カビ真菌の病原体であるうどんこ病菌は、穀物・野菜・観葉植物など数多くの植物に感染し、毎年多大な被害を及ぼしている重要な病害である。発表者らは、うどんこ病菌が感染した際の植物における初期応答分子機構を解明する為に、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）とそれを宿主とするうどんこ病菌（Golovinomyces orontii）の系を用いて解析を進めている。うどんこ病菌感染には組織選択性があり、茎・莢においては胞子の発芽・侵入が著しく阻害されるが、ワックス蓄積・クチクラ層成分に変異を示すwax2/yre/flp1においては、茎におけるうどんこ病菌発芽・侵入率の回復が見られた。しかし一方、成熟葉を用いた後期感染過程の観察結果から、wax2/yre/flp1では分生子柄形成が著しく遅延していることがわかり、WAX2/YRE/FLP1因子はうどんこ病菌の初期感染過程（発芽・侵入）においては抑制的に、後期感染過程（成長・増殖）においては促進的に働くことが示された。本発表では、更に詳細なうどんこ病菌形態観察の結果、またRT-PCRによる結果なども合わせ、WAX2/YRE/FLP1因子がうどんこ病菌感染に果たす多層的多面的役割について考察したい。

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我々はグラム陰性細菌の細胞壁構成成分であるリポ多糖(LPS)がイネ培養細胞にプログラム細胞死を含む防御応答を誘導すること¹⁾、また単独では防御応答を誘導しない様な低濃度で前処理することで後から処理したキチンオリゴ糖に対する防御応答を増大させるPriming活性を持つことを明らかにしてきた。さらに、最近の研究によってこのPriming活性が新規の遺伝子発現や植物ホルモンの蓄積に因らない活性であり、むしろLPSとキチンオリゴ糖のシナジー効果としてとらえるべきことを見出している。
一方、LPSの機能部位に関しては、動物の先天性免疫では分子中のLipid A部分が認識されることが報告されているが、植物が認識する構造は明らかでない。そこで今回、LPS合成系に変異を持つ微生物から抽出され、構造の明らかなLOSを用いることで²⁾、植物によって認識される構造を解析した。LOSがLPS同様の活性を示すことを確認したのち、穏和な加水分解によってLipid Aとコア糖鎖に分解し、それぞれの活性を調べた結果、イネにおけるLPSの生物活性はLipid Aによって担われていることが明らかになった。
¹⁾Desaki, Y. et al., Plant Cell Physiol., 47, 1530 (2006). ²⁾Alba, S. et al., ChemBioChem, 9, 896 (2008).

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植物の広範なシグナル伝達系において、各刺激に特有な細胞質Ca²⁺濃度変化 ([Ca²⁺]_cyt) の時空間パターンが重要な役割を果たすと考えられているが、Ca²⁺動員を担うCa²⁺チャネルの実体は未解明な点が多い。イネの電位依存性Ca²⁺チャネル候補OsTPC1は、糸状菌由来のタンパク質性エリシター (TvX) により誘導されるイネ培養細胞の感染防御応答の制御に重要な役割を果たす(Kurusu et al. Plant J. 2005) 。本研究では、感染防御応答初期に誘導されるCa²⁺動員にOsTPC1が関与する可能性を検証するため、野生型株やOsTPC1機能破壊株培養細胞の[Ca²⁺]_cyt測定系を構築し、TvX等種々のエリシターにより誘導される[Ca²⁺]_cyt変化を解析した。さらに、感染防御応答におけるOsTPC1の機能の網羅的解析を目指して、TvX応答性遺伝子のトランスクリプトーム解析を行い、OsTPC1機能破壊の影響を解析した。その結果、OsTPC1がTvXにより誘導されるCa²⁺動員の制御や、モミラクトン類等のジテルペン型ファイトアレキシン生合成遺伝子群を含む防御関連遺伝子の発現誘導に関与する可能性が示唆された。これらの結果に基づき、感染防御応答におけるOsTPC1の機能について議論する。

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イネの主要ジテルペン型ファイトアレキシンの一つであるphytocassaneの生合成遺伝子は、2番染色体上において2種のジテルペン環化酵素遺伝子と6つのP450酸化酵素遺伝子からなる生合成遺伝子クラスターを構成している。これまでに、クラスター中央に位置するCYP71Z7がphytocassanes A, B, Dの生合成に関与することを明らかにした。本研究では、相互に相同性の高いクラスター内の他の4つのP450遺伝子 (CYP76M5, M6, M7, M8)について、これらのRNAi株を作製し、発現抑制がphytocassane生産へ与える影響を解析した。
得られたRNAi株におけるキチンエリシター処理後のphytocassanes 生産量をLC-MS/MSにより調べたところ、これまでに全てのphytocassanes の生産が起こらない株や、phytocassanes B, C, Eは顕著に減少するがphytocassane Aの生産のみ正常に起こる株を得た。このことは、個々のRNAi株において抑制されたP450遺伝子が異なるためにphytocassaneの生産性に変化が現れたことを示唆している。現在、RNAi株における各P450遺伝子の発現抑制の状態を詳細に解析しており、これらのP450が触媒する生合成経路内のステップが明らかになることが期待される。

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イネの主要なジテルペン型ファイトアレキシンであるモミラクトン類とファイトカサン類の生合成酵素遺伝子は、4番染色体と2番染色体においてそれぞれ遺伝子クラスターを形成している。我々はこれまでにモミラクトン生合成酵素遺伝子クラスターを発現制御するマスター転写因子OsTGAP1を同定し、解析を進めた。その結果、OsTGAP1過剰発現株ではモミラクトンだけでなくファイトカサンも生産量が増加することがわかった。そこで、ファイトカサン生合成酵素遺伝子および生合成上流のMEP経路の遺伝子について、ostgap1変異株・OsTGAP1過剰発現株における発現量を解析した。ファイトカサン生合成酵素遺伝子OsCPS2, OsKSL7については、一過的な発現を示す野生型株の場合と異なり、変異株では低いレベルではあるが恒常的な発現が見られた。一方、過剰発現株ではエリシター処理時の発現量が顕著に増加していた。MEP経路の遺伝子OsDXS3, OsDXR, OsCMSは、変異株においてはエリシター処理時の発現量が低下し、過剰発現株においては、エリシター処理時の発現量が顕著に増加した。これらのことから、OsTGAP1はジテルペン型ファイトアレキシン生合成を制御する鍵転写因子として機能する可能性が考えられた。現在、OsTGAP1がこれらの遺伝子の上流域へ結合するかどうかを明らかにするため、ChIP解析を行なっている。

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OsWRKY53 はイネのいもち病菌耐性を正に制御するキチンエリシター応答性転写因子であるが、OsWRKY53 がどのような遺伝子の発現を制御することで病害抵抗性反応を引き起こしているのかは未解明である。そこで我々は、クロマチン免疫沈降法 (ChIP) とカスタムタイリングアレイを用いた ChIP-chip 解析による OsWRKY53 の直接的な標的遺伝子のスクリーニングを試みた。まず、HA タグを付加した OsWRKY53 恒常的発現株及びキチンエリシター応答性遺伝子のプロモーター領域を用いたカスタムタイリングアレイを作製し、HA 抗体を用いた ChIP-chip 解析を行った。その結果、転写因子や PR 遺伝子などの様々な遺伝子が OsWRKY53 の標的候補遺伝子として同定された。次にドミナントネガティブ型 OsWRKY53 恒常的発現株（DN 株）を作製し、トランスクリプトーム解析を行った。その結果、ChIP-chip 解析で同定された多くの遺伝子の発現量が、DN 株において著しく低下していることが観察された。この結果は、それらの遺伝子が OsWRKY53 の直接的な標的遺伝子であることを強く示唆している。現在、OsWRKY53 の結合領域が標的候補遺伝子のキチンエリシター応答性シス配列であるかどうかレポータージーンアッセイを用いて解析している。

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イネのキチンエリシター受容体として同定されたLysMドメイン含有膜タンパク質CEBiP(Chitin Elicitor Binding Protein)は，キチンオリゴ糖に結合することは明らかになっているが，結合に重要な構造は特定されていない。こうした解析を行うための実験系として，ある種のタバコBY-2細胞がキチン応答性を欠失し，また CEBiP様タンパク質を欠くことに着目し，CEBiPの構造・機能解析を行う発現系として有用であると考えた。結合特性の解析にはnon-RIで解析可能なビオチン化キチンオリゴ糖を用いた親和性標識実験を用いた。実験系を評価するため，イネCEBiPを過剰発現させたBY-2細胞の膜画分を用いてキチン結合性の評価を行ったところ、発現したCEBiPの結合特性がイネ由来のものと同様であることが認められたことから、構造・機能解析に利用可能であることが示された。CEBiPの構造機能活性相関の解析を行うにあたって、CEBiP分子内には2つのLysMモチーフが存在し、キチンオリゴ糖への結合に重要であることが推測されている。そこでイネCEBiPのLysMモチーフのデリーションクローンをBY-2で発現させ、解析したところその一つにおいてキチン結合能が消失した。現在、さらに検討をすすめるとともに、種々のCEBiPホモログのキチン結合性に関してもこの系を用いた解析を行っている。

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これまでに、我々は、キチンオリゴ糖と特異的に結合し、その結合部位と想定されるLysM ドメインを持つ膜タンパク質CEBiPが、イネにおけるキチンエリシター受容体であることを明らかにした1)。しかし、CEBiPには細胞内ドメインが存在せず、この分子単独ではシグナルを伝達することが出来ないと考えられた。一方で、細胞外LysM ドメインをもつ受容体様キナーゼOsCERK1も、そのノックダウン形質転換体の解析により、イネのキチンエリシターシグナル伝達に重要であることが明らかとなった。これらの結果から、我々は、CEBiP とOsCERK1 が受容体複合体を形成し、協調的にシグナル伝達系を制御しているのではないかと考え、こうした可能性について検討を行った。酵母Two-Hybrid法では、CEBiP やOsCERK1の直接的相互作用によるホモダイマー化やヘテロダイマー化を示唆するデータが得られ、Deletion 解析により、その相互作用に重要な部位が明らかとなった。また、タグ付きのOsCERK1過剰発現体を作成し、その生化学的解析を行った結果、OsCERK1が自己リン酸化されていることが確認された。また、ホモダイマー化したCEBiP の存在も示唆されたが、ヘテロダイマーの形成は確認できなかった。1) Kaku et al., PNAS, 103, 11086 ('06)

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シロイヌナズナやイネの膜上には多数の受容体様分子が存在するが、多くの場合、それらの機能は未解明のままである。その理由の一つとして、これらの分子の発現量が低いことや、共存する蛋白質の影響などによって詳細な生化学的解析が困難であることが挙げられる。本研究では、そうした問題を排除し、なおかつ受容体を膜上に存在する状態で解析できる実験系として、高い翻訳活性を保持しているコムギ胚芽を用いた無細胞系でのタンパク質発現と、リポソームへの埋め込みによる受容体機能解析手法の開発を試みた。
この解析系を評価するため、当研究室で同定した防御応答に関わるキチン受容体であるCEBiP(Chitin Elicitor Binding Protein)とCERK1(Chitin Elicitor Receptor Kinase1)についてプロテオリポソームの調製を行った。CEBiPについては当初、プロテアーゼによると考えられる分解が起きていたが、N末端側にGSTを付加する、または、合成時にプロテアーゼインヒビターを投与することで単一のバンドを見出すことができた。CERK1についてはこういった処理をすることなく合成に成功した。CERK1においてはホスホセリン抗体により、自己リン酸化が起こっていることが示唆された。これらの結果から、本実験系が受容体の機能解析系として有用であることが示唆された。

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微生物分子パターン（MAMPsあるいはPAMPs）認識に基づく植物による病原菌認識は、植物の基礎的病害抵抗性において重要な役割を果たしている。MAMPsエリシターの一つであるキチンオリゴ糖は、シロイヌナズナやイネにおいて各種の防御応答を引き起こす。我々は、シロイヌナズナ遺伝子破壊系統を用いた逆遺伝学的解析により、受容体キナーゼCERK1（Chitin Elicitor Receptor Kinase1）がキチンオリゴ糖シグナル伝達で、中心的な役割を果たしていることを見い出した¹⁾。さらに、新たなキチンシグナル伝達経路の構成因子を探索するため、シロイヌナズナアクチベーションタグラインを用いたスクリーニングを行った結果、キチンエリシター応答性が低下あるいは消失した変異体が複数得られた。キチンエリシター誘導性活性酸素応答が消失したひとつの変異体候補について後代の表現型の解析を行った結果、後代で表現型が逆転したことから、この遺伝子産物が防御応答の負の制御因子であり、アクチベーションタグラインでこの因子の過剰発現によって生じた防御応答抑制が、後代におけるサイレンシングによって逆に防御応答の昂進につながったという仮説を考えた。今回の報告では、このT-DNA近傍の遺伝子の同定とそれらの機能解析について報告する。¹⁾Miya et al., PNAS,104, 19613, 2007

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グラム陰性菌の細胞壁構成成分であるリポ多糖（lipopolysaccharide: LPS）は植物自然免疫を誘導するエリシターである。しかし、植物のLPS認識機構は全く分かっていない。我々は既に、シロイヌナズナLPS結合タンパク質2（AtLBP2）にLPS結合活性があること、更に、AtLBP2が植物自然免疫に関わることを明らかにしている。AtLBP2の詳細な機能解析を試みるに際し、我々は先行するヒトLBP（hLBP）研究に注目した。現在、AtLBP2がLPSシグナル伝達の増強または阻害に関わると予想し、研究を進めている。
また、hLBPと相同性の高いヒト殺菌性／透過性増強タンパク質（hBPI）はLPSと結合し、殺菌作用を示す。近年、魚類と無脊椎動物におけるhLBP/hBPI関連タンパク質がhBPI同様に殺菌・抗菌作用を示すことが報告された。そこで、AtLBP2の殺菌・抗菌作用にも注目し実験を進めている。
更に、我々は既にLPSが植物に対して成育阻害効果を示すことを明らかにしている。今回、植物のLPS認識（自然免疫）と生育阻害が同機していることが分かったので報告する。本研究結果は、LPS受容体やLPS認識関連因子の探索法として応用が期待できる。

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コムギ等を宿主とする赤かび病菌は、トリコテセン系カビ毒を産生し、穀物への混入が世界的に大きな問題になっている。トリコテセンは宿主への感染過程で病原性因子として作用することが知られており、エリシター活性や細胞死誘導活性を有することから、腐生菌である赤かび病菌がトリコテセンを利用して、宿主のプログラム細胞死を誘導することが示唆された。赤かび病に羅病性であるシロイヌナズナにおいて、トリコテセンの中でも毒性の高いT-2 toxin応答遺伝子を多数同定し、逆遺伝学的な解析により、トリコテセンによる防御応答を負に制御する転写因子AtNFXL1を見出した。さらに、このAtNFXL1と相互作用するタンパク質としてThionin2.3を同定した。Thioninは抗菌性タンパク質として知られており、大腸菌で発現・精製したThionin2.3は、赤かび病の菌糸の進展を阻害することを明らかにした。また、Thi2.3の過剰発現株の葉に、T-2 toxinを産生するFusarium sporotrichioidesを注入接種すると、野生株に比べて、菌糸の伸長が抑制され、また、花に噴霧接種すると、野生株と比べて、病徴が抑制されることが分かった。以上の結果から、Thionin2.3は菌糸の進展を抑制することで赤かび病菌に対する抵抗性に寄与することを明らかにした。

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シロイヌナズナは、炭疽病菌に対して侵入阻止型の非宿主抵抗性を示す．これまでに、プロテインキナーゼであるEDR1が、この非宿主抵抗性に関与していることを明らかにしている．今回、EDR1が関わる抵抗性メカニズムの実態を理解するために、マイクロアレイによってedr1変異体の発現プロファイリングをおこなった．その結果、edr1変異体において、4種類のディフェンシン遺伝子の発現が顕著に低下していた．定量的RT-PCR解析より、野生型においては、不適応型菌接種によってディフェンシンの発現が誘導される一方、edr1変異体では誘導されないことが判明し、病原菌接種によるディフェンシン誘導にEDR1が必要であることが示唆された．MYC2は、ディフェンシンの発現を負に制御しているが、edr1 myc2二重変異体においては、edr1変異体と比較して、ディフェンシンの発現増大が観察された．また、二重変異体においては、edr1変異体と比較して、不適応型菌の侵入率の低下が観察された．さらに、edr1変異体においてディフェンシンを過剰発現させた場合、edr1 myc2二重変異体と同様に、侵入阻止型抵抗性の回復が観察された．以上の結果より、EDR1はディフェンシンの発現誘導に関与し、この発現誘導が、侵入阻止型抵抗性において、重要な役割を果たしていることが強く示唆された．

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アブラナ科野菜は抗菌性物質を有していることが知られており、種子の発芽時における糸状菌の感染などを防ぐ効果を持つと考えられる。この代表的な物質としてディフェンシンと呼ばれる一群のポリペプチドが存在する。ディフェンシンは広く生物界に存在し、アミノ酸レベルでの構造、抗菌活性スペクトラムには生物ごとにそれぞれ共通の特徴を有している。アブラナ科野菜の持つディフェンシンは糸状菌に抗菌活性を示すものが多い。
我々はカラシナ（Brassica juncea）に注目し、ディフェンシンの活性と構造との関係に知見を加えることを目的として、ディフェンシン蛋白質の取得を試みた。カラシナの種子を材料とし、イネいもち病菌に対する抗菌活性を指標に蛋白質の精製を行った。精製した蛋白質の同定を行ったところRaphanus sativusのRs-AFP1と同一のアミノ酸配列を有する51アミノ酸から構成されるポリペプチドでありBj-AFP1と命名した。精製したBj-AFP1はイネいもち病菌Magnaporthe grisea、ヒトの日和見感染菌であるCandida albicansに対し抗菌活性を示した。

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放射線は、突然変異育種における変異原として利用されている。しかし、その変異誘発効果を遺伝子レベルで明らかにした研究は、ほとんどない。本研究では、変異検出マーカー(rpsL)遺伝子を導入したシロイヌナズナ(Arabidopsis/rpsL)に対し、炭素イオンビームまたはガンマ線を照射し、放射線誘発変異のスペクトルを解析した。その結果、炭素イオンビームおよびガンマ線照射は、どちらも欠失変異やG:C to A:T transition変異を誘発する傾向があることがわかった。また、乾燥種子においては、ガンマ線は、炭素イオンビームに比べてサイズが小さい欠失変異を誘発する傾向が見られた。しかし、代表的な放射線誘発損傷である8-oxoguanineに起因するG:C to T:AやA:T to C:G transversionの頻度は、乾燥種子・幼植物体ともに低く、他の生物種に比べてシロイヌナズナでは放射線照射による8-oxoguanineの生成が少ない可能性が示された。また、イオンビームの飛程において照射試料中で停止する直前でエネルギーの沈積が最大となる領域をブラッグピーク領域という。本研究発表では、ブラッグピーク領域の炭素およびヘリウムイオンがシロイヌナズナ乾燥種子の生育と生存に与える影響についても報告する。

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細胞は栄養飢餓ストレスに応答して自らの構成成分を分解し、その分解産物を新しい構成成分の再合成やエネルギー獲得のために利用することが知られている。このような分解メカニズムの1つであるオートファジーは、栄養飢餓条件下における細胞内タンパク質の分解に寄与することが知られている。一方、生体膜の主成分であるリン脂質もタンパク質と同様に栄養飢餓条件下で分解されるが、私たちはタバコ培養細胞(BY-2)におけるリン脂質の主な分解メカニズムがオートファジーではないことを明らかにしてきた。
本研究では、BY-2細胞におけるリン脂質の分解メカニズムを明らかにするため、蛍光色素BODIPYで標識された脂肪酸アナログを細胞に取り込ませ、蛍光顕微鏡による観察、および細胞から抽出したリン脂質の蛍光量測定を行った。それらの結果から、細胞内リン脂質の約80 %が24時間以内に分解されること、またリン脂質の分解産物が最終的に液胞に蓄積することが示唆された。本発表では、上記の結果とともに、現在解析中であるリン脂質分解産物の同定、および液胞の酵素阻害とリン脂質分解の関係についても発表する予定である。

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オートファジーは、生物が栄養飢餓状態に陥った際に起こす細胞内の物質を分解するメカニズムのひとつであり、主にautophagy（ATG）タンパク質群によって実行、制御されている。オートファジーは、哺乳動物においては、栄養飢餓条件下での栄養供給や細胞内浄化、免疫などの役割を担っていることが知られている。植物細胞においても似たような機能を果たしていると考えられるが、植物特有の機能も存在すると推測される。これと関連して、シロイヌナズナのATG遺伝子破壊株は早期老化の表現型を示すが、そのメカニズムについてはまだよくわかっていない。
本研究では、オートファジーの植物における生理機能を明らかにする目的で、ヒメツリガネゴケを用いて、ATG遺伝子群のひとつであるATG5遺伝子の破壊株を作製した。ヒメツリガネゴケATG5遺伝子破壊株の原糸体細胞を炭素飢餓培地やリン飢餓培地で培養すると、いずれの培養条件においても緑色の原糸体細胞は野生株よりも早く茶色に変色した。この結果は、シロイヌナズナにおけるのと同様にヒメツリガネゴケにおいてもオートファジーの欠損が早期老化に繋がることを示唆している。現在、飢餓条件下における原糸体細胞の観察を行って、ATG遺伝子破壊株においてオートファジーが欠損しているかを調べている。本発表ではこれらの実験結果について報告する。

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植物は浸透圧ストレス下で耐性獲得に重要な物質輸送機構を保持していると考えられる。カリウムイオントランスポーターKUP6は植物、酵母、大腸菌に広く存在するKUP/HAK/KTファミリーに属し、乾燥・塩ストレス条件およびアブシジン酸(ABA)処理で発現が誘導される。KUP6pro:GUSを植物に導入し発現組織特異性を解析した結果、KUP6プロモーターは根の維管束組織で高い活性を示した。KUP6-GFPの植物体における細胞内局在性は細胞膜に局在性を示した。KUP6および相同性遺伝子KUP8の二重変異体kup6kup8は通常の生育条件下で根毛及び側根数が増大しており、さらに、その側根形成はオーキシンに高感受性を示し、ABAおよびオーキシン輸送阻害剤NPAに対し非感受性を示した。さらに、KUP6を恒常的に高発現する形質転換シロイヌナズナの成熟葉は水分損失が低下し、土植えした形質転換体は長期の乾燥ストレスに対し耐性が上昇した。kup6kup8の気孔閉鎖におけるABA応答性は低下しており、成熟葉の水分損失は増大していた。以上の結果より、KUP6は植物体の成長制御および浸透圧ストレス応答に重要な機能を持つカリウム輸送体であることが考えられた。さらに、浸透圧ストレス条件下におけるKUP6の機能とABAおよびIAA応答のクロストークについて解析した結果を報告する。

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ブルーベリー葉は抗酸化活性が高く、機能性食品の原料として期待されている。機能性の高いブルーベリー品種を効率的に育成するため、我々は、ポリフェノール関連遺伝子から作製したDNAマーカーを用いた選抜育種を試みている。このようなDNAマーカーを作製するには、効率的なRNA抽出法が必要であるが、ブルーベリー葉は、ポリフェノールを多く含んでいるため、RNAを効率的に抽出するのが難しい。そこで、我々は、Cetyl trimethyl ammonium bromide（CTAB）法の改良を行い、効率的なRNA抽出法の確立を試みた。ホウ酸、HEPES、MES、MOPS、PIPES、TES、Tricine、Trisの8種類の緩衝液を用い、ブルーベリー葉からRNAの抽出を行った。このうち、HEPES緩衝液やMOPS緩衝液においては、生重量1gあたり200μg以上のRNAを抽出することができた。従来使用されてきたTris緩衝液では、生重量1gあたり約80μg程度しか抽出できず、HEPES緩衝液やMOP緩衝液を使用することで、2倍以上のRNAを得ることができた。また、改良した抽出液により得られたRNAを用いて、RT-PCRを行うこともできた。現在、この改良したCTAB法により得られたRNAを用いて、cDNAサブトラクションを行い、DNAマーカー作製用のcDNA断片を単離しているところである。

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最適な環境を求めて移動できない植物は、様々な外部環境への適応機構を持っている。我々は環境適応に寄与する新規RNAを探索するため、タイリングアレイを用いてストレス条件下におけるArabidopsisの遺伝子発現プロファイルを作成し、ゲノムワイドな遺伝子構造予測プログラムであるARTADEで解析した。その結果、多くの遺伝子座において、新規アンチセンスRNAが存在することがわかった。（Matsui et al. (2008)PCP 49:1135）
そこで、予測された新規アンチセンスRNAの存在を確定するため、いくつかの予測遺伝子について実験による検証を行った。まず、遺伝子毎に設計したストランド特異的プライマーを用いた逆転写反応を行い、RNase処理後にPCR反応を行うことで、センスRNA及びアンチセンスRNAの存在を検証した。その後塩基配列を解析して、その遺伝子構造を調べた。
この結果、新規アンチセンスRNAとして予測された遺伝子の存在を確認することができた。また、センスRNAの増加に伴い、アンチセンスRNAが存在しやすくなる傾向にあることがわかった。さらに、決定した塩基配列から、アンチセンスRNAはセンスRNAと同じexon-exon junctionを持つことがわかり、これらのアンチセンスRNAはセンスRNAを鋳型として転写される可能性があることが示唆された。

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我々は、既知の遺伝子の間隙に30-100アミノ酸をコードする領域がシロイヌナズナゲノム中に7,159存在することを発見した。このような領域はshort open reading frame (sORF)と呼ばれており、複数の生物種において機能を持つことが示唆されている。そこで我々は植物におけるsORFの機能解明を目指し、既知遺伝子とsORFを搭載したマイクロアレイを作成し発現解析を行っている。様々な組織（ロゼット葉、根、茎、花、さや）から抽出したRNAを用いて発現解析を行った結果、約1,500のsORFが発現していることが確認された。また、光で発現が制御されるsORFを同定するため、暗所生育させた芽生えに連続光を照射し経時的な発現解析を行い、光で転写が制御される約100のsORFを同定した。さらに一部のsORFについては過剰発現体の作製を進めている。現在までに、花のサイズや芽生えの胚軸、根の伸長に変化が生じた変異体が単離されている。これらのsORFは植物において機能し、新規の遺伝子群となるとすることが期待される。また現在、イネのsORFについても配列予測を行い、マイクロアレイによる発現解析、過剰発現体の作製を行っているのでこれらの結果も併せて報告したい。

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低分子RNA(small RNA)がDNAのメチル化、mRNAの分解、タンパク質翻訳の阻害などを通じ様々な遺伝子の発現を調節していることが明らかとなっていきている。mRNAの機能を調節する低分子RNAには大きく分けてmiRNAとsiRNAがある。前者はヘアピン構造から、後者はRNA依存性RNAポリメラーゼにより二本鎖RNAが形成された後、RNaseにより21から24塩基程度の長さに切断される。生じた低分子RNAはそれと相補な領域を持つDNAやRNAに作用し発現を調節する。多数のイネのシュート形成の変異株の原因遺伝子がsiRNA (特にta-siRNA)の生合成に関わるものであることが明らかとなり、低分子RNAの全体像を明らかにすることが形態形成を考える上で重要な課題となった。
我々は高速シーケンサー(SOLiDシステム)を用いて、イネ実生から抽出した低分子RNA の塩基配列を網羅的に解析した。野生型株とシュート形成の変異株から抽出した低分子RNAを比較すると変異株で21塩基からなる低分子RNAが相対的に減っていることがわかった。また低分子RNAが由来するゲノム上の領域について調べると変異株ではより広い領域から少量ずつもれるように発現していることもわかった。高速シーケンサーを用いることで見えてきた低分子RNAの全体像について議論したい。

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転写因子（TF）は、その支配にある遺伝子群の発現を調節する。TF遺伝子の過剰発現により、イネTFの働きを改変したイネ系統の作出は、TF自身および標的遺伝子群の機能および発現ネットワークの解明のための効果的なリソースになると期待される。本研究では約2,500種類ほどあるといわれるイネTFをコードする遺伝子座の約75％をカバーするFull-Length (FL-) cDNAクローンを用い、各種TF cDNA過剰発現（TF-OX）イネ系統を作出中である。また、産総研と連携し、同TFのキメラリプレッサー発現系統も作製している。始めに、各TF FL-cDNAに対して機能的ORF配列の解析を行い、推定されたORFをもとに、各TF cDNAのGatewayエントリークローンおよびTF-OXベクターを作製した。現在までに188種類のTF-OXベクターをイネに個別導入し、129種類のTF形質転換イネより再分化個体（総計847個体）を得ている。これらイネ系統の再分化当代の表現型を観察したところ、草丈の伸長、半わい性、多分げつ、散開型分げつ、稈や葉身のねじれ、短粒、病斑形成等の異常形質が、特定のTF-OXイネ系統群から見出された。本発表ではTF-OXイネ系統の作出状況、導入TF cDNAの発現、これまでに観察された興味深い表現型等について紹介する。

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我々は、イネ内在性レトロトランスポゾンTos17が培養細胞で特異的に活性化することを利用して、これまでに5万系統のTos17挿入変異系統(ミュータントパネル)を作出してきた。Tos17挿入変異系統は、すでに多くの研究者に利用されているところであるが、大規模表現型解析から、ミュータントパネル系統は、Tos17の挿入によらない変異が多く存在することが予想されていた。これらの変異の原因を探るため、昨年度より、次世代シーケンサーを用いてミュータントパネル系統の全ゲノム解析を進めている。これまでに、独立の2系統に関して、それぞれゲノムの5倍程度の塩基配列を取得した。得られた塩基配列のうち13%の配列にイネのゲノム塩基配列に対してミスマッチが存在した。これらのミスマッチから正しい変異を検出するため、検証プログラムを新たに作成した。最終的に、100～200ヶ所の変異が絞り込まれた。絞り込まれた変異の一部をサンガー法で確認したところ、9割程度の変異は、実際に変異していることがわかった。M₁世代に換算して、少なくとも1Mbに1ヶ所は培養によって変異が起こったと予想している。この方法を発展させれば、表現型に関係する変異の同定、あるいは、マッピングが可能になると考えられるので、さらなる改良とデータの検証を進めているところである。

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国立遺伝学研究所のDNA Data Bank of Japan(DDBJ)では、次世代シークエンサーのデータ登録システム「DDBJ Read Archive」を起点に、Genome Mappingやde novo Assemblyの自動処理を行ない、次に構造・機能注釈ツールへと接続を行う「DDBJ Read Annotation Pipeline」を構築している。提案パイプラインは、実験研究者でもGUI画面上の操作のみで解析結果を得る事ができる。本発表では、パイプラインの解析事例としてillumina 社 Genome Analyzer IIxを用いて、全ゲノム配列が未知のイネ近縁種ゲノムのシークエンス解析を行い、リファレンスゲノム配列との比較を行った結果を報告する。最初にAAゲノムの野生型イネ：O.longistaminataの2系統について試験実験を行った。系統毎に75bpのリード長で約12M x 2のpaired-endのリード配列を得た。2系統のリード配列をO.sativa(日本晴)ゲノムにアライメントした所、リードのベース位置毎のエラー率は、75bp目で2系統共に2%以下の高精度であった。また日本晴の全ゲノムに対する被覆率は、2系統ともに約40％であった。SNP解析やIns/Del解析も含めて、AAゲノム野生イネ2系統と日本晴の比較解析結果を報告する。

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遺伝子発現パターンの類似性は, 遺伝子の発現制御機構や生物学的機能, 関与する代謝パスウェイなどを推定する上で重要な指標となる. 現在, 多くのマイクロアレイ実験データがNCBI GEOなどの公開データベース上に蓄積されており, 多様なサンプルに由来する大規模な遺伝子発現データの比較が可能となっている.
そこで, 当プロジェクトでは, イネにおいて類似の発現パターンを示す遺伝子セットを選抜するために, 遺伝子発現ネットワークを構築した. まず, NCBI GEOデータベースより, Affymetrix社 GeneChip Rice Genome Arrayから得られたマイクロアレイ実験データを収集した（計244サンプル）. 次に, 発現強度を正規化した後に, すべてのプローブ・ペア間で相関係数を算出した. そして, 相関係数およびその他の統計情報を用い, 遺伝子発現ネットワークを構築した. 得られた情報は, データベースOryzaExpress(http://riceball.lab.nig.ac.jp/oryzaexpress/)に格納しており, 対話型のグラフィカルビューアーを通して閲覧が可能である. また, 遺伝子の機能アノテーションから検索ができる.

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遺伝子発現パターンは遺伝子が機能する工程を捉えた重要な生物学的情報の一つである。昨今より、遺伝子発現パターンは遺伝子機能推定の手がかりとされてきた。網羅的遺伝子発現データが蓄積している植物においては、遺伝子発現パターンに基づく遺伝子の分類は遺伝子機能、発現制御の研究における強力なアプローチとなっている。しかし、従来のような遺伝子発現相関を用いた遺伝子分類においては、多量の遺伝子発現データが求められること、また、遺伝子発現パターンの評価が定性的となることに関し、方法論の限界に直面している。本研究では、1遺伝子当たり要素数nのベクトルで表される遺伝子の発現パターンの類似性評価の指標としてコサイン距離とユークリッド距離を併用して、イネ遺伝子の分類を試みている。GEOのイネアレイデータ（GeneChip）から、RMA法により算出された遺伝子発現量を距離計算に供し、各遺伝子を軸とした発現類似遺伝子群におけるGene Ontology termの偏在を調べたところ、ユークリッド距離を併用することによって約5%のGO termに関してその出現頻度の上昇が認められた。中でも、ある発現類似遺伝子集団においては、ユークリッド距離の併用によってはじめて「glycolysis」のtermのついた遺伝子の偏在が明らかとなった。本発表では、今回の遺伝子発現比較の手法の利点も併せて報告する予定である。

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発現している遺伝子群を同定するために, 近年, 高速シーケンサーによる大規模な配列解読が進展している. これらの配列データのサンプル間比較は, 器官や生育ステージなどで特異的に発現している遺伝子などの詳細な解明を促進し得る. 従来, ESTなどの配列データに対するサンプル間比較では, 配列のアセンブリングから遺伝子発現パターンを推定した後に、階層的クラスタリングによって発現パターン分類を行っている. ここで, 階層的クラスタリングでは, 取り扱うデータの大規模化に伴い, 膨大な計算機リソースや計算時間を要し, 実施が困難となる. 今後も継続する配列解読のハイスループット化に対応するには, 解析手法の基盤整備が早急に求められる. そこで, 我々は, 多変量解析の1つである対応分析を応用し, 大規模データを汎用的な計算機でも短時間で解析し得る解析手法を開発した. 開発手法の適用により, 特異的に発現する遺伝子などを簡便に同定でき, 構築した三次元ビューワーから発現パターンが有意に類似する遺伝子群を抽出できる. 本手法を容易に実行するためのソフトウェア開発を進めており, 既知遺伝子と類似の発現パターンを示す遺伝子群をリスト化するなどのデータ処理ができる. 本ソフトウェアは, Java言語によって開発しており, 多くのオペレーティング・システムで利用できる. (特開2005－73569)

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本研究では, トマト（Solanum lycopersicum）の矮性品種マイクロトムに由来するcDNAリソースの解析とデータベースの整備を進めている.
9つのマイクロトムcDNAライブラリーに由来するESTと公開されているトマトESTよりUnigene（KTU; Kazusa Tomato Unigene）を構築し, KTUの配列および機能アノテーション等の情報をMiBASE（http://www.pgb.kazusa.or.jp/mibase/）から提供している. 現在提供しているKTU3（KTU ver. 3）は, 計322,795個のESTから構築した76,276個のUnigeneから構成される.
また, 4つのマイクロトム完全長cDNAライブラリーから, 13,227個のHTC（High Throughput cDNA）が得られている. これらHTCに対して, 機能と構造のアノテーションを付加し, その情報をKaFTom（http://www.pgb.kazusa.or.jp/kaftom/）から提供している.
現在, これらのデータベースを統合したTOMATOMICSを構築中である.
[謝辞] 本研究は, ナショナルバイオリソースプロジェクト（NBRP）のサポートを受け, 佐藤忍先生（筑波大学）および有江力先生（東京農工大）の協力のもと, 実施されている.

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トマトはナス科植物のモデル植物であり、果実発達などユニークな特徴を有する次世代のモデル植物として期待される。ナショナルバイオリソースプロジェクトNBRP (http://tomato.nbrp.jp/)の一環として、筑波大学ではトマト矮性品種マイクロトムにおける突然変異誘発系統の増殖・保存および配布を行っている。0.3-1.0%のEMS処理と300Gyで照射したガンマー線処理を用いてそれぞれ4,371系統と6,422系統のM1変異誘発系統を得た。現在これらの種子増殖を行っており、増殖が完了したM3種子をリクエストに応じて提供可能である。一方、突然変異誘発系統の種子増殖過程で野生株と異なる表現型を示した変異体を854系統単離した。これらの変異体の表現型をカテゴリー別(Plant Ontology)で分類し，表現型探索データベースTOMATOMAに登録した。現在TOMATOMAを通して、登録した変異体種子の分譲を行っている。一方、トマトゲノム(930Mb)の約5倍の領域をカバーする、約54,000クローンのマイクロトムのBACライブラリーを作製した。BACライブラリーは145枚の384穴プレートから構成され、平均インサート長は約110kbであった。作製したBACクローンの両側エンドシークエンス、計108,000リードを現在解読中であり、解読終了後にDNA配列を一般公開する予定である。

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我々はマイクロトム完全長cDNAの取得および全長配列解読を実施し、2009年3月に13,227 cDNAクローンの完全長配列を公開している（KaFTom, http://www.pgb.kazusa.or.jp/kaftom/）。本発表では、この完全長cDNA配列の詳細な解析結果に関して報告する。インサートの平均長は1461 bpで、3’-UTRの長さが平均308 bpとシロイヌナズナよりもむしろイネに近い長さを示していた。また、10％程度のクローンがスプライシングバリアントであることが示された。推定されるタンパク質の機能分布をみると、大きな偏りなく様々な機能の遺伝子を網羅していた。他の16種の植物との比較から、トマト特異的cDNAには核酸・DNA・RNA結合機能に関連するものが多いことが示された。完全長cDNA配列をトマトゲノムBAC配列にマップしエクソン・イントロンの予測を行なうと、イントロンの平均長がシロイヌナズナやイネよりも長いことが明らかとなった。またエクソン領域からマイクロトム配列とゲノム品種Heinz配列との1塩基レベルでの差異は最大0.07%程度と評価された。トマト遺伝子は他植物よりも長いUTRやイントロンを持つ事が推定された。本研究の一部は平成20年度NBRPゲノム情報等整備プログラム「完全長cDNA配列解読によるトマトリソース高付加価値化」として実施された。

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トマトのポストゲノムシークエンス研究の推進のために、トマト栽培種で利用可能なSSRとSNPマーカーの開発と、連鎖地図の構築を行った。公的データベースから取得した229,086のトマトEST配列のアセンブルを行い、49,972のコンティグ (平均長775 bp)を得、5,607ヶ所のSNP候補を抽出した。このうち1,536のSNP候補について、GoldenGateアッセイにより、「Micro-Tom」、「Ailsa Craig」、および「M82」のタイピングを行った。これと同時に、「Micro-Tom」と「Ailsa Craig」、および「Micro-Tom」と「M82」の組み合わせの交雑に由来するF₂集団（それぞれAMF2とMMF2）の分離データを取得した。その結果、「Ailsa Craig」と「Micro-Tom」との間では646、「M82」と「Micro-Tom」との間では639の座で多型を検出した。AMF2連鎖地図には、646のSNPに345のSSRマーカーを加えた、合計991マーカーが座乗し、1,468 cMをカバーした。MMF2連鎖地図には、638のSNPが座乗し、1,126 cMをカバーした。これらのマーカーや連鎖地図は、トマトの生理形質や栽培特性などに関する遺伝子のマップベースクローニングための基盤として利用可能である。

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我々は、共生系のメカニズムやマメ科植物の多様性・有用性を解明するための基盤整備を目的として、マメ科のモデル植物ミヤコグサ(Lotus japonicus)のゲノム解析プロジェクトを進めている。
解析を行ったミヤコグサのゲノム情報のうち、1898のゲノムクローンを解析することにより得られた167 Mbpのゲノム配列情報と、平行して行ったwhole genome shotgun 法で得られた配列情報を合わせて、ミヤコグサESTの9割をカバーする315Mbpゲノム配列情報を、webデータベース、”miyakogusa.jp” [http://www.kazusa.or.jp/lotus]から2008年に公開した。データ公開後もゲノムクローンの解析を進めており、460クローン分の新規配列情報が蓄積された。そこで、これらの配列情報を加えて、ゲノムクローンによりカバーされる配列情報の更新を行った。その結果、ゲノムクローンでカバーされる領域が201Mbpとなり、その7割に相当する139Mbpの領域が確定配列となっている。この情報については、miyakogusa.jpから公開する。
この更新配列および予測遺伝子情報を基にミヤコグサとタルウマゴヤシ、ダイズのゲノムの比較解析を行った結果、これらのゲノムの間には高いレベルのシンテニーが検出され、ゲノム情報の相互活用も可能となっている。

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本研究は急速に技術が発達しているプロテオーム解析とトマトゲノミックリソースを利用することにより、成熟段階の異なる緑、黄、橙、赤のトマト果実を用いてクロモプラストに特異的なタンパク質を多数同定し、クロモプラストのプロテオームデータベース作りを行う。葉緑体からクロモプラストの分化に関与するタンパク質を網羅的に解析し、クロモプラスト分化の鍵遺伝子の候補の特定、分化メカニズムの解析を目的としている。成熟段階の異なるマイクロトム果実(緑、黄、橙、赤)を用いてNycodenz密度勾配遠心分離によりプラスチドを単離した。LC-MS/MSを用いて約440のプラスチドタンパク質を推定した。4ステージの成熟段階のうち橙ステージで最も多くのタンパク質を検出し、橙ステージのプラスチドは葉緑体とクロモプラストの両方の機能を持ち、光合成タンパク質とカロテノイドを含む代謝生産に関わるタンパク質が最も活発に発現していると考えられる。検出したタンパク質をトウガラシのクロモプラストプロテオームデータと比較したところ、共通しているタンパク質はわずか42個であり、トマトのクロモプラスト特異的なタンパク質を多数同定することができた。GOをもとに本研究で検出したクロモプラストタンパク質の約半分が代謝プロセスに関わっていることが分かり、クロモプラストは様々な代謝産物の生産と蓄積を行っていると考えられる。

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日本におけるダイズの8割以上が水田転換畑で栽培されており、その収量および品質を低下させる湿害の発生が問題となっている。ダイズの湿害発生機構を解明するために、出芽期のダイズに冠水処理し、早期におけるタンパク質の発現およびリン酸化状態の変動について検討した。播種後2日後のダイズ実生を冠水処理し、12時間後の根および胚軸からタンパク質を抽出し、CyDye 蛍光色素で標識後、二次元電気泳動解析により冠水処理と無処理間で比較し解析した。検出された555個のタンパク質スポットの内、発現レベルが顕著に変動していた17個のタンパク質スポットを質量分析計により同定した。その結果、冠水処理により解糖に関わるタンパク質の増加、またフェニルプロパノイド代謝に関わるタンパク質が減少していることが明らかになった。さらにタンパク質を二次元電気泳動後、Pro-Q ダイアモンド染色によりリン酸化タンパク質スポットを検出し、同様に比較解析および同定した。121個のタンパク質スポットのうち翻訳に関わるタンパク質を含む16個のタンパク質スポットのリン酸化状態が変化した。これらの結果はダイズの出芽期の湿害発生機構において解糖およびその解毒機構の誘導が主要な反応で、この早期の応答におけるタンパク質合成にリン酸化が関与していることを示唆する。

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遺伝子の発現は、転写因子がプロモーター領域のシスエレメントに特異的に結合することによって制御されている。従って遺伝子の発現制御を理解するためには、プロモーター中のシスエレメントを特定することが重要となる。しかし、真核生物（特に高等生物）におけるシスエレメントは6-8bpと短いものが多く、それらと相同な配列がゲノム上のあらゆる場所に高頻度で存在するため、既存の予測メソッドで見つかるものは少なかった。我々は、マイクロアレイ解析の結果と、配列の分布の関連性を利用した、より高感度なシスエレメント予測プログラム MAMA (Microarray Associated Motif Analysis program) を開発した。MAMAは、発現の誘導率の高い遺伝子のプロモーター中での保存性が高く、転写開始点付近に高頻度に存在する配列を抽出する。MAMAを鉄欠乏ストレスのイネ、塩ストレス処理をしたシロイヌナズナ、およびcAMP作動物質Forskolin処理をしたヒトのマイクロアレイ結果に適用した。いずれの場合も、これらの処理で機能すると報告されているシスエレメントを最上位に含む結果が得られた。MAMAがシスエレメントを予測する能力が高いことが示された。前回の発表で、メソッドの概略を報告したが、今回、上記の予測で得られた新たなシスエレメント候補について詳細に報告する。

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Cyanidioschyzon merolae (以下シゾン) は核、葉緑体、ミトコンドリアがそれぞれ一つずつという非常に単純な細胞構造を持つ単細胞性の紅藻である。ゲノム情報を用いた分子系統解析からも植物細胞の祖先生物に近い生物であることが示唆されており、植物細胞の基本機能を解析するモデルとして研究されている。また、分子生物学的解析法の構築も進んでおり、近年、一過的遺伝子導入法や遺伝子破壊法も確立された。
今回、我々はシゾンにおいてGFPを用いたタンパク質の局在解析法を構築した。GFPを発現させるためのプロモーターとしてapcC(CMO250C)に着目した。apcC は葉緑体に局在するフィコシアニンロッドリンカータンパク質をコードする遺伝子である。apcCの上流領域をGFP上流に組み込んだプラスミドをシゾン細胞へ一過的に導入し、蛍光顕微鏡を用いて解析したところ、GFPの蛍光が細胞質から検出された。またapcCの上流に加え、apcCのORF領域を組み込んだ場合ではGFPの蛍光は葉緑体から検出された。さらにヒストンH3をコードするCENH3 (CME099C)をGFPと融合させシゾン細胞内で発現させるとGFPの蛍光は核に集中した。以上の結果よりGFPを用いた局在解析法の有効性がシゾンにおいても示された。

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光非依存型プロトクロロフィリド（Pchlide）還元酵素（DPOR）は、（バクテリオ）クロロフィル生合成系においてポルフィリンD環を立体特異的に還元しクロロフィリドa（Chlide）を生成する反応を触媒する。DPORは、L-タンパク質とNB-タンパク質から構成され、各々ニトロゲナーゼのFe-タンパク質とMoFe-タンパク質と構造的に類似している。ニトロゲナーゼと同様にDPOR反応においてもATPの加水分解がChlide生成に必須であることは示されているが、その化学量論は未確定である。本研究では、Rhodobacter capsulatusのL-タンパク質とNB-タンパク質を用いて、様々なL-タンパク質／NB-タンパク質の量比（L/NB比）でDPOR反応を行い、ATP加水分解量とChlide生成量を検討し、その化学量論について考察した。ATP加水分解量は生成したADPをHPLCで分離することにより定量し、Chlide生成量は分光学的に定量した。その結果、Chlide 1分子当たりのATP加水分解量（ATP/2e^-）は、L/NB比が高くなるほど直線的に増加し、この直線を外挿すると4という最小値が得られた。この値はニトロゲナーゼとよく一致しており、ATP加水分解に共役した電子伝達機構がDPORとニトロゲナーゼの間で保存されていることを示唆している。

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Mg-キラターゼはクロロフィル合成の第一段階を触媒する酵素で、CHLI, CHLD, CHLHサブユニットから構成される。CHLHは基質や生成物であるポルフィリンと結合しMg2+配位を触媒する。また葉緑体局在のアブシジン酸受容体であると報告されている。さらにCHLHの変異体は、葉緑体から核へのシグナル伝達に異常を来したgun表現型を示す。昨年の大会で、我々はシロイヌナズナのgun表現系を示すCHLH変異タンパク質を作製し、in vitroにおけるポルフィリン結合性の解析結果を報告した。今回、CHLH-ポルフィリン複合体が光により急速に分解を受けることを見出した。この光分解はin vitroにおける野生型CHLHのポルフィリン結合の解離定数と相関を示し、生成物Mg-プロトポルフィリンIXより高い親和性を示す基質プロトポルフィリンIXとの結合により、より顕著な分解が認められた。in vivoにおけるCHLH量を解析した結果、通常の生育条件でgun変異体cchにおいて、CHLHが過剰蓄積していることを見出した。遺伝子発現解析では差が認められなかったため、翻訳後のポルフィリンとの結合によるタンパク質分解がCHLH蓄積に関与していると考えられる。本発表ではCHLHの光分解の生理的意義について議論を行う。

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多くの植物は塩ストレスに弱くシロイヌナズナでは200mM NaClの塩ストレスにより生育阻害を受ける。しかし、海草アマモ(Zostera marina)は単子葉植物でありながら海水中(約500mM NaCl)に生育している。アマモから耐塩性に関わる遺伝子を探索するため大腸菌を用いてスクリーニング行った結果、十数種の候補遺伝子を得た(大堀ら, 2009年大会)。アミノ酸配列を解析したところ、候補遺伝子のうち1つはサイクロフィリンの活性に必要な保存モチーフを持っており、このサイクロフィリン様遺伝子をZmCyp1と仮称した。ディプロイドノックアウト法により、出芽酵母ena1破壊株(200mM NaCl感受性株)を作製した。ena1破壊株にADHプロモーター下でZmCyp1を発現させたところ、約170mM(1%)NaCl添加培地上で生育が回復した。現在35Sプロモーター下でZmCyp1を過剰発現させたシロイヌナズナを用いて塩・乾燥ストレスによる影響を調べている。

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真核生物のmRNAの 5'リーダー領域には、upstram ORF (uORF) と呼ばれる小さなORFがしばしばみられる。その中でuORFにコードされるペプチドが下流ORFの翻訳制御に関与する例が、これまでにいくつか報告されている。我々は、シロイヌナズナにおいてuORFぺプチドにより制御される遺伝子を新たに同定することを目的として、転写因子をコードする遺伝子の中から5'リーダー領域にuORFを含む遺伝子を検索し、その中からuORFのアミノ酸配列依存的に下流ORFの発現に影響がみられるものを新たに5つ同定した。そのうちの1つであるAtNAC82遺伝子はAtNAC103遺伝子と高い相同性を示し、両者の間ではuORFのアミノ酸配列にも高い相同性がみられる。しかし、AtNAC82 uORFのアミノ酸配列が下流ORFの翻訳制御に重要であるのに対し、AtNAC103 uORFのアミノ酸配列を変えても下流ORFの発現に影響はみられなかった。AtNAC82 uORFペプチドのどの領域が制御に重要であるかを調べたところ、AtNAC103 uORFと相違のみられるC末端側の領域が制御に重要であることが示された。また、NAC遺伝子の中でuORFのアミノ酸配列が植物間で保存されているものをもう一つ見出しており、そのuORF配列の下流ORFの発現への影響についても現在解析を行っている。

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The plant metabolome is extremely diverse comprising several thousands of chemical compounds. Current approaches for profiling the metabolome are hampered by the fact that no analytical platform can give comprehensive coverage of all biological metabolites. A promising way to work around this problem is to use several complementary analytical platforms in parallel and combine the resulting data sets. However, stitching together data from different platforms poses several theoretical and practical challenges for how to best normalize and summarize the data to obtain a consensus data set. Here we present a novel strategy for solving this task and a freely available software tool that implements our ideas. To validate our method we tested it on an experimental data set obtained using both GC-, and CE-MS and show its performance in comparison with alternative approaches.

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αカロテンとその誘導体（ルテインやシフォナキサンチンなど）の存在は一部の光合成生物に限られている。αカロテンのε末端基と共役二重結合の間はC-6’がキラルなため(6’R)と(6’S)タイプを取り得るが、(6’R)タイプのみが報告されている。本研究ではこれらの点を検証するために、αカロテン類の分布を再検討し、単離精製して円偏光二色性あるいは核磁気共鳴分析より(6’R)か(6’S)タイプかを決定した。
αカロテン類の分布：真正紅藻、クリプト藻、ユーグレナ藻、クロララクニオン藻、プラシノ藻、緑藻、アオサ藻、車軸藻、陸上植物に分布は限られ、灰色藻、原始紅藻、不等毛植物、ハプト藻、渦鞭毛藻からは見つからなかった。
αカロテンの立体異性：全て(6’R)タイプであった。植物ではリコペンの右側がリコペンεシクラーゼによりε末端基に、左側がリコペンβシクラーゼによりβ末端基に変化してαカロテンが合成される。この2種類の酵素は相同性が高く、βシクラーゼからεシクラーゼができたと考えられている。反応としては環化するとき、H⁺が脱離する炭素とその方向によりβ、(6’R)ε、(6’S)ε末端基が作られる。これらを合わせるとεシクラーゼ側に(6’R)か(6’S)ε末端基を決める要因は無いと思われる。従って(6’R)タイプのみが存在することは、結合タンパク質側に立体異性を規制する要因があると思われる。

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真核生物の系I複合体における詳細な反応機構の解明、および他の光合成生物の系I複合体との相違点を探ることを目的として、最古の植物とも呼ばれる好熱・好酸性原始紅藻Cyanidioschyzon merolaeから健全な光化学系I（系I）および光化学系II（系II）複合体を精製し、生化学的な解析を行った。系I複合体は単量体であり、シアノバクテリアの屐子複合体には含まれていないPsbOタンパク質や集光性クロロフィルタンパク質LHCIが結合しているという特徴が見出された。第二次電子受容体A1は、広範な光合成生物でフィロキノンであるが、C. merolaeではメナキノン-4であった。チラコイド膜をBlue-Native PAGEにより展開すると、分子量の異なる2種類の系I複合体が検出され、LHCIの結合数（アンテナサイズ）の異なる複合体が存在する可能性が示された。系II複合体は単量体であった。また、タンパク質組成は系I複合体の場合とは異なり、シアノバクテリアのものとよく一致した。そして、シアノバクテリアにはみられない未知の低分子量タンパク質の存在が確認された。これらの結果は、原始紅藻C. merolaeの光化学系は、高等植物に類似した系I複合体とシアノバクテリアに相同の系II複合体の組み合わせであることを示し、葉緑体の進化の過程を示唆するものである。

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近年、X線結晶構造解析によりSynechococcus elongatusの光化学系I（PSI）には反応中心当り4分子の脂質（1分子のMGDGと3分子のPG）が結合していることが明らかになった。今回、Synechocystis sp. PCC 6803 において、Hisタグを付加したPsaJサブユニットを発現する株（J-His）を用いてPSIを精製し、生化学的方法によりPSIに含まれる脂質を分析した。その結果、Synechocystis sp. PCC 6803のPSIには反応中心当り6分子の脂質（2分子のMGDG、1分子のDGDG、1分子のSQDG、2分子のPG）が検出された。新奇に同定された糖脂質であるDGDGのPSIにおける役割を調べるため、J-Hisにおいて、DGDG合成酵素の遺伝子を破壊し、DGDG合成欠損株を作製した(dgdA /J-His)。この株から分離したチラコイド膜及び精製したPSIの酸素吸収活性を測定したところ、双方において活性がJ-Hisよりも30%程度低かった。精製したPSIをBN-PAGEにて分離すると、J-Hisは常に三量体が殆どを占めていたが、dgdA /J-Hisの場合、殆どが単量体で占められていることがあった。これらの結果から、DGDGはPSIの三量体の安定化や、活性の維持に重要な役割を果たしていることが明らかになった。

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好熱性シアノバクテリアThermosynechococcus(T.) elongatusから単離した光化学系I（PSI）反応中心複合体をアルミナ－シリカ多孔体薄膜(NAM)内のnmサイズのシリカ孔中に導入した。NAMは、アルミ基盤の陽極酸化により、マクロ細孔をもつ多孔体アルミナを生成し、その内部にさらに直径50 nmのシリカメソ多孔体多数を導入し細孔を形成した複合メソポーラス膜である。直径4.3 cm、厚さ60 μmの円盤形状薄膜で、細孔は膜面垂直方向に貫通している。カタラーゼを導入すると、耐性が向上することが報告されている[1]。
シアノバクテリアPSIは、直径21 nm、厚さ9 nmの3量体を形成し、その中にクロロフィル約300分子を含む巨大な膜タンパク質色素複合体である。導入したPSIは膜表面には吸着せず、顕微分光から殆ど細孔内部に存在する事を確認した。光化学活性は保持され、細孔内部のPSIは、薄膜表面に対して、膜面垂直方向が平行に配向（シリカの壁にPSIの膜内露出部分が接触する形で配向）していることがわかった。
発表ではNAMに導入し配向させたPSIの性質、光反応、電子伝達体の光還元で細孔内部にどのような電場分布が現れるかを議論する。

[1] T. Itoh et al. J. Mol. Catal. B: Enzym. 2009, 57, 183-187.

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C3位にビニル基を持つ、モノビニル(MV)-クロロフィル(Chl)は光合成において最も普遍的に存在するクロロフィルである。その例外の一つとして、海洋性のシアノバクテリアであるProchlorococcus spp. が存在し、C3およびC8位にビニル基を持つジビニル(DV)-Chl a を結合している。本研究では、形質転換可能なシアノバクテリアSynechocystis sp. PCC 6803のslr1923遺伝子を欠損させ、全てDV-Chl a となった異性株から光化学系II (DV-PS II)を単離精製し、その性質を解析した。その結果、DV-PS IIは光照射による退色速度がMV-Chlを結合したPS IIより速いことを観測した。また、光照射においてD1タンパク質の分解が促進された。D1タンパク質分解産物の分子量からアクセプター側で光阻害が促進されているものと推測される。この光阻害は一重項酸素に起因すると考えられているため、我々は近赤外領域において、光照射にともない発生する一重項酸素の測定を行った。その結果、MV-Chl a は溶液中においてDV-Chl a より一重項酸素の消去効率が大きいことを明らかにした。DV-PS IIにおける一重項酸素の発生効率においても、現在検討を行っている。本大会ではこれらDV-PS IIの性質について議論する。

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Acaryochloris属は主要色素としてChlorophyll (Chl) d を結合するシアノバクテリアである。我々は、2007 年の本大会において、Acaryochloris marina MBIC 11017 から光化学系IIを単離し、そのspecial pairがChl d二量体であること、第一電子受容体がPheophytin (Pheo) a であることを報告した。しかし、この時の標品はアンテナタンパク質としてCP43´を結合しており、2分子当たりのPheo aにつき約55分子のChl aが結合していた。そこで、本研究では光化学系IIの単離精製方法を改良して、より結合Chlの少ない標品の調製を試みた。その結果、CP43´の結合していない、Pheo a 2 分子あたり29.6 ± 1.2 分子のChl dおよび1.9 ± 0.1 分子のChl aを含み、かつ高いDPC-DCIP 光還元活性を保持した標品を精製することに成功した。また、Chl dの減少により、80 Kにおける吸収スペクトルにおいて672 nm近傍にChl a由来と思われる新たな吸収ピークが観測された。今後、アンテナChlの減少したこの標品を使うことにより、よりS/Nの高い分光測定が期待できる。現在、より詳細な本精製標品の性質を解析中である。

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酸性温泉藻Cyanidioschyzon merolae は2004年に真核藻類として初めて全ゲノムが解読された原始紅藻である。C. merolaeの光化学系II複合体 (PS II)の単離は、昨年度の本大会において高橋（兵庫県立大）らによって報告された。一般に光化学系IIの表在性タンパク質は一様ではなく、PsbOタンパク質は共通しているものの、他のサブユニット組成は種によって異なり、3～5のサブユニットの存在が報告されている。C. merolaeのPS IIには、同じ原始紅藻のCyanidium caldariumと同様に、4種の表在性タンパク質PsbO, PsbQ, PsbV, PsbUが結合していた。好熱性シアノバクテリアの結晶構造解析から、PsbO, PsbU, PsbVの光化学系IIにおける局在部位は明らかとなっているものの、PsbQに関する局在情報はC. caldariumにおいて、単独でPS II膜タンパク質に結合することが報告されているのみである。そこで、我々はPsbQがPS II膜タンパク質のどのサブユニットと結合しているかを明らかにするために、2種類の距離の異なる架橋試薬を用いて、抗体反応により架橋産物の検出を試みた。現在、これら架橋関係を用いてPsbQの局在位置の検討を行っている。

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紅藻は原核生物に最も近い真核藻類の一つであり、その光化学系はシアノバクテリアから高等植物へ移行している段階にある。紅藻の光化学系II複合体(PSII)はPsbQ'を含む4つの表在性タンパク質を持っており、シアノバクテリアや高等植物のPSIIと異なっている部分がある。これまでシアノバクテリア由来PSIIの構造は2.9Å分解能で報告されているが、真核生物由来PSIIの構造は報告されていない。我々は紅藻PSIIの構造を解明するため、Cyanidium caldariumからPSIIを精製・結晶化し、これまで3.5Å分解能の回折データ収集に成功した(Adachi H., Umena Y., Enami I., Henmi T.,Kamiya N., Shen J-R.(2009) BBA 1787, 121-128)。本研究では、紅藻PSII結晶の分解能を向上させるため、PSIIの精製方法と結晶の凍結条件の改善を行った。カラムクロマトグラフィーにより調製したcrude PSIIを、2回繰り返し結晶化を行うことにより高純度なPSII標品を得た。この標品を用いて結晶化し、得られた結晶の脱水処理を2回行うことにより結晶中のパッキングを密にし,分子の配列を整えた。さらに脱水処理に用いる溶液の組成を最適化させ、分解能を2.9 Åまで向上させることに成功した。

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