多くの紅色細菌は呼吸と光合成という二つのエネルギー獲得様式を酸素や光環境の変動に応じて使い分けている。そのためこの生物における活性酸素種（ROS）の生成は必然であり、その消去機構を発達させていると考えられるが、その機構はまだ不明な点が多い。近年、多くの生物種においてROS消去や酸化ストレスシグナル伝達に関わる因子としてペルオキシレドキシン（Prx）が報告されている。本研究では、紅色細菌のROS消去機構を明らかにすることを目指してR. sphaeoridesのペルオキシレドキシンの生理機能の解析を行った。
ペルオキシレドキシンはその一次構造から4つのファミリーに分類され、R. sphaeorides 2.4.1株のゲノム上にはTypeIIおよびPrxQに属する2つのPrx遺伝子が存在している。これらのPrxを組み換え体タンパク質として発現・精製し、生化学的に解析した結果、いずれもチオレドキシンからの還元力を用いて多種のROSを消去できることがわかった。これらの遺伝子の破壊株を調べたところ、好気条件下においてPrxQ破壊株のみ生育速度の遅延が見られた。また、嫌気条件下においてROS処理に伴う野生株の色素量低下の現象が、ROS処理をしていないPrxQ破壊株にも見られた。このことから、PrxQが主にROS消去を担っており、その機構は光合成色素合成の制御に必要であると考えられた。

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Mg-キラターゼはクロロフィル合成の第一段階であるポルフィリン環へのMg²⁺の配位を触媒する酵素であり、CHLI, CHLD, CHLHの3つのサブユニットから構成される。Mg-キラターゼの反応にはCHLIによるATP加水分解が必要であり、反応の律速段階であることが知られている。また近年、紅色細菌のBCHLIの立体構造が決定され、AAA⁺タンパク質の一員であることが明らかになっている。これまで我々は、シロイヌナズナのCHLI1がチオレドキシン（Trx）の標的タンパク質であり、レドックス制御によりそのATPase活性が調節されることを報告している。今回、CHLI1で保存されている4つのCys残基について部位特異的変異体を作製し、そのレドックス制御について調べたところ、C末端側に存在する2つのCys残基の変異体におけるATPase活性のレドックス応答が失われており、酸化状態で既に活性化されていることが明らかとなった。これら2つのCys残基の分子内の配置をBCHIの立体構造をもとに予測したところ、C末端の調節ドメイン内に近接していた。以上の結果から、CHLI1におけるチオレドキシンの標的はC末端側の2つのCys残基であり、これらが可逆的にジスルフィド結合を形成することで、調節ドメインのコンフォメーション変化を誘導しATPase活性を調節しているものと考えられる。

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Nudix hydrolase (NUDX)はヌクレオシド2-リン酸類縁体に対する加水分解活性を有するタンパク質ファミリーである。本酵素群の基質には細胞毒性物質、レドックス制御物質および種々の代謝産物が含まれるにもかかわらず、それらの生理機能については不明な点が多く残されている。我々はこれまでに、シロイヌナズナNUDXにはADP-リボースおよびNADHピロホスファターゼ活性を有するものが複数存在し(AtNUDX2、6、7)、それらの過剰発現株が酸化ストレス耐性の向上を示すことを示した。そこで本研究では、これらの酵素発現と酸化ストレス耐性との関係を詳細に検討した。AtNUDX2過剰発現株は野生株と比較してNADH量に差は認められなかったが、酸化ストレス下におけるADP-リボースの蓄積が顕著に抑制されていた。一方、AtNUDX7過剰発現株および破壊株では正常/ストレス条件下におけるNADH量がそれぞれ減少および増加していた。また同様の結果は、AtNUDX6においても認められた。さらに、AtNUDX7過剰発現株では、種々の細胞応答の制御に機能するポリ (ADP-リボシル)化活性の上昇が認められた。以上より、AtNUDX2は細胞毒性物質である遊離ADP-リボースのリサイクル、AtNUDX6および7はNADHの代謝を介したポリ (ADP-リボシル)化反応の活性化により酸化ストレス耐性に寄与していることが示唆された。

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近年、ニコチンアミド補酵素群（NAD(P)(H)）のエネルギー伝達系における機能に加え、タンパク質修飾やシグナル伝達経路における機能が明らかになってきたが、未だNADの生合成、代謝経路についての知見は少ない。動物や酵母では、NAD synthetase (NADS)がグルタミンと共役して、前駆体であるNaADからNADを生合成する事が知られている。我々のグループでは、出芽酵母のNADS遺伝子(QNS1）の相同遺伝子であるシロイヌナズナAt1g55090が酵母qns1欠損を相補する事を見出した。その酵母抽出タンパク質ではNADS酵素活性が上昇しており、HAタグを用いて精製したタンパク質はin vitroでNADS酵素活性を有していた事から、At1g55090はAtNADS遺伝子である事が証明された。AtNADSプロモーターGUS発現植物体の解析から、AtNADS遺伝子の発現は組織特異的に制御されている事が明らかとなり、特定の組織や細胞でNADが生合成される事が示された。AtNADS遺伝子の発現パターンはNaMNからNaADを合成するAtNMNAT遺伝子の発現パターンと良く一致した。また、NAD生合成遺伝子改変植物では矮小化、器官数の増加など様々な表現型が観察された。この結果は、植物の形態形成にNAD生合成・代謝経路が関与する事を示唆している。

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NADリン酸化酵素（NADK）はNADからNADPを合成する唯一の酵素である。葉緑体局在型NADKを欠損した変異体（nadk2）では、光化学系IIの最大量子収率が低下し、さらに熱放散が促進されていることが判明した。そこでキサントフィルサイクルに注目し3種のキサントフィルを定量したところ、それらの組成が大きく変動していることが判明した。
さらに代謝物解析の手法を用いて、炭素代謝と窒素代謝への影響を調査した。nadk2では炭素化合物が減少し、逆にNADK2高発現体（OX）では増加した。特にカルビン回路の代謝物に影響が見られたことから、NADK2と炭素固定の関与が示唆された。一方アミノ酸分析では、グルタミン酸を中心としたアミノ酸群が変動していることが明らかになった。それらのアミノ酸合成に関わる酵素の発現量にも差が見られたことから、NADK2が窒素代謝も制御している可能性が考えられた。以上の結果から、NADK2が葉緑体の代謝機能の調節・維持に深く関わっていることが示された。NADK2を高発現させることで炭素代謝と窒素代謝が促進されることは、バイオマスの増加に応用可能である。

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種子発芽には過酸化水素が必要であるが、どのように過酸化水素が認識されて種子発芽が調節されるのかについて不明な点が多い。我々は一般的にチロシンフォスファターゼが酸化条件下で失活しやすい性質に着目し、これが種子発芽時の過酸化水素を認識する因子の候補と考えた。シロイヌナズナのゲノム中に唯一存在する典型的なチロシンフォスファターゼであるAtPTP1の種子発芽における機能について解析するために、AtPTP1遺伝子にT-DNAが挿入された変異体の単離およびAtPTP1遺伝子を高発現する形質転換体の作出をおこなった。変異体の種子はABAを含む培地において野生型種子に比べて早く発芽したのに対して、形質転換体の種子の発芽は遅延した。組換えAtPTP1タンパク質が過酸化水素で失活することやABAによって過酸化水素の生成が誘導されることをこれらの結果と考えあわせると、AtPTP1は種子発芽時のABA応答に関与すると考えられる。

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2’-デオキシムギネ酸（DMA）は三価鉄キレーターとしてイネ科植物における鉄吸収に関わる重要な物質であり、またニコチンアナミン（NA）は金属とキレートし高等植物において体内の金属輸送に関わる重要な物質である。これらの物質の存在量の測定は植物の金属吸収、輸送メカニズムを解明する上で非常に重要である。現在用いられているHPLCと吸光度測定を用いた測定方法では100 pmol単位での定量が限界であり、測定のために大量の試料を必要とし、植物個体での各部位における濃度などを測定することは不可能であった。また、測定にも長い時間を要した。そこで本研究では液体クロマトグラフィー／エレクトロスプレーイオン化法飛行時間型質量分析計（LC／EST-TOF-MS）を用い、HPLCと比べ約100倍の高精度を持ち、かつ簡便な測定法を確立した。フルオレニルメトキシカルボニル(FMOC)化したDMA、NAは極性が下がり、逆相カラムでの保持が可能となる。DMA、NAに相似の化学構造を持つN-ニコチルリジン（NL）を内部標準として用いることにより、DMA／NL、NA／NLのモル濃度比とマスクロマトグラム面積比との間で信頼できる検量線が得られた。この測定方法では米一粒のサンプルなどからHPLCの半分以下の処理時間、測定時間でDMA、NA両方を同時に測定できることを確認した。

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Glutathione (GSH) is involved in many aspects of plant growth and development. Transport and compartmentalization of GSH is essential to perform all these functions. We have cloned a GSH transporter from rice (OsGTL1). OsGTL1 is a putative member of oligopeptide transporter family and encode a polypeptide of 757 amino acids divided in 12 transmembrane domains. Electrophysiological measurements using Xenopus leavis oocytes showed that OsGTL1 is a functional GSH transporter. Microarray and Northern blot analysis revealed that the expression of OsGTL1 is upregulated in response to Fe-deficiency. GUS analysis driven by OsGTL1 promoter showed that expression of OsGTL1 is upregulated in response to Fe-deficiency especially in root tips of Fe-deficient rice. These results raised the possibility that GSH may have functions apart from that of an antioxidant and could play a role in Fe-deficiency tolerance in rice.

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イネ科植物は三価鉄のキレーターであるムギネ酸類(MAs)により、根圏から鉄を吸収する。MAs合成系の遺伝子群を含め、イネ科植物の鉄欠乏誘導性遺伝子の多くには、上流に鉄欠乏応答性シスエレメントIDE1、IDE2が存在する。鉄欠乏誘導性bHLH型転写因子OsIRO2は、IDEs結合性ではないが、鉄欠乏応答における遺伝子の発現制御機構の一端を担うことを我々は報告してきた (Ogo et al., J. Exp. Bot. 2006)。本発表では、形質転換イネを用いた機能解析について報告する。OsIRO2過剰発現イネは、ムギネ酸類の分泌量が増加し、クロロシスになりにくかった。一方、RNAi法によるOsIRO2の発現抑制イネは、ムギネ酸類の分泌量が少なく、クロロシスになりやすかった。発現抑制イネを用いたマイクロアレイ解析により、ニコチアナミン合成酵素、Fe(III)-MAsトランスポーターOsYSL15等の発現が、OsIRO2の発現抑制に伴い減少することが確認された。また、複数の鉄欠乏誘導性転写因子もOsIRO2の発現抑制によって発現量が減少し、これらにはOsIRO2のDNA結合配列を上流に持つものもあった。OsIRO2は上流にIDEsに相同性の高い配列を持つ。これらのことから、鉄欠乏時においてIDEs結合性転写因子→OsIRO2→その下流の転写因子という遺伝子発現制御ネットワークが考えられる。

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鉄の吸収は主に地上部から送られる長距離シグナルによって制御されると考えられている。鉄欠乏状態のタバコの根において鉄トランスポーター(NtIRT1)や鉄還元酵素(NtFRO1)をコードする鉄吸収遺伝子の発現が誘導されることが知られている。本研究では鉄吸収遺伝子の発現制御における長距離シグナルの役割を解明するために、様々な生理条件下で鉄吸収遺伝子の発現解析を行った。鉄欠乏状態のタバコの葉を切除すると根の鉄吸収遺伝子の発現が低下したが、鉄充分状態では葉の切除後もこれらの遺伝子の発現が誘導されなかった。また、鉄欠乏状態で新しい順に半分の葉を切除したときと、古い葉を切除したときでは同じ程度の鉄吸収遺伝子の発現が確認された。以上の結果は促進的な長距離シグナルが鉄欠乏に応答して全ての葉から生産されることを示すとともに、タバコ実生の根が地上部なしでは鉄吸収遺伝子発現を充分に誘導できないということを示唆するものである。ところが、鉄欠乏に陥ったタバコ毛状根においても鉄吸収遺伝子が誘導されたことから、タバコの根自身にも鉄濃度のセンサーと鉄吸収調節機構があることを示唆された。これら一見相反する結果の理解のために、我々は、根における鉄吸収遺伝子を制御する促進的なシグナルの合成能は植物体全体で存在し、そのシグナル量が植物の大きさに相関するというモデルを提案する。

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イネ科植物の鉄欠乏耐性の強さはムギネ酸分泌量と比例している。しかし、オオムギとの混植により鉄欠乏時のイネの鉄含量を増加させても、オオムギとイネでは鉄欠乏時のクロロシスの現れ易さや葉の展開維持が異なる。この現象より、我々はオオムギの鉄欠乏耐性の強さには鉄獲得能力に加え、体内の鉄利用効率も関係していると考える。現在までに、鉄欠乏耐性の強いオオムギは他のイネ科植物（イネ・ソルガム）よりも鉄要求量が少なく、体内の少ない鉄を有効に利用していることを示してきた。また、体内の鉄の形態と葉色との相関より、高分子を含む水溶性鉄が葉色維持に関わっている可能性が示されている。そこで今回は、体内の鉄の貯蔵と恒常性に関与しているフェリチンに着目した。水耕液鉄濃度を段階的に変化させた処理区でイネとオオムギの混植栽培を行い、フェリチンのmRNAおよびタンパク質の蓄積量を比較した。mRNAの蓄積量はどちらの植物でも下位葉で一番高く、イネでは鉄過剰で著しく増加したのに対して、オオムギでは鉄欠乏条件下においても鉄過剰時と同等の蓄積量であった。フェリチンタンパク質の蓄積量の比較においても、オオムギは鉄過剰時以外でイネよりフェリチンを蓄積しやすい傾向にあった。オオムギ体内の鉄利用効率とフェリチンの関係について議論する予定である。

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オオムギではAl耐性における大きな品種間差が存在し、またAl耐性能と根から分泌されるクエン酸量に強い相関があることが知られている。この有機酸分泌に関与する遺伝子を同定するために、Al耐性品種のむらさきもちと感受性品種のMorexを用いたマイクロアレイ解析を行った。その結果、むらさきもちにおいていくつかの輸送体関連遺伝子が構成的に高い発現を示していた。最も高い発現差を示した輸送体遺伝子はむらさきもちの根端10mmにおいてMorexの約20倍の発現を示していた。ESTからBACクローンを選抜して配列解析し、遺伝子の全長配列を取得したところ、ORFにはむらさきもちとMorex間で2つのSNPが存在しており、そのうち1つではアミノ酸レベルでの相違を伴っていた。Al耐性能が異なるオオムギ8品種においてこの候補遺伝子の発現量とAlにより誘導されるクエン酸の分泌量との間に強い正の相関（R=0.96）が得られた。またアフリカツメガエルの卵母細胞に候補遺伝子のcRNAとクエン酸を注入して、アルミニウムによる電流の変化を測定したところ、水を注入した細胞の約2倍の電流が認められたが、cRNAとリンゴ酸の注入では電流の変化が見られなかった。この遺伝子によってコードされているタンパク質は根の表皮細胞の細胞膜に局在していた。これらの結果はこの輸送体がクエン酸を特異的に輸送する特性を持っていることを示している。

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イネはアルミニウム耐性種として知られているが、その耐性機構も耐性遺伝子もまだ明らかにされていない。我々はイネのアルミニウム感受性突然変異体als1を単離し、その原因遺伝子をクローニングした。この遺伝子を突然変異体に形質転換したところ、アルミニウム耐性が回復された。Als1の発現解析を行った結果、この遺伝子は地上部ではなく、主に根において発現していた。またAls1の発現はアルミニウムによって誘導され、根端（0-1cm）と基部(1-3cm)とも発現が認められた。Als1の発現を経時的に調べた結果、アルミニウム処理後2時間で発現誘導が見られた。Als1のプロモーターにAls1とGFPを連結したコンストラクトで形質転換したイネを用いて、Als1の細胞及び組織局在性を調べた。Als1は根端では、すべての細胞の細胞膜に局在し、基部側では表皮以外の細胞の細胞膜に局在していた。また側根においても蛍光が観察された。抗体染色も同じ結果を示した。Morinで根端を染色し、細胞内のアルミニウムを経時的に観察した。その結果、短時間のアルミニウム処理で野生型のイネではほとんど蛍光が観察されなかったが、変異体ではすべての細胞に強い蛍光が観察された。これらの結果はAls1が細胞に侵入したアルミニウムを細胞外に排出することに関与している可能性を示唆している。現在、この遺伝子の機能について更なる解析を行っている。

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土壌中のアルミニウム（Al）は酸性条件下では主に3価イオンとなり、植物体の生育に著しい生育障害を起こす。この問題を解決するにはAl耐性機構だけでなく、ストレス応答機構、特にプロモーター部位を中心とした遺伝子発現機構の解析も必要である。我々はAlストレス誘導性AtGST 11遺伝子をモデル系として、Alストレス下での発現応答機構に関わる転写調節因子をコードする遺伝子群を単離し、解析することにした。
まずT7 phageを vectorとしてAlストレス処理した植物体由来のcDNA でlibraryを構築した後、AtGST11遺伝子プロモーター領域（p-AtGST11）との間で蛋白質-DNA結合反応を行うことで（bio-panning method）、候補遺伝子群を選抜単離した。得られたクローンは塩基配列を決定した後、3候補までに絞りこんだ。それらはunknown proteinとRING zinc finger proteinとHD-Leucine zipper proteinをコードしていた。これらの完全長cDNAを得るとともに大腸菌内で蛋白質を合成させ、精製した後にゲルシフトアッセイ法によってp-AtGST11領域と結合することを確認した。
これらの結果は、3者がp-AtGST11領域との結合能力を持つとともにAtGST11遺伝子のAlストレス下での発現調節因子である可能性を示唆した。今後さらにこれらの蛋白質の機能解析を進める予定である。

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コムギのALMT1はアルミニウム（Al）イオンに応答してリンゴ酸を放出するが、Alイオンによる活性化機構は明らかではない。本研究では、Alイオンによる活性化に関与する領域の特定を目的に、コムギ、ライムギ、シロイヌナズナのALMT1相同遺伝子について、配列と機能の比較解析を行った。
コムギALMT1遺伝子と90%の相同性を示すライムギALMT1遺伝子をクローニングし、タバコ培養細胞に導入し、RNA発現量の高い株を選抜した。これら形質転換タバコ細胞のリンゴ酸放出能を調べた結果、Al存在下においてのみ、コムギALMT1と同程度のリンゴ酸放出能を示した。また、コムギと51%の相同性をもつシロイヌナズナのALMT1遺伝子もAl活性化リンゴ酸トランスポーターとして機能することが既に明らかになっている。Alイオンと相互作用をする領域としてマイナス荷電のアミノ酸（グルタミン酸、アスパラギン酸）を想定し、これらALMT1相同遺伝子間で保存されているマイナス荷電アミノ酸をコードする領域を調べたところ、数箇所存在した。現在、これらのアミノ酸残基を置換した変異ALMT1遺伝子を作成し、タバコ細胞に導入し、リンゴ酸放出能を解析している。

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[目的] FAO/UNESCOによると、pH8.5以上のアルカリ土壌は世界に4億3400万ha存在するとされている。高pH条件下での生育障害の原因としてこれまでにP, Fe等の要素欠乏が明らかにされており、NH₃による障害も指摘されている。OH^-による障害の存在も推定されているがその確証はない。本研究は微量要素欠乏やNH₃障害を発現しない培養法で植物を培養して、OH^-による生育障害の存在を検討することを目的とする。
[方法] 1 窒素源としてNO₃^-のみを含む培養液を用いイネとトマトをpH6, 9, 10, 11で8日間生育させた。高pH処理区では養分欠乏を解消するために各pH培養液とpH6培養液を1日おきに更新する培養法(交互pH処理)を設定した。培養液pHの低下を抑えるため培養液に通気する空気からCO₂を除去した。2 OH^-による細胞内代謝への影響を調べるため1と同じ処理で5日間生育させMDH活性を測定した。3 pH6で前培養したイネとトマトを1と同じ処理培養液で24時間処理し、水吸収量を測定した。
[結果] 1 全ての供試植物でpH10以上で生育が低下し、pH9以上で根長が減少した。根の伸長阻害作用は特に根毛で顕著であった。生育観察と分析結果から交互pH処理区において養分欠乏は認められなかった。2 葉、茎、根で有意なMDH活性の低下は認められなかった。3 水吸収はトマトでpH9以上、イネでpH10以上でともに処理開始12時間以内で有意に低下した。以上の結果からOH^-による生育障害は存在すると判断した。

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ホウ素(B)欠乏や過剰は植物の生育を阻害する。昨年シロイヌナズナでマイクロアレイを用いた解析により、B欠乏やB過剰による遺伝子発現の誘導について報告した。このうち、B過剰で栽培した植物で発現が誘導される遺伝子9個について、定量的PCRでも発現誘導を確認した。この中には、ヒートショックタンパク質やMATEファミリーのトランスポーターが含まれていた。また、B欠乏あるいはB過剰により発現が誘導される遺伝子十数個について、T-DNA挿入変異株のホモ個体を得てB栄養に応じた生育を調べた。このうち、WRKY6遺伝子の第三エキソンにT-DNAが挿入されているwrky6-3変異株の根の長さは、30uMのホウ酸を含む標準的な培地では野生型株と同程度であったが、0.03uMのホウ酸を含むB欠乏培地では野生型株よりも短かった。既報のwrky6-1及びwrky6-2変異株を入手し生育を調べたところ、B欠乏条件下で野生型株より根が短かった。WRKY6遺伝子のプロモーターでGUS遺伝子を発現するコンストラクトが導入された植物をB欠乏培地で栽培しGUS染色を行ったところ、標準的な培地で栽培した植物よりも根の先端付近で強い染色が認められた。また、根の先端5mmから抽出したRNAにおけるWRKY6転写産物の蓄積を定量したところ、B欠乏条件で2倍程度の増加が認められた。

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ホウ素は高等植物の微量必須元素であるがその生理機能は完全には理解されていない。我々はこれまで、植物細胞中のホウ素は細胞壁に局在し、ラムノガラクツロナンII領域とのホウ酸ジエステル形成を通じてペクチン質多糖を架橋していることを明らかにしてきた。一方ホウ素欠乏による様々な障害や細胞死の発生メカニズムは未だ明らかでない。そこで本研究ではタバコ培養細胞を用い、ホウ素欠乏による細胞死の発生過程について解析した。
3日齢のタバコ培養細胞BY-2をホウ素欠除培地で培養すると、処理開始24時間前後からヨウ化プロピジウムで染色される死細胞が増加し始め、72時間で50%の細胞が死んだ。我々はこれまでに低ホウ素培地に馴化させた細胞で抗酸化酵素遺伝子の発現量が増加することを見出している。このことはホウ素欠乏ストレスで酸化障害が発生することを示唆する。そこでホウ素欠除処理細胞の過酸化脂質含量について検討した結果、死細胞の増加に先立ち欠除処理18時間から過酸化脂質の蓄積が認められた。また抗酸化物質ブチルヒドロキシアニソールを添加すると細胞死が抑制された。これらの結果は、ホウ素欠乏ストレスで実際に酸化障害が発生し、それが直接の原因となって細胞が死に至ることを示している。今後はホウ素欠乏による細胞壁の構造異常が活性酸素を発生させるメカニズムについて検討する予定である。

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マメ科植物と根粒菌の共生窒素固定は、相互の複雑なシグナルのやり取りによって成立する。ミヤコグサはマメ科のモデルとしてゲノム解析が進行中であり、その情報を利用して根粒菌からのシグナル受容や根粒形成初期のシグナル伝達の鍵となるいくつかの遺伝子が単離されている。ミヤコグサ根粒形成過程のcDNAアレイ(Kouchi et al. 2004)やSAGE (Asamizu et al. 2005)などのトランスクリプトーム解析により、根粒形成初期から窒素固定能を持つ後期の根粒で発現誘導される転写因子が20種類見出された。リアルタイムRT-PCR解析により、7種類は根粒菌接種後3時間という早いタイミングで誘導を受けることが分かった。このうち3種類については、symRK変異バックグラウンドで発現が影響を受けるもののninでは影響がみられなかったことから、NINの上流で働く可能性が示唆された。ミヤコグサTILLING系統のスクリーニングにより、ERFファミリーに属する一つの遺伝子について、根粒非着生の変異体を得た。毛状根形質転換系を使ってこの転写因子を過剰発現させたところ、ベクターコントロールと比較して有意に根粒着生数が増加した。以上の結果から、このERF遺伝子は根粒形成または根粒菌感染を正に制御することが期待されるため、現在変異体を用いた機能解析を進めている。

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マメ科植物は共生関係の構築において、パートナーである根粒菌を誘引するために、フラボノイド系の化合物を根から土壌中に分泌する。このフラボノイドの分泌は、共生関係構築の過程で最も初期の現象と位置づけられ、根粒形成に重要であることが広く認識される反面、その輸送機構に関してはこれまで未知であった。そこで本研究では、ダイズの根におけるゲニステイン分泌をモデル系として、フラボノイドの膜輸送を生化学的に解析することにした。
窒素欠乏条件下で栽培したダイズ（Glycine max）の根から粗膜画分を調製し、ショ糖密度勾配遠心法により分離した。細胞膜画分（30/40%画分）を用いてATP依存的なゲニステイン輸送を経時的に測定すると、ATP存在下でのみゲニステイン輸送の上昇が認められた。種々の阻害剤を用いて輸送特性を解析すると、ゲニステイン輸送はP型ATPaseやABC蛋白質の阻害剤であるortho-vanadateによって60%近く阻害されたが、イオノフォアであるgramicidin D、nigericin、valinomycinによってはほとんど阻害されなかった。このことから、ダイズの根からのゲニステイン分泌にはABC蛋白質が関与することが強く示唆された。年会では速度論的解析や窒素栄養による輸送活性の影響についての結果も併せて報告する。

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マメ科植物は根の一部で根粒菌の感染が成立して根粒形成のプロセスが開始されると、根系全体の新規根粒形成が抑制される。これは根粒のオートレギュレーション(AON: Autoregulation Of Nodulation)として知られており、ミヤコグサではAONが機能しないために過剰に根粒を形成するhar1変異体が単離されている。HAR1は根ではなく地上部で機能することが示されており、根での根粒菌感染により地上部のHAR1を活性化、さらなる新規感染を抑制するシグナルが生成して根系全体に伝えられると考えられている。我々はAONと植物病理学における全身抵抗性の類似性に着目して、AONが病原抵抗性に関与するかどうかを調べた。
野生型ミヤコグサはPseudomonas syringae pv.pisiに感染するがP.syringae pv.glycineaには感染しない。これらの菌を用いて野生型ミヤコグサとhar1変異体の比較接種を行ったところ、P.syringae pv.pisiを接種したhar1変異体は野生型植物よりも激しい病徴を示した。さらにhar1変異体は野生型植物には感染しないP.syringae pv.glycineaに対しても顕著な病徴を示した。以上のことからHAR1を介したAONは根での共生菌に対する感染抑制だけでは無く、地上部の防御応答にも関与している可能性が示唆された。

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アーバスキュラー菌根菌（AM菌根菌）は土壌に生息する真菌類であり、陸上植物種の8割以上と共生する最も普遍的な植物共生微生物である。AM菌根菌は根の皮層細胞内に栄養交換器官を形成し、宿主植物にリン酸供給、乾燥耐性や耐病性の向上といった農業上有用な形質を付与する。しかし、菌根菌感染の分子機構は未だ殆ど解明されていない。
近年、マメ科モデル植物から同定された根粒菌感染の初期シグナル伝達経路を制御する7遺伝子がAM菌根菌感染においても機能している事が明らかとなった。我々はこれらの遺伝子の内、根粒菌感染シグナル受容の下流でカルシウムシグナル起動に関わるプラスチド局在型イオンチャネルCASTOR及びPOLLUXと、カルシウムシグナル受容に働くLjCCaMKをミヤコグサから単離し解析を進めてきた。
今回、これらの遺伝子群がマメ科植物に特有のものではなく、高等植物－AM菌根菌共生に普遍的に関与することを検証するために、菌根菌共生能を有するモデル植物イネを用いた実験を行った。まずこれら3遺伝子のイネオルソログOsCASTOR、OsPOLLUX、及びOsCCaMKを単離し性状解析を行った。また、これらのイネオルソログがミヤコグサ変異体の表現型を相補するか否かを検証した。更に、イネTos17ミュータントパネルよりOsPOLLUX及びOsCCaMK変異体を得て、これらの変異体のAM菌根菌共生能を調べた。

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細菌細胞は菌体外へ蛋白質などを分泌することで、環境等に対し生化学的な効果を及ぼす。これまでに知られている菌体外分泌機構の中でもType III分泌系（T3SS）は、動植物の病原菌で宿主機能を制御する蛋白質を宿主細胞質内へ注入する役割を果たしている。T3SSは共生を営む根粒菌でも同定されており、Nopsと名付けられた蛋白質を分泌し、その有無が宿主特異性に関わることが報告されているが、その実体の多くは不明である。私たちは、ミヤコグサ根粒菌Mesorhizobium loti MAFF303099株が持つT3SSの共生における役割とその生化学的機構の解明を目指している。本研究では、まず、MAFF303099株T3SS構造体遺伝子群全体およびT3SSの正の制御因子であるttsI遺伝子の破壊株を作製した。次に、Lotus japonicusおよびLotus属近縁種などへの感染試験による共生能の評価を行い、T3SS欠失株で根粒形成数と宿主の生育が変動するもの宿主4種を確認した。L. japonicusにおいては、窒素固定能自体に大きな変動は無かったが、根の伸長が、非感染>T3SS変異株>野生株の順であった。相補実験の結果も併せて、MAFF303099株のT3SS因子が宿主に認識されていることを支持した。さらに、T3SSにより分泌される機能因子を同定する目的で、制御因子であるttsI遺伝子をin vitroで強制発現させ、培養上清に放出される蛋白質を回収し、ゲル電気泳動により確認を試みた。その結果、4種の分泌蛋白質が確認された。

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約13,000種類のイネ完全長cDNAをmixしてCaMV35Sプロモーター下流に連結し、アグロバクテリウムを介してシロイヌナズナに導入することにより、イネ完全長cDNA高発現シロイヌナズナ系統（イネ－ナズナFOX系統）が作出された(松井ら、第47回日本植物生理学会年会講演要旨P.97(2006))。本研究ではイネ由来の病害抵抗性遺伝子を探索する目的で、これまでに作製されたイネ－ナズナFOX系統12,000系統(T2)を用いて、シロイヌナズナの病原細菌Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000(Pst)に対する感染抵抗性系統の選抜を行った。播種後3週間の植物に、Pstをdip法(0.5-2×10⁸CFU/ml)で接種し、6日後に植物の生存状況を調査した。2次、3次スクリーニングの結果、これまでにPst抵抗性を示した20以上の候補系統が選抜され、それらに導入されている完全長cDNAを同定した。さらに同定された完全長cDNAをシロイヌナズナ及びイネに再導入し過剰発現させ、病害抵抗性形質が再現されるかどうか調査を行っている。これまでイネに再導入した4種の完全長cDNAのうち2種が、イネの細菌病である白葉枯病にT0世代で抵抗性を示した。

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我々は、植物の免疫反応の一つである過敏感細胞死の誘導機構を分子レベルで明らかとすることを目的として研究を行った。その結果、イネ非親和性菌株によって誘導される過敏感細胞死はシクロヘキシミドによって阻害されることが示され、過敏感細胞死誘導には新規のタンパク質合成が必須であることが明らかになった。そこで、過敏感細胞死誘導に関与する因子をPCRサブトラクションとマイクロアレイを併用して解析したところ、分子内にNACドメインを持つ植物特有の転写因子OsNAC4が同定された。OsNAC4遺伝子をイネ培養細胞や生葉に導入し、一過的に過剰発現させたところ、DNAの断片化を伴う細胞死が誘導された。次に、OsNAC4の RNAi抑制形質転換細胞を作出し、過敏感細胞死を誘導しうる植物病原菌Acidovorax avenaeの非親和性菌株を接種したところ、過敏感細胞死の誘導は認められなかった。このとき、過敏感細胞死誘導時に認められるDNAの断片化や特徴的な形態変化も同様に認められないことが示された。さらに、OsNAC4の局在を調べたところ、非親和性菌株の接種により細胞質から核へ速やかに移動することが示され、OsNAC4が蓄積した核では、核膜の収縮やクロマチンの凝集といった過敏感細胞死特有の変化も認められた。以上のことは、OsNAC4がイネ培養細胞の過敏感細胞死を正に制御することを示している。

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過敏感細胞死は、植物が非親和性病原菌を認識したときに速やかに誘導される免疫反応の一つであり、DNAの断片化や核の収縮などを伴うプログラム細胞死である。これまで我々は、過敏感細胞死の誘導に植物特有の転写因子であるOsNAC4が関与していることを明らかにしてきた。今回、OsNAC4によって転写制御される遺伝子を解析し、過敏感細胞死実行に関する新たな知見を得たので報告する。イネ野生株培養細胞とOsNAC4のRNAi抑制形質転換培養細胞に過敏感細胞死を誘導するAcidovorax avenaeイネ非親和性菌株と水をそれぞれ接種し、経時的にRNAを調製し、22Kのオリゴマイクロアレイチップを用いて解析を行った。その結果、イネ野生株で非親和性菌株接種により特異的に発現誘導が認められる遺伝子のうち、OsNAC4のRNAi抑制株で発現誘導が認められない遺伝子が143個同定された。これら遺伝子の構造を詳細に調べたところ、分子内にEF handを持つOsHEN1と名付けたエンドヌクレアーゼ様分子をコードする遺伝子を見いだした。そこで、OsHEN1遺伝子をイネ細胞内で一過的に発現させたところ、核DNAの断片化が速やかに誘導されることが明らかになった。以上のことから、OsNAC4はOsHEN1を介して過敏感細胞死を誘導することが示唆された。

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イネは細菌の鞭毛構成タンパク質フラジェリンを認識し、活性酸素発生や抵抗性関連遺伝子の発現などの防御応答を誘導する。これまでの研究の結果、フラジェリンN末端配列のペプチド（flg22）を認識する受容体をコードするシロイヌナズナFLS2遺伝子と相同性の高いイネOsFLS2遺伝子を同定し、この遺伝子産物がシロイヌナズナにおいてFLS2と同様の機能を有していることを明らかにしてきた。しかし、イネではOsFLS2が発現しているにもかかわらず、flg22を処理しても非常に弱い防御応答しか誘導しなかった。これは、イネにおいてOsFLS2の発現量が低いことに起因する可能性が考えられたので、OsFLS2を過剰発現させた形質転換イネを作製し、flg22の認識と防御反応誘導について解析を行った。はじめに、作製した形質転換体のOsFLS2タンパク量をその抗体を用いて調べたところ、膜画分でのタンパク量の増加が認められ、また推定分子量との比較から糖鎖修飾されていることが示唆された。その発現を確認した形質転換体を用いてflg22に対する応答性を調べたところ、野生型と比べて強い活性酸素発生、抵抗性関連遺伝子の発現が認められた。このことから、イネのflg22に対する低感受性はOsFLS2から下流のシグナル伝達経路に問題があるのではなく、OsFLS2のタンパク量に起因していることが示された。

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We have previously shown that OsRac1, a small GTPase Rac of rice, is involved in disease resistance. In this study, we find that RAR1, an important component of R gene mediated disease resistance, HSP90 and 70, the molecular chaperones, MAPK6, a rice MAPK homologous to tobacco NtSIPK and Arabidopsis MAPK6 and Sti1 (Hop in mammalian cells) are all found in OsRac1 complex. Functional studies of RAR1, Sti1 and HSP90 using RNAi method and geldanamycin (GDA), the HSP90 specific inhibitor, indicate that they have critical role in rice innate immunity and involve in OsRac1 related defense signaling pathway. On the other hand, treatment of GDA but not suppression of RAR1 disassociates OsRac1 protein complex, indicating that HSP90 but not RAR1 function is required for the complex formation. Together, our results suggest a key role of OsRac1 protein by forming the defensome with important components in the early steps of defense signaling.

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植物の病原体感染に対する防御応答シグナル伝達ネットワークの解明は以下の理由で困難であった。1）防御応答に関わるシグナル伝達経路群は高度にクロストークしており、それぞれに対する単独の観察では全体の挙動が把握できない。2）PAMPsやエフェクターなどの多数の因子が病原体感染時には同時に、あるいは経時的に植物の防御応答を誘導する。3）防御応答シグナル伝達ネットワークの一部は遺伝子変異などの妨害に対しロバストであり、詳細なシステムの挙動解析が必要である。これらを克服し、防御応答シグナル伝達ネットワークの構造と機能を明らかにするために、我々は定量的かつ多数のパラメーターについて平行したデータ収集を基盤とした方策をとっている。防御応答シグナル伝達ネットワークに対する撹乱（例 遺伝子変異・欠失）を導入後にシステムの挙動に関する観察を行い、防御応答シグナル伝達ネットワークのモデルを構築するのが目的である。そのため、我々は定量性、再現性が高く、低コストのカスタムマイクロアレイを開発し、逆遺伝学と遺伝子発現プロファイリングを組み合わせたシグナル伝達因子スクリーニングを開始した。既知の変異体を用いた解析から防御応答シグナル伝達ネットワークにおける各遺伝子の相対関係モデルや病原体からの別個の防御応答誘導因子によって活性化される共通シグナル伝達経路、およびそれを制御する鍵遺伝子が明らかになっている。

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植物は病原体感染時に多くの遺伝子発現を変化させ、防御応答を行う。病原細菌 Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000) の hrcC 変異体はタイプIII分泌機構に変異を持ち、タイプIIIエフェクターを植物細胞に導入することができない。従って、 hrcC 変異体の感染によって誘導される植物の大部分の防御応答は、 pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) の認識によって起こると考えられる。植物はタイプIIIエフェクターを認識し、サリチル酸を介した防御応答を誘導することが知られている。しかし、 PAMPs がサリチル酸を介した防御応答を誘導するかどうかについてはわかっていない。そこで我々は、 Pst DC3000 hrcC 接種後、いくつかのシロイヌナズナ防御関連遺伝子の変異体の遺伝子発現プロファイルを、カスタムマイクロアレイを用いて解析した。その結果、 Pst DC3000 hrcC によって誘導されるいくつかの遺伝子は、病原体感染時のSA合成に必須である ICS1 遺伝子依存的であることがわかった。この結果は、PAMPsによってサリチル酸を介した防御応答が誘導されることを強く示唆している。また、その他の変異体における遺伝子発現プロファイル解析も紹介し、シロイヌナズナの基礎抵抗性メカニズムについて考察する。

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KNOX遺伝子は茎頂分裂組織（SAM）の形成・維持に重要な役割を果たしている。KNOX遺伝子はSAM特異的に発現しており、本来発現していない葉で異所発現すると葉の形態異常を引き起こす。従って、植物の正常な発生にはKNOX遺伝子のSAM特異的発現が必須である。我々はKNOX遺伝子の発現制御機構を明らかにするため、KNOX遺伝子の過剰発現体と同様な表現型を示すイネの突然変異体を選抜した。その中の1つ、knox leaf expression1 (kle1)は発芽後非常に小さなシュートを形成し、実際にKNOX遺伝子の葉での発現が観察された。kle1は実生致死で、SAMの維持や葉の形態に異常が見られた。KLE1遺伝子を単離した結果、シロイヌナズナのFIDDLEHEADとよく似たfatty acid elongaseをコードする遺伝子であることがわかった。KLE1遺伝子の発現パターンを調べた結果、胚発生過程では胚の最外層の細胞と分化してきたシュートのL1で発現が見られた。幼根での発現は見られなかった。発芽後はSAMや若い葉、穂、穎花のL1で特異的に発現していることがわかった。以上のことから、KLE1はL1の脂肪酸組成を制御することによりSAMの維持や葉の形態を制御していると考えられ、シュートの発生を制御するシグナルがL1から内部の細胞に伝達されている可能性が考えられた。

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シロイヌナズナ表皮のトライコームは昆虫食害に対する構造的なバリアとして機能するが、傷害を受けた植物体はさらにトライコーム密度の高い葉を形成するようになる。これは表皮細胞がトライコームに分化する頻度の可塑的な変化であり、ジャスモン酸の生合成及びSCF^COI1複合体を介したシグナル伝達が必須である。
トライコーム数が極端に減少したgl1-2変異体背景では、トライコームの増減を感度よく検出できる。gl1-2を変異原処理し、ジャスモン酸に対するトライコーム増加応答が消失するものとしてunarmed9 (urm9)を単離した。urm9はアントシアニン蓄積や成長阻害などのジャスモン酸応答に関しては野生型同様であり、トライコームの密度制御に特異的な異常を示した。トライコーム分化に関わる変異体との二重変異体を作成して遺伝学的相互作用を調べたところ、urm9の原因遺伝子はGL1及びGL3と協調してトライコーム分化を正に制御すると考えられた。興味深いことに、urm9のマップ領域は、トライコーム密度の系統間QTLとして知られていたRTN/TDL2遺伝子座のそれとオーバーラップした。RTNのクローニングは未報告であるため、現在urm9の詳細なマッピングを進めると共に、urm9とRTNのアレリズムについて検証を試みている。

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私たちは植物の分化全能性発現の仕組みを明らかにするためにヒメツリガネゴケをモデルとして解析している。ヒメツリガネゴケは植物の中でもとりわけ高い再生能力を持ち、切断処理によって生じた葉細胞は数日以内に幹細胞化する。そこで私たちは長時間タイムラプス観察と多検体画像取得が可能な多点タイムラプスイメージングシステムを開発し、葉細胞の幹細胞化は切断面に面した細胞が不等分裂して生じることを明らかにした。葉細胞から生じた細胞のその後の発生過程は胞子発芽後の発生様式と区別できず、葉細胞がリプログラミングされ初期発生過程を繰り返していると考えられる。また、単色光照射による実験と青色光受容体であるクリプトクロム遺伝子破壊株を用いた実験から、葉細胞の幹細胞化は光依存的でありフィトクロム、クリプトクロムを介して起きることが明らかになった。さらに、葉細胞の核の大きさを核酸固定染色により調べたところ、切断処理後24時間以内に核の膨潤が認められた。現在、葉細胞の幹細胞化に伴うDNA量の変化を測定し核の膨潤と細胞周期との関係を調べている。

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植物の幹細胞は継続的に様々な分化細胞系列につながる娘細胞を産生する。そして、それらの娘細胞は最終分化細胞へと成熟していく。ただし、最終分化細胞であっても、特定の環境下では幹細胞へと分化転換する能力を持ち続けている。私たちはヒメツリガネゴケにおける最終分化細胞である葉細胞が分化転換を経て幹細胞化する過程を植物の分化全能性発現のモデル系としてとらえ、トランスクリプトームを中心にした網羅的な解析を進めている。これまでに、この分化転換に関係する可能性のある光受容・情報伝達関連遺伝子、細胞周期制御、エピジェネティク制御、植物ホルモン関連遺伝子群、及び転写因子遺伝子群等を含んだ約10,000遺伝子からなる発現アレイを作成し、分化転換過程における経時的発現解析を行なった。その結果、分化転換に伴い特徴的な発現パターンを示す遺伝子群を同定した。
さらに、分か転換過程におけるエピジェネティク制御の中で、特にヒストン修飾の関与について検討するための実験系の構築を行なった。これまでに他の生物種とのヒストンコードの比較をする目的で、シロイヌナズナ及びヒメツリガネゴケを材料にして、各種抗メチル化又は抗アセチル化ヒストン抗体を用いた特定遺伝子群に対するChIP (クロマチン免疫沈降)-PCR解析を行なった。現在、分化転換過程におけるヒストン修飾のゲノムワイドな動態変動の解析を行なっている。

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動物の比較ゲノム解析により、発生に関わる遺伝子族は左右相称性動物の祖先段階で確立されていたことが明らかとなった。一方、陸上生物のもう一つの大きな系統である陸上植物では、系統間で著しい形態、発生過程の違いが知られている。このような発生過程を制御している遺伝子がどのように進化してきたのかは、非被子植物のゲノムデータの欠如からよくわかっていなかった。本研究では、小葉類イヌカタヒバSelagienlla moellendorffii、コケ植物セン類ヒメツリガネゴケPhyscomitrella patensのwhole genome shotgun配列情報を利用して、約700のシロイヌナズナの発生過程に関わる遺伝子ホモログの系統解析を行った。その結果、従来知られていた発生多様性に関わらず、非被子植物は被子植物の持つほとんどの遺伝子族を保有していることがわかった。一方、発生多様性を導いている原因として、（1）被子植物特異的遺伝子族の存在、（2）遺伝子の機能転換、（3）各系統におけるいろいろな遺伝子族の平行的な遺伝子重複による遺伝子の機能分化が関係しているらしいことがわかった。

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多細胞生物は、幹細胞の不等分裂により幹細胞自身を複製すると同時に、分化した非幹細胞を生み出し多細胞体制を作り上げる。このような幹細胞の不等分裂により異なる運命をもつ娘細胞が生み出される過程では特定のmRNAやタンパク質が不均等に分布することが重要な役割を果たしている。しかしながら植物幹細胞の不等分裂過程において、どのタンパク質がいつ、どのように不均等分布をするのかについてはまだよくわかっていない。そこで我々は、ヒメツリガネゴケから単離したプロトプラストが不等分裂する幹細胞であることに注目し、植物幹細胞の不等分裂の制御機構ならびに細胞運命の制御機構の解明をめざし研究を進めている。
これまでに、ヒメツリガネゴケ完全長cDNAをプロトプラストに一過的に過剰発現させるスクリーニングを行い、不等分裂制御に関わると考えられる遺伝子58種類を報告している。次に、これら遺伝子産物が不等分裂の際にどのような局在変化を示すのかを調べる目的で、これら候補遺伝子に対して、遺伝子ターゲティングにより黄色蛍光タンパク質シトリン遺伝子をノックインした形質転換体を作成し、内在性プロモーター制御下におけるシトリンとの融合タンパク質の局在解析を行った。その結果、非幹細胞に比較して幹細胞で強く発現する遺伝子産物を9種類同定することができた。これらの中には植物特異的な転写因子や機能未知なタンパク質が含まれていた。

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植物の生殖器官の成長および種子成熟には鉄、亜鉛、銅、マンガンなどの金属元素が必須である。植物体内における金属元素の輸送には、キレーターが重要な機能を果たす。ニコチアナミン（NA）は植物に広く存在する金属のキレーターであり、植物体内の金属輸送や金属の恒常性の維持に関わる。ムギネ酸類はイネ科植物に特異的な金属のキレーターであり、NAを前駆体として合成され、イネではデオキシムギネ酸(DMA)が合成される。本研究では、イネの生殖成長および胚発生過程におけるNAおよびDMAの役割を明らかにすることを目的とした。
生殖器官および種子への鉄、亜鉛、マンガンの輸送形態を探るため、Fe(II)-NA, Mn(II)-NA錯体のトランスポーター遺伝子をコードするOsYSL2遺伝子、Fe(III)- DMA錯体のトランスポーターをコードするOsYSL15遺伝子、Fe(II)のトランスポーターOsIRT1遺伝子、亜鉛イオンのトランスポーターOsZIP4遺伝子、NA合成酵素遺伝子(OsNAS)、DMA合成に関わる遺伝子の発現の花や種子における発現を解析した。さらに完熟間近の種子胚における金属分布を放射光マイクロビームを用いた蛍光X線分析により明らかにした。これらの結果に基づき、イネ種子胚への金属元素の輸送を考察する。

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クロマチンリモデリング因子であるPolycomb（Pc）複合体は、ヒストンH3の第27番リジン（H3K27）のメチル化修飾を介し、遺伝子発現を負に制御する。Pc複合体の構成因子であるCURLY LEAF（CLF）とSWINGER（SWN）の二重変異体（clf swn）は、発芽後に不定胚を形成する（Schyvert et al., 2005）。胚発生関連因子であるFUSCA3のプロモーター領域では、組織によってヒストンH3K27のメチル化レベルが異なる。そのため、Pc複合体の胚発生への関与が示唆されているが、具体的な分子機構は未だ不明である。そこで、clf swn における不定胚形成の原因を特定し、胚発生関連因子の発現制御とクロマチンリモデリングの関係の分子機構の解明を試みた。
我々は、clf swnを様々な条件下で生育し、低温で生育した時に地上部においてのみ不定胚の形成が抑制されることを見出した。clf swnでは通常環境での栽培において植物体全体でLEAFY COTYLEDON1 (LEC1)の異所的発現が確認されたが、低温条件での栽培によってのみ地上部でその異所的発現が抑制された。この地上部での発現抑制は低温条件から常温に移行する事で回復した。これらの結果は、clf swnで見られる不定胚形成はLEC1の異所的発現が主な原因であり、Pc複合体が発現制御に関与することを示唆している。

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高等生物は複雑な構造をもつが、それらは全て受精卵という単細胞に由来する。ほとんどの植物では受精卵は非対称に分裂し、異なる発生運命をもつ娘細胞を生じる。娘細胞のうち、頂端細胞からは植物体の大部分が形成され、基部細胞からは根端と胚柄が生じる。
シロイヌナズナのホメオボックス型転写因子をコードするWOX2 (WUSCHEL-related homeobox2)とWOX8遺伝子は受精卵で発現し、受精卵の非対称分裂によって生じた頂端細胞と基部細胞に、それぞれの発現が受け継がれる。その後WOX8の発現は胚発生後期に至るまで、基部細胞に由来する細胞系列のみに完全に受け継がれ、胚の形態形成において重要な役割を果たすことが明らかになってきた。そこで頂端―基部軸に沿ったWOX8の非対称発現を制御する機構を知るために、WOX8のcis配列の同定と、それに結合する因子の探索、およびWOX8の非対称発現を変化させる突然変異体のスクリーニングを進めている。また、既知の遺伝子の中に制御因子があるかを調べるために、初期胚の形態に異常を示す様々な突然変異体、および各種ホルモン投与下でのWOX8の発現パターンを観察した。これらの結果について発表する。

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真核生物のDNAはhistoneをはじめとするタンパク質とchromatinと呼ばれる機能的複合体を形成し、核内に収納されている。Chromatin assembly factor-1 (CAF-1)はSV40複製系においてDNA複製に伴いchromatin assembly活性を持つものとしてHeLa cell抽出物より単離され、後にDNA修復にも関与することが示されている。一方、Asf1(anti-silencing function 1)は酵母において過剰発現した際にsilencingを抑制する因子として同定され、後にCAF-1依存的にnucleosome assemblyを促進する因子としてショウジョウバエの胚細胞抽出液より精製されたRCAFがH3/H4とAsf1からなる複合体であることが示された。当研究室の賀屋らはこれまでにシロイヌナズナにおけるヒトCAF-1のp150, p60のカウンターパートであるFASCIATA1 (FAS1), FAS2 がSAMの形成および機能維持に関与していることを報告した。今回、シロイヌナズナASF1a、ASF1bのT-DNA挿入変異体、およびfas2変異体と作成した二重もしくは三重変異体について表現型を解析した結果、asf1aもしくはasf1bとfas2の二重変異体において花粉発生の異常がみられ、三重変異体は胚致死であった。これらのことから、ASF1およびCAF-1がシロイヌナズナの配偶子形成および胚発生において重要な役割を担っていることが示唆された。

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モモcDNAライブラリーより若い果実で発現の強いPF10056，PF11634が見いだされ、．翻訳産物（444および427残基）は植物特異的と考えられているBURP-domainタンパク質との相同性が見られ，C末端側にあるこのドメインでアラビドプシス由来RD22と50%の一致が見られた．また他の植物由来のBURP-domainタンパクと同様、CHX₁₀CHX₂₅CHX₂₅CH(Xは任意のアミノ酸残基)がみられ、構造上重要であると考えられた。N末端側では，28アミノ酸の繰り返しが5ないし5回半みられた．N末端側の異なるPF10268では21アミノ酸の繰り返しが5回みられた．RT-PCRの結果，若い果実や葉で発現が強いが，果実発達の後半では数十分の一に減少していた。開花前の花芽では弱い発現が見られた．

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植物のシュートの頂端分裂組織や花分裂組織は葉や花などの側生器官の形成に重要である．シロイヌナズナでは CLAVATA (CLV) シグナル伝達系によりメリステムの維持制御が行われていることが知られている．一方，他の植物においてはメリステムの維持制御に関する遺伝的研究は報告例が少なく，シロイヌナズナのメリステムの維持制御と類似した機構が植物に普遍的に存在するものなのかは明らかになっていない．私たちは，これまで，イネの2つの FLORAL ORGAN NUMBER遺伝子 (FON1, FON2) の解析を行ってきた．その結果，イネでは CLVシグナル伝達系が基本的には保存されているが，その一方で，イネに独自の制御系が存在していることも示唆された．イネのメリステムの維持制御の独自性を明らかにするためには，メリステムの制御に関わる他の因子を単離することが必要不可欠である．
ポジショナルクローニングにより，FON2 を単離する過程で，インディカのカサラスゲノムがジャポニカのfon2変異を抑圧する可能性が示唆された．そこでQTL解析を行ったところ，主働遺伝子が存在していることが明らかとなった．さらに，その主働遺伝子が座乗している領域から候補となる遺伝子を絞り込み，解析を行った結果，fon2変異の抑圧遺伝子を同定した．さらに，その同定した遺伝子について in situ hybridization による発現パターン解析や構成的遺伝子発現体の表現型解析など，詳細な機能解析を行った．

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イネの花序は収穫器官である頴果の配列状態であることから、その形態は収量を決める重要な形質である。しかし花序形態を決めるメカニズムは未だ明らかにされていない。
同定したaberrant panicle organization 1 （apo1）変異体では、着生する小穂が少ない。幼穂の発生過程の解析から、apo1では生殖成長転換時期の分裂組織が小さいために枝梗原基が野生型と異なる空間的パターンで分化すること、また花序分裂組織から小穂分裂組織への転換が早まる結果として小穂が少なくなることが明らかとなった。
更に、雄蕊から花弁に相当する鱗被へのホメオティックな転換や無限成長的な雄蕊の分化が観察された。二重変異体の解析および花器官アイデンティティー遺伝子の空間的発現パターンの解析から、この花器官の異常はイネのクラスC遺伝子の発現が抑制された結果であることが明らかになった。またこの発現制御は、CLV1 およびCLV3のイネオーソログであるFLORAL ORGAN NUMBER 1 （FON1）およびFON2との協働的な作用であると考えられた。
APO1の機能を明らかにするためマップベースドクローニングによる遺伝子同定を試みた。この結果を併せてAPO1の機能について報告する。

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イネは通常開花し、開花の直前もしくは開花とほぼ同時に自家受粉することが知られているが、我々は開花せずに受粉する閉花受粉性イネ突然変異体を同定した。野生型のイネの花においては、双子葉植物の花弁に相当する鱗被という器官が膨潤し、外穎を外に押し出すことによって開花が起きるが、閉花受粉性突然変異体では鱗被が細長く伸長した穎状の器官に変換しており、維管束も形成されていなかった。一方、雄蕊はこの変異体においても正常に形成されており、このため閉花受粉性となったと考えられる。マップベースクローニングの結果、鱗被と雄蕊のアイデンティティを決定するSUPERWOMAN1 (SPW1) 遺伝子内にミスセンス変異を見出した。この変異体に野生型SPW1遺伝子を導入したところ、鱗被は野生型と同じくコンパクトな形態となり、さらに、SPW1のnullアリルと考えられるspw1-1に上記のミスセンス変異を持つSPW1遺伝子を導入したところ、雄蕊の形態のみが復帰し、鱗被は伸長したままであった。これらの結果から、この変異体はSPW1のミスセンスアリルであると考えられたため、superwoman1-cleistogamy (spw1-cls)と呼ぶことにした。SPW1はAP3のイネ・オルソログであると考えられているため、シロイヌナズナでAP3とヘテロ二量体を形成するPIのイネ・オルソログであるOsMADS2およびOsMADS4との関係について、yeast two-hybridやin situハイブリダイゼーション等により解析した。

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イネの花器官形成は、双子葉植物のシロイヌナズナ等で提唱されているABCDEモデルに概ね一致し、多数のMADSボックス遺伝子が関与することが知られているが、未解明な部分も多い。その中で、OsMADS6はイネの花器官形成に関与するMADSボックス遺伝子の一つで機能未知のクラスGに分類される。我々は前回、RNAi法によってOsMADS6遺伝子をノックダウンした系統では各花器官のアイデンティティや器官数に影響があること等を報告した。
今回、我々はOsMADS6と他のMADSボックス遺伝子との関係を調べるために、OsMADS6遺伝子内にTos17トランスポゾンが挿入され、発現が抑制された系統を用いて、クラスA、B、C、E、G MADSボックス遺伝子との二重変異体を作出し、花器官への影響を観察した。また、yeast two-hybrid実験によりOsMADS6タンパクと他のクラスのMADSボックスタンパクとの相互作用を解析した。以上より、クラスG MADSボックス遺伝子の花器官形成における機能と、他のクラスのMADSボックス遺伝子との関係を考察する。

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双子葉植物の葉は二次元的な面として展開し、全体に連続した形で分布する維管束も二次元的なパターンを形成するのに対し、単子葉植物では葉の伸長に携わる細胞分裂領域が基部に集約されるためその展開は一次元的で、維管束も直線的なパターンを形成する。このことから単子葉植物では、葉の基部領域の観察から維管束分化・形成過程を時空間的な連続性を維持した状態で追跡できる。そこで私たちは単子葉植物のモデル植物であるイネを用いて維管束形成機構の解析を進めている。これまでにイネの維管束形成に異常を示す突然変異体の探索を行い、維管束パターンに異常を示す突然変異体として11系統を、維管束内部構造に異常を示す突然変異体として1系統を単離した。
本研究では、横走維管束の形成間隔が狭まり、その一部で過剰に分化して塊状になる突然変異体に着目して解析した結果、原因遺伝子の単離に成功しcommissural vein excessive1 (coe1)と名づけたので報告する。COE1は膜受容体型キナーゼをコードし、系統解析からイネではユニークな遺伝子だと予測された。また、シロイヌナズナには複数のホモログ遺伝子が存在することが明らかになった。今回の発表では、これまでの結果を基にこの受容体が維管束の分化起点決定にどう関わっているのか議論したい。

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これまでにオーキシンの細胞間における極性輸送により、維管束パターンが制御されることが示されてきたが、その過程において機能する分子機構はあまり明らかではなかった。そこで我々は維管束パターンの形成機構、特に連続性構築機構の解明を目指し、葉脈の不連続性を示すシロイヌナズナの van3 変異体の解析を行っている。VAN3 は BAR, PH, ANK ドメインを持つARF (ADP ribosylation factor) －GAP (GTPase activating protein) をコードし、TGN及び細胞膜に局在する小胞輸送の制御因子であった。VAN3 の分子機能を調べるために、van3 の様々なアリルの表現型解析を行ったところ、維管束形成においてPH domainが重要な役割を果たすことが明らかとなった。VAN3 が有する PH ドメインはPI4-P と強く結合することがこれまでに明らかになっているが、興味深いことに、PI4-P の生産に関与するCVP2 の突然変異体においても葉脈の不連続性が観察される。これらの結果はPI4-P が維管束の連続性構築において重要な役割を果たすことを示唆していると考えられる。今回の発表ではこれらに加え、現在解析中である VAN3 の相互作用因子についても併せて報告し、脂質性シグナル伝達系を介した維管束の連続性構築機構に関して議論する。

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ヒャクニチソウin vitro管状要素分化誘導系では単離葉肉細胞がオーキシンとサイトカイニンの存在下で同調的に管状要素へと分化する。私たちは、オーキシンのみを含む培地で単離葉肉細胞を培養したconditioned mediumから分化誘導培地での管状要素分化を阻害する活性物質TDIF (Tracheary element Differentiation Inhibitory Factor)を見出した。TDIFは12アミノ酸からなる低分子ペプチドで、CLAVATA3を含むCLEファミリーに属していた。この新規に発見したTDIFのin vivo機能を調べるために、まず機能場所の特定を目指して、in situ hybridizationとanti-TDIF抗体による抗体免疫染色を用いた局在解析を行うこととした。このために、TDIF特異的な抗体を作成することを試み、ほぼこれに成功した。平行して、分子遺伝学的アプローチからTDIFの機能解析するためTDIFと同一あるいは類似したCLEドメインをもつシロイヌナズナ遺伝子CLE41,CLE42,CLE44,CLE46に関しRNAi形質転換体及びプロモーター::GUS形質転換体を作成している。その結果も合わせて、TDIFの生体内での局在と機能について考察する。

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clavata3 (clv3) は地上部分裂組織の肥大化、茎の帯化や花器官数の増大といった異常な表現型を示す突然変異体である。これまでに clv3 突然変異体の原因遺伝子がクローニングされており、 CLV3 遺伝子は分泌性リガンドをコードすると予想されているが、機能的な CLV3 リガンドの構造は未知のままであった。
本研究では、CLV3 の機能単位を探ることを目的として、様々なアミノ酸長の CLV3 ペプチドを化学合成し、これらを植物体に投与する生理学的アッセイを行った。この結果、 CLV3/ESR (CLE) ドメイン中の 12aa 配列が機能的に必要十分な CLV3 の最小単位であり、この合成ペプチドの投与により、CLV3 遺伝子の過剰発現時と同様に、茎頂分裂組織と根端分裂組織の縮小あるいは欠失をもたらすことを明らかにした。また、シロイヌナズナに含まれる 26 種類の CLE ペプチドに関しても同様のアッセイを行い、このファミリーに属するペプチド間に機能的冗長性が見られることを確認した。さらに、CLAVATA pathway の下流因子の同定を目的として、ペプチド投与による茎頂の欠失回復を指標にサプレッサースクリーニングを行っており、現在までに 11 line の候補を得ているのでこれについても報告する。

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単子葉植物は，被子植物の進化の初期に，基部双子葉植物の系統から派生し，その後，独自の形態を進化させてきた．とりわけ葉は，単子葉植物とその他の植物系統群の間で，大きく異なる構造，発生様式を示す．それらの相同性等に関しては，古くから比較発生学的研究が行われてきたものの，未だ明確な結論は得られていない．我々は，単子葉植物における葉の構造や，その形態進化を遺伝子レベルで明らかにするために，単面葉といわれる葉を持つ単子葉植物に着目し，分子遺伝学的研究を開始した．
単面葉とは，葉身の外側が全て背軸面（裏側）だけで構成される葉のことであり，葉の極性変化をともなって進化した，興味深い形質である．この単面葉という形質は，基部単子葉植物から，特殊化の進んだ系統群まで，単子葉植物の幅広い系統で何度も独立に進化しており，単子葉植物の葉の基本的性質を反映した形質であると考えられる．また，予備的解析により，この単面葉においては，向背軸はもとより，頂部基部軸，そして，中央辺縁軸にも，大幅な極性変化が起きていることが明らかになっている．したがって，通常の葉（両面葉）を持つ植物との比較解析により，単子葉植物の葉の，全ての極性制御機構を解析できると考えられる．本報告では，主に組織学的解析により得られた，単面葉の発生機構，そして，単子葉植物の葉のオーガニゼーション解明にむけた，分子遺伝学的アプローチに関して報告する．

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