Abiotic and biotic stresses typically trigger the formation of an array of enzymatically and non-enzymatically oxidized lipids including α,β-unsaturated aldehydes and ketones. Several members of the later group are chemically reactive and covalently bind to proteins both in vitro and in Arabidopsis thaliana in vivo. We show that cyclopentenone oxylipins (12-oxo-phytodienoic acid and several phytoprostanes) induce a common pattern of genes involved in secondary metabolism and detoxification while genes involved in cell division and growth are down regulated. Gene regulation by reactive cyclopentenones is to a large part independent of COI1 but dependent on TGA transcription factors. Some of the strongly up-regulated detoxification genes such as GST6 and OPR1 detoxify cyclopentenones in vitro but at the same time GST6 becomes itself gradually covalently modified and inactivated. Hence, endogenous reactive oxylipins may be involved in signalling and cell rescue at low levels but may significantly damage proteins at high levels.

抄録全体を表示

The response to Reactive Electrophile Species (RES) is considered as part of the plant response to pathogen and insect attacks. In plants, RES conjugation to GSH is facile and non-specific. The variety of RES leading to the same response suggests that the conjugation reaction it self and not a peculiar signalling compound is the key step in the induction of the response. In cryptogein-elicited tobacco leaves, oxylipin RES adducts to GSH are produced in correlation with GSH consumption, increase in glutathione-S-transferase activity and the appearance of the cell death symptoms. The adducts arise from the downstream 13 lipoxygenase (LOX) metabolism and the main products are obtained from 2-hexenal and 12-oxo-phytodienoic acid, supporting the role of RES in signalling. The nature of these GSH conjugates shows the key role played by the 13 LOX pathway in the RES signalling of the tobacco HR.

抄録全体を表示

植物が病傷害を受けるとその病傷害に特異的な揮発性化合物群を生成・放散する。これら揮発性化合物は病原体、あるいは草食昆虫を忌避する直接防衛と他の生物の介在によって忌避する間接防衛に関与している。また、植物がこうした植物揮発性化合物を受容し、病傷害が差し迫っていることを察知して、自らの抵抗性を高めることが知られてきた。揮発性化合物を介した植物―植物コミュニケーションといえる。植物が病傷害を受けた時に最も早く生成放散される揮発性化合物はみどりの香りと総称される炭素数6のアルデヒド類である。そこで、これらみどりの香りがこうした植物―植物相互作用に関与しているのかについて検討を進めた。
無傷で健全なシロイヌナズナ実生をガラス容器に入れ、(E)-2-hexenalの蒸気に曝すと種々の防御関連遺伝子発現が亢進した。同時に細胞壁のリグニン化、抗菌物質の生成がみられ、灰色カビ病菌抵抗性が高まった。シロイヌナズナ変異体を用いた検討からこうした抵抗性誘導にはジャスモン酸、エチレンを介した信号伝達経路が重要であるがサリチル酸信号伝達経路は関与していないことが明らかとなった。また、グルタチオン生成欠損変異体で多くの誘導応答が消失していたことからグルタチオンが揮発性アルデヒド受容に関与していることが示唆された。こうした知見を踏まえ、植物の揮発性アルデヒド受容機構、またその生態学的意義について考察する

抄録全体を表示

野外の連続した植生において，降雨は土壌ではなく，まず植生林冠（Canopy）上におちる。すなわち，密度の高い植生においては，群落上部から供給される水分のほとんどはCanopyと接触し（樹冠遮断），枝葉上の乾性沈着の洗浄や樹幹との相互作用をした結果，量的，質的に変化した水が土壌へ供給される。このことは，野外の自然植生における栄養塩循環，水供給を考える上で，植物表面に接触した水についての研究が必要不可欠であることを示している。樹冠遮断の過程で，葉表面上に沈着したNO₃^-やNH₄⁺のかなりの割合（数10～100％）が吸収される。また， H⁺が吸収され，植物体内部のK⁺，Mg²⁺，Ca²⁺が溶脱される。これらはクチクラに覆われた葉表面において活発に行われる。葉表面で濃縮した沈着物質は，植物に有害に作用することもあるが，基本的には成長に欠くことのできない栄養塩類の供給源となる。例えば，高山の山頂付近のハイマツ植生では，成長に必要な水分や窒素などの栄養塩類は，主に大気中から供給され，その動態を明らかにすることは，植生成立を理解する上で必要不可欠である。そこで，立山山頂部において，霧，降雨，露，林内雨の測定を行った結果，霧水や露水などによる植生上への水分供給が，降水よりも安定した水分供給源として位置づけられ，高い効率で降下物中の窒素が吸収されていることが明らかになった。

抄録全体を表示

窒素は非常に安定な気体として大気の約80％を占めるが、それを直接利用できる生物は限られている。一部の微生物が窒素固定により窒素分子を反応性窒素に変換することで、はじめて他の生物が利用することができる。しかし20世紀以降、化石燃料の燃焼や化学肥料の合成による人為的な反応性窒素の生成が増加し、その結果大気中に放出される反応性窒素の量も増加しつつある。大気中に放出された反応性窒素は、雨や雪と共に、またエアロゾルやガスの形で地上に降下する。放出量の増加にともなって降下量も増加し、反応性窒素の降下量は2050年には1990年代前半の約2倍に達すると予測されている。窒素は植物の成長に大きく影響する無機栄養であるため、窒素降下量の増加は植物の一次生産力に影響する。また土壌の富栄養化による種多様性の低下や、土壌の酸性化による有害金属の溶出、栄養塩の溶脱などの可能性が指摘されている。
本講演では、まず、窒素降下に関するこれまでの研究について特に草原生態系を中心に概説し、演者が2006年から行っているモンゴル草原における窒素負荷実験を紹介する。

抄録全体を表示

C/N比の増加を引き起こす低窒素条件では、ミトコンドリアへの窒素の分配率が増加する。このとき、TCA回路の酵素群だけでなく、電子伝達系のコンポーネントも大きく変化する。低窒素条件により顕著に誘導される電子伝達系タンパク質の一つとして、オルタナティブオキシダーゼ（AOX）が知られている。AOXは植物に特有のコンポーネントであり、ユビキノンから酸素への電子の受け渡しの際にH⁺の移動がない。このためAOXへの電子伝達はATPの合成に結びつかず、還元力は無駄に消費される。その一方、H⁺の電気化学的勾配に律速されることなく、過剰な還元力を散逸することができると考えられている。AOXのアンチセンス培養細胞を低窒素環境で生育させると、野生型と比較してC/N比や糖濃度の増加がより大きくなる。これは、AOXが過剰な還元力（糖）を消費することにより、C/Nバランサーとして機能することを示唆する。近年、アンモニウムもしくは硝酸を窒素源とすると、AOXの遺伝子発現や最大活性は、それぞれ増加もしくは減少することが明らかになった。我々は、シロイヌナズナにおける、これらの増減に機能する主要なAOX遺伝子として、AOX1aを同定した。さらにAOX1aの発現は、窒素化合物によって正負に制御されていることも明らかになってきた。本講演では、AOXだけでなく、他の植物特有の電子伝達コンポーネントも含めた呼吸系のC/Nバランサーとしての機能について議論したい。

抄録全体を表示

葉の老化やストレス条件下では、タンパク質の多くは速やかに分解され、それらを構成していた窒素は生長部位へ転流し、また炭素はエネルギー源として共にリサイクルされる。C3植物では葉の全窒素の約80%が葉緑体に分配され、中でもRubiscoには約12－35%が分配されている。よってRubisco分解は光合成と栄養素リサイクルの両面から炭素・窒素代謝と深く関わっているが、その分子機構の全貌は明らかにされていない。これまで私たちは自然老化葉においてRubiscoが小胞RCB（Rubisco-containing body）を介して葉緑体外に放出されている可能性を免疫電顕により見出した。RCBは細胞質において隔離膜様の構造体に囲まれていることから、その輸送経路にはオートファジーが関与していることが示唆された。オートファジーは植物においても細胞内のバルクのタンパク質分解を担う主要なシステムと考えられているが、そのRubisco分解における役割は不明である。そこで私たちは蛍光タンパク質によるRCBの生葉における可視化法とオートファジー欠損（atg）変異体を用いて、RCBの形成とオートファジーとの関係について詳細に解析した。また様々な生長段階の葉におけるRCB形成活性やatg変異体における葉緑体数、窒素、Rubisco等の消長について調べた。本発表では、これらの結果を紹介し、Rubisco分解におけるオートファジーの関与やその貢献度について考察する。

抄録全体を表示

窒素は植物にとって重要な栄養素で，実験室や耕作地での培養・栽培は，窒素大過剰条件下で行われることが多い．これに対し、我々は自然環境下で一般的な窒素制限条件下での遺伝子発現や生育に対する硝酸イオンの影響に興味を持って研究を進めている．ラン藻の場合，硝酸同化系遺伝子の発現は，窒素不足を反映する2-オキソグルタル酸の増加により誘導され，硝酸還元中間産物の亜硝酸イオンによって活性化される．亜硝酸イオンによる転写活性化はLysR型の転写因子NtcBが担っている．NtcBは窒素十分条件下では不必要だが、硝酸イオン制限条件下における硝酸イオンの獲得に重要であることがケモスタットを使った競合実験から明らかになった．一方，貧栄養湿地で成育するモウセンゴケ属植物のモウセンゴケ（Dr）とコモウセンゴケ（Ds）は硝酸イオン濃度5 mMの培地で枯死し，これらの種にとって過剰な硝酸イオンが有害であることがわかった．ところが両種の交雑に起源をもつトウカイコモウセンゴケ（Dt）は硝酸イオン濃度5 mMの培地で生育し，自生地の水質も，Dr自生地で硝酸イオン濃度がおおむね3 μM以下であるのに対し，Dt自生地では最大200 μMだった．このことから，近年のDtの増加とNOX降下による富栄養化との関連が示唆された．以上の事実は，低濃度領域の硝酸イオンが植物や藻類の遺伝子発現や生育を左右する重要因子であることを示している．

抄録全体を表示

植物は、体表面の気孔からCO₂を取り込み、光合成を行う。明条件や低CO₂環境では、効率よく光合成を行うために気孔を開き、また乾燥条件下では、余分な水分の放出を抑えるために気孔を閉鎖させる。CO₂は炭酸同化の基質以外にも、環境変動に適応するためのシグナルとして作用することが示唆されているが、これまで、CO₂シグナルを感知し、その情報を気孔開度などに反映させるメカニズムについて、ほとんど明らかにされていない。われわれは、気孔開閉にともなう蒸散率の変化に着目し、サーモグラフィーを用いた葉面温度の画像化を通じて、CO₂応答に異常を示すシロイヌナズナ突然変異体のスクリーニングを行った。ht1は、低CO₂条件でも高い葉面温度を示す変異体として単離され、CO₂応答性のみを特異的に欠損している。原因遺伝子は葉組織で気孔特異的に発現する新規のプロテインキナーゼであり、CO₂に特異的なシグナル伝達経路が存在することを示唆している。またcdi3は高CO₂による気孔閉鎖が阻害された変異体であり、その原因遺伝子は気孔の細胞膜を介したアニオン輸送に重要な役割を果たすS-typeのアニオンチャネルである可能性が示唆された。本発表では、これらの変異体の解析から得られた知見に基づいて、植物のCO₂感知機構について議論したい。

抄録全体を表示

植物は土壌中の不均一かつ可変的な養分分布に対し、それらを効率的に吸収・同化できるよう根系の代謝や形態を変化させている。このような適応は、外環境変化の指標となる外来シグナル分子もしくは体内シグナル分子の受容→シグナル伝達系を介しての標的遺伝子・タンパク質機能のコントロール→代謝機能や形態の変化、という一連のスキームの上に成り立っている。ただし植物生長に影響を与える環境因子は複雑かつ膨大であり、これらすべてのスキームを包括的に理解するには至ってはいない。しかし近年、シロイヌナズナの分子遺伝学を基盤にした研究から、栄養状態の指標となる体内シグナルとして、従来の代謝中間体に加えサイトカイニンなどの植物ホルモンが重要な役割を演じていることが明らかにされた。サイトカイニンの活性は、IPTによる前駆体の合成、P450によるゼアチン型への変換、LOGによる活性化や、CKXなどによる不活性化反応が複雑に絡み合うことで調節されている。本講演では、植物体の需要量が大きくかつ土壌中で不足しやすい窒素栄養に対する植物の応答と適応戦略について、サイトカイニン代謝系の制御機能の最新の知見とともに解説する。

抄録全体を表示

器官のサイズは、それを構成する細胞の数とサイズに依存する。葉もその点、例外ではない。その葉における個々の細胞の振る舞いは、器官レベルの未知の統合システムによって統合されていると考えられる。そのようなシステムが存在することは、二つの現象から強く示唆される。すなわち補償作用と高次倍数体シンドロームである。
補償作用とは、葉の細胞数が著しく低下すると、細胞伸長が促進され大型の細胞が生じる現象で、葉やそれを基本とした有限成長型側生器官でのみ認められる。一方、細胞数の増加や細胞サイズの変化は、こうした調節を引き起こさない。細胞の分裂と伸長は、どう統御されているのだろうか。
一方高次倍数体シンドロームは、高次倍数体の器官サイズが、2倍体と同等か小型となる現象である。シロイヌナズナの場合、細胞サイズでは2倍体より4倍体が、4倍体より8倍体が大きい。ところが不思議なことに、葉のサイズについてみると、4倍体は2倍体より大きいものの、8倍体は2倍体よりむしろ小さい。これはいかなる制御によるものなのだろうか。
これらの疑問に答えるには、酵母など単細胞性生物の研究から得られた細胞周期の知見だけでは不十分であり、多細胞器官レベルでの解析が必須である。本シンポジウムでは、これまでにシロイヌナズナの遺伝学的解析から得られた知見を元に、器官レベルでの統御システムについて、いくつか仮説を掲げて問題提起としたい。

抄録全体を表示

植物の発生過程において体細胞分裂、核内倍加の2つの細胞周期が時間的、空間的に正しく進行することは器官の形成や生長に非常に重要であるが、これらの細胞周期が発生段階でどのような制御を受け、またどのように器官形成、生長に貢献するのかについてはほとんど分かっていない。体細胞分裂周期の制御機構については近年急速に理解が進んできたが、核内倍加の分子機構についてはまだ未解明の点が多い。私達のグループはこれまでに核内倍加に異常を起こすシロイナズナの突然変異体群 (hypocotyl6-7, root hairless1-3, and brassinosteroid insensitive 3-5) の解析を通して、植物の核内倍加の正常な進行にはDNA トポイソメラーゼ VI複合体の働きが重要であることを明らかにしてきた。この酵素複合体を欠損した変異体では細胞分裂を終え、核内倍加に移行した細胞だけにATM及びATRに依存したDNA損傷応答が見られる。このことからこれらの酵素複合体は核内倍加周期に特異的に働いているものと考えられる。さらにこれまで相関関係は指摘されていながらも因果関係のはっきりしていなかった核相と細胞体積の関係について、私達は野生型や上記変異体の4倍体を作製し、核相が増加することが細胞体積の増大を誘導することを示した。今回のシンポジウムでは上記の結果を含めた最近の知見をもとに植物の核内倍加と細胞サイズ制御の分子機構について議論したい。

抄録全体を表示

26Sプロテアソームは数十のサブユニットからなる巨大なプロテアーゼであり，生体内の不要となったタンパク質を能動的に分解することによって，様々な生命現象の制御に機能している。26Sプロテアソームを構成する数十のサブユニットタンパク質は，単なる複合体の構造要素として機能するだけでなく，個別の機能をあわせもっている。 本講演では，シロイヌナズナ26SプロテアソームのRPTタンパク質群に着目し，細胞サイズや器官サイズ制御の観点から話題提供する。
シロイヌナズナRPTタンパク質群はRPT1から6まで存在し，RPT3以外は重複がみられる。これらについて逆遺伝学的解析を行った結果，AtRPT2a欠損変異体およびAtRPT5a欠損変異体のみが，顕著な器官の巨大化を示した。こうした巨大化は，細胞質分裂を伴わないDNA複製であるエンドリデュプリケーションの過剰促進によって核内DNA量が増大したことに起因していた。現在，この原因について遺伝学的および生化学的解析を行っている。研究成果をもとに，プロテアソームが関与する植物の細胞・葉サイズの決定機構について議論したい。

抄録全体を表示

細胞周期は、様々な内的・外的シグナルを細胞分裂と分化の協調的制御に変換する器官形成の制御基盤の一つと言える。したがって、その中心的な制御因子であるサイクリン依存性キナーゼ(CDK)の活性は植物の成長過程において厳密に調節されている。我々は、植物組織におけるCDK活性のレベル制御が細胞の分化状態を決める上で重要な役割をもつことを明らかにしてきた。同様な知見は、CDKの代表的な基質であるRbタンパク質の発現抑制（または過剰発現）の実験からも示唆されている。植物の細胞周期を直接制御するCDKは、酵母のCdc2/Cdc28pのオルソログであるCDKAと、植物特異的な因子であるCDKBの二種類に分類される。シロイヌナズナのCDKB2の遺伝子発現はG2～M期に限定されており、分裂細胞でのみ転写産物が蓄積する。一方で我々は最近、CDKB2タンパク質がDNA損傷ストレスに応答して分解制御を受けることを明らかにした。これは、植物のG2チェックポイントにおいてCDKBの発現抑制機構が働くことを意味している。本シンポジウムでは、その他のCDK活性制御因子も含めて最近の我々の研究成果を報告し、植物の器官形成における細胞周期制御の役割について議論する。

抄録全体を表示

植物が茎頂メリステムから生じた葉原基を急速に成熟させ展開することは、周辺環境の生物との生存競争に競り勝つ上で大変重要である。葉の大きさは葉細胞のサイズと細胞数により制御されている。その中で細胞の大きさは細胞の核相と密接に関わっている。通常、体細胞の核相は2Cであるが、多細胞生物では、一部の組織において細胞分裂を伴わない核相の増加が見られる。この核相の増加はエンドリデュプリケーションによって引き起こされる。最近、我々はシロイヌナズナの転写コアクチベーター, AtMBF1 の機能を探索するための実験として、機能重複した複数のAtMBF1 タンパク質の機能をドミナントネガティブに抑制した表現型を観察するために、AtMBF1 に強力な転写抑制ドメインとして知られる SRDX を連結した融合タンパク質, AtMBF1-SRDX を過剰発現する遺伝子組換えシロイヌナズナを作製し、その表現型を観察した。すると、その本葉は極端に矮小化し、表皮細胞が小さくなった。また、核相の変化との関連を調べるために、核相分析装置を用いて野生型と AtMBF1-SRDX 過剰発現体(OE)の核相を比較した。その結果、野生型の核相では4Cをメジャーピークとして、8Cのピークまで観察されるのに対し、AtMBF1-SRDX OE では2Cがメジャーピークとなっていた。このことから、AtMBF1-SRDX OEの本葉の矮小化は核相の減少、つまりエンドリデュプリケーションの抑制により引き起こされたことが強く示唆された。

抄録全体を表示

シロイヌナズナの器官は、様々な核相を持つ細胞から構成される。細胞の大きさは、しばしば核相と相関があることから、エンドリデュプリケーションが植物の形作りに重要な役割を担っていることが考えられる。
我々は、エンドリデュプリケーションを制御する分子機構を明らかにするために、遺伝学的な手法による解析を進めている。これまでに、アクチベーションタギングラインから、核相が増大した優性変異株を多数単離した。このうちilp1-1Dと名付けた変異株では核相の増大とともに、細胞サイズの増大とそれに伴う器官の大型化も観察された。ILP1タンパク質はホ乳類などでも保存されている転写抑制因子であり、サイクリンA2を転写レベルで制御することで核相の増大を引き起こすことがわかった。
我々は更なる分子機構の解明を目指し、完全長cDNAが過剰発現した変異集団であるFOX-huntingラインからも同様の優性変異株の単離を試みている。単離した変異株の一つでは、ミトコンドリアのタンパク輸送装置であるTIM50をコードする遺伝子が過剰発現していることがわかった。ショウジョウバエでは、この遺伝子の機能欠損により個体サイズが小さくなることが知られている。このことから、栄養状態に依存した核相の制御機構の存在を想定し解析を行っている。
本報告では、これまでに解析した変異株の紹介とエンドリデュプリケーションの制御機構について議論したい。

抄録全体を表示

細胞質雄性不稔（Cytoplasmic Male Sterility：CMS）は、ミトコンドリア遺伝子にコードされている遺伝子が原因となり、機能のある花粉が形成されず、母性遺伝する形質である。CMSは核遺伝子にコードされている稔性回復（Rf）遺伝子によって稔性を回復することが知られている。CMSとその花粉稔性の回復は、核ゲノムとミトコンドリアゲノムの遺伝子発現の相互作用のモデルとして古くから注目されていた。近年、種々の作物での（Rf）遺伝子の同定の報告が続いており、その多くがPentatricopeptide Repeat (PPR) モチーフをもつタンパク質をコードする事が明らになってきた。PPRタンパク質をコードする（Rf）遺伝子は、ミトコンドリア遺伝子にコードされたCMSに関与する遺伝子の発現を転写後に作用し、プロセシングパターンや翻訳産物の蓄積量を大きく変化させることにより花粉稔性を回復されているようである。本シンポジウムでは、我々がこれまで解析してきたダイコンCMSとその（Rf）遺伝子の作用メカニズムを紹介しながら、高等植物に非常に多く同定されているPPRタンパク質ファミリーの機能について考察したい。

抄録全体を表示

花粉形成に関与するPPR遺伝子として、BT型細胞質雄性不稔性（BT-CMS）イネに対する稔性回復遺伝子Rf1を取り上げる。Rf1はミトコンドリア移行シグナルと18繰り返しのPPRモチーフをもつタンパク質をコードしている。また、BT-CMS系統ではatp6-orf79 が共転写され、ORF79タンパク質がミトコンドリアに蓄積する。一方、Rf1タンパク質が存在すると、共転写された後にatp6とorf79の遺伝子間領域において切断反応を受けることでorf79 RNAを生じるが、ORF79タンパク質はミトコンドリアに蓄積しない。このように、異常なORF79タンパク質のミトコンドリアへの蓄積がBT-CMSの原因であると考えられている。しかし、Rf1タンパク質がatp6-orf79 RNAに結合するか、また、ORF79の翻訳がどのように制御されているかについての解析はなされてこなかった。本研究では、atp6-orf79 RNAのプロセッシングと、その後のORF79の翻訳制御についての解析を行い、ORF79の翻訳がRNAの安定性によって制御されていることを見いだした。さらに、その他の細胞質に由来するCMSイネとBT-CMSとの比較から、BT-CMS以外のCMSに対するRf1の作用についても紹介したい。

抄録全体を表示

高等植物のイソプレノイド生合成は、細胞質の酢酸-メバロン酸経路に加えて、プラスチドに存在する非酢酸メバロン酸経路があり、両者には代謝産物レベル、シグナル伝達レベルのクロストークがあると考えられている。私たちは、植物固有のイソプレノイド生産制御機構を調べるために、酢酸-メバロン酸経路の鍵酵素であるHMG-CoAレダクターゼの阻害剤に耐性な変異体をスクリーニングした。変異体の一つloi1の原因遺伝子LOI1は、ミトコンドリアに局在する新規なPPRモチーフを有するタンパク質をコードした(Kobayashi et al. (2007) Plant Cell Physiol 48: 322-331)。PPRタンパク質は、オルガネラに局在しRNAプロセッシング、転写後調節等の機能を有することが報告されているがPPRタンパク質のターゲットRNAが同定された例は極めて少ない。LOI1のターゲットRNAを同定するために、SELEX法およびシロイヌナズナ植物においてLOI1タンパク質と結合するRNAをスクリーニングした。その結果、ミトコンドリアゲノムに存在する呼吸鎖複合体の構成ユニットの一つであるシトクロームCオキシダーゼ遺伝子の転写産物が、LOI1のターゲットであることが判明した。本シンポジウムでは、呼吸鎖電子伝達系がイソプレノイド生合成に及ぼす影響について議論する。

抄録全体を表示

短日植物アサガオ（品種ムラサキ）の光周性花成誘導暗期の後半に特異的に発現する遺伝子として単離したPnC401とそのシロイヌナズナにおけるホモログであるAtC401は、暗期誘導型のサーカディアン発現変動を示す。PnC401とAtC401は共に、35アミノ酸の12回の繰り返し配列から成るPPR motif (pentatricopeptide repeat)を持ち、細胞内局在シグナルを持たないがGFP融合タンパク質は核局在を示し、新規のPPR遺伝子ファミリーに属する。AtC401はPPR motifを介してCONSTANS(CO)と相互作用を示すことがYeast two-hybrid法によって示された。そこで、AtC401 cDNAのCaMV35Sプロモーターを用いた過剰発現体 (35S::AtC401)、及びAtC401突然変異体 (atc401-1)と、35S::CO及びco-1との二重変異体の花成時期調査を行った。35S::AtC401では花成時期に大きな影響を与えないが、atC401-1 変異体は弱い花成遅延を示した。また、35S::COは早期花成を示すが、35S::CO/35S::AtC401及び35S::CO/atc401-1は共に野生型より花成遅延を示した。これらの結果より、AtC401がCOと相互作用することにより、花成誘導の調節因子として機能する可能性が示された。

抄録全体を表示

RNA編集はセントラルドグマを逸脱し、遺伝情報をRNA上で書き換えるものである。高等植物ではプラスチドとミトコンドリアにおいてCからUへの置換が頻繁に見られる。編集を受けるC残基は正確に認識されるが、その過程には編集部位周辺の配列（シス因子）が関わることが知られている。シス因子の間には本質的に保存配列がなく、それぞれの編集部位は独立のトランス因子により認識されることが示唆さていた。高等植物には、プラスチドとミトコンドリアを合わせると500程度のRNA編集部位が存在する。いかなるメカニズムでそれらが独立に認識されるのであろうか？我々は、光合成電子伝達に異常を示すシロイヌナズナ突然変異株の解析から、少なくとも葉緑体の一部のRNA編集においてPPRタンパク質がトランス因子の実体であることを明らかにした。本シンポジウムの主役であるPPRファミリーは、高等植物で500近いメンバーからなる巨大なものである。高等植物におけるRNA編集部位の増加は、PPRファミリーの巨大化と関係していそうである。PPRファミリーのメンバーは、RNA編集以外にも様々なRNA成熟化過程に関わっている。一部のメンバーがいかにRNA編集に関わることになったのか考察したい。

抄録全体を表示

PPRタンパク質は植物のみで約500個の大きなファミリーを形成しているのが大きな特徴である。PPRタンパク質は、それぞれが異なるオルガネラ遺伝子の転写物に結合し、RNAプロセシングの様々な段階（切断、スプライシング、編集、翻訳）を制御する遺伝子特異的な発現調節因子であることが徐々に明らかになってきた。PPRタンパク質は35アミノ酸から成るPPRモチーフの複数個の繰り返しで構成されている。PPRモチーフは配列特異的なRNAの結合に働くが、様々なプロセシングを触媒する活性を持たない。ほとんどのPPRタンパク質はPPRモチーフのみで構成されているため、RNAプロセシングの反応を行うには、他の触媒因子が必要である。一方、いくつかのPPRタンパク質にはPPRモチーフ以外に付加的なドメインが存在する。そのうち、DYWサブグループに属するPPRタンパク質はPPRモチーフ以外にC末端側にDYWモチーフをもつ。今回、我々は葉緑体 ndhBの5’末端形成（切断）に必要なシロイヌナズナCRR2に着目し、DYWモチーフの分子機能を解析した。その結果、DYWモチーフがRNA切断酵素として働くことを明らかにした。さらに、CRR2に含まれるPPRモチーフとDYWモチーフがどのように協同して、 ndhBの5’末端形成に働くのかを紹介する。

抄録全体を表示

Pentatricopeptide repeat (PPR) タンパク質は、35アミノ酸保存配列を繰り返し持つタンパク質で、動物、菌類、藻類、植物に広く存在するが、原核生物には存在しないのが一般である。とりわけ陸上植物は巨大なPPRタンパク質ファミリーを持ち、ヒメツリガネゴケ（コケ植物）は102個、シロイヌナズナとイネは450個余りのPPR遺伝子がそれぞれ存在する。これに対して、藻類（クラミドモナス、原始紅藻類）は10個程度のPPR遺伝子しか持たない。このことは、PPR遺伝子が植物の陸上化によってその数を飛躍的に増大させたことが推察される。植物におけるPPR遺伝子の進化と多様性を明らかにするため、ヒメツリガネゴケとシロイヌナズナのPPR遺伝子の構造について比較検討した。その結果、大きな特徴として（1）シロイヌナズナPPR遺伝子の1割がイントロンを持つのに対して、ヒメツリガネ遺伝子の8割がイントロンをもつ、（2）ヒメツリガネゴケ遺伝子のおよそ半分はシロイヌナズナにオルソログが存在する、（3）ヒメツリガネゴケPPR遺伝子にはDYWモチーフをコードするものがあるが、EモチーフとE+モチーフをコードするものが存在しないことが判明した。陸上植物におけるPPR遺伝子ファミリーの拡大のメカニズム、および植物体制の複雑化とPPRタンパク質の多様性について考察したい。

抄録全体を表示

迅速で効率的な有用形質の探索のために私達は、FOXハンティング法（完全長cDNA高発現遺伝子探索法）を開発している。この方法においては、機能性を持ったmRNAやタンパク質を産生することができる完全長cDNAをもちいることで、効率的に機能付加系統の作出を行うことができる。私達は、インプランタ法による高効率な形質転換と世代時間の短さからシロイヌナズナを宿主として用いている。私達は、13000種類のイネ遺伝子を用いて20,000系統のイネFOXシロイヌナズナ系統を作出した。これらのイネFOXシロイヌナズナ系統は、種々の範疇、形態、光合成能、紫外線、元素組成、ホルモン、一次代謝物および二次代謝物、病害抵抗性、高温や塩耐性により選抜を行った。このような変異体よりイネ遺伝子を回収し、イネやトマトに導入することでそれらの有用性について調べた。これらの選抜によって得られた情報は、データベースとしてまとめている。この研究は、文部科学省の科学技術振興調整費の支援を得て行われた。

抄録全体を表示

イネには約32,000個の遺伝子が存在すると言われるが、大半は機能未知のままである。多種多様なイネ遺伝子の機能を効率的かつ包括的に解明する手法は、点変異、欠失、内在性や外来性因子の挿入、RNAi等の発現抑制系を利用した遺伝子機能欠損に基づくものが主流で、すでに数々の遺伝子単離に成功している。しかし、約3割のイネ遺伝子が多重遺伝子族として存在することを考慮すると、loss-of-function型アプローチだけでは遺伝子機能欠損がもたらす表現型を検出来ないケースも多数出現すると予想される。その場合、gain-of-function型手法の適用が有望である。イネでは、多数の完全長（FL-）cDNAクローンや高効率遺伝子導入系が活用出来るため、FOX Hunting系の適用が可能である。まず、理研グループが開発した手法に従い、約14000種類の理研イネFL-cDNA群を、イネで任意に過剰発現するためのFOXアグロバクテリウムライブラリーを作製し、イネに導入した。これまでに約12,000系統の独立したFOXイネ系統を作出し、その表現型や導入cDNAの同定や機能解析を進めている。さらに国際科学振興財団（FAIS）由来FL-cDNA群についても、GATEWAY系アグロバクテリウムライブラリーを用いてFAIS-FOXイネ系統を作出中である。これらFOXイネ系統群の解析結果について紹介する。

抄録全体を表示

コムギは、その交雑親和性が高い性質により、倍数性で進化してきたことを特徴とする。倍数体は単なるゲノムの加算ではなく、高次の制御機構がはたらいている。制御システムには、ジェネティックなものとエピジェネティックなものがある。例えば、小麦粉の加工適性に関わる貯蔵タンパク質の成分が倍数体になることによって質的・量的に劇的に変化する。一言でいえば2倍体コムギの粉でパンは焼けない。一方、オオムギの種子にはコムギにはない健康食品としての注目される種々の成分が含まれる。従来の交雑育種法で、オオムギの7対の染色体、それぞれ1対ずつコムギに添加した系統が育成されている。これらのオオムギ染色体を導入したパンコムギの統合オミクス研究により、ゲノム間相互作用により産生される新規機能性物質を同定し、その代謝経路を明らかにして健康食品として応用するプロジェクトをスタートさせた。異質6倍体であるパンコムギにおける発現遺伝子（EST）の大量解析により、予測遺伝子の約90%以上の遺伝子を登載したオリゴDNAマイクロアレイをはじめとする機能ゲノム科学を行う基本ツールを整備した。異種ゲノム間の相互作用により影響をうける種子成分中に含まれるタンパク質、多糖類、フラボノイド類、ステロイド類、ミネラル類などの機能性物質を統合的に解析し、応用へ展開するコムギ研究の現状を紹介する。

抄録全体を表示

To evolve biology from the trial-and-error approach into a deterministic and predictive science, an engineering approach is both helpful and necessary. The Computer Aided Design (CAD) approach comprises of process analysis (systems biology) and systems engineering (synthetic biology). The key challenge in synthetic biology is to make complex biological systems that are programmable, predictable and stable. In my talk I will begin by describing classic engineering driven design and manufacture approach. I will then move on to computational systems biology approach and explain key concepts there. I intend to spend most of my time on synthetic biology and link all three sciences that, in future, would help us design pathways, networks and by extension, organisms with precision. I will present examples to argue that CAD biology is rational approach. It is indispensable, intuitive and makes use of standard biochemical and physical principles.

抄録全体を表示

Steviol is biosynthesized from ent-kaurenoic acid, a common precursor of gibberellins (GAs), and serves as the aglycon of steviol glycosides, a class of diterpenoid natural sweeteners produced by Stevia rebaudiana and Rubus suauissimus. We have recently identified a cytochrome P450 monooxygenase that catalyzes the formation of steviol from ent-kaurenoic acid in Arabidopsis. To examine whether steviol-glucosides can be produced in Arabidopsis, we introduced the Stevia glycosyltransferase gene, UGT85C2, into Arabidopsis plants that overexpress steviol synthase gene. In vitro assay suggested that crude extracts from the double-overexpressor plants were able to produce rubusoside, a sweet steviol-glycoside, from steviol, while this enzyme activity was undetectable in extracts from wild-type plants. Our results indicate the capability of Arabidopsis plants to produce a non-sugar sweetener by modifying the GA biosynthesis pathway via the introduction of a heterologous gene. We also investigated how the engineered steviol-glucoside pathway affects endogenous GA profiles.

抄録全体を表示

サリチル酸（SA）の機能的アナログであるベンゾチアジアゾール（BTH）は、植物活性化剤としてSAシグナル伝達経路に作用し、多種の病害への抵抗性を植物に誘導する。本研究では、イネにおけるBTHの作用を解析した結果、重要な役割を果たすBTH誘導性転写因子WRKY45を同定した。WRKY45抑制（WRKY45-kd）イネではBTH処理によるいもち病抵抗性誘導が失われ、WRKY45 過剰発現イネは非常に強いいもち病抵抗性を示した。このことから、WRKY45はBTHの作用に中心的な役割を果たしていると考えられた。WRKY45-kdイネを用いた解析により、WRKY45は約300種の遺伝子を制御していることがわかった。またイネSAシグナル伝達は、NPR1が主要な役割を果たすシロイヌナズナの場合とはかなり異なり、WRKY45がイネ固有の役割を担っていることがわかった。WRKY45過剰発現イネでは抵抗性反応が恒常的に発現していないため、生育阻害が比較的少ない。また、病原体感染時には、SAシグナル伝達と同時に活性化されるもう一つのシグナル伝達がWRKY45下流の抵抗性発現に重要な意味をもつことが示唆された。WRKY45過剰発現イネのいもち病抵抗性の程度は非常に強く、細菌病の白葉枯病にも強い抵抗性を示す。これらのことからWRKY45の実用利用も期待される。

抄録全体を表示

光合成速度の測定には、二酸化炭素の吸収速度を測定する方法、あるいは酸素の発生を測定する方法などが古くから用いられてきた。近年になって、パルス変調を用いたクロロフィル蛍光測定により、光合成速度や収率を見積もる方法が開発された。この方法は、光合成の電子伝達速度、光化学系IIの最大量子収率、エネルギーの熱放散の効率などを簡便に見積もることができるため、急速に使用例が増えている。また、植物体の葉をそのまま非破壊的に測定できること、海水中のプランクトンの光合成活性をそのまま測定できることなどから、野外での応用例も増え、光合成のさまざまな側面の指標となるパラメータが提案されている。一方、測定自体は「ボタンを押すだけ」に近く簡単であるにもかかわらず、その原理は十分に理解されているとは言えず、測定はしてみたもののデータの解釈がわからない、などという声も少なくない。また、高等植物と藻類では、異なる測定方法および異なるデータの解釈が必要である、といった問題点も存在する。そこで、本講演では、クロロフィル蛍光測定方法について、パルス変調の仕組みからその原理を平易に解説し、基本的な測定方法とその問題点について紹介する。

抄録全体を表示

単細胞の緑藻クラミドモナス（Chlamydomonas reinhardtii）は高等植物と同様の光合成反応を行い、遺伝学的や生化学的解析が可能であることから、光合成研究のモデル生物として使われてきた。とくに酢酸塩存在下で従属栄養的に生育するため、数多くの光合成変異株が単離され、光合成装置の構造と機能の解明に大きく寄与してきた。近年では葉緑体と核の形質転換が可能となり、光合成変異株のスクリーニングに、コロニーの蛍光収率の変化、例えば蛍光収率の高低や、蛍光収率の時間変化（蛍光誘導機現象）が有効に使われている。特に後者を測定することにより、電子伝達系に変異が生じた部位をより詳細に推定もしくは特定することが出来るようになり、変異株のスクリーニング効率が改善された。ここではクラミドモナス野生株の蛍光誘導機現象の測定例を紹介し、高等植物の場合との違いなどを議論したい。さらに、様々な光合成変異株や形質転換株の測定結果を紹介し、光合成電子伝達系の特定の部位が完全にもしくは部分的に機能が損なわれると蛍光誘導機現象にどのような影響を与えるかについて紹介する。

抄録全体を表示

植物の光合成活性の指標としてPAMクロロフィル蛍光計を用いたquenching analysisで汎用されるパラメータは、Fv/Fm, (Fm’-F)/Fm’, PQ, NPQ等である。これらの測定で、PSIIの光阻害、PSIIのdown regulation、P680周辺の電子伝達活性を推定できる。今回は、蛍光パラメータFv/Fmおよび ∆F/Fm’の異常の原因となる因子について考察する。
Fv/Fm値は、P680の近傍または酸化側の異常により低下する。また、光阻害の誘発および回復過程の異常も低下の原因となる。さらに、電子伝達または炭酸固定等に異常がある場合に、酸化的ストレス条件下では、光阻害が起こるため、Fv/Fm値が低下する。
(Fm’-F)/Fm’値はPSIIの量子収率を示し、この値の低下は、photochemical quenching (PQ)またはnon-photochemical quenching (NPQ)の低下による。PQの低下はPSIIの還元側の電子伝達または炭酸固定系の異常により引き起こされる。一方、NPQの低下は、xanthophyll cycleに依存したPSIIのdown regulation機構の異常、ステートトランジション機構の異常等に起因する。
2次元蛍光計を用いたスクリーニングにより単離されたシロイヌナズナ光合成変異株の解析例についても発表する。

抄録全体を表示

光は植物の行う光合成に必須である一方、過剰に与えれば有害なものとなる。そこで、強光条件下の植物では、チラコイト膜内外にプロトン濃度勾配が形成されることに端を発し、集光アンテナによって集めたエネルギーを熱として系外へ排出する仕組みが誘導される。この仕組みは、q_Eクエンチング（高エネルギー状態依存の蛍光消光）と呼ばれ、「暗条件下の最大蛍光収率(Fm)と励起光下の最大蛍光収率(Fm’)の差」として容易に観察することができる。通常、高等植物におけるNPQ(non-photochemical quenching)の大部分はこの仕組みによるものとされるため、q_EクエンチングとNPQはしばしば同義のものとして扱われる。しかし、植物の種類によってはq_Eクエンチング以外のNPQ成分が主要である場合があるので気をつけなければならない。本講演では、NPQの形態の一つとしてステート遷移をとりあげ、緑藻等の植物プランクトンにおけるNPQの特徴と測定について紹介する。

抄録全体を表示

陸上植物の生理生態学におけるPAM蛍光計による蛍光解析例を紹介する。

植物は過剰な光エネルギーを熱として散逸している。通常の生理学的条件にある葉でも、日中は吸収した光エネルギーのかなりが熱として散逸される。熱による散逸はNPQ = (Fm －Fm’)/Fm’ として測定することができる。光照射によっておこるチラコイド膜内腔のpHの低下がzeaxanthinの形成やPsbSのプロトン化を引き起こし、これらがNPQを大きくする。越冬時の常緑樹には弱光下でも熱散逸の大きいものがあり、D1の修飾やELIPの関与が示唆されている。

ストレス条件下では植物は慢性的な光阻害を受けていることが多い。慢性的な光阻害は、阻害に修復が追いつかない状態として理解できる。この度合いは、サンプル葉を、エネルギー依存クエンチングやステート変化によるクエンチングが消失するのに十分で最短時間暗黒下におきFv/Fmを測定することによって判断する。系II修復の阻害剤存在下でおこる光阻害の度合いは、Excess（閉じた系II反応中心に到達するエネルギー）によってよく説明できるのに対し、光阻害は酸素発生系のマンガンクラスターの阻害であり、光強度にのみ依存することを示唆する研究もある。マンガンクラスターがほとんど吸収しない赤色光を使った生理学的研究を進めているので、その結果を紹介したい。蛍光パラメータの相互関係にも言及したい。

抄録全体を表示

2000年にシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の全ゲノム配列が発表されて既に7年が経とうとしている。その間、2004年にイネの全ゲノム配列も公開されるに至った。このような状況のもとモデル植物のゲノム情報を利用した作物研究の新たな展開が始まろうとしている。その中で我々はハクサイ（Brassica rapa）を用いて、病傷害応答に着目したESTと完全長cDNAの整備、及びシロイヌナズナ遺伝子との対応付けを推進している。また、これらの成果を公開するためのデータベースABRANA（Arabidopsis and BRAssica Network Access）の整備も進めている。現在、ハクサイゲノムプロジェクトが欧米韓を中心に進んでおり、近い将来、アブラナ科作物、特にハクサイを取りまく研究状況は急変することが予想される。シロイヌナズナと同じアブラナ科に属するハクサイではシロイヌナズナに感染する多くの病原菌が同じく感染する。また、病傷害応答性のメカニズムの共通性も高いことが考えられ、シロイヌナズナで得られた知見の応用に適した作物モデルとなりうる。本シンポジウムにおいては、我々が進めているハクサイcDNAの整備の状況に加えて、Brassica研究の国際コンソーシアムの現状、及び、今後のハクサイ研究の課題についても言及したい。

抄録全体を表示

根こぶ病は、完全寄生真核生物Plasmodiophora brassicaeによって引き起こされるアブラナ科野菜の土壌伝染病害である。感染した植物の根はこぶ状に肥大し養水分吸収が悪くなるために、地上部の生育が著しく悪化し最終的には枯死する。ハクサイでは、ヨーロッパの飼料用カブを抵抗性素材とした交雑育種により抵抗性品種が多数育成されているが、根こぶ病病原体の病原性の分化により抵抗性品種の発病が報告され問題となっている。これまでの抵抗性品種の育成には、労力と時間を要する接種検定による抵抗性個体の選抜が必要であった。そこで我々はDNAマーカーを利用した効率的な抵抗性品種系統の選抜技術について検討し、2つの根こぶ病抵抗性遺伝子座（Crr1, Crr2）に連鎖するDNAマーカーを開発した。これらのDNAマーカーを利用することにより、戻し交雑集団から強度抵抗性の系統を選抜できることを明らかにした。マーカー選抜の効果をさらに高めるためには、抵抗性遺伝子のより近傍に位置するマーカーが必要である。Crr1, Crr2はハクサイの連鎖地図上では異なる連鎖群に位置するが、これらに連鎖するDNAマーカーはいずれもシロイヌナズナ第4染色体の一部の領域と高い相同性を示した。そこでシロイヌナズナのゲノム情報を利用して、効率的に近傍に位置する複数のDNAマーカーを開発した。

抄録全体を表示

モデル実験植物で得られた有用知見の作物への応用展開を進める上で、シロイヌナズナと同じアブラナ科に属するハクサイは重要な対象作物である。当研究グループでは、ハクサイの遺伝子ライブラリーを作製して遺伝子資源の確保とその利用技術の開発を試みている。まず、ハクサイESTライブラリーおよび完全長cDNAライブラリーを作製し、ハクサイマイクロアレイを構築した。これまでにシロイヌナズナ完全長cDNAマイクロアレイを用いて病害および環境ストレス下におけるトランスクリプトーム解析を遂行し、比較ゲノム解析の基盤となるデータを蓄積している。そこで、シロイヌナズナおよびハクサイマイクロアレイを用いて病原糸状菌アブラナ科野菜類炭そ病菌の感染に対する宿主遺伝子の発現変動を解析した。得られた発現プロファイルを解析した結果、本菌の攻撃に対するシロイヌナズナおよびハクサイの初期防御応答にはサリチル酸シグナル伝達経路の活性化が重要であることが推察された。本結果をもとに、あらかじめハクサイにサリチル酸経路を活性化する薬剤を処理しておくと、その後の炭そ病菌の感染を防ぐことができた。本発表では、シロイヌナズナ-ハクサイ間のゲノム情報の比較・利用による植物免疫学研究の今後の展開について報告する。

抄録全体を表示

シロイヌナズナのゲノム情報と病害応答機構に関する研究の進展により、様々な病害応答関連遺伝子の性状が明らかになり、それらの有効活用が期待される状況となってきた。特に病害応答性遺伝子の発現パターンと、それらの発現制御配列に関する情報が利用可能となったことから、防御応答関連遺伝子プロモーターとレポーター遺伝子との融合遺伝子を迅速に作成し、利用することができる状況にある。私たちはシロイヌナズナのゲノム情報を利用した物質探索に関する技術開発を試み、植物の病害防除に有効な植物活性化剤（抵抗性誘導剤）の研究開発に有用であることを見出している。特に、ホタルルシフェラーゼ等の発光レポーターを導入した形質転換シロイヌナズナによるマルチウェルプレート（6～384穴）を用いたアッセイ系は、化合物ライブラリー由来の対象物質の所要量も少なく、市販の化合物ライブラリー等で極微量の試薬を扱う必要がある場合のハイスループットスクリーニング系としては理想的なシステムであることなどを明らかにした。今回は、化合物ライブラリースクリーニングの実例を紹介し、それらの問題点と今後の発光レポーター系の技術改良の方向性等について議論する。

抄録全体を表示

トマトは基礎研究、応用研究の両面において重要な植物種であり、2007年度から文部科学省ナショナルバイオリソースプロジェクト(NBRP)に採択された。NBRPは、生命科学研究の材料として広く国民的に認知された生物資源の収集・保存・配布を行う中核リソース機関を整備することを目的とする。トマトNBRPでは、筑波大学が中核機関となり実験用の矮性トマトであるマイクロトムの変異誘発系統と変異体、形質転換体及び実験用トマト系統を、かずさDNA研究所がサブ機関となって完全長cDNA及びプロモーターDNAの収集・保存・提供を行う。筑波大学では1万系統以上の変異誘発系統を作出し、かずさDNA研究所では28万クローンの完全長cDNAを収集している。トマトNBRPではこれらのリソースを体系的に利用できるシステムを構築する。トマトNBRPは日本及び世界の植物科学に貢献できる基盤作りを推進する。

抄録全体を表示

我々はモデル作物トマトMicro-Tomを用いて塩ストレスシグナルを利用した果実の甘味改良法の開発を進めている．近年, 乾燥・塩ストレス・ABAに応答して活性化する植物特有のストレス応答性キナーゼが発見された．これは出芽酵母のグルコース代謝調節に関与しているSNF1遺伝子の植物ホモログであり，SNF1関連キナーゼ(SnRK)と呼ばれる．植物SnRKファミリーは栄養代謝に関与するSnRK1と乾燥・塩ストレス・ABA応答に関与するSnRK2およびカルシニューリンB様分子結合キナーゼ(SnRK3/CIPK)の3種類のサブファミリーに分類される．我々は塩ストレスに応答した果実の糖代謝制御に関わる候補シグナル分子としてSnRK2およびCIPKに着目した．そこでトマトESTデータベース(MiBASE)からSnRK2とCIPKの遺伝子情報を抽出し，それらの機能解析に着手した．特異性の高い抗SnRK2抗体と抗CIPK抗体を作製し,トマトの各器官におけるSnRKsの分布をイムノブロットにより解析した．また一過性タンパク質発現実験系によりSnRKsの環境ストレスに応答した活性変動を解析した．
トマトSnRK2ホモログSlSnRK2Cは若い成長期の果実においてタンパク質レベルが顕著に増大した． 塩ストレスに応答した果実の糖度向上メカニズムと果実特異的SnRKsの関係について議論する予定である．

抄録全体を表示

トマトはGABAを最も多く蓄積する野菜の一つである。トマト果実においてGABAは緑熟期に高蓄積し、赤熟期に入ると急速に代謝される。我々はこれまでに赤熟期にGABAが代謝されない変異体DG03-9品種の獲得に成功している。本研究は、トマトにおけるGABA生合成および代謝の鍵酵素を明らかにすることを目的に、モデル品種であるMicro-TomとDG03-9の果実におけるGABA生合成および代謝関連酵素の遺伝子発現、タンパク質量および酵素活性を測定し品種間での比較を行った。その結果、‘果実中のGABA含量の減少’と‘α-ケトグルタル酸依存型GABA分解酵素（GABA-TK）の活性の上昇’に強い相関関係があることがわかった。植物においてGABA-TKの活性はピルビン酸依存型GABA分解酵素（GABA-TP）の活性よりも低いと考えられているが、トマト果実においてはGABA-TK活性がGABA-TP活性の500倍以上高いことが明らかとなった。GABA生合成酵素（GAD）の活性はMicro-Tom果実においては緑熟期に最大に達し赤熟期に低下するが、DG03-9においてはGADの活性は赤熟期に入っても低下しないことがあきらかとなった。これらの結果からGADとGABA-TKがトマト果実におけるGABA生合成および代謝の鍵酵素であることが推察された。

抄録全体を表示

トマトはナス科植物のモデルとして注目され、ゲノム配列、完全長cDNA配列、EST配列、DNAマーカーをはじめとしたゲノム情報に加え、突然変異系統群、染色体置換系統群、野生種等の遺伝資源といった研究リソースの整備が急速にすすめられている。これらの情報やリソースは、ナス科植物の基盤的研究に役立つだけでなく、品種改良や栽培法の開発など応用研究にも活用できると考えられる。
我々は、機能性成分を高含有するトマトの育成を目標に品種改良を行っている。標的の一つがトマトの果皮に特異的に多く認められるフラボノイド類の一種ナリンゲニンカルコンである。野生種には、同じくフラボノイド類のアントシアニンを果皮と果肉に含むものがある。そこで、野生種がもつアントシアニン蓄積遺伝子座（Anthocyanin fruit, Aft）に連鎖したDNAマーカーの開発を行った。Aft遺伝子座をもつ系統「LA1996」と「Micro-Tom」のF₂集団を作出し、アントシアニン蓄積に関わる遺伝子や公開DNAマーカー、Conserved Ortholog Set II (COSII)を利用して解析を行った。その結果、Aft遺伝子座と強く連鎖したDNAマーカーを見出した。このようにして、トマトのゲノム情報やゲノミクスリソースは、応用場面にも役立つと期待される。

抄録全体を表示

イネ種子貯蔵タンパク質はグルテリンとプロラミンを主成分としている。グルテリンは小胞体サブドメインであるCisternal ERで生合成後、ゴルジ体での修飾を経てタンパク質貯蔵型液胞に輸送され、そこで成熟型グルテリンとなり蓄積される。一方、プロラミンは別の小胞体サブドメイン、PB-ERで生合成されそのまま小胞体内腔に蓄積する。イネはこのような経路により貯蔵タンパク質を異なる細胞小器官に蓄積している。私達のグループは、両タンパク質の蓄積部位の選別には、RNAの異なる小胞体サブドメインへの特異的局在が関与していること、またRNAの特異的な局在にはRNA上のシス制御領域が重要であることを示してきた。さらにRNAの小胞体サブドメインへの局在を人為的に改変し、そのタンパク質の蓄積部位を変化させることに成功した。 形質転換イネ種子内でトウモロコシゼインRNAはPB-ERに局在し、タンパク質は小胞体内腔に蓄積する。このRNAを人為的にCisternal ER に局在させた結果、そのタンパク質は貯蔵型液胞に輸送され蓄積していた。逆に、ヒマワリ2SアルブミンRNAはCisternal ERに局在し、タンパク質は貯蔵型液胞に輸送、蓄積されるが、このRNAをPB-ERに局在させた結果、そのタンパク質は小胞体内腔に蓄積していた。これらのことから、種子貯蔵タンパク質の細胞内局在には、RNAの特定小胞体サブドメインへの選択的局在が深く関与していることが示唆された。

抄録全体を表示

イネ種子貯蔵蛋白質プロラミンは小胞体（ER）に集積し蛋白質顆粒PBIを形成するのに対し，α-グロブリンは液胞由来蛋白質顆粒PBIIへ輸送される．両蛋白質はシステイン残基を含む三つのコンセンサス配列を有し，分子間および分子内ジスルフィド結合形成が蛋白質顆粒への集積・輸送に重要である．新生ポリペプチド鎖のジスルフィド結合は，酵母ではER内腔において酸化還元酵素 protein disulfide isomerase (PDI) および PDI へ酸化力を供給するフラビン酵素 ER oxidoreductase 1 (ERO1) により形成される．本研究ではイネ種子貯蔵蛋白質の分別集積・輸送の分子機構を明らかにすることを目的とし，胚乳細胞におけるERO1 およびPDIの局在および機能解析を行った．基質蛋白質-PDI-ERO1電子伝達系の最終電子受容体は酸素分子であり，結果，過酸化水素が発生することが報告されている．過酸化水素特異的蛍光プローブを用いてイネ胚乳細胞における過酸化水素発生部位を可視化したところ蛍光がrough ERで観察された．PDIは多重遺伝子族を形成し，イネでは19のPDI-like (PDIL)遺伝子が存在する．ここではPDIL1-1およびPDIL2-3についてそれぞれDsRedおよびGFP融合蛋白質を発現する形質転換イネを作出し，胚乳細胞におけるER内局在部位の比較解析を行った．PDIL1-1欠損体およびPDIL2-3のRNAi形質転換体における貯蔵蛋白質集積・輸送挙動の解析結果とあわせて両 PDI の機能分業について議論する．

抄録全体を表示

イネ種子グルテリン及びプロラミンは、小胞体上で生合成された後、小胞体内で分別され、それぞれ異なるプロテインボディ（PB）に輸送・集積される。植物種子貯蔵タンパク質の細胞内輸送・蓄積の遺伝的制御機構の解明のために、MNU受精卵処理によって誘発したイネのグルテリン前駆体を多量に集積する突然変異を解析した。
これらの変異体から、ジスルフィド結合の形成を触媒するタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ(PDI)を欠損する変異（esp2変異）、小胞輸送に関与するsmall GTPase Rab5aに関する変異（glup4変異）、液胞プロセッシング酵素に関する変異（glup3変異）を同定した。遺伝子の上下位性検定の結果、esp2変異遺伝子が他の2遺伝子に対し上位であり、glup4変異遺伝子がglup3変異遺伝子に対し上位であった。esp2変異体では、小胞体由来の変異型PB内でグルテリン前駆体とプロラミンが混在していた。glup4変異体ではグルテリン前駆体を集積する新規構造体が認められた。glup3変異体ではグルテリン前駆体と成熟型グルテリンが貯蔵型液胞（PSV）内に蓄積していた。これらの結果から、グルテリン前駆体の小胞体からPSVへの輸送蓄積経路において、PDIが小胞体内における分別に、Rab5aが小胞体からの輸送に、VPEがPSVにおけるグルテリン前駆体の開裂に寄与することが明らかとなった。

抄録全体を表示

種子貯蔵タンパク質は小胞体で前駆体として合成され，小胞輸送によりタンパク質蓄積型液胞へ運ばれ成熟化して蓄積する．貯蔵タンパク質は大量に合成・輸送されるため，小胞輸送をモニターするよい実験系である．この利点を生かし，我々は貯蔵タンパク質の輸送変異体をシロイヌナズナで単離し遺伝子同定とその解析を行ってきた．maigo (mag) 変異体は電気泳動により貯蔵タンパク質の前駆体を指標に，green fluorescent seed (gfs) 変異体は種子のGFP蛍光強度を指標に変異体のスクリーニングを行ったものである．GFSスクリーニングでは貯蔵タンパク質プロモータの制御下で液胞型GFPを発現する植物体を用いている．いずれのスクリーニングも量的に多いものを指標にしているのが秘訣であり，葉など栄養器官の液胞輸送は検出感度の問題で難しい．現在のところ，貯蔵タンパク質の小胞輸送は，内在性の液胞タンパク質の輸送異常を簡便に検出できる唯一の例と言える．得られた変異体には，貯蔵タンパク質の輸送異常のみならず，栄養器官の形態などにも異常を示すのもが多数得られている．これらの変異体の解析を通して，植物の成長や形態形成における小胞輸送の役割についても調べている．

抄録全体を表示

細胞増殖の過程で、多量の細胞膜タンパク質が細胞膜へ輸送され、分泌性タンパク質や細胞外多糖が分泌される。動物や酵母での解析により、トランスゴルジ網（TGN)で形成された分泌小胞が、これらを輸送することが知られている。しかし、植物細胞中で分泌小胞がどのように輸送されるかは、殆ど解析されていなかった。そこで我々は、このTGN以降の細胞内輸送を、タバコBYー2細胞をモデル細胞とし、また、EST解析で見出された機能と局在未知の膜タンパク質をマーカーとして解析を進めている。今回は、SCAMP2を分泌小胞のマーカ―として解析した結果、分泌に関わる新奇な構造体を見出したので、それについて紹介する。
急速高圧凍結切片の電子顕微鏡観察と抗体染色、蛍光タンパク質標識したSCAMP2の細胞内輸送の解析等から、分泌小胞が、以前に同定されておらず、我々がsecretory vesicle cluster (SVC)と名付けた小胞の集合体として細胞内を移動しているこを見出した。また、SVCのは、増殖中の細胞の細胞膜や、分裂中の細胞の細胞板と融合することも見出した。SVC様構造は、イネの培養細胞、シロイヌナズナの表皮の細胞や、タバコの根端付近の細胞にも見出された。これらの結果から、SVCが、TGNから細胞膜や細胞外に多量の物質を運ぶ、以前に命名されていたオルガネラと異なる、細胞内輸送に携わる新奇構造体であると結論した。

抄録全体を表示

高等植物における小胞輸送と高次機能との関連についての研究が進む一方で、必須遺伝子の場合や機能重複のある遺伝子ファミリーの場合、植物個体レベルでの解析は容易でない側面もある。我々が単離したシロイヌナズナzig変異体は、trans-Golgi network (TGN) - prevacuolar compartment (PVC)/液胞間の小胞輸送に関与するQb-SNARE VTI11の機能欠損変異体であり、地上部の重力屈性及び形態に異常を示す。本研究は、zigを抑圧するサプレッサー変異体zip（zigzag suppressor）の解析を通して、小胞輸送関連因子の分子ネットワークの遺伝学的な関係を解くことを目的としている。
zip3はzigの表現型を部分的に抑圧するAtVPS35bの機能欠損変異体であった。AtVPS35は、酵母Vps35pとの相同性から、AtVPS29, AtVPS26と共にレトロマー複合体の構成因子として、PVC-TGN間の逆行輸送に関与すると考えられている。シロイヌナズナゲノム中にはVps35, 29, 26と相同性を示す遺伝子が3, 1, 2個あると予測されている。AtVPS29の発現量が低下しているmaigo1-1変異と、AtVPS26bのT-DNA挿入変異は、それぞれzig変異を抑圧することがわかった。従って、AtVPS35b, 29, 26bはzig抑圧という共通の機能を持ち、おそらくレトロマー複合体として共に機能している可能性が強く示唆された。また、AtVPS35の3つの相同遺伝子が高次の生理機能において果たす役割の違いとzig変異抑圧のメカニズムについても報告する。

抄録全体を表示

エンドサイトーシスは，かつて植物細胞における小胞輸送経路網の中でも一際研究が立ち遅れていた輸送経路であった．しかしながら，近年の分子遺伝学的解析の目覚ましい成果と，それに続く細胞学的な知見の蓄積により，現在は非常にホットな研究対象へと変貌を遂げている．我々は，このエンドサイトーシス経路の重要性にいち早く注目し，その分子機構と高次機能発現における役割を明らかにするべく研究を行ってきた．その結果，植物が動物とは大きく異なるエンドサイトーシスの制御機構を獲得していることが明らかになりつつある．本シンポジウムにおいては，最近我々が見いだしたRab5を介した互いに拮抗的に機能する2つのエンドサイトーシス制御機構の存在とともに，エンドサイトーシスが関与する植物の多様な生命現象について最新の知見を紹介したい．

抄録全体を表示

ショ糖を含む栄養培地で培養していたタバコ培養細胞(BY-2)をショ糖を欠いた培地に移すと、(1)タンパク質やリン脂質などの細胞の構成成分が正味の分解を受ける、(2)液胞が大きくなり細胞が成長する、といった現象が起こる。これらの現象を解析して、(3)細胞内タンパク質は、最初は、オートファジーと呼ばれる真核細胞に共通の機構によって分解されるが、後に、液胞が関与する別の機構によって分解されること、(4)膜リン脂質の分解にはオートファジーはほとんど寄与していないこと、(5)リボソームはオートファジーによって分解されること、(6)液胞の拡大化と細胞の成長にオートファジーが関与していること、を明らかにした。これらの解析の経過を報告する。

抄録全体を表示