水分可変型で、極度の乾燥に耐えられるものとして、一部のラン色細菌、藻類、蘚苔類、シダ植物、及び地衣類が知られている。我々はこれまでラン色細菌Nostoc commune （イシクラゲ）及び、コケの乾燥や乾燥後の吸水に伴う光合成諸反応の解析を行ってきた。その結果、イシクラゲやコケにおいては細胞外に水分を蓄える仕組みの他は特別に水を保持する仕組みはなく、逆に水分の減少を敏感に関知して、積極的に光合成の活性を失わせたり、吸収した光エネルギーを熱に変えたりすることが明らかとなった。また、地衣類も生長が遅いにもかかわらず同じ生育環境で、コケと競争しながら生育している。
　本年会ではこれまで調べたイシクラゲやコケと比較しながら地衣類における乾燥応答について報告する。また地衣の共生藻であるスミレモや単離培養しているTrebouxiaにおける乾燥応答についても報告する。乾燥に伴う水分の消失や水分添加による活性の回復は非常に速やかで、分から時間のオーダーであった。乾燥に伴う光化学系●の特異的失活や系●に吸収された光エネルギーの特異的消光が観察された。水ポテンシャルや高張処理の効果から、地衣の細胞浸透圧は1.0 M sorbitol相当であることが分かった。スミレモの場合には菌と共生することによる乾燥応答の大きな違いは認められなかった。

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緑色植物は、クロロフィルaとクロロフィルbをもつ。これらの組成は光環境に応じて変化する。クロロフィルbの蓄積は、LHCタンパク質の蓄積および光化学系のアンテナサイズの制御に関与していることが明らかとなっている。本研究では、高等植物のクロロフィル蓄積の調節機構を明らかにするためにアンテナサイズが常に小さく、光強度に対する適応能力が低い、シロイヌナズナのクロロフィルb欠損変異体chlorina5(ch5)の解析を行った。
本研究でのch5変異体のポジショナルクローニングの結果、亜鉛プロテアーゼのモチーフをもつタンパク質をコードする遺伝子に変異が起きていることがわかった。このタンパク質は、葉緑体局在の膜タンパク質であると予想される。アミノ酸配列の相同性検索の結果、すべての光合成生物に広く保存されることが示唆された。
クロロフィルbの合成はクロロフィリドaオキシゲナーゼ(CAO)が行っている。これまでに報告されてきたクロロフィル蓄積量の少ない変異体は、CAOの転写量が減少していた。しかし、ch5変異体では、CAO転写量が増大していた。これらの結果から、プロテアーゼとクロロフィル蓄積の制御について考察する予定である。

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生育光条件に対するC₄植物の応答機構を資源利用の観点から明らかにするために，スギモリゲイトウ（Amaranthus cruentus L. NAD-MEタイプ）を異なる光，窒素栄養条件下で栽培し，葉の光合成特性の比較を行った。
1）葉面積当りのクロロフィル量は，強光栽培個体よりも弱光栽培個体の方が多かった。この結果は，C₄植物でも，弱光栽培条件では光吸収能力を高めるために集光性タンパク質複合体に多くの窒素が投資されている事を示唆している。
2）葉組織のδ¹³Cの値は弱光栽培個体の方が低く，C₃植物の示す値に近づいた（強光栽培個体；-15‰，弱光栽培個体；-19‰，C₃植物の平均値；-30‰）。また，葉面積当たりのPEPCとPPDK量は，栽培光条件によって違いはないが，Rubisco量は弱光栽培個体の方が多かった。弱光栽培条件ではC₄葉の一部においてC₃的光合成が行なわれている可能性がある。
3）弱光栽培個体の葉は，強光栽培個体の葉と比べて厚く，細胞のサイズも大きかった。これらの形態的特徴から，弱光栽培個体の葉では葉肉細胞と維管束鞘細胞間の機密性が大きく低下し，固定されたCO₂が維管束鞘細胞から漏れやすくなっていると考えられる。
今後は，弱光栽培個体でC₃的光合成が行われているかを検証し，また維管束鞘細胞からのCO₂の漏れの程度についても調べる予定である。

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酸素発生型光合成生物の多くは、クロロフィル（Chl）の生合成の後期過程で2つのプロトクロロフィリド（Pchlide）還元酵素、光依存型酵素（LPOR）と光非依存型酵素（DPOR）、を用いてChlを合成している。本研究では、2つのPchlide還元酵素を併存する光合成生物における両酵素の機能分業を検討するために、ラン藻Plectonema boryanumを材料として、DPORとLPORの欠損株の形質を詳細に検討した。両欠損株を強光下で種々のO₂濃度のN₂ガスを通気して生育を検討した結果、DPOR欠損株はいずれの条件でも野生株と同様に生育したが、LPOR欠損株は3%以上のO₂濃度では生育できなかった。この結果は、2つのPchlide還元酵素のうちDPORが酸素感受性酵素であることを間接的に示している。DPORの3つのサブユニットとLPOR蛋白質含量をウェスタン解析で検討した結果、DPORサブユニットのChlLとChlN含量が著しく増加していた。嫌気的条件下でのLPOR欠損株の生育は、嫌気条件によるDPORの酸素失活防御だけでなく、ChlLとChlNサブユニットの含量を増加させることで活性を維持することにより可能となっていると推察される。また、Pchlide含量が野生株の4-6倍に上昇していたことから、PchlideのchlL-chlNオペロンの発現誘導への関与についても検討中である。

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A maize bundle sheath-specific phosphoenolpyruvate carboxykinase (PCK) gene was introduced into tobacco under the control of tomato rbcs-3C promoter with its transit peptide. The expression of the gene in transgenic tobacco was detected and the growth of the transgenic plants was enhanced under our test conditions. The enhanced growth was evidenced by increases in leaf fresh weight and leaf area. The growth of the transgenic tobacco showed some correlation with PCK protein level in the plants. Our measurements showed that relative chlorophyll content in transgenic tobacco was increased and their photosynthetic activity was also enhanced under higher light intensity and higher CO₂ concentration. The increase in the contents of starch, sucrose, glucose and fructose was observed in the mature leaf of the transgenic tobacco.

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Reef-building corals possess endosymbiotic algae that provide essential energy for the host animals through photosynthesis. Therefore, the inhibition of photosynthetic activity is lethal for corals, a potential cause of "coral bleaching" phenomena that threat many coral reef ecosystems globally. Many studies have suggested that photoinhibition is involved in coral bleaching. However, the molecular mechanism remains unclear. Here we show a protective role of water flow on high-light induced photoinhibition in the coral Acropora digitifera. We conducted series of experiments for assessing the effects of water flow on photoinhibition with PAM chlorophyll a fluorometer. For hours to weeks, suppression of photoinhibition was observed in flow-treated corals. Severity of photoinhibition was reduced with increasing water flow velocity; coral bleaching occurred in the flow-limited corals. We conclude that water flow is capable of suppressing high-light induced photoinhibition in the reef building corals.

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The defect in the Calvin cycle appears to accelerate photoinactivation of PSII. To understand its molecular mechanism, we investigated effects of glycolaldehyde (GA), which inhibits the Calvin cycle at the site of phosphoribulokinase, on the photoinactivation of PSII in Chlamydomonas reinhardtii cells. When cells were exposed to light, GA did not enhance the Q_A reduction but accelerated photoinactivation of PSII in the concentration-depended manner. Effect of GA on the photoinactivation was abolished in the presence of chloramphenicol. After photoinactivation treatment, the PSII activity was recovered close to the initial under low light and this recovery was inhibited by GA. GA did not affect degradation of photodamaged D1 protein or the level of psbA mRNA. However, synthesis of D1 protein de novo in chloroplasts was significantly inhibited by GA. Based on these observations, we discuss the photoinactivation mechanism caused by environmental stresses.

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一重項酸素（¹O₂）は光阻害の原因となる活性酸素のひとつであるが、未だに確実的な検出方法は確立されていない。フルオレセイン骨格を持ち、¹O₂との反応によりエンドパーオキシド体を形成し蛍光を増加させる9-[2-(3-carboxy-9,10-diphenyl)anthril]-6-hydroxy-3H-xanthen-3 (DPAX) (Angew. Chem. Int. Ed. 1999, 38:2899)を用い(Ex. = 505 nm, Em. = 525 nm)、新たな検出方法を開発した。Xe-PAMを使い、照射光下における蛍光測定を可能とした。また、共焦点レーザースキャン顕微鏡でも測定を行った。DPAXを加えた葉緑体の懸濁液に赤色光照射を行ったところ蛍光増加が観測された。しかし、嫌気条件、または電子受容体であるフェリシアン化カリウムを加えた条件下では観測されなかった。これは無酸素条件、または電子伝達が迅速に行われている際には¹O₂が生成されないことを示している。これらの結果は、植物での¹O₂生成の検出がDPAXによって可能であることを示している。また、DPAXとXe-PAMを使うことで¹O₂の生成速度などの測定も可能である。

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PSIIの最大量子収率（Fv/Fm）は、光阻害の指標として広く用いられている。しかし、Fv/Fmの低下がどの程度光合成全体速度に影響するのか、高等植物においてはまったく明らかにされていない。さらに、PSIIでの電子伝達速度（J_(PSII)）、PSIでの電子伝達速度（J_(PSI)）およびガス交換速度を同時に解析した例はなく、Fv/Fmの低下が電子伝達反応にどのような影響を及ぼすのか詳しいことは分かっていない。そこで、それら3点を同時に測定する装置を構築し、15^oC、1500 μmol m^-2 s^-1で低温・強光処理したイネの光合成特性を調べた。
Fv/Fmが低下するに伴って、大気CO₂分圧下および高CO₂分圧下でのガス交換速度は低下した。このときPSII量子収率(ΦPSII：ΔF/Fm')もPSI量子収率(ΦPSI：ΔAsat/ΔAmax)も低下したが、ΦPSIの低下に比べてΦPSIIの低下の程度が大きかった。さらに、J_(PSII) (PFD×α×ΔF/Fm') とJ_(PSI) (P700⁺/(ΔAmax×k)) を比較すると、Fv/Fmが低下するに伴ってJ_(PSI)/J_(PSII)は増加していた。このことから、低温・強光処理によりFv/Fmが低下したイネ葉において、PSI循環的電子伝達反応が起きている可能性が考えられた。

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Non-symbiotic hemoglobins (nsHbs) are ubiquitous in plants. Dicots are known to have two distinct classes of nsHb genes whereas monocots may have one class. Recent microarray work indicated that class 1 nsHb genes are inducible by nitrate in Arabidopsis, though the factors associated with induction of nsHbs by nitrate have not been examined in detail. Expression of two class 1 nsHb genes, ORYsaGLB1a and ORYsaGLB1b, was induced in nitrate treated rice cells in a manner similar to that of the induction of nitrate reductase (NR) activity. When nitrate-treated cells were grown in a medium containing tungstate, an inhibitor for NR activity, the expression of ORYsaGLB1a and ORYsaGLB1b was repressed. Furthermore, mutants defective in NR activity were impaired in the induction of ORYsaGLB1a and ORYsaGLB1b by nitrate. These results suggest that NR activity may be essential for the induction of nsHbs by nitrate in cultured rice cells.

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マメ科植物と根粒菌との共生成立において、根毛における根粒菌の感染・侵入には硝酸態窒素が阻害的に働く。根粒形成初期過程における硝酸阻害を解析するために1,9000のnon-redundantなミヤコグサESTクローンをスポットしたアレイを用いて、根毛における硝酸応答遺伝子を解析した。硝酸処理4日後の根毛において、窒素同化関連遺伝子の他に、HPP domain containing protein、MYB-type transcription factor、LRR protein をコードする硝酸誘導遺伝子を同定した。興味深いことに、ジャスモン酸誘導遺伝子として知られる12-oxo-phytodienoic acid reductase、 glutathione S-transferase、 UDP-glucosyltransferaseをコードする遺伝子は発現抑制されていた。窒素制限条件下での根粒菌感染時にジャスモン酸を与えると、感染糸形成は顕著に向上した。これらの結果から、根毛における根粒菌形成過程には、硝酸による内生ジャスモン酸量の低下によって引き起こされる、サリチル酸による病原防御応答が関わっていることが示唆された。

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　我々は、ヒメツリガネゴケの硝酸還元酵素（NR）遺伝子および亜硝酸還元酵素（NiR）遺伝子のcDNAをそれぞれ2コピーずつクローニングし、ノーザン解析によりそれらはすべて硝酸イオンによって誘導され、アンモニアの代謝産物によって抑制されることを示した（2003年度本大会）。
　シロイヌナズナにおいてNR遺伝子の発現は、硝酸イオンによって誘導され、亜硝酸イオンによって抑制されることが、最近報告された。ヒメツリガネゴケにおいても、NR遺伝子の発現は亜硝酸イオンによって抑制されたが、亜硝酸イオンによる抑制の効果としては、亜硝酸イオンの還元産物であるアンモニアによる抑制の効果をみている可能性が考えられた。そこで、アンモニア代謝産物によるフィードバック阻害の影響を排除するために、相同組み替えによって作製したNiR破壊株を用いて実験を行ったところ、NR遺伝子の発現は、亜硝酸イオンを与えた場合にも誘導された。このことから、ヒメツリガネゴケにおいては、シロイヌナズナとは異なり、亜硝酸イオン自身にはNR遺伝子の発現を抑制する効果がないことが示された。次に、グルタミン合成酵素とグルタミン酸合成酵素の阻害剤を用いて、アンモニア代謝産物による抑制機構の解析を行ったところ、NRおよびNiR遺伝子は、すべてグルタミンによって抑制されることを示唆する結果が得られた。

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　硝酸イオンの取り込みは、植物の硝酸同化経路の最初に位置し、経路全体の律速段階となっている。高等植物においては、器官間の輸送などが複雑に影響するために、硝酸イオン取込み活性の詳細な解析が困難であった。セン類ヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens) の原糸体は比較的未分化で液体培養が可能なので、我々はこれを材料として解析を行った。まず前培養時の窒素源を変えるなどして取込み活性を測定したところ、ヒメツリガネゴケには誘導性の高親和性輸送体しか存在しないことを示唆する結果が得られた。また、硝酸イオン存在下で前培養して活性を誘導しておけば暗条件でも取込みが起こったことから、取込み活性自体には光は必須でないことを見出した。さらに、光強度を上げることで取込みが促進された。一方、アンモニアの添加によって硝酸イオンの取込みが可逆的にかつ速やかに阻害されることを以前報告したが（2003年度本大会）、今回、さらに解析を行った。まずグルタミン合成酵素の阻害剤を添加すると、硝酸イオンの取込みがアンモニアによる阻害を受けなくなったことから、硝酸イオンの取込みを阻害するのはアンモニアではないことが示された。さらに、グルタミン酸合成酵素の阻害剤またはグルタミンを添加すると硝酸イオンの取込みが阻害されたことから、硝酸イオンの取込みを阻害するのはグルタミンであることが明らかとなった。

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PIIはBacteria, Archaea, Plantで保存されている炭素/窒素のバランスセンサータンパク質で、窒素欠乏時には2-オキソグルタル酸 (2-OG)が結合し、リン酸化を受ける。我々はSynechocystis PCC6803のゲノムライブラリーを用いた酵母ツーハイブリッドスクリーニングによりPII結合タンパク質としてPamAを同定し、in vitroでの結合を調べ、C末可溶性部位がPIIと結合し、さらにATP & 2-OG存在下でPIIとPamAが解離する事を発見した (小山内他 2003年日本分子生物学会)。pamA破壊株 (GN10) を用いた研究により、この株では窒素関連グループ2シグマ因子sigEを含む数種の窒素関連遺伝子の転写が減少していることが明らかとなった。GN10において、野生型と比べ転写量の変化した遺伝子・変化しなかった遺伝子を分類した結果、PamAは窒素欠乏一段階目(Phase-I)の遺伝子の転写には関与せず、二段階目(Phase-II)以降の遺伝子の転写に関与する事が示された。このように、シアノバクテリアでは窒素欠乏時に遺伝子発現カスケードが存在し、PamAはPhase-II以降の窒素関連遺伝子発現に関与する事が示唆された。

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　我々はこれまでにトウモロコシの2-オキソグルタル酸/リンゴ酸輸送体（OMT）とジカルボン酸輸送体（DCT）を同定し，これらの輸送体が葉肉あるいは維菅束鞘細胞特異的に発現し，C₄光合成回路の代謝産物輸送に関わっている可能性を示してきた．C₄植物が様々なC₃植物種より分岐進化し，C₄光合成回路を獲得する過程で，既存のOMTおよびDCT遺伝子にC₄特異的な発現調節機構を付与し，機能を分化してきたと推定できるが，トウモロコシ近縁種のC₄植物におけるOMT,DCTは，いかなる発現様式および機能を有しているのだろうか．本研究では，トウモロコシと同じイネ科のC₃植物であるイネよりOMT,DCT遺伝子を同定し，その遺伝子発現および各タンパク質の輸送特性を明らかにすることを目的とした．その結果，一つのOMT遺伝子(OsOMT1)と二つのDCT遺伝子(OsDCT1, OsDCT2）を同定することができた．このうちOsDCT1とOsDCT2は，トウモロコシのZmpDCT1とZmpDCT2にそれぞれ高い相同性がみられた．それぞれの遺伝子の発現を調べたところ，OsOMT1とOsDCT2が植物体全体で発現しているのに対し，OsDCT1は地上部でのみ発現していた．現在，組織レベルでの発現解析を進めており，輸送特性の解析とも併せて報告する予定である．

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光非依存型プロトクロロフィリド還元酵素（DPOR）は、プロトクロロフィリド（Pchlide）のD環を還元し、クロロフィルの直接の前駆体クロロフィリドを生成する酵素であり、光合成生物の暗所でのクロロフィル合成を決定づけている。紅色非硫黄細菌Rhodobacter capsulatusのDPORはBchLとBchNBの二つのコンポーネントで構成されており、前回の本年会では、それら各コンポーネントの大量発現系と活性の再構成系について報告した。今回、この大量発現系を利用して、各コンポーネントの活性を個別に評価する系を確立し、それらの生化学的性質について検討した。嫌気条件下でBchLの大量発現株から調製した粗抽出液に、BchNBを含む粗抽出液を順次添加してPchlideの生成量を測定することによりBchNBの活性を、また、逆の組み合わせによりBchLの活性を評価することが可能となった。この活性評価系を利用して、各コンポーネントの酸素耐性を検討した。その結果、BchNBは酸素に対し安定であるのに対し、BchLはきわめて高い感受性を示した（半減期約30分）。また、アフィニティタグを用いて精製したBchLのEPR測定を行ったところ、[4Fe-4S]型鉄硫黄クラスターを示すシグナルを検出した。各コンポーネントの生化学的諸性質と、それに基づいたニトロゲナーゼとの相異について考察する。

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　光合成細菌 Rhodobacter sphaeroides f. sp. denitrificans IL106 のDMSO (dimetylsulfoxide) 呼吸系のdmsCBAオペロンは2成分制御系のDmsS/DmsRで転写制御が行われている。一般にセンサーキナーゼは膜貫通タンパクと推定されているが、DmsSの予想されるアミノ酸配列において明瞭な膜貫通セグメントが見られなかった。LacZ 融合による膜結合領域の解析を行った結果、DmsSの膜結合領域はペリプラズムに露出していないことが推測された。そこでDmsSがDMSOではなく、何をシグナルとして認識しているのかが問題となった。
　本研究ではセンシング機能を有する膜結合領域を部分切除することにより、センシングに必要な領域を同定することを目的とした。DmsSの膜結合領域のC末端側から長さを変えてアミノ酸を削るように、4つのプラスミドを構築した。それぞれのプラスミドをDmsS破壊株に接合導入し、イムノブロットによってDMSO還元酵素の発現を確認したところ、すべての株において発現の回復は見られず、膜結合領域はセンシング機能に必要であることが推定された。

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シアノバクテリアは光化学系II(PSII)のD1、D2タンパク質をコードするpsbA, psbD遺伝子を重複してもっているため、光独立栄養増殖を阻害せずにこれらの遺伝子破壊と置換が可能である。中温性Synechococcus elongatus PCC 7942の染色体上のpsbAIおよびpsbDI遺伝子のタンパク質コード領域を好熱性Thermosynechococcus vulcanusのD1とD2タンパク質のコード配列に置換した組換え体を作成した。シアノバクテリアの菌体よりチラコイド膜を可溶化し、T. vulcanusのD1-1特異的抗体を用いてウェスタン分析を行った。S. elongatus PCC 7942 のpsbAI遺伝子のみを置換した組換えS. elongatus GRPS201株では、PSII複合体に好熱菌由来のD1-1タンパク質はほとんど組み込まれていなかった。psbA遺伝子のノーザン分析より、GRPS201 株では組換え型psbAI遺伝子が最も多く転写されていたので、D1-1タンパク質の翻訳または翻訳後のアセンブリーが進行していないと考えられた。GRPS201株のpsbDI遺伝子ORFを好熱菌のD2タンパク質ORFに置換した株を作成し、好熱菌由来D1-D2ヘテロダイマーが中温菌内でアセンブリーされるか調べている。

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Synechocystis sp. PCC 6803のssl0564遺伝子は、89アミノ酸残基の全長のほとんどが、LuxR型のへリックスターンへリックスモチーフ部分から成る、低分子量転写因子をコードしている。同様な転写因子は原核生物に広く存在するが、機能解析は枯草菌で胞子形成時に働くGerEについてなされているのみである。ssl0564の生理的役割を明らかにするため遺伝子破壊株を作製し、通常条件と、強光、酸化、塩、高温の各種ストレス下で表現型を調べたが、野生株との間に違いはなかった。しかし窒素欠乏条件では、破壊株でフィコシアニン量の著しい減少がみられた。組換えSsl0564タンパク質を発現させたところ、二量体の形成が確認されたが、DTT等還元剤の存在下では二量体化は起きなかった。シアノバクテリアのGerE様低分子量転写因子のC末領域には、良く保存された三つのシステイン残基が存在するが、これらが二量体化に関わっている可能性が考えられる。以上の結果からSsl564が窒素欠乏条件下でレドックス変化を検知し、遺伝子発現調節を行っているのではないかと考え、現在マイクロアレイ解析の準備を進めている。また、ゲノムDNAライブラリー中から、Ssl0564タンパク質に特異的に結合する配列を単離する試みについても併せて報告したい。

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緑色硫黄光合成細菌の持つクロロソーム内の色素は種によって異なり、バクテリオクロロフィル（BChl）c・d・eのいずれかで構成されている。しかし、我々はこれまでに緑色硫黄細菌Chlorobium (Chl.) vibrioformeにはクロロソーム内の色素組成が異なるいくつかの株が存在することを報告してきた。Chl. vibrioforme NCIB 8327株にはクロロソーム内にBChl cのみもしくはBChl dのみを持つ2種類の菌株が存在することが分かった（それぞれC株およびD株とする）。また、この株と同一クローンとされているChl. vibrioforme DSM 263株にはこの2つの色素が同一細胞内に存在していることも明らかにした。本研究では、これらの株が同一クローンにも関わらずに異なる色素組成を示す原因が、BChl cの20位メチル化酵素遺伝子、bch U、にあると考えて、まずはこれらの株のbchU遺伝子配列の解析を行った。その結果、D株ではbchUが不活性化しているが、短い期間にその遺伝子に変異が蓄積し、bchUが再活性化してC株とDSM 263株に変化したことが示唆された。また、2つの色素の生理的機能を調べた結果、BChl cはdよりも菌の生育に有利に働くと考えられた。このことが1つの選択圧となってD株の不活性化bchUに復帰突然変異が生じ、BChl cを合成する株に変化したと考えられる。

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緑色硫黄光合成細菌の持つクロロソームは、光エネルギー捕集のための特殊な膜外アンテナ系であり、その光捕集の中核部はタンパク質の関与しない色素のみの自己会合体からなっている。そのため、クロロソームの研究は、光デバイスや光センサーの開発においても近年注目されてきている。当研究室では、有機合成化学的に自己会合能力を持たせた新規クロロフィル型化合物を合成し、様々な環境下で自己会合させて、その機能を解明する研究を行っている。しかしながら、有機合成によって合成可能である化合物には制限があり、特に複雑な化合物へのメチル基を直接導入することは困難である。生体内のクロロソーム内に存在する色素であるバクテリオクロロフィル（BChl）c・d・eには多くのメチル基が存在し、合成化合物を用いた研究においても種々のメチル基を導入した化合物を比較検討することが今後の研究の発展に必要である。本研究では、近年ほぼ明らかとなった緑色硫黄光合成細菌Chlorobium tepidumのBChl c合成経路におけるメチル化酵素に着目し、それらの酵素を用いて有機合成化学的に応用できる反応系を確立することを目的とした。これまでにBChl cの20位のメチル化酵素遺伝子bchUの大腸菌内での発現実験を行い、可溶性画分に目的の大きさのタンパク質を確認した。現在、合成化学への応用を視野に、様々な基質とBchUとの反応系を検討している。

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ヘリオバクテリアの光化学反応中心は、シアノバクテリアや高等植物の系I型反応中心と同じFe-Sタイプである。この光合成細菌はグラム陽性であり、集光性タンパクやアンテナ色素会合体をもたない。反応中心コアタンパクはホモダイマー構造と推測されている。我々は昨年の本大会では、好熱性のHeliobacterium modesticaldumから調製した膜標品を用いて、センターX（F_X）に由来するシグナルを初めて観測したことを報告した。また安定なコアタンパク標品を単離し、膜標品との分光特性の比較を詳細に行った。今回は、異なる可溶化方法により得た粗精製標品の閃光照射実験とESRによる測定を行ったので報告する。室温293Kで粗精製標品を閃光照射すると、P798⁺はt_1/2 = 30 msで再還元され、この値は膜標品での電荷再結合の値と同じであった。また低温77Kではt_1/2 = 2 msの成分のみ観測され、これはF_Xとの電荷再結合に由来する。昨年、コア標品の室温での電荷再結合はt_1/2 = 20 msであることを報告した。したがって粗精製標品には、末端電子受容体であるF_A/F_Bタンパクの存在が強く示唆された。実際、ESR測定を行ったところ、14Kで光照射によりF_Bシグナルが観測された。さらに230Kから14Kに冷やしながら光照射を行うことによりF_A/F_Bのinteraction formのシグナルが観測された。これらF_A、F_Bのシグナルはすでに膜標品で報告されていたが、可溶化標品で報告された例は初めてである。

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　Rhodovulum sulfidophilumは、反応中心結合チトクロムが3ヘムであり、一般の4ヘムとは大きく異なる特徴を持つ。欠失しているヘムは、4ヘム型チトクロムでは可溶性電子伝達体からの電子受容部位であり、電子受容機構が異なることが予想される。本研究では、その電子伝達体について調べた。
　Rdv. sulfidophilumのスフェトプラストから可溶性タンパクのない膜標品を調製し、閃光照射実験を行ったところ、反応中心結合チトクロムの再還元が観察された。このことから、この菌には膜結合性電子伝達体が存在し、チトクロムbc₁複合体から反応中心結合チトクロムへの主要な電子伝達体として機能していると考えられた。
　低濃度のオクチルチオグルコシド（30mM）で膜を処理したところ、分子量100kDa程度の膜結合性チトクロムcが新たに得られ、再構成実験の結果、この膜結合性チトクロムcによる反応中心結合チトクロムの再還元が見られた。すなわち、このタンパクが先に示した反応中心への膜結合性電子伝達体の候補であると考えられる。
　これまで、このような膜結合性電子伝達体は、反応中心結合チトクロムを持たない紅色細菌でのみ観察されていたが、本研究により反応中心結合チトクロムを持つ菌にも存在することが示唆された。

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It is reported that NifS or IscS (a homolog of NifS) protein in Azotobacter vinelandii and Escherichia coli are involved in assembly of iron sulfur (FeS) protein. It is thought that mobilizing sulfur from free cystein is incorporated into apo-FeS protein to form FeS cluster by NifS or IscS. IscS homolog was also reported from oxygenic photosyntetic bacteria, cyanobacteria Synechosystis PCC 6803. Whole genome sequence of Green sulfur Bacterium Chlorobium tepidum revealed that the putative iscS is present on the genome of C. tepidum. Phylogenetic analysis indicate that the iscS of C. tepidum is classified with different from those of E. coli and cyanobacteria. To investigate the function of iscS of C. tepidum, we over-expressed iscS using His-tagged expression vector in E. coli. The biochemical function of purified protein from E. coli will be reported.

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Chlorobium tepidum can grow with N₂ as the sole nitrogen source. The whole genome sequence of C. tepidum contains four putative Fd genes and Seo et. al. purified three Fds, each binding two [4Fe-4S] clusters. The genome contains one more Fd gene, which has a putative sequence motif for binding of [2Fe-2S] cluster, and is located on the downstream of nif operon that encode the structural genes of nitrogenase. In this study, we characterized the transcription of Fd genes in C. tepidum and found the [2Fe-2S] type Fd gene was expressed only under combined-nitrogen depleted conditions as were several nitrogenase genes. The expression of other [4Fe-4S] Fd genes were not significantly affected by nitrogen source. The [2Fe-2S] type Fd gene was overexpressed in Escherichia coli, and UV-visible absorption spectrum of the purified Fd was similar to those of Azotobacter vinelandii and Clostridium pasteurianum [2Fe-2S] Fds.

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　我々はシアノバクテリアSynechococcus sp. PCC7942株において3つのdnaK相同遺伝子(dnaK1、dnaK2、dnaK3)を見い出している。これら3つのdnaKのうち、dnaK2はdnaK3と共に生育に必須であり、熱ショック応答を示す他、強光、塩ストレスでも誘導されることが当研究室より確認されている。
　酵母2ハイブリッドシステムを用いたスクリーニングの結果、DnaK2タンパク質とRNase Eとの相互作用が示唆された。MicrocystisにおいてRNase Eは非翻訳領域内のAU-boxをターゲットとしてpsbAII mRNAの安定性を光条件により調節していることが示唆されている（伊東葉子 他, 2001 日本分子生物学会）。このことからDnaK2がRNase Eによる psbAII mRNAの安定性の調節機構に関与している可能性を考えた。
　今回我々は、lacZ遺伝子をレポーター遺伝子としてpsbAII mRNAの非翻訳領域と融合させ、AU-boxの有無による影響を調べた。その結果、S. 7942株においてもpsbAII mRNAの安定性にAU-boxが関与している可能性が示唆された。次にDnaK2の過剰発現による影響を調べたところ、通常の生育光条件でDnaK2を過剰発現させるとpsbAII mRNAが安定化することが示唆された。DnaK2の影響が、RNase E を介したpsbAII mRNAの安定性によるものかどうかさらに詳しく解析中である。

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　ゲノム塩基配列が判明した生物種の全カロテノイドの同定は，生理学的・系統分類学的研究に重要である．シアノバクテリアSynechocystis sp. PCC6803ではミクソール・ジメチルフコシドなど全カロテノイドを同定し，ミクソールを除く生合成経路と遺伝子が判明した（Takaichi et al. (2001) PCP）．
　本研究ではAnabaena sp. PCC7120の全カロテノイドを同定した．極性カロテノイドは (3R,2'S)-ミクソール・フコシド (12%，モル％)，(3S,2'S)-4-ケトミクソール・フコシド(6%)で，他にβ-カロテン(56%)，エキネノン(26%)，カンタキサンチン(1%)，β-クリプトキサンチン(1%)があった．この結果と遺伝子情報検索により，ミクソールを除く生合成経路を推定した．β-カロテン・ケト化酵素(CrtO)はβ-カロテンをエキネノンにするがカンタキサンチンにはできず，ミクソールのケト化もする．β-カロテン水酸化酵素(CrtR)はβ-カロテンには作用せず，デオキシミクソールにのみ作用する．このような同じ作用をする酵素の基質特異性の差異が，カロテノイドの多様性を生じると考えられる．遺伝子の相同性からはリコペン・シクラーゼがSynechocystis sp. PCC6803と同様に見つからなかった．

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脱窒光合成細菌Rhodobacter sphaeroides f. sp. denitrificans における脱窒の最初の酵素、硝酸還元酵素はペリプラズムに局在し硝酸還元酵素遺伝子はnapKEFDABCより成る。テトラヘムcより成るNapCはキノールから硝酸還元酵素への電子キャリアーと考えられている。一方、napオペロンの発現制御に関わるシグナルについては全く不明である。本研究では、napオペロンの発現制御に関わるシグナルを明らかにすることを目的とした。
　napKEFD-lacZとの融合プラスミドを、野生株及びnap変異株に導入して環境条件によるLacZ活性の変化を見た。嫌気/暗条件で硝酸を加えた時LacZ活性が高く、光は阻害的であった。しかし、好気条件では硝酸を加えなくても高い活性を示した。napAとnapB変異株ではLacZ活性は殆どなかったため、硝酸そのものがシグナルでないことを確認した。次に、napC変異株では、硝酸還元酵素活性を示すと同時にLacZ活性も示し、NapCタンパク質の硝酸還元における役割が問題となった。

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　同花被花が多い単子葉植物では、花の形態の遺伝的機構を説明するモデルとしてABC modelの代わりにmodified ABC modelが提唱されている。このモデルによれば、Bクラス遺伝子がwhorl2と3だけでなく、whorl1まで発現することによって、whorl1が花弁様の花被片を形成すると考えられている。近年、チューリップ等のユリ科植物で、Bクラス遺伝子の発現パターンがmodified ABC modelを支持する結果が報告されている。しかし、単子葉植物においてガクと花弁が分化した異花被花を用いた研究はこれまで行われておらず、異花被花の形態とBクラス遺伝子の関連は明らかになっていない。
　そこで本研究では、単子葉植物のBクラス遺伝子と花被の分化の関連を解明するために、単子葉の異花被花植物であるムラサキツユクサ(Tradescantia reflexa)とツユクサ(Commelina communis)を用いて、Bクラス遺伝子の単離及び花における発現解析を行った。これらの植物からは5つの相同遺伝子が単離され、RT-PCRによる発現解析の結果、GLO-like遺伝子はすべてのwhorlで発現が見られるのに対し、DEF-like遺伝子の発現はwhorl2、3でしか見られなかった。この結果から、これらの植物においてDEF-like遺伝子の発現領域の変化が花被の分化を決定している可能性が示唆された。

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　植物の木繊維形成過程では、細胞伸長や二次壁合成が起きている。製紙産業において、木繊維長や細胞壁の量は、紙の性質を決めるうえで重要なファクターである。木繊維形成過程には、多くの遺伝子が関わっていると考えられるが、それらの発現情報や発現制御メカニズムに関する知見は乏しい。我々は、木繊維形成過程での遺伝子発現情報を網羅的に得るため、アラビドプシスとユーカリのオリゴマイクロアレイを用いた解析を行った。
　アラビドプシスのオリゴマイクロアレイは市販(Agilent社製)のもの使用した。ユーカリオリゴアレイは、独自に構築したESTデータベースをもとに作製し実験に用いた。これまでに、アラビドプシス野生株やセルロース合成変異体の細胞伸長期の遺伝子発現プロフィールと、ユーカリ木部形成部位における遺伝子発現プロフィールを取得した。現在、細胞伸長および木繊維形成に関与する遺伝子群を選抜するため、得られた結果の解析を進めている。

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　枝分かれは、植物の形を決める大きな要因の一つである。枝分かれは、茎頂分裂組織の側方に枝のもととなる腋芽分裂組織が確立し、それが分化、成長する現象である。われわれはイネを材料に、腋芽分裂組織形成の分子メカニズムを解析している。イネの栄養成長相における腋芽分裂組織は分げつとして成長し、生殖成長相における腋芽分裂組織は穂の枝梗・穎花となる。これまでに、枝梗・穎花が形成されないlax変異体の変異原因遺伝子を単離し、そのmRNAが、穂の形成時に茎頂と枝梗・穎花原基の境界部で層状に発現することを示した。また、遺伝学的解析からLAXが分げつ形成にも必要であることが示され、分げつ原基が形成される際にも、穂の形成時と同様の層状の発現を示した。
　分げつ原基の発生過程については古くから組織解剖学的な研究が行われてきたが、分子レベルでの知見は少ない。そこで、現在、分裂組織マーカー遺伝子を用いて、分げつ原基発生過程の詳細な解析を行っている。また、分裂組織マーカー遺伝子とLAXの発現パターンを比較することにより、LAXの腋芽分裂組織形成における機能を明らかにすることを試みている。さらに、イネにおける栄養成長相と生殖成長相の腋芽形成過程の相違について考察したい。

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植物の形態形成において重要な役割を担う頂端分裂組織（茎頂分裂組織、根端分裂組織）の形成は胚発生過程において行われる。また、これらの器官の形成は胚に形成される基本パターンや領域化に基づいて行われると考えられている。我々は、胚発生過程において器官形成能を欠失したイネ胚発生突然変異体を複数単離しているが、これらの突然変異体は器官分化のメカニズムそのものを欠失している場合と、器官分化に先立って行われる基本パターンの形成が異常になっている場合が考えられる。今回、我々はシュート領域（apical region）の分子マーカーであるOSH1、L2層の分子マーカーであるOsSCRの発現パターンが正常であるにも関わらず、器官形成が出来ないorganless1 (orl1) 変異体に注目し解析を行った。
orl1変異体は胚長約1600μmになるが、胚器官を全く分化しない変異体である。しかし、orl1変異体は胚盤上皮細胞由来のカルスからの再分化が可能であり、維管束の分化異常、花の形態異常など幾つかの形態異常を伴う再分化個体を得ている。ORL1遺伝子を単離し解析したところ、トリプトファン合成に関わる酵素をコードしていることが明らかとなった。変異体の特徴などからトリプトファンを前駆体としたIAAの合成にも影響を与えている可能性が考えられ、現在さらに詳しい解析を進めている。

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　コシヒカリ種子へのアジ化ナトリウム処理により得られた水稲変異体KT95は、下位葉が正常な葉身で、止葉を含む上位葉数枚が水分ストレス様の捲葉となる。本変異体KT95の代謝特性を明らかにするため、水分ストレスに応答して変動するプロリンやポリアミン、また主要なミネラル、微量元素などについてKT95と親株コシヒカリとの間の成分の比較を行った。
主稈の最終葉数が13枚の場合、KT95は11枚目までが正常で12、13葉が捲葉となった。しかし、葉身の水分含率は親株と変わらず、水分ストレス様の外観であっても、実際には水分欠乏とは認められなかった。実際、葉身のプロリンやプトレシンの含有量は親株との間に顕著な差が認められなかった。一方、親株とKT95では葉身のスペルミジンとスペルミン含量に大きな差が認められ、組織の代謝活性の指標となるスペルミジン/スペルミン比はKT95が著しく低い値を示した。主要ミネラルの中ではCaおよびMnが、また微量要素ではCaと同族のBaとSrがKT95の葉身で低く、親株との差は止葉でもっとも著しかった。

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　イネ種子胚乳組織は、胚乳母細胞を起源としてデンプン性胚乳細胞とアリューロン細胞に分化し、その後それぞれの組織で急速に貯蔵物質の合成・集積を伴い種子形成が進行する。しかし、胚乳形成の分子機構については不明な点が多い。本研究ではイネ胚乳組織の特定細胞を限定分離し、貯蔵物質合成に関わる遺伝子の発現をミクロレベルで解析することを目的とした。
　これまでの組織・器官レベルの解析では組織分画に限界があり、細胞レベルの精度を求めることはできなかった。動物組織ではLCM法を用いて標的細胞を正確に切断し回収することが可能になったが、植物組織は細胞壁を含むため困難であった。そこで、植物種子細胞に適したLCM法を開発し、胚乳形成期の特定細胞で発現している遺伝子の解析を行った。登熟過程の種子を固定・包埋し、10 µmの厚さに薄切した後LCMにて内胚乳組織を外周部と中心部に分けて回収した。RT-PCR法によりmRNAを検出したところ貯蔵タンパク質であるプロラミンは外周部で発現量が多いという結果を得た。また、貯蔵器官に関連する遺伝子としてグルテリンや液胞プロセッシング酵素の発現も解析したので合わせて報告する。

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1つの細胞が不等分裂し、それぞれが異なる運命をもつ娘細胞に分化していく過程は、細胞の多様性を生み出す根元的事象である。しかしながら、その分子メカニズムの多くは未解明である。コケ植物ヒメツリガネゴケは、形態が単純で細胞レベルでの研究に適しており、また、相同組換えを利用した遺伝子ターゲティングが高効率で可能なことから詳細な遺伝子機能解析が期待できる。ヒメツリガネゴケから単離したプロトプラストは、増殖能を維持し続けるいわゆる幹細胞としての性質を持つ娘細胞と、増殖能の低いより分化した娘細胞に分かれる不等分裂を繰り返し原糸体を再生している。我々は、この点に着目し、ヒメツリガネゴケの配列決定済みの完全長cDNAをヒメツリガネゴケ単離プロトプラストに一過的に過剰発現させることで、原糸体再生過程に異常を引き起こす原因遺伝子のスクリーニングを行ってきた。機能未知の遺伝子を中心に3,000以上の遺伝子を過剰発現させた。その結果、不等分裂が等分裂になるもの、不等分裂がおこらず等方位的に細胞が巨大化するもの、幹細胞様細胞がクラスター化するものなど細胞極性形成や不等分裂異常に関わると考えられる原因遺伝子を多数同定することができた。本年会ではこれまでの過剰発現スクリーニングの結果をまとめ、得られた遺伝子群の特徴と不等分裂における関わりについて考察したい。

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開花後1か月および収穫期のモモ果実よりcDNAライブラリーを作製し、ランダムにピックアップした約2,000クローンのマイクロアレイによる発現解析を行った。ターゲットとして開花後10、30、60、80、100、120日の果実および若い葉より精製したmRNAを用い、果実発達に伴い発現量が5倍以上変化する遺伝子を探索したところ1割程度が該当し、大きいものでシグナル強度で2桁の変動があった。i) 初期と収穫期で発現が強いもの：E6 protein ホモログ、IAA-アミノ酸ヒドロキシラーゼホモログ等、ii) 中期に発現が強いもの：cinnamoyl-CoA reductase、オーキシン抑制型タンパクの一種等、iii) 収穫期に発現が減少するもの：キシログルカンエンドトランスグリコシラーゼ、ヒスチジン型リン酸転移タンパク等。発現パターンごとにグループ化した結果の詳細を報告する。

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Rice flowers are composed of one lemma, one palea, two lodicules, six stamens and one carpel. Nagasawa et al. (1996) previously identified the floral organ number1 (fon1) mutant of rice, which showed a specific increase in floral meristem size and consequent increase in the number of lodicules, stamens and carpels. Recently, the FON1 gene was identified as the rice ortholog of the CLAVATA1 gene of Arabidopsis (Suzaki et al., 2003).
Here we report the identification of a new allele of fon1, fon1-5, which have a stronger phenotype than the previously reported fon1-1 allele. fon1-5 plants not only show a higher increase in inner floral organs, but also the formation of extra lemma/palea-like structures as well as fasciations of inflorescence branches, features that are not observed for fon1-1. fon1-5 contains a frameshift mutation upstream to the extracellular LRR domain, indicating that it might represent a null allele.

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　アラビドプシス花芽形成遺伝子であるLEAFYのリンゴのオルトログであるAFL遺伝子について、ゲノムのクローニングを行った。以前(岡山 2002)報告したAFL1, AFL2以外にAFL1aが得られた。このAFL1aは、AFL1の第1イントロンに約800bpの未知の配列が挿入されており、前後に9bpのdirect repeatがあった。栽培品種によってこれらの遺伝子の存在パターンはランダムに変化しており、AFL1, AFL1aを同時に持つものなどその種類や数は一定していなかった。また、後代への遺伝様式もランダムであった。また別の品種では上記以外の相同遺伝子が存在していることが示された。以上のことはリンゴAFL遺伝子の機能が固定されたものではなくリンゴの花芽形成に柔軟に関与していることを示唆した。さらに、リンゴの野生種や近縁種のAFL相同遺伝子をゲノムサザンにより解析すると、複数個のバンドが検出された。これにより、複数のAFL遺伝子はリンゴ栽培品種に特異なことではなく、この属や近縁種に共通の特徴であることが分かった。また、AFL1aが実際発現し機能するのかどうかを、アラビドプシス形質転換体を作製して解析を行ったので報告する。

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植物の体は頂端分裂細胞から形成されるが、その形成維持機構の分子メカニズムの全貌はまだ知られていない。セン類ヒメツリガネゴケの配偶体は原糸体頂端分裂細胞、茎葉体頂端分裂細胞によって形成される。我々は頂端分裂細胞の形成・維持機構を明らかにする目的で、遺伝子トラップ系を用いて頂端分裂細胞特異的に発現する遺伝子を同定している。今回は、原糸体および茎葉体頂端細胞にレポーター遺伝子が発現するエンハンサートラップ系統ET21から単離されたet21遺伝子及びシロイヌナズナオーソログAtet21遺伝子について報告する。et21及びAtet21遺伝子はそれぞれ145、127アミノ酸からなる、新奇なタンパク質をコードする。ヒメツリガネゴケet21遺伝子末端に、GFP遺伝子を相同組換えにより挿入しGFP融合タンパク質として細胞内局在を調べたところ、融合タンパク質は頂端分裂細胞特異的に発現し、細胞核に局在した。また、シロイヌナズナAtet21の発現解析を行ったところ、細胞分裂が盛んな組織に発現していた。et21とAter21遺伝子のプロモーター領域にはG2/M期特異的転写を担うMSA配列が認められることから、これらの遺伝子はG2/M期に発現し頂端分裂細胞で機能していると考えられる。遺伝子機能を解析するために、ヒメツリガネゴケ遺伝子破壊系統の作出を行っており、この結果も併せて報告する。

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Rice PLASTOCHRON1 gene encodes a cytochrome P450 protein, the CYP78A11. Loss-of-function mutations of the PLA1 affect the plant height, lamina joint bending, leaf initiation rate and the duration of vegetative phase. Transgenic plants over-expressing PLA1 exhibit abnormal leaf development resulting in seedling lethal. Phenotypic analysis of pla1 mutant suggested that PLA1 might regulate rice development via the regulation of plant hormone(s). Plant P450s are known to be involved in important biochemical pathways such as biosynthesis of alkaloids, terpenoids, lipids, glucosinolates, and plant growth regulators such as gibberellins, auxins, and brassinosteroids. To investigate the biochemical changes associated with PLA1 function, we performed metabolome analysis (Phenomenome Discoveries Inc.) using PLA1 over-expressing plants. It was revealed that over-expression of PLA1 could cause global change in the rice metabolism, including tryptophan metabolism and terpenoid biosynthesis that are related to auxins and gibberellins production, respectively. Further analysis is now under way.

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An Arabidopsis hpm1 mutant, induced by ion-beam irradiation showed a number of aberrant morphological phenotypes including serrated leaves, inhibited growth and early flowering. Similar to ddm1 and met1 mutants, the hpm1 showed a hypomethylation of 180 bp centromeric repeat. In contrast to the ddm1 and met1 mutants, however, hypermethylation of rDNA and transposons was observed in the hpm1 by Southern blot analyses and bisulfite sequencing. F1 plants from a cross between the hpm1 and the wild-type expressed the hypomethylation of the centromeric repeat DNA.The methylation of rDNA in F1 was not affected in comparison with the wild-type. Our results indicated that DNA methylation of repetitive sequences, rDNA and transposons was affected differently in the hpm1 mutant. Contradictive methylation status in the hpm1 suggested the more complex methylation mechanism than expected previously.

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高等植物の体細胞では非相同組換え活性に対して相同組換え活性は低いことが知られている。一方、減数分裂期相同組換え頻度は比較的高く、その組換え機構の解析により、相同組換え能向上の手がかりが得られると期待される。減数分裂期組換え酵素Dmc1は真核生物で広く保存され、相同染色体間組換え反応に中心的役割を果たす。我々はイネに存在する2種類のDMC1ホモログ（完全長cDNA：OsDMC1AとOsDMC1B）を単離し、それらのcDNAを導入したトランスジェニックイネを作出、解析し、以下のような知見を得た。1）OsDMC1アンチセンス・イネでは花粉稔性の著しい低下が生じたことから、DMC1遺伝子発現がイネ配偶子形成に必須であることを見出した。2）トランスポゾンTos17挿入によるイネdmc1変異系統の解析の結果、DMC1AまたはBの単独変異では稔性に影響は見られなかったことから、両遺伝子は構造的のみならず、機能的にも類似した重複遺伝子である。3）DMC1::GFP融合遺伝子導入イネの体細胞ではGFP蛍光が染色体に強く局在することが観察された。従って、Dmc1が体細胞でも機能し得ることが示唆された。4）DMC1遺伝子の過剰発現は、相同組換え活性検定用改変GUS遺伝子導入イネの組換え効率の増減には寄与しないことが判明した。

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In order to monitor global gene expression changes during the nodulation process, we have performed SAGE analysis using the model legume, Lotus japonicus. In the last year's meeting, we have reported on the results obtained from comparative analysis of 85,482 and 80,233 tags from uninfected root and nodulating root. A statistical test has revealed 408 tags whose transcription is induced upon nodulation. The gene identification of tags was done using public as well as in-house EST sequences. Extension of the SAGE tags into 3' cDNAs was performed for characterization of unknown tags by use of the reverse SAGE (rSAGE) technique. As a next step toward understanding of the gene regulation system of the nodulation process, we initiated analyzing promoter regions obtained from the genomic sequence. Status of the project will be presented including computational analysis of the promoter sequences and establishment of the transgenic plants for assessing the promoter activity.

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緑化による地球環境の保全や修復のため，耐乾性，耐塩性や耐凍性など環境ストレス耐性を向上させた組換え樹木の開発が期待されている。そのためには，まず樹木の環境ストレス応答や耐性のメカニズムを知る必要がある。近年のゲノム科学的解析手法の発展により，シロイヌナズナ等のモデル植物ではストレス応答やストレス耐性に関与する遺伝子が数百個以上存在することが知られている。一方，樹木でも米国を中心にポプラ全ゲノム解読プロジェクトが進行しており，ポプラの「モデル樹木」としての重要性が一層増している。本研究では，無菌的に栽培したセイヨウハコヤナギ（Populus nigra var. italica）組織培養体の葉に，乾燥，高塩濃度，低温，高温，アブシジン酸や過酸化水素の各種ストレス処理を行い，各々の試料から調製したRNAを用いて完全長鎖に富むcDNAライブラリーを構築した。さらに，そのライブラリーから30,000個以上のcDNAクローンの末端塩基配列情報（ESTs）を収集した。これら発現遺伝子群の情報をもとに，ポプラとモデル草本植物の相同性及び特異性について比較ゲノム学的見地から考察する。

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　シロイヌナズナ、イネなどの種子植物ゲノムの全塩基配列が既に決定されたが、それに対してシダ植物のゲノムに関する知見は乏しい。これまでに細胞生物学及び分子生物学の手法による光形態形成に関する研究がホウライシダを用いて行われてきた。そこで、これらの知見を活かしたシダのモデル植物としてホウライシダを位置づけるために、その前葉体で発現している遺伝子配列 (EST) を解析した。
　白色光下で培養したホウライシダ前葉体から調製したRNAよりcDNAを合成し、これを均一化した。このcDNAライブラリーより、約10,000クローンの塩基配列を決定した。得られた配列の重複について調べると、4,961クローンは1,541のクラスターを構成し、結果として合計で7,132の独立したESTグループが得られた。このことは、均一化が比較的効率良く行われたことを示している。相同性検索により、既知の遺伝子と相同性を示したものが約1,600 グループ、機能未知の遺伝子との相同性がみられたものが約1,100グループ、残りの約4,400グループは、相同性が全くみられず、新規の遺伝子をコードしている可能性が考えられた。

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理化学研究所に所属する植物科学研究センターとゲノム科学総合研究センターの共同プロジェクトとして、シロイヌナズナAc/Dsトランスポゾン挿入遺伝子破壊株約12000ラインの中から遺伝子coding領域とその上流100pb内に入っている約4000ラインの表現型を網羅的に観察記録している。
まずF3世代において、地上部の表現型、発芽率、薬剤耐性率、flowering timeなどを中心とした観察記録を行い、現在までに3000ラインの観察を終えており、色が白くなったもの、下偏成長のもの、ワックス合成欠損のもの、背が低いもの、鞘が短いもの、花序異常のもの、葉柄が捻れているものなどを分離している。
またF3世代において、薬剤耐性率からhomozygoteと判定されたラインは次世代についても表現型を観察している、芽生えにおいての根毛の長さ、根毛数、根毛の密度、胚軸の長さ、胚軸の太さ、主根の伸長率、側根数、側根の密度、本葉に見られるトライコーム、これらの項目を所定の日数に基づき観察し、一部のラインについては数値化も行っており、現在までに400ライン観察し主根の伸びが悪いラインと胚軸が短いラインを単離した。これらのラインの詳細な解析についても併せて報告する。
今後もトランスポゾン挿入位置と表現型を対応させたデータベース作成に向けて観察記録を行っていく予定である。

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We have been constructing two databases, "The Chloroplast Net (http://chloroplast.net)" and "The Small RNA Net (http://smallRNA.net)".
The Chloroplast Net is the database of chloroplast/photosynthesis-related genes in rice, and contains all genes encoded by the rice chloroplast genome and more than 1700 nuclear genes encoding the chloroplast components. These genes are easy to found using several search systems in The Chloroplast Net.
The Small RNA Net is the database of plant small RNA genes, such as tRNA and snRNA. In the Small RNA Net, we present more than 900 tRNA genes with their secondary structures that are predicted from whole rice genome using our original program (seqtrn02), and provide the services of tRNA prediction using seqtrn02.

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EST解析は新規遺伝子発見のための基盤を提供し、マイクロアレイ技術は遺伝子発現ネットワークの包括的な解析に有用な手法である。タバコは重要なモデル植物であるが、ゲノム配列はもとより、cDNAクローンやESTなどの大規模な遺伝子情報およびリソースが殆ど整備されておらず、マイクロアレイが利用できなかった。そこで、我々はタバコにおいてEST解析を行った。糸状菌エリシター処理および無処理のタバコ（Nicotiana tabacum cv. Xanthi-NC）幼植物体由来の完全長cDNAライブラリーをGatewayシステムに適合したベクターを用いて構築した。5,000個以上のコロニーを無作為に選抜してクローニングされたcDNAの配列を解析した。結果的に4,762個の5'-端から端読みしたESTが得られ、これらは1,668個のコンセンサス配列に分類された。各配列についてBLASTx検索結果を基にアノテーションを行った。このようにして選抜された完全長cDNAを用いてマイクロアレイを作製し、タバコにおいてそれらに対応する遺伝子の発現プロファイルの解析を行った。

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AP2/ERFドメインを持つ植物特異的な転写因子であるERFファミリーの包括的かつ体系的な機能解析を目的として、2種のモデル植物について公開されている配列情報を基にin silicoによるERFファミリー遺伝子の同定およびタンパク質構造、分子系統等の解析を行った。シロイヌナズナでは122個の遺伝子が推定された。その多くはERFおよびDREBという2つの主要なサブファミリーに分類され、さらにそれぞれ5つおよび2つのグループに分けられた。これらに属さない12個の遺伝子は3つのグループに分けられた。またAP2/ERFドメイン外にはそれぞれ特異的な転写制御機能を持つと考えられる複数のモチーフが見いだされ、各グループあるいは各サブグループには、特徴的なモチーフが保存されていた。これらの結果および既知のERFファミリー遺伝子の機能情報等から、グループあるいはサブグループごとの機能分化が推定された。さらに、ジャポニカイネのゲノム中にはこれまでのところ115個のERFファミリー遺伝子の存在が推定された。これらはシロイヌナズナとほぼ同様にグループ化され、保存モチーフの多くも同様に存在していた。このことは、ERFファミリーのグループあるいはサブグループごとの機能分化が種を越えて共通している可能性を示唆している。さらに、DNAアレイを用いてシロイヌナズナERFファミリーの発現プロファイルの解析を行った。

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雌雄異株植物ヒロハノマンテマはXY型の性決定を行い、Y染色体上に雄性決定因子の存在が示唆されている。雌雄異株植物における性決定のモデルとしてサブトラクションを中心に雄性決定因子の探索が行われてきが、現在までにY染色体特異的遺伝子は単離されていない。そこで、BACライブラリーを構築し、Y染色体上の遺伝子を探索することを試みた。Y染色体上の遺伝子を解析するため、Y染色体STSマーカー群を用いてBACライブラリーをスクリーニングした。その結果、Y染色体断片由来の7つのBACクローンを特定した。サザン解析を行い、各クローンに含まれるY染色体特異的配列の比率を検討した。雌雄のゲノムDNAでシグナル強度に明確な差のみられたMS2-9d12Fクローンを選び、物理的断片化とショットガンクローニングによってその塩基配列を決定した。MS2-9d12Fのインサートサイズは120 kbで、100 アミノ酸残基以上のORFを48含んでいた。24のORFはレトロエレメントと相同性を示した。また、蕾での蓄積量が多くnon-coding RNAと考えられるCCLS96.1遺伝子がコードされていた。ORF128とORF191はイネゲノムで報告されているORFに、ORF211はシロイヌナズナで発現が確認されているORFとの相同性を示した。Genomic PCRによってORFのY染色体特異性を、RT-PCRによって発現を確認した。その結果、発現が確認されたORFは全てY染色体以外に、常染色体またはX染色体にコピーを持ち、雌雄の葉と蕾で発現していた。

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