成熟した体細胞から幹細胞への分化転換の分子基盤は、動物・植物いずれの研究分野においても、十分に解析されていない。ヒメツリガネゴケは、幹細胞への分化転換を解析する上で、よいモデル生物になると考えられる。
ヒメツリガネゴケは、通常の発生過程では、胞子が発芽して、幹細胞の一種である原糸体頂端細胞を形成し、その後、この細胞は、性質をかえて、茎・葉構造を有する茎葉体を形成する。一方、切断した葉では、傷に面した細胞が原糸体頂端細胞へと分化転換する。この過程は、分化した葉の細胞から幹細胞の機能を有した原糸体頂端細胞への分化転換という点で、リプログラミング過程とみなすことができる。私たちは、まず、この分化転換を高頻度かつ同調的に誘導できる実験系を確立した。続いて、この実験系を用いて植物ホルモンの分化転換過程への関与を解析した。その結果、オーキシン、アブシシン酸の過剰投与は、原糸体への分化転換を遅らせるが、サイトカイニン、ジベレリン、ブラシノステロイドは何の影響も示さないことが分かった。さらに、アンチオーキシンは分化転換を顕著に抑制し、その抑制効果は、オーキシンの投与によって特異的に回復することが分かった。このことは、リプログラミング過程で適正な濃度の内生オーキシンの蓄積が必要であることを示している。

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高等植物においてアブシジン酸 (ABA) は、気孔の閉鎖や適合溶質の蓄積、種子成熟、休眠といった様々な生理応答に関わることが知られている。近年、種子や気孔を持たないコケ植物においてもABAを合成していることが明らかとなったが、コケ植物における内性ABAの役割についてはほとんど知られていない。そこで本研究では、ヒメツリガネゴケ (Physcomitrella patens) におけるABAの生理作用の解明を目的とし、シロイヌナズナにおいてABA代謝の第一段階に関わるABA 8'水酸化酵素をコードするCYP707A3遺伝子を過剰発現させた株を作出した。作出された過剰発現株の表現型解析を行ったところ、原糸体において葉緑体が巨大化した細胞が観察された。さらに、この巨大化した葉緑体はABAの添加で回復し、野生型株においてもABAの合成阻害剤 (Abamine SG) の添加で現れることが分かった。その他にも、発現量に比例して茎葉体の形成頻度が低下し、また形成された茎葉体も矮化していた。これらの結果から、ヒメツリガネゴケの葉緑体の分裂や茎葉体の分化にABAが関与していることが示唆された。

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アブシジン酸 (ABA) は種子の登熟や休眠の促進、さらに水ストレスに対する応答といった植物の環境応答に関わる重要な植物ホルモンである。2C型プロテインフォスファターゼ (PP2C) をコードするシロイヌナズナabi1-1はABI1の優性変異であり、ABAシグナル伝達系において強力な負の制御因子として機能する。我々は一過的発現実験からabi1-1がシロイヌナズナと進化的に遠く離れたヒメツリガネゴケ (Physcomitrella patens) においてもABAシグナル伝達を強く抑制することを明らかにした。またabi1-1を恒常的に発現させた形質転換体では野生型株と比べて、ABAに対する感受性および浸透圧ストレス耐性が低下していた。さらに茎葉体のサイズが大きくなる、胞子体形成に異常を示すといった形態的特徴が見られた。これらの結果からPP2Cを介したABAシグナル伝達がヒメツリガネゴケにおいてもストレス応答や発達制御に関わっていることが示唆された。そこでヒメツリガネゴケとシロイヌナズナを用いてABAのシグナル伝達を負に制御するPP2C機能の比較解析を行うために、ヒメツリガネゴケESTデータベース（Physcobase）からABI1と高い相同性を示す遺伝子を同定し、PpABI1と命名した。PpABI1はヒメツリガネゴケを用いた一過的発現系において過剰発現させるとABAシグナル伝達を強く抑制したことから、PpABI1がヒメツリガネゴケにおいてABAシグナル伝達系の負の制御因子として機能することが明らかとなった。

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2C型脱リン酸化酵素(PP2C)をコードするABI1は、シロイヌナズナにおけるアブシジン酸(ABA) シグナル伝達系の負の制御因子として機能する。我々は、進化的にシロイヌナズナと大きく離れたコケ植物ヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)においても、PP2Cを介したABAシグナル伝達制御機構が存在していることを示し、ABI1と高い相同性をもつヒメツリガネゴケ遺伝子PpABI1を同定した。PpABI1はヒメツリガネゴケを用いた一過的発現系から、ABAシグナル伝達系の負の制御因子として機能することが示唆された。本研究では、PpABI1のin vivoにおける機能を明らかにするために、相同組換えによるPpABI1遺伝子の破壊株(PpABI1 KO)を作出し、解析を行った。ABA処理がヒメツリガネゴケ原糸体の凍結耐性を濃度依存的に増すことから、PpABI1 KOの凍結耐性を試験したところ、0.1µM ABA処理において野生型株の約2倍高い生存率を示した。また、桿状の原子体細胞はABA処理によりbrood cellと呼ばれる球形細胞へと分化するが、PpABI1 KOは野生型株と比べてより低濃度のABAでbrood cell化した。PpABI1 KOがABA高感受性となることから、PpABI1がヒメツリガネゴケABAシグナル伝達系の負の制御因子であることが明らかとなった。

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アブシジン酸 (ABA) は種子成熟とそれに続く乾燥耐性と休眠性の獲得に深く関与している。そしてそのシグナル伝達の重要な因子として転写調節因子のABI3/VP1が知られている。我々はコケ植物ヒメツリガネゴケ (Physcomitrella patens) において3種のABI3/VP1相同遺伝子 (PpABI3A、PpABI3B、PpABI3C) の存在を明らかにし、さらにPpABI3Aが高等植物ABI3/VP1の機能を部分的に相補することを報告した。しかしながら種子を持たないヒメツリガネゴケにおけるPpABI3の機能は未だ明らかではない。PpABI3の機能解析を目的に定量的RT-PCRによる発現解析を行ったところ、3種のPpABI3 はともにヒメツリガネゴケの原糸体、茎葉体、胞子嚢において発現がみられ、これは主に種子でしか発現がみられない高等植物ABI3/VP1とは大きく異なっており、PpABI3の生活環を通じた機能が示唆された。PpABI3A過剰発現株では、ヒメツリガネゴケのABAおよびストレス応答性遺伝子であるPpLEA1の発現が、ABA濃度依存的に野生株よりも増加することが明らかとなった。またヒメツリガネゴケではABA添加による生長抑制が知られているが、過剰発現株では野生株に比べて抑制効果がより低濃度のABA添加でもみられた。一方、PpABI3三重欠損株ではABAによる生長抑制はほとんど観察されなかった。以上のことからPpABI3はヒメツリガネゴケにおけるABAシグナル伝達の正の調節因子として機能し、細胞生長を制御していることが示唆された。

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メチル基転移酵素（MT）は、植物の多様な代謝経路において機能する。我々は、シロイヌナズナの二つのMTがジベレリンの6位のカルボキシル基のメチルエステル化を触媒することを発見し、これらをGAMT1、GAMT2と命名した。ジベレリンのカルボキシル基は生理活性に必須であり、メチルエステル化などの化学的な修飾によりその生物活性が顕著に低下することが知られている。これらの酵素の植物体内での機能を検証するため、それぞれのGAMT遺伝子を過剰発現する形質転換シロイヌナズナを作出したところ、内生ジベレリン量の減少を伴って植物体が矮化した。gamt1, gamt2およびgamt1 gamt2二重変異株を獲得し、GAMT1, GAMT2遺伝子の発現が主要に認められるさやにおける内生ジベレリン量を測定したところ、二重変異株におけるGA₁の内生量が野生型と比較して約10倍に増加していることが明らかとなった。また、gamt変異株種子は、発芽時にジベレリン生合成阻害剤に対する耐性が高まっていた。以上の結果から、GAMT1とGAMT2はシロイヌナズナ種子中の新奇なジベレリン不活性化酵素として機能するものと考えられる。

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我々はこれまでにイネの最上位節間が著しい徒長を示すeui変異体の原因遺伝子が、シトクロムP450のひとつであるCYP714D1をコードしており、本タンパク質がジベレリン（GA）のC-16(17)の二重結合をエポキシ化する新奇のGA不活性化酵素であることを明らかにした。同様のGA不活性化機構が他の植物種に存在するかどうかを明らかにするため、シロイヌナズナにおいてイネCYP714D1に最も高い相同性を示すCYP714A1の機能解析を行った。酵母において発現させたCYP714A1組み換えタンパク質の各種GAの代謝産物を、GC-MSにより分析した。その結果、本タンパク質はGA₁₂をエポキシ化とは異なる反応で変換する活性を持つことが明らかになった。この変換産物はGA欠損変異株ga1-3に対して、顕著な生長促進効果を示さなかったことから、CYP714A1を介した反応経路はGAの不活性化であることが示唆された。そこでCYP714A1を過剰発現するシロイヌナズナを作製したところ、多くのラインでga1-3変異体と同様の厳しいわい性を示した。さらにこの植物体のわい性はGA₄投与によって回復した。以上の結果から、シロイヌナズナのCYP714A1はイネCYP714D1とは異なる触媒活性をもつGA不活性化酵素であることが強く示唆された。

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ジベレリンは植物の成長の多様な局面で作用する。従ってその生合成、及び情報伝達は厳密に制御されていると考えられる。またジベレリンは情報伝達系を介して、自身の生合成を制御していると考えられている。このフィードバック制御は、ジベレリン合成、分解に関わる酵素遺伝子の発現を調節し、内生ジベレリン量を適切な範囲に維持する恒常性の中心的なメカニズムであると思われる。我々はジベレリン合成酵素のうち活性型ジベレリンの合成を直接触媒する酵素GA3酸化酵素遺伝子に着目し、そのフィードバック制御の分子機構について解析を行っている。これまでにシロイヌナズナのGA3酸化酵素遺伝子のうちフィードバック制御を受けるのはAtGA3ox1のみであることを見出し、AtGA3ox1のプロモーター上にフィードバックに重要なシス領域を同定した。またそこに結合するトランス因子として、AT-Hook モチーフを有するタンパク質AGF1を単離した。AtGA3ox1のフィードバック制御におけるAGF1の機能を明らかにすべく、AGF1過剰発現体を作成したところ、興味深いことにAGF1過剰発現体はフィードバック制御時においてのみAtGA3ox1の発現量が野生型と比較して上昇することが明らかとなった。現在はAGF1がどのようにしてGAからシグナルを受けているのかを含め機能解析を行っており、その結果について報告する。

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GID1は、ジベレリン(GA)の核内受容体である。GAと結合したGID1は、GAシグナル伝達の抑制因子であるSLR1と結合し、SLR1を分解に導くと考えられている。GID1は、hormone sensitive lipase (HSL) に類似した一次構造を有しており、我々はHSL様の構造の内どのドメインでGAやSLR1と結合するのかに興味を持っている。昨年報告したGID1のデリーションコンストラクトの解析結果は、N末15アミノ酸を除くほぼ全ての領域がGA結合に必要であることを示した。このことから、受容体全体の立体構造の維持がGA結合に必須であると考えられたので、今年度は、3次構造の変化を最小にしつつアミノ酸変異の影響を見る目的でアラニンスキャニングを行った。イネGID1とアラビドプシスの3つのGID1ホモログの間で保存されているアミノ酸をそれぞれアラニンに置換した94個の変異型GID1タンパク質を作製した。現在、そのGA結合能とGA依存的SLR1結合活性を測定しているので結果を報告する。
我々のもう1つの興味は、植物内におけるGA依存的なGID1とSLR1の結合である。そこで、GID1-GFPを過剰発現した形質転換カルスを作製し、±GA処理後にGFPに対する抗体で免疫沈降を行った。その結果、GA処理したカルスのみからSLR1タンパク質が共沈したことから、in vivoにおいても、両タンパク質はGA依存的に結合することが明らかとなった。

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いくつかのシダやコケはジベレリン(GA)を生産することが知られているが、種子植物と同様のGA受容やその後のシグナル伝達経路の有無については解っていない。我々はシダ（Selaginella moellendorffii：イヌカタヒバ）とコケ（Physcomitrella patens：ヒメツリガネゴケ）のGA受容機構について解析した。イネではGA依存的にGAレセプター（OsGID1）とDELLAタンパク質（SLR1）が結合し、その結果SLR1の分解がF-box タンパク質（OsGID2）を介して引き起こされることによりGA反応が誘導される。
コケにはGID1、DELLA様遺伝子は存在するものの、コケGID1様タンパク質はin vitroでGA結合活性を持たず、Y2Hアッセイ系においてもDELLAタンパク質と結合しなかった。一方シダでは2種類のGID1（SmGID1a, SmGID1b）とSmDELLA1, SmGID2がGAシグナルに関与していると考えられた。SmGID1aはその性質がOsGID1と類似し、イネのgid1変異体を完全に相補した。またSmGID1bはイネのgid1変異体を部分的に相補しGAに対する結合性もOsGID1とは異なりシダ特有のGA受容体であることが推察された。これらの結果は、GAシグナル伝達経路は陸上植物がコケと維管束植物に分岐した後、シダ植物と本葉植物が分岐する以前に誕生したことを示唆している。

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植物が重力方向に沿って育っている状態（縦）と、常に障害物に遮られて重力刺激・物理的刺激を受けている状態（横）とでは植物の成長にどのような違いがあるのだろうか。 透析膜を敷いた寒天培地上で3日間育てたArabidopsis thalianaの根の伸長を縦と横の間で比較したところ、横方向の場合に根の成長が縦に比べ約半分（0.57倍）となった。 エチレン関連ミュータントを使用した実験の結果、エチレンシグナル系が関わっていることが明らかとなった。 これは、横方向の環境では、根の先端が常に重力と物理的刺激の影響を受けているためと考えられる。 エチレン産生量を比較したところ縦と横の間で有意な差は見られなかったが、エチレン応答遺伝子ERF（Ethylene Responsive Factor）と BACH(Basic chitinase)のmRNAの発現量は、横方向で育成した場合、縦の状態に比べてそれぞれ5.2倍、2.7倍と上昇していることがリアルタイムPCRを用いて明らかとなった。 横方向で育成した時にエチレン応答遺伝子の発現が上昇する機構についても議論する予定である。
植物生理学者は、植物の成長への化学物質の影響を見るためにしばしば濾紙上において根の伸長を観察するが、少なくともエチレン応答遺伝子が常に加算されていることに注意を払うべきかもしれない。

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キュウリ・トマトの胚軸を用いた以前の我々の研究から、傷をつけた胚軸の皮層は切断後7日間で癒合すること、癒合過程の細胞分裂に葉からのジベレリン(GA)が必要であることが示されている。しかし、組織癒合の分子メカニズムに関しては、ほとんど明らかになっていない。本研究では、シロイヌナズナを用いて、切断花茎の組織癒合過程の形態学的、分子生物学的解析を行った。花茎の第一節間を直径の約半分切断し、癒合過程を観察したところ、約10日目でほぼ癒合が完了した。また、茎頂と茎生葉を切除することによって組織癒合が阻害されたが、GA欠損変異体、およびGA生合成阻害剤の処理個体では、通常の組織癒合が観察された。この結果、シロイヌナズナ切断花茎の癒合にGAは関与しないことが示された。次に、組織癒合過程のマイクロアレイ解析を行い、癒合過程中に発現変動する遺伝子を同定した。これらの遺伝子には、細胞分裂・伸長や細胞壁多糖の代謝、植物ホルモンに関わる遺伝子が含まれていた。また、切断後1日目の花茎において、ACC合成酵素遺伝子の発現上昇が確認されたことから、エチレン非感受性変異体を用いて同様の解析を行ったところ、組織癒合が抑制されていた。これらの結果より、切断花茎の組織癒合において、エチレンが重要な役割を担っていることが考えられた。また、XTH遺伝子の発現解析から、細胞壁多糖類の構造変化が生じている可能性が考えられた。

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MPN+ドメインを有する蛋白質はユビキチン・ユビキチン様蛋白質の脱修飾に働くことが知られている。シロイヌナズナで同定されている3種のMPN+ドメイン蛋白質のうち、RPN11(脱ユビキチン化酵素・26Sプロテアソーム構成因子)とCSN5 (脱Nedd化酵素・COP9シグナロソーム構成因子)の作用機構については多くの知見が得られているが、残るひとつ、AMSHについては解析が行われていない。AMSHは、ほ乳類ではK63ユビキチン鎖特異的な脱ユビキチン化酵素として報告されており、エンドサイトーシスの制御に関与すると考えられている。
本研究では、逆遺伝学を用いたシロイヌナズナamsh変異体の解析によって、AMSHの作用機構の解明を目指している。データベース検索の結果、シロイヌナズナには3種類のAMSHホモログが存在することが分かり、これをAMSH1-3と名付けた。現在までの結果から、全てのシロイヌナズナAMSHがin vitroでMPN+ドメイン依存的な脱ユビキチン化活性を持ち、このうちAMSH3は植物の生育に必須であることが明らかとなった。局在解析、生化学的解析をもとに、シロイヌナズナAMSHの高等植物における機能について議論したい。

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タンパク質のユビキチン化は、ユビキチン活性化酵素E1、結合酵素E2ならびに連結酵素E3を介して行われ，真核生物における主要な翻訳後修飾の一つである。これまでユビキチン化は、ターゲットタンパク質の分解のシグナルであると考えられてきたが、最近、種々のシグナル伝達や転写の調節等への関与が明らかとなっている。モデル植物であるシロイヌナズナのゲノムシークエンスから、これらの構成因子をコードする多くの遺伝子が明らかとなっているが、個々の詳細な機能については未詳な点が多い。そこで本研究では、これらの事象を明らかとするために、コムギ無細胞タンパク質発現系とハイスループットな検出系であるAlphaScreenを組み合わせた、in vitroにおける網羅的なタンパク質ユビキチン化スクリーニング技術の開発を目指した。RAFLならびに本研究室でクローニングされた合計32種類のシロイヌナズナE2遺伝子について、コムギ無細胞系を用いて組換えタンパク質を作成した結果、24種類について可溶化タンパク質が得られた。この組換えE2タンパク質について、市販のビオチン化ユビキチンおよびrabbit E1を用いてユビキチン結合活性を調べた結果、24種類のE2のうち20種類において顕著なユビキチン化が認められた。今後、このアッセイ系を用いて、シロイヌナズナにおけるユビキチン化を受けるシグナル伝達関連タンパク質の探索を行う。

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SUMO化修飾は、タンパク質の機能、活性、局在を変換する機構であり、細胞内シグナル伝達に重要な役割を果たす。しかし、植物におけるSUMO標的タンパク質についてはほとんど報告例がない。SUMO化修飾には、SUMO特異的E1, E2, E3酵素が必要であり、標的タンパク質はSUMOとE2酵素の両方と相互作用する例が多い。シロイヌナズナでは、AtSCE1aが唯一のE2酵素である。そこで、two-hybrid法によりAtSCE1a結合タンパク質を単離することで、SUMO標的タンパク質の同定を試みた。その結果、3種類のタンパク質の単離に成功した。そのうちAt2g20310は、植物に特有の機能未知タンパク質であった。また、シロイヌナズナにはAt2g20310のパラログとしてAt4g28690が存在する。At2g20310とAt4g28690は共にAtSUMO1, 2, 3と相互作用を示した。さらに、in vitro及び大腸菌を宿主としたin vivo SUMO再構成系においてそれぞれのSUMO化を確認した。以上の結果は、At2g20310とAt4g28690がSUMO標的タンパク質であることを強く示唆する。また、GFP融合タンパク質による解析の結果、At2g20310は根端付近の細胞の核に局在していた。現在、これら二つのタンパク質の機能と、SUMO化についてさらなる解析を進めている。

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COP9シグナロソーム（CSN）は、ユビキチン・プロテアソーム系を介したタンパク質分解を制御するタンパク質複合体であり、動植物の発生に不可欠である。本研究は、シロイヌナズナを用いてCSNサブユニット1（CSN1）とその結合因子との相互作用を解析することにより、CSNの生体内での新規機能を明らかにすることを目的としている。
CSN1結合因子の一つであるSAP130は、スプライソソームを形成するU2snRNPを構成するタンパク質であり、遺伝子転写調節に関わるSTAGAやTFTCタンパク質複合体と相互作用する。シロイヌナズナのSAP130は、第3染色体上に2コピー存在し（SAP130a, SAP130b）、100%相同なタンパク質をコードしている。mRNAの発現解析から、両遺伝子がともに植物の全器官で発現しており、SAP130bの発現はSAP130aよりも高いことが明らかになった。また、シロイヌナズナよりSAP130のcDNAを単離し、大腸菌を用いて発現させた。これを用いた共沈降法により、CSN1とSAP130がin vitroで結合することを明らかにした。さらに、Yeast-Two-Hybrid法を用いたin vivoの解析結果についても報告する。これらの結果より、CSNとSAP130の相互作用が、タンパク質分解とmRNA代謝において担う役割について議論する。

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シロイヌナズナのbZIP型転写因子であるAtbZIP10はプログラム細胞死制御因子であるLSD1と細胞質で相互作用し、その機能がプログラム細胞死の制御に関わることを、我々は既に明らかにしている(1)。またAtbZIP10の核外への輸送には、Exportinとの相互作用が関与することも明らかにした(1)。AtbZIP10の核－細胞質間移行のメカニズムはAtbZIP10の機能発現に密接に関わると考えられることから、AtbZIP10の細胞内局在部位を制御する未知の因子を同定するために、酵母のツーハイブリットスクリーニングを行った。その結果、複数のAtbZIP10と相互作用するタンパク質を同定したが、その中でも微小管プラス端集積因子であるAtEB1(end-binding 1)との相互作用に注目した。AtbZIP10はシロイヌナズナの全てのEB1(AtEB1a,b,c)と相互作用し、更にAtEB1のC末端領域に存在するロイシンジッパー様領域がAtbZIP10のbZIPドメインを含まないC末端領域と特異的に結合することを明らかにした。これまでAtEB1の機能は明らかになっていないが、その局在部位から、AtbZIP10-AtEB1間の特異的な相互作用はAtbZIP10の細胞質での局在部位の制御に関与すると示唆される。(1)Kaminaka et al., EMBO J. (2006)

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2005年度大会で、ノックアウトイネ集団から単離したSSIIIa変異体について報告した。本大会ではこの変異体のイネ胚乳に蓄積されるデンプンの成分、構造を詳細に解析し、SSIIIaの機能および他の酵素への影響を明らかにした。SSIIIa変異体のイソアミラーゼ、プルラナーゼ、枝作り酵素BEIIa, BEIIb、ホスホリラーゼの活性は、野生型と比べて変化はなかったが、BEI活性がやや強くなっていた。これに対して、SSI活性は、顕著に増加しており、タンパク質レベルで野生型の1.3-1.7倍であった。また、GBSSIタンパク質の量も1.4-1.7倍に増加していることが明らかになった。SSI活性の増加は、アミロペクチンのグルコース重合度(DP)≤20の鎖長に影響を与え、DP10-15の増加が顕著に見られた。また、GBSSIの増加は、真のアミロース含量およびアミロペクチンの超長鎖(DP≥500)をそれぞれ1.3倍および12倍に増加させた。SSIIIa変異体の胚乳デンプンは、粘度が劇的に低下するなど、物性の劇的な変化が見られたが、これは、SSIIIa欠失の直接的なアミロペクチン長鎖(DP≥33)の減少に加え、他のSSアイソザイムへの影響による間接的な要因に起因すると考えられた。

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高温がイネ種子登熟代謝に及ぼす影響を明らかにするために、乳熟期のイネ頴花に高温処理を施した。高温登熟応答性遺伝子がマイクロアレイ解析およびディファレンシャルスクリーニングによって同定され(2006年度年会)、さらに定量RT-PCRによる詳細な発現解析を行った結果、高温によってGBSSI、BEIIb等のデンプン合成関連遺伝子の発現が抑制され、デンプン分解に関与するα-amylaseおよびHSP遺伝子の発現が誘導された。また、高温下で登熟した玄米の胚乳に含まれるデンプンを分析したところ、アミロース含量の低下およびアミロペクチン側鎖の伸長が観察された。これらの変化はそれぞれGBSSIおよびBEIIbの発現低下に起因していると考えられる。さらに、種子貯蔵タンパク質の分析によって、高温登熟玄米中では13kDプロラミンが減少していることが見出された。高温条件で登熟した米粒は外観が著しく白濁化して粒重が低下するが、高温によって影響を受ける登熟代謝と玄米の白濁化の関連性について考察する。

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フモニシンB1（FB1）は、植物のプログラム細胞死を誘導する。FB1はスフィンゴ脂質代謝系のセラミド合成を阻害し、細胞内に遊離のスフィンゴイド長鎖塩基（LCB）を蓄積させることから、細胞死の誘因となるシグナルの一つが、細胞内のLCBレベルの増加にあるといわれている。一方、LCBの蓄積を回避する機構として、LCBをリン酸化し、LCB-1-リン酸を合成する代謝経路が存在する。LCB-1-リン酸リアーゼ(SPL)は、LCB-1-リン酸をC16アルデヒドとホスホエタノールアミンに分解する酵素であるが、我々は最近、シロイヌナズナのこの遺伝子AtSPL1が破壊された突然変異株(spl1-1、spl1-2)の葉片をFB1で処理し、葉片からの電解質の漏出程度を調べたところ、野生型と比較して48時間以降に著しい漏出率の増加を認めた。さらに、FB1を96時間処理したspl1-1およびspl1-2において、葉脈周辺にスポンジ状の組織崩壊が観察された。この現象がLCB-1-リン酸による蓄積によって引き起こされるのか、現在解析中である。一方、spl1-1およびspl1-2のホスファチジルエタノールアミン（PE）やホスファチジルコリン(PC)の全脂質に占める割合は、野生株と比較して減少していた。本発表ではLCB-1-リン酸によって制御される PE、PC代謝系についても考察する。また、スフィンゴ脂質生合成の初発酵素セリンパルミトイルトランスフェラーゼの遺伝子発現に及ぼすFB1の影響をタバコBY-2細胞で解析したので、その結果を報告する。

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種子植物のチラコイド膜脂質合成には2つの経路が存在する。1つの経路では、色素体で合成された脂肪酸が一度小胞体に運ばれた後、グリセロ脂質前駆体であるフォスファチジン酸（PA）に取り込まれ、再び色素体に戻ってチラコイド膜のガラクト脂質合成に用いられる（真核型経路）。もう1つの経路では、脂肪酸が色素体内でグリセロール骨格に取り込まれ、ガラクト脂質合成に用いられる（原核型経路）。これらのうち、真核型経路が阻害された変異株をシロイヌナズナから単離したところ、チラコイド膜脂質の合成が原核型経路に依存するようになった。また、これらの変異株では葉においてトリアシルグリセロール、トリガラクトシルジアシルグリセロール（TGD）の蓄積が観察されことから、tgd変異株と名づけられた。tgd変異遺伝子座の1つ、TGD1はバクテリアのマルチサブユニット型ABCトランスポーターの膜貫通タンパク質をコードしていた。また、TGD2はバクテリア型ABCトランスポーターの基質結合タンパク質と相同性を持ち、色素体内包膜に局在していた。TGD2のC末端基質結合領域を用いて脂質結合解析を行ったところPAを特異的に結合することがわかった。これらのことから、TGD複合体は色素体外包膜から内包膜へのPAの輸送に関与していると考えられた。

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脂質は比較的疎水性の高い物質の総称であり，構造的には多様な化合物群から構成される．それらには，リン脂質のような細胞膜を構成するような脂質も含まれれば，テルペノイドの誘導体のような二次代謝産物も含まれる．本研究では，植物が生合成する脂質のプロファイルを明らかにすることを目的とし，液体クロマトグラフィー質量分析装置を用いた分析系の構築を試みた．
植物材料としてシロイヌナズナを用い，その脂質を含む抽出物を親水性相互作用クロマトグラフィーにより分離した．溶出液はそのままion trap-TOF型質量分析装置に導入し，化合物の検出を行った．その結果，リン脂質やガラクト脂質のような細胞膜を構成する代表的な脂質などが検出された．これらの脂質には脂肪酸の鎖長と不飽和度が異なる多くの類縁体が存在するが，溶出時間と精密質量により個々の類縁体を区別した．分析系の構築と同時に，組織別の脂質プロファイルの解析やシロイヌナズナの変異体が蓄積する脂質について解析を行っている．それらのうちのいくつかの事例について報告したい．

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スルフォキノボシルジアシルグリセロール(SQDG)は葉緑体に存在する膜脂質のなかで、唯一硫黄(S)を含む。我々は既にS欠乏条件にさらされたクラミドモナスがSQDGの分解系を誘導することを報告した。そこで、S欠乏時における細胞内Sの挙動を調べた。まず、クラミドモナスを[³⁵S]硫酸でラベルしたところ、SQDGに11％、タンパク質に68％の放射活性が検出された。Sを含まない培地にこの細胞を移したところ、SQDGの放射活性は6時間で2％にまで減少し、その一方でタンパク質の放射活性が83％に増加した。この結果は、タンパク質へ移行するSの大部分がSQDGに由来することを示している。また、S欠乏条件下において、SQDG欠損変異株は野生株に比べてクロロフィルの蓄積や硫酸トランスポーターの活性誘導が抑制され、さらに生育が野生株の約半分に抑えられていた。これらの結果から、S欠乏条件下においてSQDGがタンパク質合成に必要なSを提供すること、このSの移行が生理学的に重要な意義を持つことが示された。

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高等植物の葉緑体とシアノバクテリアの膜脂質組成は、いずれもその約50％を糖脂質モノガラクトシルジアシルグリセロール（MGDG）が占めるが、その合成経路は両者で異なっている。高等植物では、MGDG合成酵素がジアシルグリセロール（DAG）とUDP-ガラクトースを基質として糖転移反応を行い、MGDGを合成する。一方、シアノバクテリアではモノグルコシルジアシルグリセロール（MGlcDG）合成酵素がDAGとUDP-グルコースを基質としてMGlcDGを合成し、その後グルコースからガラクトースへの異性化反応によりMGDGが生成される。
高等植物とシアノバクテリアの進化的中間に位置する緑藻クラミドモナスでは、我々がゲノムサーチを行ったところ、高等植物型MGDG合成酵素とシアノバクテリア型MGlcDG合成酵素の両方のホモログを持つ事が分かった。さらにどちらのホモログ遺伝子も転写レベルで発現している事が確認された為、クラミドモナスのMGDG合成経路が高等植物型かシアノバクテリア型かを調べるために、クラミドモナスの分画物を用いてUDP-ガラクトース/グルコースを基質としたMGDG合成活性を測定した。その結果、クラミドモナスの膜画分でのMGDG合成は高等植物型経路である事が明らかとなった。今回の発表ではクラミドモナスMGDG合成酵素遺伝子のクローニング及びさらに詳細な酵素学的解析の結果についても報告をする。

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ロズマリン酸(rosmarinic acid; RA)は、シソ科(Lamiaceae)とムラサキ科(Boraginaceae)の植物に含まれており、抗ウィルス、抗細菌、抗炎症などの作用を示すことが知られている。RAはアミノ酸のL-phenylalanine由来のcaffeic acidとL-tyrosine由来の3,4-dihydroxyphenyllactic acidのエステルであることが明らかになっている。我々は、シソ科植物に含まれる抗酸化物質を環境制御により増量させる技術の開発を進めており、これまでに、スィートバジルに含まれる主要な抗酸化物質がRAであり、青色光とUV-Bの夜間補光によってRA含量が増加する現象を明らかにした。現在、スィートバジルのRA生合成に関わる酵素群（phenylalanine ammmonia-lyase, tyrosine aminotransferase, hydroxyphenyl pyruvate reductaseなど）の遺伝子を単離し、発現解析を進めている。

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キノリチジンアルカロイドは、主にマメ科ルピナス属植物に含有され、分子内にキノリチジン環を有する植物アルカロイドである。飼料用作物としての育種が進んだLupinus angustifoliusには、アルカロイドを含むbitter品種cv.festと含まないsweet品種cv.unihervestが存在する。本研究では、アルカロイド生合成に関与する酵素を明らかにするために、アルカロイド含有品種特異的発現遺伝子の単離と機能解析を行った。
PCR-select cDNA subtraction法により得られたFest品種特異的な71フラグメントのうち、植物由来のオルニチン脱炭酸酵素、アミン酸化酵素に相同性を示すフラグメントについて5’-および3’-RACEによりコード領域を含むLaDCならびにLaAOを単離した。LaDCは439アミノ酸からなり、Glycine maxのオルニチン脱炭酸酵素と71％の相同性を示した。LaAOは774アミノ酸からなり、Glycine maxのペルオキシソーム局在銅含有アミン酸化酵素と79％の相同性を示した。またC末端にペルオキシソーム輸送シグナル(PTS1)が存在することが明らかになった。LaAO , LaDCの組織別発現解析の結果、Uniharvest品種に比べ、Fest品種の若い葉で特に発現が高かった。現在、大腸菌で発現させた組み換えタンパク質を用いた機能解析を検討中である。

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ベタレイン色素はナデシコ目の多くの植物が蓄積する植物色素であるが、これらのベタレイン色素を合成する植物はアントシアニン蓄積しないことが知られている。この二律背反性の謎を解く手がかりの一つはベタレイン色素合成に関わる最も重要な酵素であるDOPA 4,5-dioxygenase （DOD）遺伝子について解析することである。これまでの研究で、高等植物における DOD 遺伝子は 2004 年にマツバボタン (Portulaca grandiflora)の花弁を用いた cDNA サブトラクション法によって単離され、マツバボタン花弁におけるパーティクル・ガン法によってその活性が確認されている (Christinet, et al., Plant Physiol 134: 265-274)。組換え酵素の活性については不明であったが、筆者らのグループがオシロイバナ由来のMjDODについて、酵母を用いた組換え酵素活性を2005年に本学会で報告した。DOD遺伝子はベタレイン色素を合成しない植物においてもDOD遺伝子の存在が示唆されていた。本研究ではベタレイン色素を合成しない植物種である、アラビドプシス、トレニア、カーネーションから DOD 相同遺伝子を単離した。それらについて大腸菌発現系を用いて組換えDOD活性について検討したところ、トレニア由来のTfDODがDOPAを基質としてベタラミン酸を合成していることが示唆された。

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クマリン化合物は植物界に広く存在する二次代謝産物である．クマリン化合物は桂皮酸類のオルト位が水酸化された後，側鎖二重結合の異性化，ラクトン化を経て生合成されると考えられる．特に、オルト位水酸化酵素はクマリン骨格形成に重要な鍵酵素であるが，植物界から同定された例は未だ無い．我々はシロイヌナズナの根においてスコポレチンが β-グルコシド体（スコポリン）として高レベルで蓄積していることを見出した．さらに，スコポレチン生合成はメチル化酵素 CCoAOMT1 によるカフェー酸 CoA エステルへの 3'メチル化反応を経ていることを示した．
そこで CCoAOMT1 遺伝子と似た発現パターンを示す酸化酵素遺伝子を種々のデータベースから検索し，SALK 研究所よりその欠損変異株種子を取得した．これらのホモ個体の根におけるスコポリン内生量を測定したところ，著しく蓄積量の減少した株を見いだした．この遺伝子産物を His₆-融合タンパク質として大腸菌にて発現させたところ，オルト位水酸化活性を示したことから，この酵素を桂皮酸類オルト位水酸化酵素として同定した．さらに，この酵素の基質特異性についても検討した．

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フラボノイドは、20万種以上に及ぶ植物の代謝産物のうち6000種以上を占めている。その多様性は配糖化、アシル化、メチル化といった多彩な修飾系に起因している。シロイヌナズナには、少なくとも19種類のフラボノイドの存在が報告されているが、その構造からは少なくとも9種類の配糖化酵素の関与が推測される。シロイヌナズナには、配糖化酵素をコードする107の遺伝子の存在が明らかにされている。しかしながら、配糖化は二次代謝産物に普遍的に見られる修飾系のため、その一次構造のみで機能を推定することは困難であり、今までに4種類のフラボノイド配糖化酵素遺伝子が報告されているに過ぎない。
昨年の本大会において、我々は、公開データーベースATTEDを用いた共発現解析によりフラボノイド生合成系に強く相関の見られる配糖化酵素遺伝子（UGT1）について、その推定アミノ酸配列およびT－DNA挿入変異体におけるフラボノイドプロファイリングにより、UGT1がフラボノイド7-O-ラムノシルトランスフェラーゼ（7RhaT）をコードしていることを示唆した。本大会では、組換えUGT1タンパク質を用いた実験およびT－DNA挿入変異体の相補実験によりUGT1がフラボノール7RhaTとして機能することおよびUGT1の基質特異性について報告する。またシロイヌナズナにおけるフラボノール配糖化経路についても議論したい。

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サイクリックGMP（cGMP）は動物の視覚や血管弛緩における細胞内情報伝達の重要なセカンドメッセンジャーであるが、植物におけるその機能は不明確である。我々は、フィトクロームの光シグナル伝達のセカンドメッセンジャーとして、cGMPがアントシアニンの合成やカルコン合成酵素遺伝子（chs）の発現を誘導することを報告したが、その分子機構の詳細は不明である。今回、ダイズ光独立栄養培養細胞（SB-P細胞）を用いて、多くのフラボノイド合成系遺伝子の発現がcGMPによって誘導されることを明らかにした。また、これらのcGMP応答性遺伝子は一酸化窒素（NO）にも応答すること、SB-P細胞中のアントシアニン量がcGMP、NOおよび光照射により増加したことから、cGMPとNOはフラボノイド合成を誘導する光シグナル伝達のセカンドメッセンジャーとしてリンクして機能していることが示唆された。一方、cGMPによる遺伝子発現調節機構を転写レベルで解明するため、カルコン還元酵素遺伝子（chr）のプロモーターを一過的遺伝子発現系で解析した。その結果、chrの推定転写開始点から上流-576～-991 bpの領域がcGMP応答に必要であることが示唆された。現在、薬理学的方法により、フラボノイド合成系酵素遺伝子群の発現調節とフィトクロームシグナル伝達経路との関連を解析中である。

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プレニルフラボノイドは様々な生理活性を有し、植物の感染応答以外に医薬及び食品産業でも注目を集める化合物群となっている。その生理活性には、芳香環上のプレニル基の存在が重要であることが知られ、プレニル化を触媒する酵素は長年多くの研究者の興味の対象となってきた。しかし、フラボノイドを基質とする植物プレニルトランスフェラーゼは膜結合性であるとされ、遺伝子のクローニングは未だ一例も報告されていない。本研究では、マメ科のクララ培養細胞のプレニルフラボノイドsophoraflavanone G (SFG) 生産系を利用し、フラボノイド・プレニルトランスフェラーゼの遺伝子を単離し、その分子生物学的解析を行うことを目的とした。
クララ培養細胞のESTデータのインフォマティクスと酵母発現系を用いた機能スクリーニングを組み合わせ、ナリンゲニンをプレニル化する酵素 naringenin 8-dimethylallyltransferase (SfN8DT) のcDNAの取得に成功した。この酵素はSFG生合成における最初のフラボノイド・プレニルトランスフェラーゼに相当する。
発現解析を行ったところ、SfN8DT mRNAは根皮部分のみで特異的に発現していた。実際にクララ植物体においてプレニルフラボノイドは根皮のみで蓄積していることから、SfN8DTによりプレニル化されたフラボノイドは転流せず、そのまま根皮に蓄積することが示唆された。

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植物の代謝経路の最終段階において、低分子化合物に糖を付加することにより二次代謝産物の多様性に寄与している配糖化酵素は、有用物質の水溶性、安定性の向上、毒性軽減、生理活性や機能性の増大が期待できることから、植物バイオテクノロジーのターゲットとしても非常に重要視されている。植物配糖化酵素の機能解析については、保存性の高いアミノ酸残基を中心に、酵素間で共通したドナー基質の認識、結合や触媒機構などを担うアミノ酸残基の役割の解明が進められているが、酵素の個性ともいえるアクセプター基質の認識や触媒活性に関与しているアミノ酸残基についての解析はほとんどなされていない。我々はこれまでに、ニチニチソウ由来クルクミン配糖化酵素CaUGT2においてはPSPG-box中のCys377が活性発現に重要な役割を果たしていることを明らかにしてきた。そこで、本研究では部位特異的変異導入法によってこのアミノ酸残基を置換した変異酵素を作製し、酵素活性を測定した。その結果、C377G、C377Aの置換によってはK_m、k_catともほとんど影響はみられなかったが、C377N、C377D、C377Yではk_catが減少し、C377R、C377Wでは活性は消失した。これらの結果から、CaUGT2の触媒効率は377位のアミノ酸残基の側鎖の立体的な大きさに依存している可能性が示唆された。

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リグナンはケイヒ酸モノリグノール経路から派生する二次代謝産物であり、維管束植物に幅広く存在している。セサミンはゴマ科植物の種子に含まれるフロフラン型の代表的なリグナンであり、エタノール誘導性の肝障害の保護、脂肪酸代謝の促進、ビタミンE活性の増強、活性酸素生成の抑制など多岐にわたる有用な生物活性を有することから既に健康食品として商品化されている。ゴマ由来CYP81QサブファミリーのP450タンパク質は初期リグナンであるピノレジノールに二回のメチレンジオキシブリッジを形成し、セサミンを生成する。ゴマ種子内においてセサミンはその後、セサミノールおよびセサミノール配糖体に代謝されるが、その分子機構については不明である。ゴマ種子(Sesamum indicum) cDNAライブラリーから単離した新規配糖化酵素をコードするUGT71A9遺伝子はゴマ種子において強い発現を示した。大腸菌で発現させたUGT71A9はセサミノール、ピペリトールおよびピノレジノールに対して配糖化活性を有していた。アフリカのゴマ野生種であるS.alatumおよびS.radiatumから単離したUGT71A8およびUGT71A10の組換えタンパク質においてもリグナン配糖化活性が認められため、UGT71Aサブファミリー配糖化酵素がゴマ科植物において機能的に保存されていることが示された。

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アサガオの花色変異体の中で、a-3、r-1、r-3、speckled変異体は、各々アントシアニン生合成系遺伝子DFR、CHS、ANS、CHIの自然突然変異で、白色花か淡黄色花を咲かせ、茎は緑色で黒い種子を付ける。ここでは、白色花を咲かせるが、赤色の茎と黒色の種子を付与するc-1変異及び緑色の茎と象牙色の種子を付与するca変異について同定をおこなった。我々は、先ずアントシアニン生合成系遺伝子の転写制御に関わると思われる3種類のR2R3-MYB転写因子（InMYB1～3）、3種類のbHLH転写因子（InbHLH1～3）、2種類のWDR因子（InWDR1、2）をコードする遺伝子を単離し、器官特異的な遺伝子発現の解析を行い、次に、c-1がInMYB1遺伝子に生じた2 bpの欠損変異、caがInWDR1遺伝子に生じた7 bpの挿入変異であることを明らかにした。InMYB1とInWDR1はペチュニアのAN2、AN11ホモログであるが、転写を活性化するアントシアニン生合成系遺伝子のセットは異なっており、ペチュニアのAN2とAN11が司る液胞のpHの調節には関与しないことが示唆された。また、InWDR1についてはAN11が係わる種子の着色に加えて、種皮のトライコーム形成にも関与することを明らかにした。今回単離した転写制御因子をコードする遺伝子の表皮細胞の分化における役割についても議論する。

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高等植物の表皮細胞では、MYB転写因子、bHLH転写因子、WDR因子の相互作用により、アントシアニンやタンニンによる着色、根毛やトライコームの形成などが支配されている。我々もアサガオとソライロアサガオの変異体の解析から、これらの因子がアントシアニンによる花弁の着色と、未同定な色素による種皮の着色を促進することを明らかにしている。
マルバアサガオでは花色が薄く、種皮が象牙色となる複数のivs変異が分離されている。その変異体の花弁ではbHLH2遺伝子と、アントシアニン色素生合成に係わるCHS、CHI、F3H、DFR、ANS、UF3GT 遺伝子のmRNA蓄積量が低下していた。これら変異体のbHLH2遺伝子には、いずれもhATもしくはMutatorファミリーのトランスポゾンが挿入していることから、IVS遺伝子がbHLH2転写因子をコードすることが判明した。一方、野生型の黒い種皮にはタンニンと植物メラニンが含まれ、それらの蓄積量が変異体で低下していた。タンニン生合成に係わる遺伝子のmRNA蓄積量を調べたところ、変異体のCHS、CHI、F3Hは野生型と変わらなかったが、DFRとANSは著しく低下していた。以上の結果より、マルバアサガオのbHLH2転写因子は、アントシアニンとタンニンの生合成だけでなく、植物メラニンの蓄積も活性化することが判明した。さらに走査顕微鏡による観察から、種皮ではトライコーム形成を促進することも明らかとなった。

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フラボノイド合成は、周囲の環境からのストレスや発達段階、器官、組織による違いなど、さまざまな要因によってその発現が制御されている。マメ科植物ではフラボノイド合成に関与する酵素群は多重遺伝子族を形成しており、その背後には種々の要因に応答する複雑な転写制御ネットワークの存在が推察される。近年、種々の植物において、フラボノイド合成に関与する転写調節因子(MYB、bHLH、WD40タンパク質)が単離され、特性解析がなされている。マメ科モデル植物であるミヤコグサのゲノムデータベースを検索したところ、これらの転写調節因子と相同性の高いいくつかのホモログが見つかった。このうちシロイヌナズナのプロアントシアニジン合成に関与するとされるTT2と相同性の高い遺伝子が3つ存在した(LjMYB-1, -2, -3)。これらの遺伝子は異なる発現パターンを示したことから、LjMYB-1, -2, -3はそれぞれ機能分化している可能性が示唆された。そこで、シロイヌナズナのプロアントシアニジン合成の鍵酵素であるBANYULS (BAN) のプロモーターに対する転写活性化能を、レポーターアッセイにより検討した。その結果、シロイヌナズナにおいてLjMYB-1, -3はBANの転写を活性化することが明らかとなり、TT2様の機能を持つことが示唆された。現在、3つのLjMYBと相互作用する他の転写因子に注目して解析を進めている。

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メタボロミクスはシステムバイオロジー研究の一端を担う分野であり、植物の包括的理解のための研究手段として急速に発展した。現在、メタボロミクス方法論は多変量解析のみならず代謝物―代謝物相関解析を含んだ、よりインフォマティクスと融合したものに進化している。前年度大会において、我々はGC-TOF/MSを用いたメタボロミクスパイプラインについて紹介した。本大会では実際に本パイプラインを用い、代謝物変動が報告されているシロイヌナズナ変異株について、代謝物―代謝物相関解析による植物代謝物プロファイリングを行った。
MS培地上でシロイヌナズナ野生型（Col-0）、メチオニン過剰蓄積株（mto1-1）およびCHS機能欠損変異株（tt4）を生育させ、地上部および地下部を個体別にサンプリングした。得られたサンプルについてGC-TOF/MS分析を行い、最終的に地上部で96既知化合物を同定し、67未知化合物ピークを得た。地下部においては97既知化合物を同定し、69未知化合物ピークを得た。次に、地上部163ピークについて、Col-0, mto1-1およびtt4での代謝物―代謝物相関解析を行った。その結果、mto1-1ではCol-0やtt4で保持されている代謝制御の制御構造が変化していることが示唆された。tt4においては、リンゴ酸―シキミ酸経路系を中心とした相関関係の変化を抽出することに成功した。

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