自然界における高等植物のRubiscoの比活性（k_cat）には有意な変異があり、特に寒冷地由来の植物体において高い傾向が報告されている。さらにCO₂とO₂のspecificity（ τ ）は高等植物で最大であり、近年、常緑樹>落葉樹>草本の順に有意な差が認められ、乾燥地や高温地に生育するもので高い傾向が見出された。このように高等植物間においてもRubiscoの性能の変異は大きく、自然界に優れたRubiscoの遺伝子資源が存在することを示唆している。また比活性と τ の間には負の相関があることが報告されており、そのため高性能なRubiscoを見出すには両者を両面から同時に解析する必要がある。本研究ではこの点に着目し、草本、落葉樹、針葉樹、CO₂削減対策の有用植物として重要視されるユーカリ属等13種のk_catと、大気条件下でのcarboxylase活性/oxygenase活性比（v_c/v_o）を調べた。イネとの相対比較で、k_catはタバコ、ギンドロ、ブナ、Eucalyptus maidenii、E. globlusが50～70％高い値を示した。またv_c/v_oにおいてはギンドロ、アオモリトドマツ、ハイマツで15～20％高い値を示すことがわかった。この二つのパラメーターを用いて、各植物種のRubisco酵素タンパク質あたりの大気条件下での正味のcarboxylase活性値 [k_cat(1-0.5v_o/v_c)]を算出、比較したところ多くの樹木がイネよりも優れたRubiscoを有しており、その中でもギンドロは1.7倍の高い値を示すことが明らかとなった。

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光合成の律速段階であるRuBisCOによるカルボキシラーゼ反応は、リブロース-1,5-二リン酸（RuBP）のエンジオール化を初発とする多段階反応である。アミノ酸配列において相同性を持つ枯草菌のRuBisCO-like protein（BsRLP）が触媒する2,3-ダイケト-5-メチルチオペンチル-1-リン酸（DK-MTP-1-P）エノラーゼ反応は、RuBPのエンジオール化と似ている。そこで両者の相関性を調べた。まずBsRLPの酵素学的諸性質を決定した。触媒にはRuBisCOと同様にMg²⁺を必要とし、活性は高CO₂条件下で上昇した。部位特異的変異により、RuBPのエンジオール化必須残基で、かつBsRLPにおいても保存されているLys175、Lys201、Asp203、Glu204らのアミノ酸残基がBsRLPの活性にも必須であることを明らかにした。一方、DK-MTP-1-Pエノラーゼ活性を持つRLP特異的に保存されているLys123も活性に必須であることを明らかにした。興味深いことにBsRLPの活性が、RuBisCOの基質RuBPや生成物のホスホグリセリン酸、反応中間体アナログの2-カルボキシアラビニトール-1,5-二リン酸で特異的に阻害されることがわかった。このことはBsRLPがすでにカルボキシラーゼ反応を行う潜在的な能力を保持していたことを示唆しており、RuBisCOがBsRLPから進化してきたという我々の仮説を強く支持した。

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海洋性珪藻類は、CO₂感知機構とCO₂に応答した転写調節機構を有している。現在までに、海洋性珪藻Phaedactylum tricornutumのCO₂応答性遺伝子である葉緑体カーボニックアンヒドラーゼ（ptca1）遺伝子のプロモーターであるPptca1の機能解析が行われ、転写開始点上流70bpまでがCO₂応答に重要であることが分かっている。この領域には2つのcAMP応答性配列（CRE1: -70～-63、CRE2: -21～-14）とcAMPに関連した機能を有することが知られているP300結合部位（-52～-46）が存在し、CRE1は細胞内cAMP濃度の影響下にあり、抑制的に調節されていることが確認されている。本研究は、Pptca1のシスエレメントを精査し、CO₂応答性発現制御の分子機構を明らかにすることを目的としている。これまでに、uidAレポーター遺伝子に連結した変異導入Pptca1改変コンストラクトを海洋性珪藻に形質転換し、得られた変異体を5％及び大気レベルCO₂環境下に順化した。GUSレポーター解析を行った結果、現在までに分かっていたシスエレメントに加えて、新たなCO₂応答性配列の候補が見出された。本発表ではこれらのシスエレメントの一次構造を詳細に特定し、その機能について解析した結果を示す。

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海洋性藻類は地球上の有機物生産の25％を担う重要な生物であるが、この生物のCO₂濃度に対する応答はまだ詳細に調べられていない。本研究では、海洋性珪藻の大気CO₂濃度変化に対する応答機構の体系的な理解を目的として、海洋性珪藻phaeodactylum tricornutumにおけるCO₂応答性遺伝子の半網羅的な解析を行なった。5％ CO₂ ( 高CO₂) 及び現在の大気条件である0．038％ CO₂ (低CO₂) に順化させた細胞から取得したRNAを用いて、cDNA－AFLP ( cDNA－amplyfied fragment length polymorphism ) 解析を行い、現在までに49のCO₂応答性遺伝子断片の単離に成功した。このうち低CO₂で抑制されるものは、28あり、その中には、ホスホグリセリン酸キナーゼやトランスケトラーゼなどのカルビン回路に関連因子をコードするものが含まれていた。低CO₂で誘導されるものは21あり、その中には、ラン藻で低CO₂での抑制が確認された亜硝酸還元酵素やバクテリア特異的な遺伝子であるアンモニア依存型アスパラギン合成酵素などが含まれていた。この事から、海洋性珪藻の窒素代謝系はラン藻とは異なるCO₂応答をすることが考えられた。また、ラン藻や緑藻などのCCM（無機炭素濃縮機構）関連因子の珪藻で見出されたホモログについても討論する。

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多くの水生光合成生物は、無機炭素が不足すると、能動的に無機炭素を細胞内に取り込む無機炭素濃縮機構（CCM）を誘導する。我々は緑藻クラミドモナスにおけるCCMを制御するマスター因子CCM1を発見し、その機能に亜鉛の配位が必要であることを示してきた。CCM1タンパク質は細胞内で複合体を形成することが示唆されたので、今回そのCCM1複合体を精製し、その構成成分を質量分析法で解析したので報告する。
FLAGタグをC末端に付与したCCM1を発現する緑藻クラミドモナスを形質転換により作出した。この細胞から抽出した可溶性タンパク質からAffinity Gel に吸着するCCM1-FLAGを回収後、バッファで洗浄し、3×FLAG peptideで競合溶出させた。このサンプルと、非形質転換株の可溶性タンパク質を同様に処理したサンプルの泳動パターンを比較し、質量分析に供するタンパク質を選抜した。CCM1タンパク質は、そのcDNA配列からCCM1-AおよびCCM1-Bの2種類が存在すると推定されていたが、LC-MS/MS解析により、少なくともCCM1-Aタンパク質が発現していることが示唆された。また、アミノ酸配列データベース（JGI ver3.1）と照合することで、CCM1と共に精製されたタンパク質の一次構造を推定した。CCM1の修飾ならびに複合体成分の特徴からCCM1の機能について考察する。

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多くの水生光合成生物は低CO₂環境下においても効率の良い炭素固定能力を示す。これは無機炭素濃縮機構(CCM)によることが示されているが、多細胞緑藻のモデル生物であるVolvox carteriではCCMが機能しているかどうかは報告がなかった。今回、我々はオープンガス分析装置 を用いて低CO₂環境下のV.carteriにも無機炭素濃縮機構が存在し、炭酸脱水酵素が関与していることを明らかにした。
また、単細胞緑藻Chlamydomonas reinhardtiiでは無機炭素濃縮機構の制御を行うマスター因子CCM1が単離同定されている。このCCM1は細胞外のCO₂濃度の検知、もしくはそのシグナル伝達に必須な因子であることが予想される。しかし、CCM1は核局在であることは示されているが、依然その機能は不明である。そこで、我々はV.carteriから51.1%の類似性をもつCCM1ホモログ(VcCCM1)を単離した。特にN,C末端に高度な保存領域が存在した。VcCCM1がクラミドモナスで機能するかどうかについて検討中である。

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水生光合成生物であるクラミドモナスは環境中のCO₂濃度が低下すると無機炭素濃縮機構（CCM）を誘導し、低CO₂ストレスに順化することが知られている。我々はCCMが誘導される時に発現が誘導される遺伝子群をcDNAアレイ解析により網羅的に同定し、CCMに関与する候補遺伝子を複数見出している。LCIBは高CO₂条件でも細胞内に存在するが、低CO₂条件に移すことで発現が強く誘導される。またLciB欠失変異株であるpmp1とad1は低CO₂条件（350-400 ppm）において生育できず、LciBのRNAi株も低CO₂条件において生育速度が著しく遅延することから、LCIBは低CO₂条件における光合成活性の維持に必須であることが示された。また、間接的免疫蛍光染色法及び免疫電子顕微鏡法により、LCIBは低CO₂条件において発達するピレノイド構造の周囲に局在することが示された。LCIBのオルソログは高等植物には見つからず、CCMをもつミカヅキモやシアノフォラなどの多くの藻類に見いだされることから、水生環境における光合成の低CO₂順化において広く機能していることが示唆される。LCIBのRNAi株の表現型と細胞内局在から推測されるLCIBの機能について議論する。

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多くの水域のpHは中性または弱アルカリ性であるために、水生植物は炭酸イオンを炭素源として利用する。炭素固定の結果、多量の水酸イオンがつくられ、細胞外に放出される。そのために、外液のpHは10近くまで上昇する。シャジクモ類の細胞では、特定の部位から水酸イオンが放出されるためにアルカリバンドが形成される。Lucas(1976)は外液のカリウム濃度を10mMにすると、ほとんどの細胞において炭酸イオンの吸収が著しく阻害されるが、一部の細胞では影響がないことを報告している。本研究ではオオシャジクモのアルカリバンド形成に対するカリウムの影響を調べた。外液に10mM KClを加えると、ほとんどの細胞で細胞外アルカリ化が著しく阻害された。しかし、一部の細胞では影響がなかった。膜電位を測定しながら、アルカリバンド形成を解析した。ほとんどの細胞において、10mM KCl存在下で細胞膜の急激な脱分極が起こった。このような細胞では、アルカリバンド形成が著しく阻害された。しかし、一部の細胞では、細胞膜の静止電位が維持された。このような細胞では通常通りのアルカリバンドが形成された。さらなる解析の結果、アルカリバンド形成には膜電位が必要であると結論した。

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ヒメツリガネゴケは遺伝情報資源が整備され、かつ遺伝子ターゲティング等の逆遺伝学的解析が可能な優れたモデル生物である。私たちはこのヒメツリガネゴケを用いて葉細胞から原糸体を形成する多能性幹細胞へと分化転換する過程を植物の分化全能性のモデルとして研究を行っている。この過程に関わる新規の作用因子を探索するためには変異体を用いた遺伝学的解析が有効であると考えられる。しかし、ヒメツリガネゴケではゲノムの物理地図や、アグロバクテリアを用いた効率的なT-DNAタギング法が未だ確立されておらず、また生活環の多くが単相であることから順遺伝学的解析を進める事が現時点で困難である。そこで私たちはヒメツリガネゴケの幹細胞化過程に影響を与える低分子化合物を探索し、その標的因子を同定するケミカルジェネティクス的解析を試みた。10,000品目の化合物を含む多様性合成ライブラリーを用いて葉細胞からの幹細胞化を基準に約500化合物の候補を得た。現在、これらの化合物について作用の有効性及びヒメツリガネゴケの幹細胞化過程における作用位置の特定を行っている。

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幹細胞は自己複製をしながら分化細胞を作り出す細胞である。多細胞生物の発生過程においては、多様な幹細胞がそれぞれ様々な分化細胞を作り出す事が不可欠である。しかしながら、多様な幹細胞がどの様な分子機構で形成されるかについてはほとんど明らかになっていない。今回、ヒメツリガネゴケにおけるAINTEGUMENTA/PLETHORA/BABY BOOM相同遺伝子であるPpAPB1,2,3,4遺伝子の機能解析を行なったところ、PpAPB遺伝子が幹細胞の性質の決定を制御していることが分かった。ヒメツリガネゴケでは原糸体細胞が原糸体頂端幹細胞と茎葉体頂端幹細胞のどちらかへと分化する。後者への分化はサイトカイニンによって促進されるが、PpAPB遺伝子の四重遺伝子破壊株を作出したところ、サイトカイニンの有無にかかわらず、茎葉体頂端幹細胞の転換が起こらなかった。このことから、PpAPB遺伝子は原糸体細胞からの茎葉体頂端幹細胞の分化に必要不可欠な因子であることが分かった。一方、発現解析の結果、PpAPB はサイトカイニンではなくオーキシンによって発現制御を受けている事が示唆された。これらの結果と、現在進行中のアンチオーキシンBH-IAAを用いた生理学実験の結果を併せて、ヒメツリガネゴケの幹細胞形成過程におけるPpAPB、オーキシン、サイトカイニンの役割について議論したい。

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myo-イノシトールは、生体膜のリン脂質成分や細胞壁多糖の前駆物質として、グルコース6リン酸からmyo-イノシトール1リン酸を経て合成される。この最終ステップを触媒、脱リン酸化する酵素が、myo-イノシトールモノフォスファターゼ(IMP)であるが、植物では詳細な解析がほとんど進んでいない。そこで、ヒトのIMPのアミノ酸配列と比較して相同性の高いシロイヌナズナのIMP-like遺伝子を3種類同定し、解析を行った。その結果、AtIMP-like3遺伝子欠損ホモ個体では、胚発達が非常に初期に停止する事が明らかとなった。myo-イノシトール合成経路には、グルコース6リン酸からの新規合成経路以外に、生体膜リン脂質の一部であるホスファチジルイノシトール(PI)からリン酸が外れてmyo-イノシトール3リン酸(IP₃)となり、再合成されるリサイクル経路も存在する。 この経路で、シグナル伝達のセカンドメッセンジャーとして重要な働きを持つIP₃は、3'(2'),5'-bisphosphate nucleotidase(SAL1)によって脱リン酸化される。AtIMP-like3遺伝子の発現パターンが、PIからのリサイクル経路に関与するSAL1遺伝子と一致して生殖器官で高いことから、AtIMP-like3遺伝子はPIからのリサイクル経路で働き、種子発達初期に重要である可能性が示唆された。

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Cdf1 (Cell growth defect factor-1)は酵母内で発現させると細胞死を引き起こすシロイヌナズナ遺伝子として単離された (Kawai-Yamada et al, JBC, 2005)。シロイヌナズナには本因子の相同遺伝子が他に2個 (Cdf2, Cdf3)存在するが、それらの機能に関する知見は無い。植物に広く保存されたCdfファミリーの生理機能を解明することを目的として、まず本因子の細胞内局在を調べるため、Cdf1-3をGFPとの融合タンパク質としてシロイヌナズナで発現させた。その結果、Cdf1-3はいずれもプラスチド包膜上に局在することが明らかとなった。また、Cdf1のヘテロT-DNA挿入植物体は栄養成長期の生育には異常を示さないが、ホモ個体は致死となり、球状胚のステージで胚発生が停止していた。この表現型はCdf1の過剰発現により相補されたことから、正常な胚発生の進行にはCdf1が必要であることが明らかとなった。一方、Cdf2およびCdf3の欠損植物体では胚発生の異常は観察されなかった。また、Cdf1の過剰発現植物では葉の暗所老化が促進され、一方、Cdf2やCdf3のT-DNA挿入個体では暗所老化が抑制されることが明らかとなった。Cdfファミリー遺伝子と胚発生、および老化制御の関係について考察する。

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Polycomb complex Group（PcG）は、ヒストンH3の第27番リジン（H3K27）に対するメチル化修飾を介し、遺伝子発現を負に制御することが示唆されている。シロイヌナズナにおけるPcGの一員であるCURLY LEAF（CLF）とSWINGER（SWN）の二重変異体（clf swn）は、発芽後に胚様組織を形成する（Schyvert et al., 2005）ことから、PcGが発芽時に胚的性質の抑制に関与する可能性が示唆されているが、具体的な機構は未解明である。そこで、clf swn における胚様組織形成の原因を特定し、PcGによる胚的性質の抑制についてその制御機構の解明を試みた。
我々は本大会において、clf swnを低温条件下で成育した際、胚様組織形成が抑制されることを既に報告した。そこで、低温による胚様組織形成の抑制効果がどの時期から喪失するかを検証するため、常温で播種後、様々な播種後日数より低温環境へ移植し、胚様組織形成に与える影響を評価した。その結果、8日目以降に移植した場合に胚様組織の形成が見られはじめ、14日目以後の移植ではすべての個体で認められた。この結果はclf swnを常温で成育した場合の子葉展開時期と一致した。一方、低温条件下においても2,4-D含有培地上で成育させることで胚様組織形成が回復し、その胚様組織形成率は2,4-D濃度依存的であることを見いだした。これらの結果は、clf swnで見られる胚様組織形成にオーキシンが関与し、その作用時期は子葉展開時である可能性を示唆している。

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植物細胞の分化に関しては、植物ホルモンに依存した組織・細胞培養によるさまざまな細胞分化誘導系がこれまでに開発され、利用されてきた。近年、細胞分化のマスター因子と呼ばれる転写因子群の同定が進んでおり、これらを利用することによって、これまでの手法では誘導が困難であったタイプの細胞分化の誘導が可能になると考えられる。そこで本研究では、後生木部細胞の分化を誘導する転写因子を、シロイヌナズナ培養細胞に導入し、これまで植物ホルモンで分化を誘導することが困難であった後生木部細胞の分化誘導系を開発した。この形質転換細胞株では、培養開始後24時間目から48時間目の間に後生木部細胞が生じ、分化率および同調性に関しても高い値が得られた。この実験系は、後生木部細胞の分化過程において二次細胞壁がどのようにして形成されるのか、また、細胞分化に伴うプログラム細胞死がどのようにして実行されるのかといった、細胞レベルでの現象を解析するための強力なツールになると期待できる。その一例として、後生木部細胞の二次細胞壁形成制御機構に関して、細胞骨格に着目した解析もあわせて報告したい。

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細胞間での情報伝達は、組織の構造を形成・維持する上で重要である。ヒャクニチソウの管状要素分化誘導系において培地から見出されたTDIFは、管状要素分化の阻害活性をもち、細胞間情報伝達を担う一つの因子と考えられる。TDIF は 12 アミノ酸からなる低分子ペプチドで CLAVATA3 を含むCLEペプチドの C 末に共通して存在する CLE ドメインそのものである。本研究では TDIF の in vivo での機能を明らかにするため、シロイヌナズナを用いて分子遺伝学的解析を行ってきた。シロイヌナズナの CLE41 、CLE44 遺伝子は TDIF と同一の CLE ペプチドをコードする。CLE41 および CLE44 のプロモーター::GUS による発現解析によって、維管束と維管束を取り巻く特赦な細胞に発現していることがわかった。また、anti-TDIF 抗体による抗体免疫染色によっても維管束の細胞に局在するとわかった。これらの結果は CLE41、CLE44 が維管束の特殊な細胞にて発現、翻訳され機能することを示唆する。現在、変異体の解析をすすめており、併せて発表したい。

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維管束組織の連続性や放射パターンといった構造上の秩序は、組織を構成する細胞群の細胞間相互作用により維持される。ヒャクニチソウ in vitro 木部細胞分化系より、このような細胞間相互作用を担う分泌性因子が単離されてきた。このうち、管状要素分化の抑制活性を持つ TDIF は、二つの水酸化プロリン残基を含む 12 アミノ酸からなる CLE （CLV3/ESR）ペプチドの一種である。TDIF をコードすると推定される遺伝子は、ヒャクニチソウの他にシロイヌナズナなどにも存在する。
本研究では、TDIF の in vivo での機能を調べる手始めとして、まず化学合成した TDIF をシロイヌナズナ植物体へ投与したときの形態変化を観察した。その結果、植物体全体の形態、篩部形成、葉脈パターン、根の道管形成には大きな変化が見られなかったが、本葉と胚軸の道管形成に異常が導かれた。TDIF の 9 番目のプロリンをアラニンに置換した誘導体では、このような効果は見られなかった。以上の結果から、TDIF は in vivo においても道管形成を抑制することで維管束形成を制御するシグナル分子であることが示唆された。TDIF 非感受性変異体の探索などの結果も合わせて維管束形成過程における TDIF の機能を考察する。

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我々は、パルプ特性に優れた遺伝子組換えユーカリの作出を目的とし、木繊維形成過程の遺伝子発現制御機構の解析を行っている。これまでに、マイクロアレイ解析によってユーカリ木繊維細胞の伸長や二次壁合成に関わる遺伝子群とその制御に関わると予想される転写因子群の単離を報告している（2005, 2006年度年会）。今回、それらの一つであるHD-ZIP II型転写因子EcHB1について機能解析を行ったので報告する。
最初に、一分子蛍光分析法を用いてEcHB1と木繊維形成遺伝子群の各プロモーターとの網羅的なin vitro相互作用解析を行った。本方法では、蛍光標識したDNA断片と転写因子タンパク質の結合（相互作用）を、分子運動（並進時間）の変化から検出する。解析の結果、EcHB1はXTHやCCOMTのプロモーターと相互作用することが示された。次に、in vivoでのEcHB1の機能解析のため、35Sプロモーターによる過剰発現ユーカリカルスとタバコの作出を行った。得られた組換えユーカリカルスのマイクロアレイ解析では、いくつかのXTHやCCOMTの発現変動が見られた。また、タバコ組換え体では、二次木部繊維形態（繊維長、二次壁厚等）の変化が観察された。以上の結果から、EcHB1は木繊維形成に関与しており、XTHやCCOMT等の木繊維形成遺伝子の発現を制御していることが示唆された。

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植物細胞には、原形質連絡(プラズモデスマータ; PD)と呼ばれる細胞壁を貫通する穿孔構造が存在し、栄養物質、情報物質、生体高分子、ウイルスなどの透過を制御している。PDには、細胞分裂の細胞板形成時に形成される一次原形質連絡と、細胞分裂後に隣接する細胞間で新規に形成される二次原形質連絡(2˚-PD)とがある。前者は単純な直線型構造であるのに対し、後者は分岐を持った複雑な形状をとる。2˚-PDは葉のソース化に伴い葉脈篩部の伴細胞(CC)-篩要素(SE)間の細胞壁に形成されることが知られているが、その形成過程に関する分子的知見はほとんどない。
我々は、シロイヌナズナにおいて、ロゼットの成熟葉特異的に糖を蓄積し、耐凍性を向上させる変異株rsx1(restricted sucrose export1)を報告している（植物生理学会、2005）。RSX1はシロイヌナズナに27個存在するペクチンリアーゼ様遺伝子のひとつで、葉のソース化に伴い葉脈(篩部のCCおよびその近傍の篩部柔細胞、維管束鞘細胞)で発現した。rsx1変異株の篩管では、CC側からSE方向に細胞壁の中葉部までしか発達していない2°-PDが観察された。細胞壁の中葉部にはペクチン層が存在し、細胞接着の役割を果たしている。RSX1は葉のソース化に伴い、CC-SE間のペクチン層を穿孔し、2˚-PDの形成に直接的に関与すると考えられる

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RSX1ペクチン酸リアーゼ(EC 4.2.2.2)は、シロイヌナズナソース葉の伴細胞―篩要素複合体間の二次プラズモデスマータの形成に必要なペクチン酸リアーゼであるが、これまでその活性は詳細に研究されていない。トネリビャクシン（Juniperus ashei）の花粉症抗原物質であるJun a 1は、そのアミノ酸配列からペクチン酸リアーゼと予測されているが、結晶構造の解析からN末端部位の立体障害が大きいために、そのままでは活性を示さないと報告されている。今回、われわれはRSX1とJun a 1の相同性に注目し、Jun a 1で活性を阻害すると予測された領域を欠失させたRSX1組換えタンパク質がポリガラクツロン酸を分解するペクチン酸リアーゼ活性を示すことを見出した。この組換えタンパク質は、メチルエステル化レベルの低いペクチンに対しても高い活性を示したが、メチルエステル化レベルの高いペクチンに対しては、低い活性しか示さなかった。この結果は、RSX1ペクチン酸リアーゼは、植物細胞壁で通常高度にメチルエステル化されているペクチンは分解せず、ペクチンメチルエステラーゼで脱メチルエステル化されたペクチンを分解する酵素であることを示唆している。このことは、二次プラズモデスマータの形成には、RSX1と共同して働くペクチンメチルエステラーゼのはたらきも重要であることを示唆している。

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イネの膜電位依存性Ca²⁺チャネル候補遺伝子OsTPC1のレトロトランスポゾンTos17の挿入による機能破壊株では、タンパク質性エリシターTvXによりイネ培養細胞に誘導される過敏感細胞死の誘導やMAPキナーゼの活性化が抑制される(Plant J. 2005 42: 798-)。本研究では、Ostpc1機能破壊株を用いて、TvXエリシター応答性遺伝子のトランスクリプトーム解析を行い、感染防御応答における機能解析を進めた。Ostpc1機能破壊株では、TvXにより発現が誘導される遺伝子群の一部について、発現の顕著な抑制が観察された。OsTPC1依存的にTvXにより急激に発現誘導を受ける遺伝子として、Ca²⁺制御型プロテインキナーゼOsCIPK14/15を同定した。RNAi法による発現抑制株を作成し解析した結果、TvXにより誘導される細胞死や防御遺伝子の発現誘導の抑制が観察された。Ostpc1機能破壊株やOsCIPK14/15の発現抑制株においてTvX誘導性の発現誘導が抑制されていた遺伝子の中には、ジテルペン型ファイトアレキシンの生合成に関与する遺伝子群が含まれていた。本発表では、モミラクトン類、ファイトカサン類と言ったジテルペン型ファイトアレキシンの生合成の誘導に重点を置いて、タンパク質性エリシターにより誘導される感染防御応答におけるCa²⁺シグナル伝達系関連因子の機能について議論する。

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ジテルペン型ファイトアレキシンのモミラクトンとファイトカサンの生合成前半を担うジテルペン環化酵素遺伝子は全て同定されており、それに続く酸化反応を担う酵素遺伝子についても、モミラクトン生合成に関しては、4番染色体上にクラスターを成すP450遺伝子(CYP99A2,CYP99A3)とデヒドロゲナーゼ遺伝子（OsMAS)の関与が示されている。一方、ファイトカサン生合成遺伝子については、2番染色体上のファイトカサン生合成に関与するジテルペン環化酵素遺伝子の近傍に6種のP450遺伝子が存在するが、それらの機能は同定されていない。そこで本研究では、RNAi法による発現抑制株を作製し、2番染色体上でクラスターを成すこれらのP450遺伝子群が、ファイトカサン生合成に関与しているかを追究した。クラスター内のP450遺伝子6種のうち、相同性が高い2種（CYP71Z6、CYP71Z7）については二重発現抑制株の作製を試みた。得られたRNAi株3株についてエリシター処理後のファイトカサン生産量の測定を行った。その結果、当該RNAi株ではファイトカサンA-EのうちファイトカサンAおよびBの生産が特異的に抑制されていることが判明し、CYP71Z6/CYP71Z7がジテルペン炭化水素以降の酸化段階で2位水酸化を触媒することが示唆された。

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ジャスモン酸（JA）は植物の病害抵抗性発現において二次シグナル物質として働く植物ホルモンである。植物の病害抵抗性発現におけるJAを介したシグナル伝達経路の解明を目指し、イネ培養細胞を用いてJA応答性遺伝子の単離を行ってきた。その過程で、我々はbHLH型転写因子をコードするRERJ1をJA早期応答性遺伝子として単離した。前年度大会において、RERJ1が転写活性化因子として機能すること、クラス4キチナーゼをコードするOsChia4aの発現誘導に関与することを報告した。
本発表では、RERJ1によるOsChia4aの発現誘導メカニズムを明らかにするため、OsChia4a上流域の解析を行い、JA応答性シスエレメントを同定した。デリーション解析の結果、翻訳開始点上流-515 bpから-265 bpの領域にJA応答性シスエレメントが存在することが明らかになった。次に、この領域に存在する3つのE-boxについてミューテーション解析を行ったところ、翻訳開始点上流-448 bpから-443 bpにあるE-boxがJA応答性シスエレメントとして同定された。また、このE-boxはRERJ1依存的な発現誘導にも必要であった。現在、RERJ1がこのE-boxに直接結合することで発現制御をしているかどうかを追求するため、クロマチン免疫沈降法による解析を進めている。

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イネの病害抵抗性発現にいたるシグナル伝達経路においては、ジャスモン酸（JA）が重要な役割を果たすことが知られている。JAを介したシグナル伝達経路に関しては、F-boxタンパク質のCOI1を中心とした経路の存在が数種の植物において示されているが、イネの病害抵抗性発現におけるCOI1の役割については未解明のままである。そこで本研究では、イネOsCOI1遺伝子発現抑制株の作成を行なうことで、JAを介した病害抵抗性発現におけるOsCOI1の役割を明らかにすることを目的とした。得られたRNAi株におけるOsCOI1ホモログ遺伝子の発現量を測定したところ、3種存在するOsCOI1ホモログ遺伝子の内、2種の発現が同時に抑制されたラインを多数得た。そこで、これらの培養細胞にJA処理を行い、JA応答性の転写因子遺伝子RERJ1の発現を調べたところ、その誘導的発現が顕著に抑制されていた。この結果は、イネOsCOI1ホモログがJAを介した病害抵抗性発現においても重要な役割を果たすことを示唆している。現在、OsCOI1-RNAi株における他のJA応答性遺伝子の発現プロファイルやファイトアレキシン生産、植物体での表現型の解析を進めている。

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植物の抵抗性遺伝子産物（以下、Rタンパク質）は、病原体を認識する細胞内レセプターとして働くことが知られている。多くのRタンパク質は、ヌクレオチド結合部位(NBS)とロイシンリッチリピート(LRR)をもつNBS-LRR型Rタンパク質に属している。現在、Rタンパク質がどのような複合体を形成し、下流のシグナル伝達系を制御しているかはほとんど明らかになっていない。我々はこれまでに植物免疫の分子スイッチである低分子量GTP結合タンパク質OsRac1がイネのRタンパク質を介した抵抗性反応において重要な役割を果たしていることを明らかにしている。最近、OsRac1相互作用分子の探索を行ったところ、NBS-LRR構造をもつRタンパク質様のタンパク質を複数同定した 本研究では、OsRac1に結合した5種類のNBS-LRRタンパク質をOrin1-5と名付け解析を行った。Orin1は、直接、活性型のOsRac1にNBSドメインを介して結合した。Orin1をタバコの葉で過剰発現すると、細胞死などを伴う過敏感反応と呼ばれる強い特異的な抵抗性反応が観察された。Orin1とドミナントネガティブ体のOsRac1を共発現すると、Orin1により誘導される過敏感反応が抑制された。以上の結果から、OsRac1は、NBS-LRR型Rタンパク質の下流で、植物の抵抗性反応に重要な役割を果たしていることが示唆された。

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In plants, perception of pathogen-associated molecule patterns (PAMPs) triggers innate immune responses that contribute to disease resistance. Previously, we showed that the small GTPase OsRac1 play key roles in defense signaling of rice. Overexpression of the constitutively active form of OsRac1 enhances reactive oxygen species production in rice cells treated by N-acetylchitooligosaccharide elicitor, a PAMP derived from rice blast fungus. Here we report the development of an intracellular fluorescence resonance energy transfer (FRET) sensor that can detect the activation of OsRac1 by N-acetylchitooligosaccharide elicitor in vivo . The FRET biosensor is composed of OsRac1, the CRIB domain of PAK1, which binds specifically to the GTP-bound form of Rac, and variants of the green fluorescent protein, Venus and SECFP, as FRET donor and acceptor, respectively. This biosensor would facilitate identification of the upstream regulators of OsRac1, such as guanine exchange factors (GEFs) and real-time monitoring of PAMP-induced defense responses.

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Basal and R gene-mediated resistance are two systems for plant defense against pathogen attacks. Rac GTPase, RAR1, SGT1 and Hsp90 have been shown to be important components of defense signaling. To further understand the relationship and context of important components, we identified and characterized Sti1/Hop and RWD as novel players in defense signaling. We found that Sti1-knockdown plants were compromised to virulent fungus, while Sti1-overexpressing plants became more resistant. R gene-mediated pathway was also affected by the loss of Sti1. Our data showed Sti1 interacted with Hsp90, and RWD interacted with SGT1 and RAR1, while Rac1 interacted with Sti1 and RWD. These results indicate the existence of an OsRac1-containing protein complex. We hypothesize that defense components may form a dynamic complex termed as 'defensome'. Defensome may be required for both basal and R gene-mediated resistance and its composition may vary depend on different triggers and signaling stages.

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OsPti1aはOsRAR1の上流で機能し、真性抵抗性だけではなく基礎的抵抗性の発現も負に制御する因子である。培養細胞を用いた解析から、OsPti1aは活性酸素による細胞死の誘導シグナルの抑制に関与している可能性が示唆された。そこでOsPti1aを介した耐病性シグナル伝達機構を明らかにするために、OsPti1aに結合する因子Pip1(Ospti1-interacting protein 1) を単離した。Pip1はAGC kinaseをコードし、AGC kinaseの制御因子であるPdk1と相互作用すること、またin vitro kinase assayの結果からPdk1-Pip1-Pti1aというリン酸化を介したシグナル伝達が想定された（昨年度大会）。Pip1、Pdk1の機能を解析するため、Tos17ミュータントパネルからpdk1変異体を単離するとともに、Pip1、Pdk1高発現イネ（Pip1-OE, Pdk1-OE）を作出した。シロイヌナズナのOXI1( oxidative signal inducible 1)と高い相同性を示すPip1は、H₂O₂で発現が誘導されるだけでなく、Pip1-OE培養細胞はospti1a変異体と同様に細胞死が強く引き起こされた。また、Pip1-OE及びPdk1-OEイネは親和性いもち病菌による病斑の形成が有意に減少したことから、Pip1及びPdk1は耐病性シグナル伝達を正に制御すると考えられた。以上の結果から、Pdk1-Pip1-OsPti1aを介した耐病性シグナル伝達機構について報告する。

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ERボディは、シロイヌナズナに存在する小胞体由来の新規オルガネラであり、その機能はまだ不明な点が多い。ERボディは、アブラナ科植物の幼植物体全身の表皮に恒常的に存在する（恒常型ERボディ）が、成熟葉には存在しない。しかし、成熟葉に虫害や傷害を与えると、傷口の周りにERボディが誘導される（誘導型ERボディ）ことから、ERボディが生体防御に関与することが示唆されている。ERボディの機能を明らかにするため、恒常型ERボディと誘導型ERボディの比較解析を試みた。まずERボディの数に着目し、誘導型ERボディが多く誘導される系を探索した。その結果、小胞体を可視化した野生株（GFP-h）の発芽9日目の子葉組織を用いることによって、傷害後66時間でERボディの数が明確に増加した。また、ERボディの誘導を調べるため、共焦点顕微鏡を用い、一定体積あたりのERボディ数を測定する手法を確立した。この手法を用い、GFP-h子葉の片方の葉にのみ傷害を与えたところ、傷害を与えた葉のERボディ数が2倍以上に増加するとともに、傷害を与えていない葉のERボディ数も同様に増加した。GFP-h子葉に傷害を与えた66時間後に定量PCRを行った結果、恒常型ERボディの主内容物であるPYK10の発現量は変わらず、そのホモログであるBGL1の発現量が誘導されていることが判明した。この結果より、恒常型と誘導型ERボディの内容物は異なり、それぞれ異なった機能を果たしていることが示唆された。

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我々は、シロイヌナズナの斑入り突然変異体var2を用いて、植物が斑入りを形成するメカニズムとその意義を研究している。斑入りとは未分化のプラスチドを含む白色セクターと、正常に分化した葉緑体を含む緑色セクターが混在した状態を指す。前年度までに、var2の斑入り葉では緑色セクターの葉緑体特異的に多量の活性酸素種が蓄積していることを見出している。これら活性酸素種が直接的な抗菌作用や間接的な病害応答に役割を持つ可能性を評価するため、var2にGFPを導入したシロイヌナズナ病原細菌Pst DC3000を接種し、蛍光顕微鏡により細菌局在性を野生型と比較した。その結果、var2の白色セクターでは接種初期に強い蛍光が観察されたが徐々に減衰し、緑色セクターでは初期侵入も抑制されていた。また細菌増殖数測定の結果、var2は野生型に比べ僅かながらPst DC3000に対する増殖抑制効果を持つことが示唆された。var2の原因遺伝子は葉緑体局在型メタロプロテアーゼFtsH2であり、主に光化学系IIの修復サイクルに機能する。その遺伝子を欠損したvar2は光合成機能的には不利な形質を持つが、病害応答という観点においては利点となりうる形質であることが予測された。

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根寄生雑草ストライガはアフリカを主とする半乾燥地帯に分布し、穀物の根に寄生する。中でもStriga hermonthica はトウモロコシやソルガムなどイネ科主要穀物を宿主とするため、多大な農業被害をもたらしている。ストライガ種子は宿主植物より分泌されるストリゴラクトンによって発芽誘導され、発芽した幼根は吸器を形成し宿主根に付着・侵入する。ストライガ吸器は宿主と自身の維管束系を連結させ、水分や栄養分を奪って生活する。しかし、この寄生成立過程における宿主・非宿主認識に関する知見は未だ乏しい。そこで我々は、ストライガの宿主認識機構を明らかにするために、宿主（イネ、トウモロコシ）および非宿主植物（シロイヌナズナ、ミヤコグサ、ササゲ）にS. hermonthica を感染させ、経時的な観察をおこなった。その結果、1．ストライガ幼根の付着・侵入初期の過程において宿主特異性が見られないこと、2．非宿主植物ミヤコグサの皮層において寄生植物侵入を防ぐ機構があること、3．宿主植物イネにおいてストライガが内皮より内側に侵入できなくなる場合があること、が明らかになった。また、半寄生植物コシオガマを宿主として感染を試みたところ、ストライガ幼根は宿主を認識することが出来なかった。これらの結果から、ストライガの非宿主認識には少なくとも4パターンが存在すると考えている。
また、S. hermonthica のESTプロジェクトに関しても合わせて紹介したい。

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昆虫による食害は、干ばつなどの環境要因、病原菌などによって引き起こされる病害と並び、植物の生育を脅かす重大な要因の一つである。近年、植物のストレス応答に植物ホルモンが深く関わっていることが分子レベルで明らかになり、その重要性が再認識されるに至っている。我々はシロイヌナズナとミカンキイロアザミウマ（Frankliniella occidentalis）を用いて、植物の虫害応答に植物ホルモンがどのように関わっているのか解析を行なっている。ミカンキイロアザミウマは野菜や果物、そして花等を加害するだけではなくウイルス媒介虫としても知られている。世界的に施設栽培で特に問題となっている難防除害虫であり、その防除法の開発が切望されている。
ミカンキイロアザミウマにより食害を受けたシロイヌナズナにおいては、マーカー遺伝子として広く知られているPDF1.2、VSP2、PR1などの遺伝子発現が誘導されており、エチレン、ジャスモン酸、サリチル酸の重要性が示唆された。そこで我々は、アザミウマによる虫害応答における、これらホルモンの機能をより詳細に解析するために、アザミウマ虫害とこれらホルモン処理による発現応答をマイクロアレイを用いて比較した。更に、これらホルモンに関連した変異体を用いて解析等を行った。以上の結果をもとに植物の虫害応答および耐性における植物ホルモンの役割を考察したい。

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イネ完全長cDNA約13,000種類を個々に発現するシロイヌナズナ形質転換系統（イネFOXライン）を用いて有用形質を示す変異体の選抜をすることで、イネ有用遺伝子の探索を行っている。本研究ではイネFOXラインからのUV-B耐性変異体を単離する目的で、UV-B照射下での根の伸長程度を指標にしたroot bending assayによる選抜を行ってきた。
現在までに約7,000系統のT2種子を用いた選抜が終了している。その中から49系統の候補を単離し各々のラインに含まれる50種類のcDNAを同定した。同定されたcDNAをシロイヌナズナに再導入し、そのうち28種類について表現型が再現できるか確認を行った。
上記の方法で単離された変異体の中には、UV-Bの有無に関わらず根の成長が促進される変異体が含まれる可能性がある。再導入により得られた変異系統にはそのような候補が15系統含まれていた。その多くの系統に含まれるcDNAは機能未知であったが、一部でCDPK, CIPKなどのストレス応答が知られる遺伝子が含まれていた。一方で、UV-B処理区のみ根の屈曲異常が見られる変異体が1系統得られ、この系統にはオーキシン応答遺伝子が挿入されていた。これらについては現在詳細な解析を行っている。
本研究は、平成17年度科学技術振興調整費「イネ完全長cDNAによる有用形質高速探索」によって行なわれている研究である。

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イネのUVB感受性は、品種間で大きく異なる。これまでの研究より、このUVB感受性差異は、UVB誘導シクロブタン型ピリミジン二量体（CPD）を修復するCPD光回復酵素のアミノ酸配列の変異に由来する活性の変化に起因していることが明らかとなった。このことから、UVB抵抗性イネ品種を作出する手段として、CPD光回復酵素活性を高めることが有効であると考えられる。そこで本研究では、高いCPD光回復酵素活性を示す遺伝子資源を探索するために、栽培イネの原種であり、遺伝的多様性を保持しているAAゲノム野生イネ（O. barthii、O. meridionalis、O. rufipogon）と栽培イネ（O.sativa、O.glaberrima）のCPD光回復酵素活性とそのアミノ酸配列を比較解析し、UVB感受性との相関を調査した。その結果、(1)イネのUVB感受性は、草型、自生地、speciesに関係なく、CPD光回復酵素の活性が強く影響すること、(2)野生イネでは様々な推定アミノ酸配列の変異が認められたが、中でも126番目がQからR（Nori-type）に変異すること、さらに296番目がQからH(Sur-type)に変異することによって酵素活性が低下すること、(3)W1299のCPD光回復酵素は、Nori-typeを含む10箇所のアミノ酸配列が変異しているが、高い酵素活性を示すことが明らかになった。

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UVBによって誘発されたピリミジンニ量体 (CPD) を、青色光を利用して修復する CPD 光回復酵素の活性は、植物のUVB抵抗性を決定している。植物細胞には、核、葉緑体、ミトコンドリアが独自のゲノムを有し、UVBによってCPDが誘発されているが、CPD光回復酵素が全てのオルガネラ内で機能しているか否かは、明らかとなっていない。これまで我々は、イネでは、核、葉緑体、ミトコンドリアにおいて、青色光照射時間に依存して、UVB誘発CPD損傷の減少が見られる事を報告してきた。さらに、UVB感受性が異なるイネを用いて、核、葉緑体、ミトコンドリアでのCPD光修復速度の解析を行った結果、各オルガネラでCPD光修復活性が異なる事から、CPD光回復酵素が核、葉緑体、ミトコンドリアへ移行して機能していることを強く示唆するデータを得てきた。本研究では、CPD光回復酵素の細胞内局在を明らかにするため、まず、イネ葉から葉緑体とミトコンドリアを単離し、抗イネCPD光回復酵素抗体を用いたウェスタンブロッティング解析、及びCPD光回復酵素のGFP融合タンパク質を用いた発現解析を行った。その結果、(1)各オルガネラの粗抽出液にCPD光回復酵素のバンドが確認された。(2)核とミトコンドリアにおいて、GFPの局在が観察された。これらの結果により、イネにおいては、CPD光回復酵素が各オルガネラに移行して機能している事が示された。

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UVB照射により生じるDNA損傷であるシクロブタン型ピリミジン二量体（CPD）を修復するCPD光回復酵素は、イネのUVB抵抗性を左右する主要な因子である。CPD光回復酵素は、アミノ酸配列の相同性からクラスIとクラスIIに分類されており、クラスIの諸特性は大腸菌を用いて良く解析されているが、クラスIIについての知見は乏しい。そこで、イネ葉からCPD光回復酵素の精製を行い、精製標品を用いてその諸特性の解析を行った。精製したタンパク質をSDS-PAGEに供したところ、約54kDaと56kDaのタンパク質を含んでおり、CPD光回復酵素抗体を用いたウエスタンブロットの結果などから、2つともCPD光回復酵素であると考えられた。精製したCPD光回復酵素に対し、タンパク質脱リン酸化酵素を反応させ、SDS-PAGEを行ったところ、約56kDaのバンドが減少し、54kDaのバンドが増加したことから、イネのCPD光回復酵素はリン酸化修飾を受けていることを見出した。一方、イネCPD光回復酵素のcDNA配列をもとに、大腸菌にて発現・精製したタンパク質は、約55kDaタンパク質のみからなり、リン酸化修飾を受けていないと考えられた。また、大腸菌発現イネCPD光回復酵素は、イネから精製した酵素と比較してタンパク質量あたりの活性が低くかった。以上の結果から、CPD光回復酵素のリン酸化修飾の機能について考察する。

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これまでにタバコ培養細胞を用いて短波長紫外線(UV-C)による細胞死誘導メカニズムを解析してきた結果、活性酸素種およびカルシウム情報伝達系の関与が示唆されている。本研究では、新たにシロイヌナズナ培養細胞を用いてUV-C誘導性細胞死を観察したところ、タバコ培養細胞と同様に活性酸素種の関与が認められた。またシロイヌナズナの変異体および組み換え体に由来する培養細胞を用い、UV-Cによる細胞死誘導過程における情報伝達経路、特にサリチル酸経路の役割を詳細に解析した。

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イネの環境ストレス応答機構には、未解明の部分が多く残されている。我々は、マイクロアレイ解析により、イネの環境ストレス応答性遺伝子を数多く見出した。本研究ではそれらのうち、乾燥ストレスによって発現量が著しく減少し、シロイヌナズナのPhytochrome Interacting Factor (PIF)と高い相同性を示すOsPIF1に関して解析を行っている。これまでに、OsPIF1遺伝子の非ストレス条件下での明期における発現上昇が乾燥ストレス処理によって消失すること、OsPIF1過剰発現イネでは節間伸長が促進されること、リプレッションドメインを利用したOsPIF1機能欠損イネでは節間伸長が抑制されること等を示してきた。これらの結果は、OsPIF1が乾燥ストレス応答機構においてイネの節間伸長を制御している重要な因子である可能性を示唆している。最近、トランジェント発現系を用いた解析によりOsPIF1は転写活性化因子であること、GFP融合タンパク質を利用した解析により核に局在していることを明らかにした。さらに、プロモーターGUS解析の結果、節においてGUSのシグナルが非常に強く観察された。この節での発現はOsPIF1のリアルタイムRT-PCR解析によっても確認された。現在、形質転換イネを用いたマイクロアレイ解析によりOsPIF1の下流遺伝子の同定を試みている。

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カルシウム結合タンパク質CBLとその標的分子であるタンパク質リン酸化酵素CIPKは、高等植物のカルシウムを介したシグナル伝達において重要な役割を担うと考えられている。シロイヌナズナゲノム上には10のCBLと25のCIPK遺伝子がコードされており、様々な細胞内シグナル伝達系が、特異的なCBL/CIPKの組み合わせによって調節されるというモデルが想定されている。今回我々は新たに、CBL1/CIPK1の組み合わせが光応答に関与していることを見出した。
赤色および青色光下において、シロイヌナズナcbl1/cipk1二重欠損株の芽生えは、野生株に比べて短い胚軸、すなわち光高感受性を示した。一方で、赤・青色光による光応答性遺伝子CHS, CAB3の発現誘導量は、cbl1/cipk1二重欠損株において低下していた。これによく似た表現型が、フィトクロムおよびクリプトクロム系光シグナル伝達の調節に関わる遺伝子HRB1の欠損株について報告されている。そこでこのHRB1に注目してBiFC解析を行ったところ、CIPK1とHRB1のタンパク質間相互作用が示された。CBL1/CIPK1はHRB1を介して光シグナル伝達に関与している可能性が考えられる。また本発表では、cbl1/cipk1二重欠損株が短日条件における早咲き表現型を示したことも併せて報告し、光応答におけるCBL1/CIPK1の機能について考察する。

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BLUFドメインは近年見つかったフラビン結合青色光受容ドメインである。好熱性シアノバクテリアThermosynechococcus elongatus BP-1のBLUFドメインであるTePixDはフォトサイクルを示し、室温での光照射によりFADの吸収スペクトルが約10nm長波長シフト変化する。X線結晶構造からはflavin分子近傍のGln50,Tyr8などとの水素結合が示唆されている[1]。 長時間の光照射によりFADラジカルが蓄積されることがわかっている[2]。 今回、TePixDに80-150K照射することによりg=2領域に85Gの分離を持つ一対のEPR信号を発見した。 信号の線形からESR信号の由来は2つのラジカルの磁気的双極子相互作用と考えられ、近似的に両者のスピン間の距離は6.9Aと見積もれる。またパルスENDOR法によりFADとチロシンに特徴的な信号を得た。 X線結晶構造との比較によりこのラジカル対はFADと近傍チロシンY8由来と考えられる。また、長時間の光照射によりラジカル対は単体のFADラジカルへと変化する。 得られた結果より反応機構を検討する。
[1] Kita et al., J. Mol. Biol., 2005, 349, 1-9.
[2]Fukushima et al. Biochemistry, 2007, in press

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シアノバクテリオクロムは、シアノバクテリアに存在するフィトクロム様光受容体の一群であり、赤/遠赤色光以外の様々な光を吸収する。CcaSはSynechocystis sp. PCC 6803のシアノバクテリオクロムの1つである。既に我々は、CcaSの色素結合ドメインが緑色光吸収型（Pg）と赤色光吸収型（Pr）を光可逆的に変換することを報告した（広瀬・植物生理学会・2007）。今回、MSスペクトル解析と変性タンパク質の吸収スペクトル解析から、CcaSに結合する色素はPCBであり、その構造はPgがZZZ型、PrがZZE型であることを報告する。また、ほぼ全長のCcaSの自己リン酸化活性の緑色光照射による上昇と、転写因子CcaRへのリン酸基の転移を確認した。CcaRはcpcG2のプロモーター領域に結合することから（片山・ISPP・2003）、緑色光→CcaS→CcaR→cpcG2というシグナル伝達経路の存在が明らかとなった。これは、光化学系II光の下で光化学系Iのアンテナ（CpcG2型フィコビリソーム）を増やす応答と考えられる（Kondo K., et al. 2007 Plant Physiol）。また、Nostoc punctiforme PCC 73102にCcaSオルソログが存在することを踏まえて、CcaSによるフィコビリソーム調節機構の普遍性と多様性を議論する。

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我々はシアノバクテリアがもつ新しい光受容体タンパク質シアノバクテリオクロムの解析を進めている。その GAF ドメインは開環テトラピロールを結合し、可逆的な光変換を示すが、植物のフィトクロムと異なる分光特性を示す。このうち走光性の光受容体、 Thermosynechococcus elongatus PixJ の色素結合ドメイン TePixJ_GAFの研究では、これまでに His タグ融合 TePixJ_GAF を常温性シアノバクテリア Synechocystis sp. PCC 6803 で発現、精製し、 433 nm と 531 nm の可逆的な光変換を示した。また、変性タンパク質の分光解析から TePixJ の発色団がフィコビオロビリン (PVB) であることを報告した。本発表では化学合成したフィコシアノビリン (PCB) とアポ TePixJ_GAF タンパク質を用いた再構成実験について報告する。両者の混合直後に 430 nm と 545 nm の間で光変換するホロ TePixJ_GAF が形成されたが、その発色団は共有結合した PCB であった。これを長時間保温すると結合した PCB は徐々に PVB に変換されたがそのホロタンパク質は 434 nm と 532 nm の間で光変換を示した。これらの結果は、 TePixJ_GAF は PCB を共有結合するが、その発色団の立体構造は歪んでおり、 GAF ドメイン自身がこの歪みを解消するために異性化を触媒することを示唆する。つまり TePixJ の GAF ドメインはリアーゼ活性、異性化活性、光変換活性を合わせ持っている新奇の GAF ドメインといえる。

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フィトクロムは、植物において赤色・遠赤色光受容体として様々な光応答に関わっている。一方、シアノバクテリオクロムと呼ばれるフィトクロムと似て非なるタンパク質群がシアノバクテリア特異的に見出され、多様な分光特性が報告されている。これらのうち、推定走光性光受容体AnPixJが、フィコシアノビリンを共有結合し、緑色光吸収（Pg）型と赤色光吸収（Pr）型の間を可逆的に光変換することを我々は明らかにした。また、AnPixJのPr型はフィトクロムのPr型と色素の立体配置はよく似ており、Pr型からPg型への光変換過程においてフィトクロム同様、C環とD環の間のZ/E変換が起きていることが示唆された。本研究では、AnPixJのPr型の結晶化をハンギングドロップ蒸気拡散法により行った。その結果、1.8 ÅのX線回折分解能を示す結晶が得られ、結晶化条件に含まれていたヨウ素の異常分散効果を利用したSAD法により、結晶構造を決定することに成功した。全体構造はバクテリオフィトクロムとよく似ていたが、色素のタンパク質に対する結合位置は両者で異なっていた。また、色素を取り囲む環境はバクテリオフィトクロムと異なっているにもかかわらず、色素の立体配置は非常によく似ていることが明らかとなり、これまでの分光学的な研究結果と一致していた。これらの結果から、非常によく似たPr型から、特異なPg型への光変換機構について、Pr型の構造を基に議論する。

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フィトクロムは植物が持つ主要な光受容体である。フィトクロムを初発とする光シグナル伝達経路を解明するため、本研究ではユニークなモデル植物である苔類ゼニゴケを用いた。ゼニゴケは進化上最初の陸上植物のグループに属しており、生活環の大半が半数体である遺伝学的解析の利点を備える。単離されたMpPHY遺伝子は1分子種のみ存在した。大腸菌発現系より得られたリコンビナントMpphy(N612)は赤色光／遠赤色光可逆的な構造変換を示した。次に、フィトクロムのGAFドメイン内のTyr残基をHis残基に置換することで光可逆性を失い、常に活性型として機能するという知見に基づき、Mpphyの241番目のTyrをHisに置換したリコンビナントMpphyY241H(N612)を得た。このMpphyY241H (N612)は光可逆性を失い、蛍光タンパク質となったことを確認した。ゼニゴケ野生株では光依存的に仮根形成が見られる一方で、MpphyY241H全長を発現させたMpphyY241H導入株では暗黒下でも仮根形成が観察された。またこの株では青色光応答が抑制されていた。MpphyY241H-GFPは光条件を問わず核内で顆粒状構造体を形成し、常に活性型として機能していると予測された。現在、Mpphy機能欠失変異体の作出を試みており、Mpphyが制御する光形態形成およびシグナル伝達経路の解明を目指している。

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We previously demonstrated interactions among peroxisomal biogenesis factors, Pex5p, Pex7p and Pex14p, peroxisomal proteins with two targeting signals, PTS1 and PTS2, in Arabidopsis thaliana using yeast two-hybrid analysis. In the present study, we introduced bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay using split yellow fluorescent protein (YFP) to visualize the interactions between these proteins in living plant cells. When nYFP-PTS1/PTS2-cYFP or nYFP-Pex7p/PTS2-cYFP fusion proteins were expressed transiently, onion epidermal cells showed punctate green fluorescent signals that were co-localized with tdTomato-PTS1. The result indicates that PTS1-PTS2 and Pex7p-PTS2 interacted with each other in vivo in the peroxisomes On the other hand, when cYFP-Pex5p and nYFP-Pex7p were expressed together, onion epidermal cells showed cytosolic green fluorescent signal, suggesting that Pex5p and Pex7p interacted with each other in the cytosol. In this report, we propose a revised model for the import of PTS-containing matrix proteins.

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オイルボディは、脂肪性種子細胞に多量に存在するオルガネラでである。このオルガネラは、1層のリン脂質で囲まれ、内部に種子貯蔵脂肪であるトリアシルグリセロールを含む単純な構造をしている。オイルボディは、トリアシルグリセロールが小胞体の脂質2重膜間に合成された蓄積した結果形成されるという説が提唱されているが、その詳細はまだはっきりしていない。本研究は、オイルボディ形成異常を示す変異体を単離・解析することで、オイルボディ形成機構の解明をめざしたものである。
オイルボディ膜にはオレオシンという膜タンパク質が多量に存在している。我々は、オレオシンとGFP（緑色蛍光タンパク質）からなる融合タンパク質を発現する形質転換シロイヌナズナを作成することで、オイルボディを生体蛍光染色した。次いで、本形質転換体を変異原処理し、後代でオイルボディ形成異常を示す突然変異体を複数系統同定することに成功した。これらの1つは、種子におけるオイルボディの形態、オレオシンの蓄積や貯蔵脂肪の蓄積などに異常が認められた。これらの表現型および原因遺伝子の機能予測から、種子の登熟課程におけるオイルボディの形成機構を考察する。

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油糧種子は発芽時の栄養源となる貯蔵脂質をオイルボディに蓄えている．オイルボディの主要膜タンパク質であるオレオシンはオイルボディを小さく保つ機能を持つと考えられている．このようなオレオシンの性質の生理学的な役割を，オイルボディの分解を伴う種子の発芽時に注目して解析した．シロイヌナズナの3種類の種子型オレオシン（OLE1～3）のT-DNA挿入変異体を確立した．電子顕微鏡観察の結果，すべてのオレオシン欠損変異体でオイルボディが野生型よりも大きくなっていた．オイルボディの大型化の程度はオレオシンの存在量に比例しており，最も多量に存在するOLE1の欠損変異体における巨大化が顕著であった．いずれの変異体も，外見上は野生型と変わらず，通常の栽培条件では正常に発芽し成長した．興味深いことに，それぞれの変異体の乾燥種子は，凍結処理を施すことで発芽が顕著に阻害されることが判明した．凍結処理後の種子では，オイルボディはさらに巨大化し，核の形態に異常が見られた．凍結処理により発芽出来なくなった種子の細胞では核が消失していた．種子の凍結処理は，野生型では影響が見られないが，オレオシン量が少ないと致死的な障害を与えることが分かった．以上の結果から，シロイヌナズナのような油糧種子は，オレオシンを大量に蓄積することでオイルボディ同士の融合を防ぎ，冬の凍結にも耐えているという可能性が浮上してきた．

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高等植物は他生物にはみられない柔軟な環境応答能力を持つ．植物を特徴づけるこの柔軟性は細胞核による遺伝情報の機能制御によって支えられている．しかしながら，植物の細胞核自身の研究はほとんどなされておらず，その構造や機能を支える分子はほとんど不明である．高等植物の生命現象を支える細胞核の形成機構を明らかにするために，シロイヌナズナを用いて，二つのアプローチにより解析を進めた．
核膜孔は細胞質と核を結ぶ唯一の通り道である．核膜孔はNucleoporinと呼ばれるタンパク質群によって形成される巨大複合体である．シロイヌナズナのゲノム中に，ほ乳類や酵母のNucleoporin遺伝子のホモログが存在しているが，その機能や生理学的意義は分かっていない．そこで，それぞれのシロイヌナズナのNucleoporinと蛍光タンパク質の融合タンパク質を作製し，細胞内での動態解析を行った．その結果，いくつかのNucleoproinは核膜上に特異的かつ安定的に局在することが分かった．一方，細胞核の高次構造がどのような機構で成り立つのかを理解するために，プロテオミクスの手法を用いて植物細胞に特異的な核タンパク質の同定を試みた．シロイヌナズナ培養細胞から純度の高い核の単離方法の確立し，この標品を高塩，アルカリ，界面活性剤等で処理し，核タンパク質の網羅的解析を行った．

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Organellar DNA degradation in plants is sensitive to the physiological state such as developmental stage and senescence. However, the underlying mechanism is unknown so far. Angiosperm pollen is a good experimental system because organellar DNA is degraded dramatically during pollen development. We performed screening to isolate mutants defective in organellar DNA degradation. Pollens from a mutagenized population were stained with DNA-specific fluorescent dye, DAPI, and observed using a fluorescent microscope. Wild-type pollen showed DAPI signals from the nuclei of vegetative and sperm cells, while mutant candidates exhibited additional signals in the cytoplasm. Among the mutant candidates was the 1411 mutant that also showed additional variegation phenotype. The responsible gene of the 1411 mutant encoded the large subunit of the ribonucleotide reductase (RNR) enzyme. The enzyme ensures adequate and balanced deoxyribonucleotide pool. Characterization of pollens and variegation phenotypes in several RNR mutants including 1411 will be presented.

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原核生物において、RelA/SpoTはセカンドメッセンジャーppGppの合成または分解を栄養状態の変動に応じて行なう。ppGppは、多くの遺伝子の転写制御、および酵素活性の制御に関与する。ppGppを介した一連の制御機構は緊縮応答と呼ばれる。近年高等植物においてRelA/SpoTのホモログRSH(RelA SpoT Homologs)の存在が明らかにされ、それらは葉緑体で機能することが示唆されている。我々は高等植物の高次機能に緊縮応答がどのように関与するのかを明らかにすべく、シロイヌナズナの4つのRSH (RSH1, RSH2, RSH3, CRSH)の解析を進めている。
レポーター遺伝子を用いたプロモーター解析の結果、シロイヌナズナの4つのRSH遺伝子は、緑色組織および花で発現していることが分かった。またCRSHのノックダウンにより稔性が大きく低下した。CRSHのppGpp合成活性は、Ca²⁺で活性化されることが報告されており(Tozawa et al. 2007)、葉緑体内の緊縮応答は、ホルモンの前駆体量をCa²⁺依存的に制御することで、種子形成時に必須の役割を果たすと考えられた。ノザンブロット解析により、RSH2の発現は傷害などのストレスで誘導されることが分かった。以上のことから、ppGppを介した葉緑体内の緊縮応答が、植物の示すさまざまな高次機能に重要な役割を果たしていることが分かった。

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葉緑体は大量のCa²⁺を蓄積するオルガネラであるが、その大部分はチラコイドに存在し、ストロマのCa²⁺濃度はμM以下に保たれている。近年この葉緑体内のCa²⁺が、細胞内カルシウムシグナルの制御に関わることが示唆されている。例えば、植物を光照射条件から暗条件に移すと、ストロマ内遊離Ca²⁺濃度の一過的上昇が起こり，引き続き細胞質内のCa²⁺濃度が上昇する現象が報告されている。葉緑体と細胞質の間に、未知のCa²⁺コミュニケーションが存在することが示唆される。しかし、その分子機構はほとんど分かっていない。
我々は、これまでの研究から、葉緑体チラコイド膜に局在するCa²⁺結合タンパク質CASが、気孔運動に先立つ細胞質カルシウムシグナルの発生に必須であることを明らかとしている。今回は、このCASが、暗処理が引き起こすストロマ内のCa²⁺濃度上昇に関わることを報告する。まず、Ca²⁺結合発光タンパク質のエクオリンを利用し、葉緑体ストロマ内のCa²⁺測定系を作製した。その植物体を使って暗処理によるストロマ内Ca²⁺変化を測定したところ、cas変異体ではCa²⁺濃度の一過的上昇が見られなかった。また、CASが光照射によるリン酸化を受けることも明らかにしている。これらの結果を踏まえ、細胞内カルシウムシグナルの明暗制御におけるCASの役割について考察したい。

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