となっている。最近、複数の遺伝子導入と遺伝子破壊により酵母で有用ステロイドを生産できることが明らかにされたが、植物は殆ど無機栄養で生育可能なので、いわゆるself-sufficient系を構築する場としては、さらに可能性が高いと考えられる。これまで動物ではステロイドの代謝あるいは抗肥満の研究を軸に、菌類においては抗菌剤の開発を目指して、ステロールの生合成経路および輸送・蓄積系の研究が進んできた。一方、植物においては、ブラシノステロイドの生合成経路・シグナル伝達を軸に、精力的に研究が行われてきたが、生合成経路の制御系、あるいはステロールの輸送・蓄積に関する知見は十分とは言えない。本講演では、動物・酵母・植物でのステロール類の生合成・輸送蓄積経路の研究を俯瞰しながら、有用ステロール・トリテルペン類の、植物を用いた生産系開発のために今後必要となる知見・技術を展望する。本調査研究の一部は経済産業省「植物の物質生産プロセス制御基盤技術開発プロジェクト」の一環として行われた。

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シダ類のトリテルペノイドはシクロアルタンを除きスクアレンが直接閉環して生合成される点で高等植物のそれとは大きく異なり，C-3位に酸素官能基を持たない炭化水素，diplopteneと ferneneがその代表である．ホウライシダ科の ホウライシダ属は adiantone等のノルホパノイド,　近縁のエビガラシダ属はそれとは異なりトリテルペノイドと共にセスターテルペノイドを含む．特にウラボシ科のシダは形態が単純で分類に混乱が見られるが，属あるいは種単位で含有されるトリテルペノイド成分に特徴がある．ウラボシ科のシダ類には5環性のトリテルペノイドと共に2~4環性のトリテルペノイドが含まれ，属単位で大きな特徴が現れる．アオネカズラ属はβ-amyrin acetateと共に oleanane系炭化水素の含量が高い．イワヒトデ属はトリテルペノイドの種類が非常に少ないが，squaleneが両端から閉環したcolysanoxideとα-onoceradieneを含有する．ヒトツバ属からはhopane, dammarane骨格のトリテルペノイドと共に新規骨格を有する cyclopanediolも発見された．マメヅタ属は oleanane, taraxerane, baccharane, lemmaphyllane等を含む2~5環性の20種以上の骨格を持つトリテルペノイドが含まれ，あたかもトリテルペノイド成分の生合成における制御機構を持たないシダのようである．このようにトリテルペノイドは分類学上の良い指標となるが，シダ類における生理学的な役割は未だ不明である．

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高等植物が生産するトリテルペンは多様な構造と生物活性持ち、配糖体の形で根や種子などの特定の器官に蓄積している。これらトリテルペンは多様な構造に依存して多様な生物活性をもつため、薬学的見地から非常に興味深い化合物である。一方、トリテルペンの生合成はオキシドスアレンの閉環反応で一次代謝のステロールの生合成と分岐しており、トリテルペンを二次代謝産物として分類することも可能であるが、植物内での本来の機能についても植物生理学的に興味深い。オキシドスクアレン閉環酵素はトリテルペンの構造多様性の最初の源となっており、これまでに単離されたトリテルペンの骨格は80種を越える。これまで、ステロール生合成に関与するサイクロアルテノール合成酵素に加え、トリテルペン生産植物から、β−アミリン合成酵素、ルペオール合成酵素、イソマルチフロレノール合成酵素、タラキセロール合成酵素、ククルビタジエノール合成酵素、混合アミリン合成酵素、ダンマレンジオール合成酵素、アキレオール合成酵素が演者の研究室においてクローニングされている。本シンポジウムでは、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)のゲノムに存在する13種のトリテルペン合成酵素の構造と反応機構についての最近の成果を発表し、高等植物におけるトリテルペン骨格多様性とその起源について議論する。

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マメ科モデル植物タルウマゴヤシのメタボローム解析として、我々はトリテルペノイドサポニンをLC-MSで分析し、得られた27種類のサポニン成分をMS/MS解析から5種類のアグリコン（soyasapogenol B/E, medicagenic acid, hederagenin, bayogenin）の配糖体に大別した。5種のアグリコンは2,3-オキシドスクアレンの閉環反応によって生成するβ-アミリンの水酸化反応によって生成し、さらに配糖化反応によって多様なサポニンを生成することが示唆された。β-アミリンを生成する初期経路に関与する生合成酵素遺伝子の機能同定するため、タルウマゴヤシESTのデータ解析より得られたスクアレン合成酵素（SS）遺伝子を大腸菌、スクアレンエポキシダーゼ（SE）遺伝子及びβ-アミリン合成酵素（β-AS）遺伝子を酵母に導入して、発現タンパク質の機能解析を行った。ジャスモン酸メチル(MeJA) 処理後の培養細胞の時間的な遺伝子発現の変動をノーザン分析、サポニン含有量の変化をLC-MSで分析した。その結果、サポニン含有量がMeJA処理後24時間後に約10倍に増加し、β-AS遺伝子の転写量は処理後8-24時間後に約30倍に誘導され、SS及びSE2遺伝子も同様な転写量の変動が見られた。以上のことより、MeJAはサポニン生合成経路の生合成遺伝子群を特異的に誘導することが明らかになった。この培養細胞を用いて、サポニン生合成の重要遺伝子同定と代謝ネットワークの解明を進めることができる。

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植物は，細胞膜成分や植物ホルモン前駆体である植物ステロールの他に様々な骨格を持つトリテルペノイドを生合成する．トリテルペノイドの多様な基本骨格は共通基質であるオキシドスクアレンの閉環酵素（OSC）によって形成される．これまでの報告から，トリテルペノイドが植物の成長・分化やマメ科植物と根粒菌との共生に関与することが示唆されている．演者らは，トリテルペノイドの植物における生理機能や，植物が多様なトリテルペノイド骨格形成能を獲得した分子進化過程に興味を持ち，マメ科のモデル植物ミヤコグサLotus japonicusを材料に OSC 遺伝子の機能と構造の解析を行っている．これまでに，cDNAクローニングと酵母発現系を用いた機能解析により3種の OSC を同定した．また，かずさDNA研究所との共同研究によりミヤコグサゲノム中に OSC 遺伝子ファミリーを8種見いだした．これらのうち，互いに高い配列同一性を示す3遺伝子は3番染色体上でクラスターを形成していた。また，シクロアルテノール合成酵素遺伝子，ルペオール合成酵素遺伝子および機能未知の2遺伝子は2番染色体上でクラスターを形成していた．遺伝子クラスター構造はシロイヌナズナでも見られ，OSC 遺伝子ファミリーが，遺伝子の局所的重複と変異の蓄積により進化してきたことが予想された．

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生殖過程においては、適切な交配相手を選択するために、花粉（管）と雌ずい間で、様々な細胞間認識が行われている。自家不和合性は、こうした雌雄間認識機構の一つであり、これによって植物は自己の花粉を識別し、その発芽・伸長を特異的に阻害することで自殖（近親交配）を回避している。この自他識別反応は、多くの植物種において、1遺伝子座（S遺伝子座）上のS複対立遺伝子(S₁, S₂, ---, S_n)を想定することにより遺伝学的に説明されてきた。すなわち花粉と雌ずいが同じS遺伝子を発現する場合に不和合性反応が起きる。このことは、S遺伝子毎に構造の異なる（多型を示す）花粉因子と雌ずい因子がS遺伝子座上にコードされていると想定し、両者の相互作用を介して自他識別が行われていると仮定すると説明できる。実際、複数の植物種において花粉因子・雌ずい因子の探索が行われ、それらの実体が明らかにされてきつつあるが、これまでに同定された因子類の分子性状は、植物種間で全く異なっている。このことは、それぞれの植物種が、進化の過程で独自の自他識別機構を獲得してきたことを示唆している。アブラナ科植物およびバラ科・ナス科植物を中心に、自家不和合性の分子機構解明の現状について紹介する。

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高等植物の形態形成において、分化した細胞同士の接着が重要である。しかし、その主役であるペクチンの生合成メカニズムや発現特性に関する知見は極めて乏しい。近年我々は、Nicotiana plumbaginifoliaの半数体植物の葉切片にT-DNAを挿入して培養し、不定芽形成能力を失うと同時に、細胞接着性の弱くなった突然変異体nolac (non-organogenic callus with loosely attached cells) の作出法を確立した。この系では、シロイヌナズナでは作出が困難な胚性致死の細胞接着変異体をカルスとして維持し、変異体の生化学的解析を行うことが可能である。nolac-H18 の解析より、新規ペクチングルクロン酸転移酵素遺伝子（NpGUT1; glucuronyltransferase 1）が同定された。この遺伝子は、植物のペクチン合成に関わる初めての糖転移酵素遺伝子で、頂端分裂組織で特に発現が強く、メリステム形成と共にホウ素の作用点であるラムノガラクツロナンII二量体の形成に必須であることが判明している（PNAS, 2002）。また、生殖器官の詳細な発現解析を行ったところ、タペート組織、花粉、花粉管の先端、花柱の伝達組織において発現が見られた。以上の結果よりNpGUT1は、分裂組織における細胞接着に重要であるだけでなく、花粉管ガイダンスにも重要である可能性が示唆された。本講演では、高等植物の細胞接着にかかわるペクチンの生合成が時空間的にどのように制御され、どのような役割を持つかについて考察する。

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植物の体は様々なタイプの細胞から構成されている。形態形成過程において、それぞれの細胞は分裂・伸長を繰り返して、適切な数と大きさになり、植物の体を作り出す。固い細胞壁に囲まれた植物細胞が伸長する際には、細胞壁の再構築が必須である。このことは植物の細胞伸長現象を理解する上で細胞壁再構築機構の解明が必須であることを示している。これまでの植物生理、生化学の研究によって、細胞伸長時の細胞壁再構築に関わる多くのタンパク質が同定され、細胞壁再構築機構のモデルが提唱されている。しかし、これらの研究の多くは、幼植物体の胚軸などを材料にした、特定の組織における細胞伸長の研究成果に基づくものであるため、全ての細胞タイプにおいて、同一の細胞壁再構築機構が働いているか否かは未だ不明である。この点を解明するために、我々はマイクロアレイ法やプロテオームの技術を用いて、植物の各組織で働く細胞壁関連遺伝子セットの同定を目指して、細胞壁関連遺伝子群の包括的発現解析を進めている。本大会では、マイクロアレイ法の解析結果を中心に、植物の各組織の細胞で発現する細胞壁関連遺伝子セットと、細胞伸長に伴う、それら遺伝子の発現プロファイルについて報告し、細胞タイプの違いによる細胞壁再構築機構の相違について考察する。

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植物の道管・仮道管は、縦に連なった細胞が管状要素と呼ばれる細胞に次々に分化することで形成される。この連続的な細胞分化は、細胞間相互作用によって厳密に制御されていると考えられるが、その制御機構はほとんどわかっていない。我々はヒャクニチソウのin-vitro管状要素分化系を用い、管状要素前駆細胞が分化誘導因子を分泌し、近傍の細胞を管状要素分化経路に引き込むことを示した。この分化誘導因子が新規のアラビノガラクタンタンパク質であることを突き止め、活性に因んでxylogenと名付けた。木部組織におけるxylogenの局在パターンとxylogen変異株の解析から、xylogenは極性をもって分泌され、隣接した細胞の分化を引き起こすことにより、道管・仮道管のパターン構築に寄与することが明らかになった。
　硫酸化ペプチドホルモンphytosulfokineはin-vitro管状要素分化を促進するが、その生理的意義はわかっていなかった。我々の解析により、phytosulfokineが傷害により誘導され、傷害応答を抑制する役割を果たすこと、この傷害応答抑制効果はプロテインキナーゼやエチレン合成の抑制などを介していることが示唆された。Xylogenやphytosulfokineなどが分化を促進する一方で、低分子の分化阻害因子が存在し、全ての細胞が管状要素に分化しないようにバランスを保っていることが示唆されている。以上の結果を総合して、維管束分化を制御する細胞間相互作用について考察する。

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　我々は、根毛形成を正に制御するR3タイプのMyb遺伝子であるCAPRICE(CPC)遺伝子が、非根毛細胞から根毛細胞に移行することをGFP遺伝子との融合遺伝子をもった形質転換体の解析より既に報告している。次にCPC+GFP融合遺伝子を異所的に発現させたところ、根毛細胞から非根毛細胞には移行できるが、中心柱の細胞層から表皮細胞層には移行することはできなかった。我々はCPCの細胞間移行機構を解析する為に、まずCPC蛋白質内の移行に関わる領域を二ヶ所同定した。酵母two-hybrid スクリーニングにより移行に関わる因子を検索するとともに、CPC+GFP形質転換体を変異原処理した植物体の中よりGFPの蛍光のパターンが異常になったものを探索している。またCPCホモログ遺伝子産物の細胞間移行能についても比較・考察をおこなっている。
　別の表皮細胞分化決定因子であるbHLH蛋白質をコードするGLABRA3(GL3)遺伝子は根毛細胞で強く発現しているが、機能欠失型のgl3突然変異体では非根毛細胞が根毛細胞に変換されていた。GL3+GFP融合遺伝子をもった形質転換体では、GFPの蛍光は根のすべての表皮細胞の核で観察されたので、GL3も細胞間移行をすることが示唆された。
　以上の結果より、表皮細胞分化における制御因子の細胞間移行の機構について考察をおこないたい。

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Systems biology approach through integrating transcriptomics and metabolomics may provide precise information on gene-to-metabolite and/or metabolite-to-metabolite networks under particular genetic alteration or stress condition. Metabolomics approach should be emphasized particularly in plant science more than in animal biology, because of huge chemical diversity and high producibility of plants. To find new cellular networks under particular gene expression and nutritional stress in Arabidopsis thaliana, we analyzed global gene expression profile by DNA micro/macro-array and metabolite profile by combination of different mass spectrometric technologies. Nutritional stress of nitrogen and sulfur resulted in global change of metabolome that could be correlated with the modulation of global gene expression, indicating the presence of several gene-to-metabolite networks. The gene expression and metabolite profiles of PAP1 gene over-expressing A. thaliana could depict the whole cellular system for anthocyanin production.

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Metabolites can be regarded as end products precisely defining the net result of all cellular regulation processes, and therefore, ultimately determining the phenotype.
Several thousand metabolites may appear simultaneously in a given plant species. By use of GC/TOF technology, over 1,000 metabolites are currently detectable from a single sample. This data is automatically exported into data bases, where they are compiled and cleaned for large scale analysis. Select results are shown for the analysis of 1,000 leaf extracts of 25 Arabidopsis genotypes, and 2,300 tuber extracts of 10 potato plant genotypes from a German GMO field trial, with emphasis on pattern recognition and statistical analysis.
In addition, recent advances in complementary LC/MS based methods are presented, from fast de novo identification routines for novel natural compounds by ion trap and QTOF technology to better separation using capillary silica-based monolithic columns, which almost reach the peak capacity of GC based methods.

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Metabolomics, which can be defined as the measurement of the level of all intracellular metabolites, has become a powerful new tool for gaining insight into functional genomics. Tracking metabolite changes under different conditions not only provides direct information on metabolic phenotypes but also complementary to gene expression and proteome analysis. Despite its importance, only a limited number of methodologies have been developed for a large- scale metabolome analysis. Here, we propose a new approach to the comprehensive and quantitative analysis of charged metabolite by capillary electrophoresis mass spectrometry (CE-MS). Metabolites were first separated by CE based on their charge and size and then directly and selectively detected by MS by monitoring over a large range of m/z values. Its utility was demonstrated in the analysis of metabolites from Bacillus subtilis extracts, and of 88 metabolites in rice plant and dynamic changes in metabolic levels throughout a period of 24 hours.

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We introduce a systematic approach to constructing entire pathway model of whole cell metabolism: (1) Top down modeling from genomic information, (2) Bottom up modeling from metabolome analysis, and (3) Closing gap by bioinformatics. We have developed a computer program named GEM system that automatically constructs whole-cell-level metabolic pathway model from genome sequence data of a given organism, based on general enzymatic information published in credible database systems, such as COG, SWISS, KEGG and EMBL. Models so constructed are incomplete due to incomplete knowledge in the published databases. To fill the gaps in the incomplete pathway models, we next identify all metabolites in the cell by CE/MS (for charged metabolites) and LC/MS (for neutral metabolites), and then bioinformatics algorithms try to connect them to complete the pathway model. The bioinformatics methods to predict unknown pathways are based on chemical structure comparisons and correlations of dynamic changes in quantity among metabolites.

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The metabolome is largely uncharted territory. Only a small percentage of the small molecules in the biosphere have been identified and characterized, and of these, analytical standards are available for only a very limited number. Since the phenotype of an organism is the best equilibrium that it is able to attain with its environment given its genotype, to understand the change in phenotype resulting from a change in genotype or environment the comprehensive analysis of metabolites is essential. Examples of how comprehensive metabolomics enabled us to better understand cold acclimation in Arabidopsis, the anti-oxidant properties of different Huang-qin genotypes, and the effects of a GDH insertion in tobacco will be presented. As well, the analytical and bioinformatics challenges associated with this approach to understanding plant physiology will be discussed.

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We present here a good example of metabolic engineering of plants through modifying biochemical pathway, leading to stress resistant plants. The ectopic-expression of OsHCTR in rice promoted the level of NAD (P)(H) through up-regulating enzymes required for NAD biosynthesis. Elevated level of nicotinamide nucleotide would serve as a pool of redox substances needed for quenching ROS effects. Transgenic rice plants showed tolerance to oxidative stress induced by H₂O₂, UV-C irradiation, oxygen stress, and rice blast pathogen. Nitrogen assimilation is an essential metabolic pathway that includes the primary fixation of ammonia to carbon skeletons to biosynthesize amino acids and other organic compounds involving nitrogen in plants. The great utility of transcription factors in modulating plant metabolism to generate crops having superior characters will be presented.

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We have developed a technology platform called SOLUCEL to identify the majority of genes involved in the biosynthesis of secondary metabolites and regulation thereof. Furthermore, the genes that enhance the production of secondary metabolites can be functionally screened in a high-throughput mode. We designed this novel approach using tobacco BY-2 cell culture as a model system, in which a cDNA-AFLP based transcript profiling technique is linked with targeted metabolite profiling of these cells to simultaneously identify genes involved in nicotine alkaloid metabolism on a genome-wide scale. We have been able to build an ample inventory of genes, either known or novel, involved in tobacco secondary metabolism, and most probably in plant secondary metabolism in general. The great advantage of SOLUCEL technology is its universal application to any plant or cell culture of interest (e.g. rare medicinal plants) without pre-existing gene sequence databases.

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SOLUCEL technology is based on the current advancement in understanding plant genomes, and on the development of novel tools for high throughput selecting and testing genes involved in the production of plant secondary metabolites. It can be applied (i) to enhance the production of marketed high-value pharmaceuticals in plant cell cultures (ii) to develop reliable and reproducible sources of plant-derived molecules with potential pharmaceutical value, and (iii) to increase the chemical diversity of plant based molecules through Combinatorial Biochemistry. We have developed this technology using the nicotine alkaloid biosynthesis pathway as a model system. A few examples will be given of how overexpressing some novel genes can be used either to tailor cell cultures to enhance the production of nicotine alkaloids or to direct biosynthetic pathways in related plant species. Furthermore, these novel genes may play an important role in secondary metabolism as master regulators in general.

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本講演では，ゲノム情報や遺伝子機能の解析への，コンピュータグラフィックス，特に可視化技術の応用について述べる．遺伝子関連情報は一般に極めて大規模であり，計算機を用いて有効な情報だけを効率よく取り出すことが求められている．この目的のために，人工知能的な情報検索技術や画像認識技術などが，数多く研究されている．これらは，いわば人間の能力を計算機に代行させ，より高速に行うことを目指したものである．しかしながら，特に認識能力に関しては，人間には容易でも計算機には困難なケースが数多くある．
そこで我々は，コンピュータグラフィックスならびに可視化技術を用いて，計算機と人間との分業によって有効情報を効率よく得ることを目指している．計算機によって単純かつ大量のデータ処理を行って何らかの画像を生成し，これを人間に提示することにより，人間のもつ高度な視覚認識能力によって情報を得るのである．
一例として，植物の生長過程を撮影した動画像に基づく，生長の可視化手法を紹介する．この例では，計算機による認識処理を行うことなく，単純な画像処理の組み合わせだけで実現している．可視化結果を人間が見ることで，植物の生長曲線を容易に読み取ることができる．この他，大量情報のクラスタリング結果の表示方法や，物体をイラスト的に描画することで情報をより的確に伝達する手法なども，紹介する．

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