高等植物の根系の発達は、根端メリステム活性の維持と、新たな側根・不定根の形成能に大きく依存している。根端メリステムでは幹細胞の規則的な分裂により、表皮・皮層・内皮・内鞘など各組織からなる同心円状の放射パターンが形成される。一方、根の成熟領域では内鞘細胞の分裂によって新たな側根が形成される。これまでシロイヌナズナを用いた分子遺伝学的研究により、1）根の放射パターン、特に皮層・内皮の形成に、SHR遺伝子の非細胞自律的な働きによるSCR遺伝子の活性化が必要なこと、2）側根形成開始および側根原基形成に正常なオーキシンシグナル伝達が必要なことが明らかとなった。特に2）に関しては、側根形成能に欠損をもつslr（solitary-root）変異体やarf7 arf19変異体などの解析から、オーキシン応答転写因子ARF7、ARF19とそのパートナーとなるAux/IAAタンパク質（SLR/IAA14など）を介した転写制御が側根形成開始に重要なことを明らかにした。そして、側根形成で機能するARFの標的遺伝子として、植物に特有なLBD/ASL ファミリーに属する遺伝子を複数見出した。さらに、slrのサプレッサー変異体の解析から、側根形成にクロマチンリモデリングが関与することが強く示唆された。本講演では、これらの研究によって明らかになりつつある根の発生機構、特にオーキシンを介した側根形成の制御機構について紹介する。

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植物の成長の様々な局面において，分泌型低分子タンパク質やペプチドが，細胞間コミュニケーションの中核を担うケースの報告が相次いでいる．PSKは，このような分泌型ペプチドの初期の例のひとつである．演者らは，硫酸化ペプチドであるPSKが，細胞膜上のLRR型受容体キナーゼ（LRR-RK）であるPSKR1に直接結合し，細胞増殖の促進をはじめとして，細胞レベルにおいて多面的な生理活性を示すことを明らかにしてきた．また，ペプチドミクス解析により同様の硫酸化修飾を受けた分泌型ペプチドとして，PSY1を同定した．興味深いことに，PSY1はPSKと酷似した細胞増殖促進活性を示し，PSKR1のパラログのうち1つがその認識に関わっている．PSKR1ファミリーのLRR-RK遺伝子群をすべて破壊したシロイヌナズナ植物の解析から，これらの分泌型硫酸化ペプチド群がメリステム領域を含めた植物個体における全身的な細胞増殖活性の制御に関与していることが示された．一方，PSK−PSKR1をペプチドリガンド−受容体ペアのモデルとして用いた検討により，LRR-RK群の機能的な固相固定化が可能になりつつある．LRR-RK固定化技術は，受容体アレイの作製や，直接的リガンドフィッシングに応用でき，数多くのリガンド未知LRR-RKのリガンド同定に役立つと期待している．

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アーバスキュラー菌根経由のリン酸吸収に主要な役割を果たす菌根誘導型リン酸トランスポーター遺伝子LjPT3のcDNAをミヤコグサから単離した。LjPT3の発現は菌根菌の樹枝状体を含む皮層細胞に局在していた。遺伝子産物の輸送活性は、高親和性リン酸トランスポーターを欠く酵母突然変異体を相補することによって確かめた。当該トランスポーターの生理的役割をさらに明らかにする目的で、毛状根形質転換によるRNAi法を用いてLjPT3遺伝子ノックダウン植物を作成した。予想通り、ノックダウン形質転換体は菌根経由のリン酸吸収が減少したため、低リン酸培地における生育不良を引き起こした。ただし意外なことに、ノックダウン形質転換体では菌根菌の樹枝状体の数が非常に低下していた。また、ノックダウン形質転換体に菌根菌と同時に根粒菌を接種したところ、根粒が未熟なままネクローシスを引き起こした。このような観察を基にして、宿主植物は常に菌根菌の働きを監視していると推察した。今回の実験では、ノックダウン形質転換体は菌根経由のリン酸吸収量が少ない原因を菌根菌の働きが悪いと誤認識したために、菌根菌排除または菌根形成抑制の応答を示したと思われた。また、根粒菌は菌根菌への宿主応答のあおりを食ったようであった。なお、本論文の骨子はPNAS 104: 1720-1725 (2007); Funct. Plant Biol. 34: 803-810 (2007)で追認された。

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ゲノム上の塩基の位置に対して、生物のさまざまな情報を結びつけることによって、多元的な情報を統合的に、格納、整理、表示することが可能である。これは、Google Map/Earthなどでも利用されている地理情報システム（GIS）と同じ考え方であり、ゲノムにおいてはDAS (Distributed Annotation System)という仕組みが、EnsEMBL, SPICE, Gbrowseなどにより広く利用されている。我々は、ゲノムの位置情報上に文献情報やタンパク質機能アノテーションなどを、蓄積、統合、編集、共有、表示することができる「KazusaAnnotation」システムを開発している。現在このシステムにより、マニュアルキュレーションで文献情報と遺伝子の関連づけを行って、情報を蓄積している。今後、このシステムを公開して、実験研究者からのアノテーションへのフィードバックや、ユーザ同士の集合知の利用、個人の実験メモなどとしても使っていただく予定である。さらに、研究者間のコミュニケーションや知識共有を支援するシステムを開発している。これらのシステムは発見的な仮説デザイン、オミクス実験や個別の生物現象の解析を行う際の情報の統合、分析の助けになると考えている。

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We present a WIKI-based database of flavonoid structures with their biosynthetic pathways. It contains 14,000 flavonoid–plant relationships and 7,000 molecular structures, where each flavonoid is assigned a 12-digit ID based on its core structure (e.g. flavonol, flavane, or anthocyanin) and chemical modifications (e.g. hydroxylation, glycosidation, and prenylation). The database is accessible at http://www.metabolome.jp/software/FlavonoidViewer/.
In this presentation, we emphasize the benefit of WIKI-based system, and why it contributes to the interdisciplinary area such as bioinformatics.

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マイクロアレイ技術の普及に伴い、公共のデータベースには多くの遺伝子発現データが蓄積してきた。共発現する遺伝子間には機能的関連が期待できることから、共発現遺伝子群を用いて実験ターゲットを絞り、遺伝子破壊等で機能同定を行うアプローチが増えつつある。
我々は植物ではシロイヌナズナ（ATTED-II, http://www.atted.bio.titech.ac.jp）、動物ではヒト、マウス、ラット（COXPRESdb, http://coxpresdb.hgc.jp）について遺伝子共発現情報をデータベースとして公開している。基本となるデータは、マイクロアレイによる発現データから計算した2遺伝子間の発現強度だが、それを基にネットワーク表示も行っている。機能的関連を類推できるよう、共発現ネットワークには既知のタンパク質間相互作用、共通代謝経路、保存共発現も表示している。また巨大なネットワークの表示にはGoogle Maps APIを利用し、ネットワークの全体像と細部との切り替えを容易にした。
本演題では、共発現の計算手順、遺伝子機能予測の解析例を紹介すると共に、本共発現データベースのオームデータにおける位置付けについて議論したい。

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植物を含め真核生物では原核生物ほど多くの生物種でゲノムが決定していないが、一方で、ESTデータに基づく発現解析は様々な生物種で活発にされており、データ数も増加している。我々は真核生物のゲノムレベルでのパスウェイ解析を実現するために、ESTデータを利用したゲノムアノテーションとパスウェイ再構築の手段を提供しており、約40種の植物に対しては再構築したパスウェイ情報をKEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) EGENESデータベースとして公開している。EGENESの構築は大きく2段階に分かれる。第1段階ではdbESTに登録されているESTデータを生物種毎に取得、クラスタリング、アセンブリングすることにより、仮想的な遺伝子の集合を作成する。第2段階では各遺伝子の機能アノテーションを自動で行い、そのアノテーションに基づいてパスウェイを構築する。第1段階のプロセスはEGassembler、第2段階のプロセスはKAAS (KEGG Automatic Annotation Server) というウェブのツールとして公開しているので、だれもがESTの配列集合から始めてパスウェイの構築までできるようになっている。発表ではツールと解析例を中心に紹介する。

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オミックスとは、生体のもつあらゆる分子情報を、網羅的に計測して解析する研究領域である。オミックスを一言でいうと、物質世界に存在する生体の姿を、データとして情報世界に写像化することである。オミックスでは、各遺伝子はデータ化され、さらに、それらが作り出す転写産物や蛋白質などの様々な階層のデータも統合されて、遺伝子と機能の網羅的なカタログ情報が作られる。そこから有用な遺伝子だけが情報的に選び出され（経済選択）、遺伝子組み換え技術によって再び物質世界に戻されることで、急速にコピー数を増やす。R.ドーキンスの定義では、進化とは、遺伝子プール内で、ある遺伝子が数を増やし、ある遺伝子が数を減らす現象をいう。オミックスはこの増減を人為的かつ遺伝子単位で加速させる。自然選択は人間が気づかなくても生じる淘汰圧なのに対し、経済選択は人間が経済性を実感することにより生じる淘汰圧である。品種改良など、以前から行われた個体単位での経済選択は、フェノタイプが現物として確認できるため、情報処理は不要であった。これに対し、オミックスは遺伝子単位での経済選択を可能にするものであって、オミックスデータの情報基盤に依存して初めて可能になる。「オミックス進化論」では、オミックスの視点から進化論を捉えなおし、自然選択がはたらく物質世界と、経済選択がはたらく情報世界（データベース）の関係から、未来のデータベースの役割を再考する。

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植物における一酸化窒素（NO）研究の歴史は古く、起源は1774年のプリストリーによる光合成の実験にまでさかのぼることができる。産業革命とその後の工業の発達によって、NOは有害な大気汚染物質（NOx）として認識されるようになった。1980年代にNOを合成する酵素（NOS）が動物で発見され、NOが生体に必須なシグナル分子であることが次第に明らかとなった（1998年ノーベル生理医学賞受賞課題）。動物での発見が刺激となり、90年代後半から植物でもアルギニン依存性NO合成酵素を見出す試みが盛んにおこなわれた。当初、哺乳類型NOSの存在を支持する論文が数多く出されたが、アラビドプシスゲノム配列決定によって哺乳類型NOSの存在は完全に否定されることとなった。2002年には植物iNOS、2004年にはAtNOS1がCellおよびScience誌に発表され、哺乳類とは全く異なるアルギニン依存性NO合成酵素の構造と機能に関心が集まった。ところが、2002年にiNOSが、2007年にはAtNOS1がデータ捏造産物であるとして、発表論文が撤回される科学スキャンダルに発展してしまった。この様な紆余曲折を経て、2007年現在では、硝酸還元酵素（NR）が実証された唯一の植物NO合成酵素として認知されている。これらの研究の歴史を概説しながら、植物NO研究の問題点と今後の展望について議論する。

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一酸化窒素（NO）は生体内で生成されるフリーラジカルの一種である。動物細胞ではNOが生体機能の維持に必須であり、酵素的なNO生成機構として、L-アルギニンを基質としたNO合成酵素（NOS）反応が知られている。動物と同様に、植物でもNOが多彩な生理現象に関与していることが指摘されているが、NOの細胞内発生源および酵素的なNO発生機構については未だ不確定な点が多い。本講演では、硝酸還元酵素（NR）が植物におけるNO生成酵素の一つであることを紹介する。NRは植物の窒素同化系の鍵酵素であり、通常、硝酸（NO₃^-）を亜硝酸（NO₂^-）に還元する反応を触媒している。ところが、単離NR酵素系に本来の反応生成物である亜硝酸（NO₂^-）を加えると急速なNO生成が見られる。このNO生成反応はNR 阻害剤感受性であり、硝酸還元反応と同様にin vivo条件で制御を受けていることが報告されている。我々は、NRがNOだけでなく非常に毒性の高いペルオキシナイトライト（活性窒素種）も生成することを見出した。これらの知見は、植物生産性向上のために古くから研究されてきたNRの全く異なった性質を示すものである。

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植物における NO の普遍的生理機能の解明が進むにつれ，その正負両面の作用を媒介する活性窒素分子種の存在が明らかにされつつある。活性窒素とは Nathan と Shiloh (1998) によれば，生理環境下で生成する無機窒素酸化物のなかで，NO（および NO⁺）からその最も安定な酸化物である硝酸（NO₃^-）に至る酸化還元中間体（NO，NO₂，NO₂^-，N₂O₃など）を指す。また，これらの活性窒素酸化物に由来して副次的に生じる生理的あるいは化学的に活性な化合物も包含され，その例として生体 NO リザーバー／ドナーとして知られる S-ニトロソチオールや，強力な酸化剤かつニトロ化剤であるペルオキシナイトライトなどが挙げられる。活性窒素が有する反応性と分子修飾能は，これらの分子種が NO シグナリングを関与するだけでなく，その生成濃度や細胞の生理条件に応じて普遍的に細胞毒性をもたらすこと（活性窒素ストレス）を示している。したがって，活性酸素と並び生物にとって「諸刃の剣」である活性窒素に対する代謝機能は，おそらく NO シグナリングの制御のみならず，活性窒素ストレスに対する細胞防御の観点からも極めて重要と考えられる。本発表では，植物の活性窒素の代謝基盤に関する最近の知見を紹介するとともに，関連研究の現状と今後の展望について議論したい。

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根粒菌とマメ科植物の相互認識機構については、分子的理解が急速に蓄積した。しかし、共生成立に向けた初期応答と植物の様々な防御応答との関係については、依然として不明のままである。植物の防御応答では、一酸化窒素（NO）や活性酸素種(ROS)がシグナル分子として重要な役割を担っていることが明らかとなってきている。また、植物ヘモグロビン(Hb)は、様々な生理的局面で発生するこれらのシグナル分子との相互作用により、植物の生理応答の調節に関与していると考えられている。
ミヤコグサの根に病原菌を接種すると、NOが持続的に発生するが、class 1 Hb遺伝子(LjHb1)は発現しない。しかし、共生根粒菌を接種した場合には、NO発生は一過的であり、NO発生と同調するようにLjHb1が発現する。根粒菌による防御応答の誘導が、class 1 Hbの働きにより回避されるのかもしれない。共生が成立した根粒内部でも、NOが発生している。NOは、ニトロゲナーゼ活性を阻害することが知られていたが、LjHb1を過剰発現させることにより、根粒の窒素固定活性を2倍程度向上させることが可能であった。植物Hbは、植物の能力を十分に引き出すために活用可能な新しい遺伝子素材として注目しているが、その機能を充分に理解するためには、信頼性の高い簡便なNO定量法の開発が必要である。

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一酸化窒素 (NO) は生理的および病理的な諸過程を制御する細胞内・細胞間情報伝達系因子として働くことが知られている。非病原菌接種あるいは抵抗反応誘導物質（エリシター）処理に応答したNO生成は植物に共通な現象として認められ、過敏感反応の誘導、防御関連遺伝子の発現、抗菌物質（ファイトアレキシン）の生成といった感染防御応答機構においてNOが関与することが示されている。植物におけるNO生成系については未だに不明な点が多い。窒素同化の律速酵素である硝酸還元酵素 (NR) がNO生成系として着目された。NR遺伝子をサイレンシングしたベンサミアナタバコ植物 (Nicotiana benthamiana)では、疫病菌由来のタンパク質性エリシターINF1の処理によるNO生成活性が部分的に抑制され、NRはエリシター応答性NO生成を担う酵素であるといえる。しかし、NR以外にもNO生成系が存在している可能性は高い。植物には動物のNO合成酵素 (NOS) と類似した酵素は存在しないと考えられ、NOS活性調節タンパク質をコードすると推定される AtNOA1 がシロイヌナズナから単離されているのみである。AtNOA1 ホモログである NbNOA1 をサイレンシングしたベンサミアナタバコ葉において、INF1処理によるNO生成が抑制され、NOA1がNRに加えてエリシター応答性NO生成に関与することが示された。

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過去6,7年で、植物分野においてmiRNAやsiRNAといった低分子RNAが発見され、その機能解析等が精力的に行われ，多くの発見があった。植物組織における軸形成など各種発生過程の進行をつかさどる転写因子の翻訳を、負に制御するmiRNAの存在の発見はその一例である。このように低分子RNAが存在するということは、対応して何らかの遺伝子の発現に関するfine tuningをしていることがと期待される。短いRNAに関して網羅的な解析をおこなうという大きな流れを見ながら，われわれはこうした短いRNAを合成／利用する植物側の因子の候補の機能解析を進めている。そのなかで短いRNAの新たな機能の発見も期待できると考えている。これまでsiRNAあるいはmiRNAは、Argonaute1(AGO1)が中心となるRNA induced silencing complex (RISC)に入り，その配列と相補的な標的RNAを抑制するとされている。実はシロイヌナズナのAGOは10個の多重遺伝子ファミリー(AGO1~10)を構成している。このうち今回AGO2と AGO5に注目して行った解析から得た知見を披露したい。4個のDicer-like protein (DCL), AGOの機能分担からみえる低分子RNAによる遺伝子発現制御について議論したい。

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植物は移動の自由がないため、乾燥、低温、塩などのストレスに対する独自の適応機構を備えている。これまでにDNAマイクロアレイ法などを用いて、乾燥、低温、塩などのストレスに対して応答する植物遺伝子が多数単離され、それらの機能が同定されつつある。しかしながら、アンチセンスRNA、non-coding RNA、small RNAやクロマチンリモデリングなどのストレス応答機構における役割に関してはまだ多くの点が不明なままである。
全ゲノムタイリングアレイ解析や新世代の超高速シーケンシングシステムを用いた解析は、全ゲノムトランスクリプトームの解析方法の1つとして最近注目されてきている。これまでにシロイヌナズナ全ゲノムタイリングアレイを用いて、乾燥、低温、塩などのストレスやABA処理（2時間および10時間）したサンプルを用いて解析したところ、ストレス応答性の新規な転写産物やアンチセンスRNAが多数存在することが明らかになった。また、454 Life Sciences社の高速シーケンサーを用いたsmall RNAの大量解析から、ストレス応答性のsmall RNAを幾つか同定した。同定されたストレス応答性の機能性RNAに関して、現在機能解析を進めている。

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私たちの研究グループは、SAGE法を改良して、新規遺伝子発現解析法「SuperSAGE法」を開発した。SuperSAGE法では、III型制限酵素EcoP15Iを利用することにより、各転写産物由来のcDNAの特定箇所から26塩基のタグ断片を抽出することができる。タグ数を数えることにより遺伝子発現量を解析する一方、26塩基の情報に基づいてタグの由来した遺伝子を高い精度で同定することが可能である。データがデジタルであること、ゲノム情報を駆使した解析が可能であることから、本法はポストゲノム時代の有力な技術であると確信する。本発表では、1）SuperSAGE法の概要、2）highly parallel sequencingによるSuperSAGEの効率化、3）タグ断片をそのままプローブに用いたマイクロアレイ「SuperSAGE-array」などを紹介する。また私たちは、ベンサミアナタバコを用いたcDNAの一過的過剰発現スクリーンにより、細胞死誘導因子NbCD1を同定した。NbCD1は、EARモチーフを有するII型ERF転写因子に属する。NbCD1を過剰発現するアラビドプシスから、クロマチン免疫沈降によりNbCD1と相互作用するDNA領域を回収した。現在、このDNAに対して、SuperSAGE法の変法GMAT法を適用して解析中であるので、これについても紹介する。

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植物は、酸素と食料を供給するばかりでなく、人類の生活を豊かにする様々な物質を供給してくれる。これらの植物の機能をより効率的に利用するためには、個々の遺伝子機能を知ることが必要である。植物では転写レベルの制御が遺伝子発現制御に中心的な役割を果たしており、そのため転写因子の機能、すなわち、転写因子が制御する形質と標的遺伝子群を解明することが、植物機能の有効活用する上で有効な手段であると考えられている。ところが、植物の転写因子遺伝子は、ファミリーを形成し重複遺伝子が数多く存在し、遺伝破壊や相補的なRNA導入等の従来の方法では、植物の転写因子の機能解析が容易ではないことが判ってきた。そこで、我々は転写抑制を強力な転写抑制因子に変換し、これを発現させることによって標的遺伝子の発現を抑制し、欠損型の表現型を誘導する新しい遺伝子サイレンシングシステム（CRES-T法）開発し、これまで困難であった重複した転写因子の機能解明を可能にした。これまでにシロイヌナズナを中心にCRES-T法を用いて個々の転写因子の機能解明を行った結果、マスター因子として機能する様々な転写因子が明らかになってきた。また、このシステムを用いることによって、これまでの変異体では見られなかった代謝経路を有する植物や、環境ストレスに耐性を持つ植物等が作出出来ることが判ってきた。このシステムの概要と、これを用いた有用形質の探索研究について紹介する。

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植物の胚乳組織では、受精前にプログラムされるエピジェネティックな制御にもとづいて、遺伝子発現のオン・オフが決定される遺伝子が存在する。これらはインプリント遺伝子と呼ばれ、シロイヌナズナでは、母親特異的に発現するFWA, MEDEA, FIS2、父親特異的に発現するPHERES1が知られている。母親特異的に発現するインプリント遺伝子は、いずれも雌性配偶体で脱メチル化されることで母親アレル特異的な発現を獲得する。一方で、DNAメチル化などのエピジェネティックな修飾が正しく保たれないと、ゲノムインプリンティングの解除が引き起こされてしまう。
FWA遺伝子は雌性配偶体の中央細胞特異的に活性化されることや、インプリンティングに必要なシス領域の解析（Kinoshita, Y et al., 2007）など、最も情報が得られているモデル系である。我々は、インプリントされた遺伝子発現をモニターできるFWA-GFPを用いてゲノムインプリンティングの制御因子の変異体を単離し、その解析を行っている。我々の解析から、DNAのメチル化を伴ってサイレントな状態にある遺伝子が、どのような機構によって活性化されるのか、より詳細な知見を得られつつある現状を紹介する。

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植物では、乾燥ストレスによって細胞内のアブシシン酸（ABA）濃度が上昇することにより、ABA誘導性のストレス耐性遺伝子群の発現が誘導されると考えられている。また、このABAによる遺伝子発現には、シス因子としてABRE配列が必要である。我々のグループでは、このABRE配列に結合して転写を活性化するbZIP型転写因子としてAREB1遺伝子を単離し、ABAを引き金とした水分ストレス応答において中心的な役割を果たしていることを明らかにした。さらに最近、AREB1が下流遺伝子群の発現を誘導するためには、ABAによるAREB1遺伝子の転写誘導に加えて、SnRK2タンパク質キナーゼによるリン酸化が必要であることを示した。本発表では、転写因子AREB1の活性化を通してABA誘導性遺伝子群の発現を制御していると考えられるSnRK2タンパク質キナーゼの役割の解明を目的とする。AREB1タンパク質とSnRK2タンパク質間相互作用の解析に加え、SnRK2タンパク質の細胞内局在や組織特異的発現解析およびSnRK2遺伝子群の欠失変異体を用いた表現型解析を行い、SnRK2タンパク質キナーゼの機能と役割について報告する。また、SnRK2遺伝子群の欠失変異体を用いたマイクロアレイ発現解析の結果から、SnRK2タンパク質キナーゼを介した乾燥ストレス時の遺伝子発現制御ネットワークについて考察する。

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微小管は植物の細胞壁形成に重要な役割を担っている。間期の細胞に形成される表層微小管列は新たに合成されるセルロース微繊維の方向を制御し、細胞質分裂時に形成される隔膜形成体は細胞板形成に働く。これらの微小管構造の構築機構を理解するためには微小管構造中で個々の微小管がどのように生じ、配列するかを明らかにする必要があるが、固定した細胞の観察のみから個々の微小管の挙動を推測することは難しい。我々は、微小管をGFPで標識したタバコ培養細胞を用い、生きている細胞内の微小管の挙動を解析することにより、表層微小管列および隔膜形成体における微小管の形成過程を明らかにすることに成功した（Murata et al. 2005, Murata et al. unpublished data）。表層微小管列、隔膜形成体のいずれにおいても新しい微小管は既存の微小管上で枝分かれとして生じた。細胞質抽出液と単離表層微小管列を用いた無細胞系の解析から、細胞質中のγチューブリンが既存の微小管に結合し、新しい微小管を枝分かれ状に伸長させることが明らかになった。さらに、細胞板形成においては、微小管枝分かれによって隔膜形成体微小管の分布が拡大することにより細胞板の拡大が起こることが示唆された。γチューブリンによる微小管の枝分かれは植物微小管構造の形成に広く働く素過程と考えられる。

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高等植物は動物のような明瞭な中心体を持たないため、植物特有の微小管形成機構が存在すると考えられている。蛍光プローブを使った微小管ダイナミクスの解析から、植物の間期表層微小管と分裂準備帯（preprophase band）微小管では、そのダイナミクスに違いがあることが報告されているが、その詳細は不明な点が多い。微小管周辺のダイナミックな構造変化を観るには、1～10nm分解能の顕微鏡が必要である。このサイズは、光学顕微鏡観察とX線回折の狭間であり、電子顕微鏡が必要な世界である。電子線トモグラフィーは、電子顕微鏡試料をCTスキャンし立体再構成する方法で、このサイズの生体ナノシステムを3次元的に見るのに必要な電子顕微鏡技術として注目されている技術である。この技術に加圧凍結・凍結置換の手法を組み合わせることで、信頼性の高い3次元微細構造解析が可能である。我々は加圧凍結法でタマネギ子葉表皮細胞の微小管を瞬時に凍結し、凍結置換、樹脂包埋した試料を分解能の良い2軸電子線トモグラフィー法で解析することで、幾つかの新しい事実を見つけることができた。本発表では、加圧凍結・2軸電子線トモグラフィー法の説明と、それを使って新たに分かって来た植物の間期微小管、および分裂準備帯の微小管端の構造変化とダイナミクスの関係、また、微小管とマイクロフィラメント、あるいは周囲に存在する小胞との関係について紹介する。

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陸上植物は地上の様々な環境に適応するために多様な形態を獲得してきた。植物の形態は個々の細胞を囲む細胞壁によって規定されることから、進化の過程においては、各植物種の形態形成に必要な細胞壁の多様化が起こったものと考えられる。複雑な高次構造物である細胞壁の構築・再編には、非常に多くの細胞壁遺伝子が関与しているが、今日のゲノム科学の発展によって、1つの植物種の全ての細胞壁遺伝子が明らかにされるとともに、植物種間の遺伝子の比較解析も可能になった。我々は、細胞壁の多様化プロセスを明らかにするために、異なる細胞壁タイプを持つシロイヌナズナ、イネ、ヒメツリガネゴケの細胞壁遺伝子の比較解析を行なった。
植物の細胞壁は、セルロースとヘミセルロースのネットワーク構造を基本骨格として構築されている。シロイヌナズナのヘミセルロースの主成分がキシログルカンであるのに対して、イネではグルクロノアラビノキシランなどが主に利用されている。またヒメツリガネゴケにおいては、種子植物とは分子構造が異なるキシログルカンが見つかっている。このような3つの植物種間において、キシログルカン分子の繋ぎ換え反応を触媒するXTH遺伝子の比較解析を行ない、サブファミリーの構成の違いや各種固有のXTHの存在を明らかにした。これらの違いが、細胞壁の構造変化に寄与するものなのか、他の細胞壁遺伝子の比較解析の結果も含めて議論したい?

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微小管機能の遺伝学的解析は、ねじれや細胞肥大を引き起こす変異株や微小管重合阻害剤に対する反応性が変化している変異株をスクリーニングことにより行われる。アラビドプシス植物体は根、暗所胚軸、葉柄、花弁などの組織が速く伸長しており、表層微小管の異常が細胞形態の変化として現れやすい。これらの変異株の多くはα又はβチューブリンのdominant negative型のアミノ酸置換型変異であった。その中でも、GTPase活性化領域の変異は安定な微小管を構築し、左巻きへリックス構造の表層微小管束を形成した。右巻き変異株のspiral1とspiral2は植物特異的な新規遺伝子ファミリーの劣性変異であり、SPIRAL1は微小管プラス端に部分的に集積する。spiral3は微小管重合核形成複合体の構成成分GCP2の劣性変異であり、安定な微小管マイナス端を形成する。一方、左巻き変異株phs1-1はMAPK phosphatase様タンパク質のdominant negative型変異であった。PHS1のフォスファターゼ活性部位の変異型を植物細胞で発現させると、表層微小管の脱重合を顕著に引き起こす。また、弱い左巻き変異株phs2は新規の微小管付随タンパク質ファミリーの変異であった。ねじれ変異株における微小管動態の観察と原因遺伝子の機能解析を通じて、植物細胞の伸長方向の制御機構が明らかになってゆくと期待される。

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全ての植物細胞が持つ一次細胞壁に対して二次壁は茎や胚軸、葯、鞘などの限られた組織にのみ形成される堅固な外骨格である。私たちはNST1、NST2、NST3（=SND1）転写因子が二次壁形成を根本的に制御するマスター転写因子であることを明らかにした。NST1プロモーターは花茎や胚軸の木部、葯、鞘で、NST2プロモーターは主に葯で、NST3プロモーターは花茎や胚軸の木部、鞘で活性が認められる。これを反映するように、NST1、NST2の二重変異体は葯内被細胞層の二次壁肥厚が抑制され葯の開裂が起きなくなる。一方、NST1、NST3の二重変異体は、花茎や胚軸において二次壁形成がほとんど見られなくなり植物体は直立できなくなるほか、果実鞘において道管以外の二次壁を形成する細胞すべてにおいて二次壁形成がみられなくなり鞘の自然開裂が起きなくなる。またNST遺伝子のいずれかを異所的に過剰発現させると、地上部の様々な部位で異所的な道管様二次壁肥厚が観察される。これらのことからNST転写因子は多重に機能重複して、道管以外で起きる二次壁形成の大部分を制御する木質形成のマスター転写因子であることが明らかになった。しかし、その上流、下流で働く因子については未だ不明確な部分が多い。本発表では他グループによって明らかにされた知見も交え、二次壁形成を制御する転写制御ネットワークの研究に関する諸問題を提起し議論する。

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植物では細胞壁を介した細胞間の接着が種々の発生現象を規定している。我々は植物の接着現象の理解を目指して新たな実験系の開発を行なってきた。まずタバコの半数体植物を用い、細胞接着に異常が生じた変異体を解析した。その結果、ホウ素と結合することで細胞接着に重要な働きをするペクチンRG-IIの生合成にかかわるグルクロン酸転移酵素遺伝子が、茎頂や根端のメリステムにおける細胞接着とメリステムの機能維持に重要な働きをしているとともに、めしべや花粉の形成および花粉管の伸長等の生殖成長と受精のプロセスにおける細胞間接着に必須であることが判明した。一方、傷害・接ぎ木などに見られる組織癒合時には、離れた細胞同士が接着し、異なる組織の細胞壁が出会うことで、古い細胞壁の代謝と新生による細胞壁の再構築と融合が生じると考えられる。そこで、シロイヌナズナの花茎をマイクロナイフを用いて半分まで切断し、癒合過程におけるマイクロアレイ法を用いた時系列に沿った網羅的遺伝子発現解析を行なった。その結果，細胞分裂、オーキシンやエチレンなどのホルモン情報伝達因子や各種転写制御因子等に加え、Xyloglucan endotransglycosylase/hydrolaseやFucosyltransferaseなどの細胞壁に関連する遺伝子の発現が、切断後1、3、5日目と大きく変動していることが明らかになった。

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脂質過酸化物の特徴は、その多くが反応性に富むことであり、細胞内タンパク質の化学修飾が原因となって病変を誘起している可能性が示唆されている。そのため、酸化ストレスによる病変発症機構を理解するためには、こうした反応性活性種によるタンパク質の “翻訳後修飾”の詳細な分子機構の情報は極めて有用である。ケトアルデヒド、2-アルケナール、4-ヒドロキシ-2-アルケナールなどの脂質過酸化物と種々のタンパク質との反応を詳細に解析した結果、こうしたアルデヒド類は少なくともSH基以外にヒスチジンやリジンと反応し、芳香環などを有する特徴的な付加体を生成することを明らかになっている。また、これらのアルデヒドのタンパク質付加体についてはモノクローナル抗体が作製され、病態との関わりが示唆されている。このように酸化ストレスマーカーとしての有用性は確立されているものの、こうした修飾反応が直接病態につながるような事例はまだ知られていない。本講演では、こうした背景とともに、アルデヒドによるタンパク質の共有結合修飾が関わる疾病の探索に関する我々の最新のアプローチを紹介したい。

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過酸化脂質由来のα,β-不飽和アルデヒド（reactive aldehydes; RAL）は強い求電子性をもちタンパク，核酸を修飾するため，細胞毒性が高い。我々はこれまでにシロイヌナズナから，RALのα,β-不飽和結合を還元し飽和アルデヒドを生成する新規酵素を単離し，2-アルケナールレダクターゼ（AER）と命名した。AER遺伝子はシロイヌナズナへの酸化的ストレスによって発現誘導される。AERを過剰発現させたタバコは，パラコートまたは強光，紫外線，オゾンに対し耐性を示した。すなわちこれらの酸化的ストレス処理により，葉でRALが生成し，それが細胞を損傷すると考えられた。葉緑体に含まれるアルデヒドをLC/MSにより分析し，過酸化脂質由来のRALやプロピオンアルデヒドなどが存在することを見いだした。単離した葉緑体にさまざまなアルデヒドを与えると，ストロマのカルビン回路酵素が失活し，CO₂固定が阻害された。CO₂固定阻害は飽和アルデヒドよりRALの方が強かった。RALはミトコンドリアに作用し光呼吸も阻害すると示唆されている。AER過剰発現株では，RALによる炭酸固定阻害および光呼吸阻害が抑制されたため，葉の電子シンク容量が保たれ，強光耐性がもたらされたと考えられる。このように，RAL消去活性は植物の重要な抗酸化機能である。

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Productivity of plants is greatly affected by environmental stress, therefore there is a continuous need for the improvement of stress tolerance in the agriculture. During oxidative stress rapid accumulation of reactive oxygen species (ROS) and reactive carbonyl species (RCS) significantly contributes to the damage of crop plants. Improvement of intracellular scavenging capacity provably lead to increased stress tolerance. In response to different stress treatments the MsALR aldo-keto reductase gene in Medicago sativa showed increased transcription. Transgenic tobacco plants ectopically expressing the MsALR cDNA were more tolerant to dehydration stress and recovered better from damages caused by water deficit than the untransformed wild type plants and were more tolerant to heavy metal, salt, dehydration and UV-B stress. Reactive carbonyl levels were significantly lower in the transgenic plants under these stress conditions. Agronomical importance of these data was underlined by increased yield parameters of transgenic wheat plants under drought stress.

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Glyoxalase pathway involving glyoxalaseI (glyI) and glyoxalaseII (glyII) enzymes is required for glutathione-based detoxification of methylglyoxal (MG), a potent cytotoxic compound. The exact physiological role of the glyoxalase pathway in plants is not well investigated. Our studies have shown that under normal conditions plants maintain and tolerate a certain level of MG, however, under stress conditions MG concentration increases leading to growth inhibition. Overexpression of both the genes in transgenic tobacco and rice showed delayed leaf senescence and improved tolerance to high NaCl, metal and drought stress; the plants were able to grow, flower and set seeds under stress. Enhanced detoxification of MG and maintenance of glutathione homeostasis in the glyoxalase overexpressing transgenic plants is one of the possible mechanisms behind this tolerance. Our preliminary work suggests that MG could also act as a signal molecule for regulating the expression of some of the genes including glyoxalase I and II.

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環境ストレスを受けた植物体内で活性酸素の過剰生成とそれに引き続く不飽和脂肪酸の過酸化が起こることはよく知られているが、そのプロセスで生成する種々の反応性の高いアルデヒド化合物が植物にもたらす影響や機能に関する知見は少ない。我々はまず、植物に多く含まれているC18脂肪酸を用いたin vitroでのモデル実験を行い、リノレン酸から生じる主要な脂質過酸化生成物であるマロンジアルデヒド（MDA）のタンパク質への結合が温度に依存していることを明らかにした。このことからMDAはin vivoでは高温ストレスに関係していると仮説を立て、高温ストレスを受けた植物におけるMDAの役割に着目した。1 μM MDAを噴霧したアラビドプシスは、未処理のアラビドプシスが生存できない45℃、6時間という高温処理に耐性を示した。このMDA処理は熱ショックタンパク質(HSP)遺伝子を誘導しておらず、MDAはHSPによらない高温耐性機構を誘導するシグナル分子として機能していることが示唆された。一方、40℃の高温処理を施したアラビドプシス個体から抽出したタンパク質の抗MDAモノクローナル抗体を用いた免疫染色解析から、高温処理は多くの葉緑体タンパク質に修飾をもたらすことが分かった。これらの結果は、MDAが高温ストレスを受けた植物中で「シグナル分子」および「毒性物質」として機能している可能性を示している。

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