微小管およびアクチン繊維は植物の発生、形態形成に深く関わっている。ヒメツリガネゴケは、体制が単純であり細胞分裂や細胞伸長などの様々な現象を一層の細胞層の組織で観察できるため、各々の現象に伴う細胞骨格の動態の解析に非常に適している。また、相同遺伝子組み換えにより外来遺伝子をゲノム内の特定の領域に挿入することができ、導入遺伝子の働きを再現性良く解析できる。我々は、ヒメツリガネゴケにおける微小管およびアクチン繊維の動態を調べるため、GFPとヒメツリガネゴケのα-tubulinとの融合コンストラクト（GFP-α-tubulin）、およびGFPとマウスのアクチン結合タンパク質タリンのアクチン結合ドメインとの融合コンストラクト(GFP-talin)を作り、イネアクチンプロモーター下で発現させた。挿入部位は、HD-Zip 遺伝子の一つであるPphb7 遺伝子領域を用いた。Pphb7遺伝子は発現および機能解析が詳細に行われており、仮根以外の組織では発現が認められず遺伝子破壊株の表現型も仮根以外には認められない。したがって、この部位にレポーター遺伝子が挿入された株は、仮根を除く全ての成長過程で微小管およびアクチン繊維の動的な変化を生体観察できる。本発表ではヒメツリガネゴケ配偶世代において見られる様々な現象（細胞分裂、先端成長、葉緑体運動など）に伴う微小管およびアクチン繊維の動態を報告したい。

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目的： 稲の低温誘導性遺伝子として単離したlip19は、bZIP(basic region leucine zipper)タンパク質をコードすることから低温ストレス時における遺伝子発現の制御に関与すると思われるが、その詳細は不明である。従ってLIP19の機能解明を目的とした。
方法と結果： LIP19はそれ自身では二量体形成能やDNA結合能を欠失している。昨年、本大会で酵母two-hybrid systemを用いてLIP19と相互作用するタンパク質をコードするクローンとしてOsOBF1の単離を報告した。後者の遺伝子産物はトウモロコシ由来のbZIPタンパク質OBF1と高い相同性を示した。今回、LIP19とOsOBF1の相互作用についてpull-down検定法により再確認した。さらにLIP19の細胞内局在性、LIP19の二量体形成ができない理由がロイシンジッパー部分に有る事、OsOBF1とlip19の稲葉身での空間的発現部位が同じである事等を明らかにした。両遺伝子の低温に対する発現が相反することを踏まえ、LIP19の低温ストレス時の機能を考察する。

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発芽後7日目のイネ幼植物(ゆきひかり)を5℃の低温で処理すると、ポリアミンの生合成に関与する、S-アデノシルメチオニン脱炭酸酵素(SAMDC)遺伝子の発現が増加することを既に報告した。SAMDCは、プトレシン(Put)からスペルミジン(Spd)やスペルミン(Spm)が生合成される酵素反応を触媒するため、今回は低温処理に伴うSpdやSpmの増加を調べた。その結果、予想に反して地上部(茎葉)ではSpdやSpmは殆ど変化せず、代わりにPutが増加することがわかった。これに関連して、種々の環境ストレスがイネのポリアミン生合成に及ぼす影響を詳しく調べたところ、茎葉では5℃の低温処理以外に、12℃の穏やかな低温や冠水処理によって、Putのより顕著な増加が起こることが判明した。また、以前から指摘されてきた、低温処理に伴うPut増大へのABAの関与を調べるため、イネ幼植物にABAを投与してPutの変動を調べた。その結果、ABA処理によって根のPutは増加するが、茎葉のPutはやや減少することが明らかになった。これらの事実から、12℃の穏やかな低温や冠水処理で誘導される茎葉のPutの蓄積には、ABAが関与している可能性が低いことが示唆された。その他、Putの生合成に関わるアルギニン脱炭酸酵素(ADC)遺伝子やオルニチン脱炭酸酵素(ODC)遺伝子の、環境ストレス応答に伴う発現量の変化について報告する。

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植物膜脂質の主要構成要素であるトリエン脂肪酸は、生育の温度環境に応じてその含量が変動し、植物の温度適応に重要な役割を果たしている。トリエン脂肪酸の生成は、小胞体および葉緑体膜に内在するω-3デサチュラーゼにより触媒される。シロイヌナズナでは葉緑体型イソ酵素としてFAD7、FAD8 の2つが存在し、特にFAD8 の発現は環境温度の変化に応じて調節されることが示唆されている。われわれは生体内におけるFAD7、FAD8の構造と温度変化との関連について、非変性ゲル電気泳動法(Blue Native PAGE)を用いて調べた。高温または低温環境において生育させた植物の葉組織から調製したタンパク質を同法により分離し、両イソ酵素の機能構造の分子量を推定した。FAD7、FAD8の単量体サイズはともに40kDa程度と予測されるが、FAD7は生体内において80kDa程度の複合体を形成していることが示唆された。一方FAD8は、複合体および単量体として検出され、これら2種の構造体の量比は生育温度に依存して変動した。単離葉緑体から調製したタンパク質を用いた実験では、FAD7、FAD8はいずれも複合体として検出され、単量体型FAD8は検出されなかった。これらの結果は、FAD7、FAD8はいずれも複合体として機能し、単量体として検出されたFAD8は、葉緑体膜に組み込まれる以前の未成熟の構造体である可能性を示唆している。

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シロイヌナズナを含め、温帯域に生息する高等植物は、外気温の低下に伴い自らの凍結に対する耐性（耐凍性）を増大させる。この現象は低温馴化として知られ、CBF/DREB1 (C-repeat binding factor/Dehydration responsive element binding protein 1)　転写因子の発現が低温馴化を促進することがわかっている。しかし、耐凍性増大のしくみはまだ十分にわかっていない。我々は、耐凍性増大の機構を明らかにする目的で、シロイヌナズナのT-DNAタギングラインから、低温馴化につづき脱馴化させた際に高い耐凍性を維持する突然変異体を選抜してきた。今回、野生型植物体に較べて顕著な耐凍性の上昇を示す突然変異体freezing tolerant 1 (frt1) を単離したので報告する。frt1は脱馴化時のみならず未馴化時や低温馴化時にも野生型より高い耐凍性を示したが、CBF/DREB1やその下流のCOR (Cold-regulated) 遺伝子群の転写産物レベルは野生型と殆ど違いがみられなかった。また、プロリンの蓄積レベルは野生型よりもやや低かった。一方、frt1は野生型よりも恒常的に高い糖レベルを示したので、frt1の示す耐凍性表現型は植物体内での糖の蓄積によるものと考えられた。今回の発表では、このfrt1変異体の生理学的解析の結果を報告する。

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植物個体における凍結耐性付与機構に関しては多くの研究があるが、その結果は非常に複雑な様相を示し、凍結耐性増大に関与する個々の要因を解剖してその貢献機構を解明することが困難な場合が多々ある。そこで、我々はシロイヌナズナT87縣濁培養細胞を用いて低温馴化過程における凍結耐性付与機構を明らかにし、植物個体と培養細胞間の耐性付与機構や遺伝子発現様式の違いを解析することを目的に研究を開始した。異なった成長段階（誘導期、対数期、定常期）におけるT87懸濁培養細胞の凍結耐性を測定したところ、誘導期の細胞で低温馴化2日処理した時に最大凍結耐性が得られ、より長い低温馴化では凍結耐性増大が見られない事が明らかになった。その時の低温誘導性遺伝子（DREB1A、RD29A、COR15a）は、低温馴化6～24時間で発現が誘導された後、急速に発現量が減少していた。一方、培地中のショ糖含量を増加させて低温馴化を行ったところ、低温馴化による凍結耐性の増大が長い期間持続されることを見いだした。この時の低温誘導性遺伝子発現、細胞内外の浸透濃度や糖含量の変動を現在解析している。これらの結果は、植物個体と比較して培養細胞の低温馴化による凍結耐性変動パターンが異なっていること、培地中の糖含量によって低温馴化カイネッティクスが影響を受けることを示しており、今後、遺伝子発現プロファイルを比較し、低温馴化に関わる要因の解析を進めていく予定である。

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植物の耐凍性は、細胞膜の構造的・機能的損傷を回避する機構によって左右されていると考えられている。低温馴化の過程で生じる生理的な変化の中でも、細胞膜に関連したタンパク質が耐凍性獲得に果たす役割は重要であると考えられるが、その機能については不明な点が多い。本研究では、Arabidopsisの低温馴化の過程におけるプロテオーム解析によって同定された、量的に変動する種々の細胞膜タンパク質の情報に基づき、細胞膜タンパク質の可溶化される成分に含まれ、低温馴化によって顕著に増大するlipocalin-likeタンパク質に着目して解析を行った。lipocalin-likeタンパク質をコードする遺伝子は低温馴化1日目までに発現が増大するが、その後は減少する。それに対し、細胞膜タンパク質に占める量は低温馴化7日目まで増大を続けることから、低温馴化の過程におけるlipocalin-likeタンパク質の挙動を明らかにするため、局在性の解析を行った。さらに、耐凍性の獲得におよぼす影響をin plantaで明らかにするため過剰発現形質転換体を作成し、植物組織およびプロトプラストでの耐凍性評価を行った結果、lipocalin-likeタンパク質の蓄積により、野生型と比較して耐凍性の向上がみられた（本研究は生研機構の援助によって遂行された）。

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大気中の酸性物質を含む酸性雨が植物の生育や代謝に影響を与えることはすでによく知られている。しかし、酸性雪が積雪地域の越冬性植物に与える影響についてはほとんど調べられていない。そこで本研究では、酸性雪が越冬性植物の生存にどのような影響を及ぼすのかを簡易的に評価するために、組織切片を用いて酸性条件下での耐凍性試験を試みた。試料には低温馴化させた冬小麦（Triticum aestivum L. cv. Chihokukomugi）緑葉の切片を用い、硫酸でpHを調整した酸性溶液を添加し平衡凍結法による耐凍性試験を行った。凍結融解後の試料の生存率を測定すると、pH 4.0や3.0の酸性凍結処理は対照区の純水(pH 5.6)での凍結処理とほぼ同程度であった。一方、pH 2.0の凍結処理では対照区よりも生存率が著しく低下していた。この酸性凍結の場合、植氷した試料を直ちに4℃に移してゆっくり融解させても生存率はほとんど低下しなかった。同様の試料を緩速冷却によって平衡凍結すると、凍結処理温度の低下に伴って生存率が低下し純水凍結との差が徐々に大きくなった。-12℃での純水凍結処理の生存率は約40%であったのに対して酸性凍結処理では約10%であった。また、pH 2.0の酸性溶液を添加した試料を-12℃まで過冷却させると、生存率はとほんど低下せず約90%であった。これらの結果から、冬小麦の緑葉を硫酸共存下で凍結融解すると著しく凍結傷害を被ることが明らかになった。

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生物は生育温度の低下に応答し、適応する能力を持っている。その過程で、低温への適応に必要な様々な遺伝子の発現が誘導され、低温への耐性を獲得する。しかし、その発現調節機構の全容はいまだ明らかとなっていない。光合成生物においては、光照射下での低温へのシフトは、生育温度の低下であると同時に相対的な光強度の増加として働き、光化学系の酸化還元状態に影響を及ぼす。このような複合的な影響が、低温への応答機構の解明を複雑なものとしている。今回、シアノバクテリアAnabaena PCC 7120における低温シフトによる遺伝子発現の変化を、光照射下と暗所で解析し、光の有無に関わらず低温により発現が調節される遺伝子を同定した。
　マイクロアレイ解析は、光照射下での低温シフト、暗所へのシフト、そして暗所での低温シフトの3条件で行った。その結果、光照射下での低温シフトにより発現量が変化する遺伝子は、大きく4グループに分けられた。（1）いずれの環境変化にも応答するもの、（2）光の有無に関わらず、低温に応答するもの、（3）光照射下でのみ低温に応答するもの、そして（4）光照射下で低温にすることで発現量が変化するが、温度に関わらず暗所への移行においてその逆の変化を示すものである。グループ2に含まれるORFに関してさらに解析を行い、光の有無に関わらず低温により転写産物量が増加するORFを15個同定した。

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RNA helicases play important roles in various aspects of RNA metabolism, such as ribosome biogenesis, translation initiation and mRNA degradation. In general, RNA helicases are enzymes that unwind base paired RNAs. In the present study, we mutated the crhL gene for a cold-inducible RNA helicase with complete segregation of the native copy of the gene in Synechocystis sp. PCC 6803. The mutant of the RNA helicase (ΔcrhL) exhibited a phenotype of slow growth at low temperatures. DNA microarray and Northern blotting analyses indicated that the ΔcrhL mutation decreased the transcript levels of the groESL1 operon that encode the 10-kDa chaperonin and the 60-kDa chaperonin1 and the groEL2 gene that encode 60-kDa chaparonin2 under cold stress. The ΔcrhL mutation did not affect the stability of groESL1 transcript under cold stress. The involvement of RNA helicase in regulation of the expression of groESL1 and groEL2 genes will be discussed.

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我々は、少なくとも主要な熱ショックタンパク質(HSP)がシアノバクテリアの熱耐性獲得に重要な役割を果たすことを示してきた。In vitroの研究により、低分子量HSPとHtpG (Hsp90 family)の主な機能は、変性タンパク質と結合し天然構造への折れたたみ可能な状態の維持であると考えられている。シアノバクテリアの低分子量HSP（HspA）やHtpG遺伝子破壊株は、高温における生育阻害や獲得性熱耐性の顕著な減少などの類似の表現型を示す。そこで、HspAとHtpGが相補可能な細胞機能を有するのかどうかを明らかにすることを本研究の目的とした。
まず、HtpG破壊株にHspAを構成的に大量発現するシャトルベクターを導入し、相補試験を行った。HspAは変異株の高温における生育および生存率を改善させることができなかった。これは、HtpGの機能がHspAのそれとは異なることを示唆している。HtpGとHspAが標的タンパク質を限定した特殊な細胞機能を果たすのではないかと仮定して、現在、これら分子シャペロンの標的タンパク質の同定を試みている。

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フィコビリソームはシアノバクテリアに存在する200以上の分子からなる巨大な集光性色素タンパク質複合体である。我々は、低分子量熱ショックタンパク質(HspA)を構成的に大量発現するSynechococcus sp. PCC 7942変異株とその対照株から、ショ糖密度勾配超遠心分離法でフィコビリソームを単離し、その構成タンパク質を比較した。さらに、精製HspAと精製フィコビリソームを用いたin vitroでの解析を行い、フィコビリソーム構成タンパク質がHspAの標的となりうることを昨年の本学会で発表した。
本研究では、十数種からなるフィコビリソーム構成タンパク質のどのタンパクとHspAが特異的に相互作用するのかを明らかにすることを目的とした。精製HspAと精製フィコビリソームを混合し、0.3% 過酸化水素存在下で50℃、15分間の熱変性処理を行い、ショ糖密度勾配超遠心分離法で生成物を分離したところ、HspAはフィコシアニンまたはアロフィコシアニンと相互作用することが示唆された。現在はαとβのフィコシアニン各サブユニットを単離精製し、HspAとの直接的な相互作用を解析している。

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DNA microarray analysis revealed salt stress enhances the expression of several HSP genes in Synechocystis sp. PCC 6803. Higher enhancement in the case of hspA suggested its role in the protection from salt stress. As a consequence, we studied a deletion mutant of hspA (HK-1) at various salt stresses and examined the expression patterns of some of the HSP genes. To our surprise, HK-1, survived to a higher level after a direct lethal salt treatment, constitutively accumulating higher level of groESL1 and groEL2 transcripts at 30^oC, compared to wild type. However, HK-1 failed to acquire tolerance by moderate salt pretreatment in contrast with wild-type cells. Salt stress influenced groEL2, htpG and dnaK2 transcript accumulation by specific stabilization of these transcripts. Electron micrographs at various salt stresses showed HK-1 failed to undergo changes in ultrastructure that wild-type cells experienced. This further confirms the role of hspA in salt stress management.

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Synechocystis sp. PCC 6803株は鉄欠乏条件下でCP43’およびフラボドキシンをコードするisiABオペロンを発現誘導させる。このオペロンは高温、酸化ストレス条件下でも発現することが最近明らかにされた。そこで、isiA/isiBおよびisiB遺伝子破壊株を用いてこれらのストレス耐性獲得に果たすCP43’およびフラボドキシンの役割解明を本研究の目的とした。5 μM methylviologenの存在下では、isiA/isiBとisiBの両変異株に生育阻害、光合成色素量の減少、生存率の低下がみられた。isiAに比べ、isiB破壊株の方が酸化ストレスに対する著しい感受性を示した。穏やかな高温（42℃）では、isiA/isiB破壊株のみに顕著な生育阻害、光合成色素の減少がみられた。致死温度処理（48℃）後の生存率は、野生株の3.7%、isiB破壊株の0.75%に対して、isiA破壊株は0.0098%で、明確な高温感受性を示した。isiABオペロンを形成するにもかかわらず、isiA/isiBとisiB破壊株は高温ストレスと酸化ストレスに対する異なる表現型を示した。これらの結果は、CP43'とフラボドキシンが、酸化及び熱ストレス条件下で重要な役割を果たすことを示すものである。

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　優れた乾燥強光耐性を示す野生スイカの葉組織では、強光乾燥ストレスに伴い活性酸素消去能に優れたシトルリンが高蓄積される。この蓄積機構を解明するために、初発段階と第5段階を同時に触媒する酵素glutamate acetyltransferase (GAT)に注目し、機能解析を行った。
　まず、野生スイカの葉からGAT酵素を精製した。精製酵素は、2つのサブユニットから構成されていた。それぞれのポリペプチドのN末端アミノ酸配列は、シロイヌナズナの GATホモログの37から49番目のアミノ酸、249から283番目のアミノ酸とそれぞれ相同性を示した。また、5’-RACEにより得られたスイカGATのcDNAを解析したところ、葉緑体移行シグナルペプチドの存在が推定された。このことから、野生スイカのGAT酵素前駆体は葉緑体に移行し、酵母のミトコンドリアGATと同様に自己触媒的切断によって2つのサブユニットが形成されると想定している。
　次にGATの酵素学的性質を解析したところ、酵母GATと異なり、シトルリン、アルギニンによるフィードバック阻害は認められず、至適温度は70^οCと高い値を示した。また乾燥強光条件下で野生スイカは、水分の蒸発を防ぐため気孔の閉鎖し、葉面温度が約45^οCに達する。これらの結果に基づいて、GATの乾燥強光時のシトルリン蓄積における役割を考察する。

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　コリンモノオキシゲナーゼ(CMO)は、コリンをベタインアルデヒドに酸化する酵素で植物のベタイン合成のキーエンザイムといわれている。植物から精製したCMOは失活しているためか異常に活性が低い。そこでホウレンソウからコリンモノオキシゲナーゼ遺伝子を単離し、その分子的性質について検討した。コリンモノオキシゲナーゼ遺伝子はホウレンソウのcDNAライブラリーからPCR法で単離した。単離した遺伝子をpETベクターに組み込み、大腸菌で発現させた後、精製し抗体を作成した。大腸菌のbetオペロンのコリンデヒドロゲナーゼ遺伝子をCMO遺伝子に交換してもベタインを蓄積したが、CMOのCys181、His287を他のアミノ酸に変えると蓄積しなかった（J. Biol. Chem., 277, 41352-41360 (2002)）。コリンモノオキシゲナーゼ遺伝子をアラビドプシスに導入した形質転換植物を作出した。また、ホウレンソウのコリンモノオキシゲナーゼとベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼの両遺伝子をアラビドプシスに導入した形質転換植物も作出した。これら形質転換植物の塩・高温・低温等のストレスに対する耐性について検討した結果についても報告する。

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水分屈性における水分濃度勾配の感知や情報伝達に関する分子機構は未だ解明されていない。そこで分子レベルでの水分屈性機構の解明を目的として、当研究室で開発したシロイヌナズナの水分屈性検定法を用いて、屈水性の低下した変異体の選抜を行った。その結果、4860系統のT-DNA挿入種子から、重力屈性は正常で、水分屈性にのみ異常を示す変異体7系統を単離した。得られた変異体の中から、本研究ではcs2448について詳細な解析を行ったので報告する。
cs2448は野生型に比べ有意に根が長く、また接触刺激によるとされる波形成長を調べたところ、根がコイル状になることが判明した。顕微鏡観察では両者間に根の形態的相違は認められなかった。
また、TAIL-PCR法を用いてT-DNAが挿入している遺伝子を解析した結果、AKT2遺伝子が欠損していることが明らかになった。そこでAKT2遺伝子にT-DNAが挿入している3系統の種子をSALK研究所から取り寄せ、根の屈水性を検定したところ、水応答性が低いことを確認できた。これらの結果はAKT2遺伝子が水分屈性変異体の原因遺伝子であることを示唆している。興味深いことにAKT2遺伝子はK^＋チャンネルをコードしており、pAKT2::GUSを用いた解析から中心柱で、特に師部において強い発現が見られた。
現在、水分屈性におけるAKT2遺伝子の役割と植物ホルモンとの関連性を追究している。

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　植物の細胞体積の80%以上は液胞で占められており、細胞質は細胞膜と液胞膜の間に挟まれた狭い空間に位置している。細胞膜と液胞膜には、タイプの異なる水チャネルが発現しており、これらの水チャネルが、両膜の水透過をそれぞれどのように調節制御しているのか、水分生理に果たす役割が注目されている。例えば、細胞質水分量の安定化のためには液胞膜の水透過率が細胞膜より十分高いことが必要、との推測がある。しかし、細胞レベルでの検証はこれまで困難だった。そこで本研究は、プロトプラストを対象とした、細胞膜と液胞膜水透過率の分離評価手法の開発を目的とした。プロトプラストは、内外の浸透ポテンシャル差に応じて膨張・収縮し、その速度は細胞膜と液胞膜両方の水透過率を反映している。そこで、プロトプラストの膨張・収縮プロセスを観察し、これを再現する数値モデルを考案した。さらに、プロトプラストから単離した液胞単独の膨張・収縮速度を計測して液胞膜の水透過率を求め、その値をモデルに代入することにより、細胞膜の水透過率を求めた。

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Plant responds and adapts to environmental stress at gene expression level as well as physiological level. Genetic and molecular analysis indicates that several signal transduction pathways to control stress-responsive gene expression. We have analyzed gene expression profiles of Arabidopsis during rehydration from dehydration stress using a 7k RAFL-cDNA microarray and identified many rehydration-inducible genes (Plant J, Oono et al. 2003). We think recovery process from abiotic stress also has several pathways like stress response process. In the present study, we present the results of expression profile of low-temperature stress and recovery from cold stress using the 7k RAFL-cDNA microarray and an Agilent 22k oligo-array. We identified many genes that are regulated during recovery process from low-temperature stress. We compared gene expression profiles during recovery process from low-temperature stress with those from drought stress. We will discuss specificity and common processes in the recovery process from cold stress and drought stress.

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ポリアミンは微生物から動植物に至るまで広く生体内に存在する生理活性物質である．ポリアミンは古くから様々な細胞内のプロセスに関与していると考えられてきたが，我々は乾燥，塩ストレス応答に関わるポリアミンの機能について解析を行っている．植物中に存在する主なポリアミンはプトレスシン，スペルミジン，スペルミンの3種である．これまでの解析により，プトレスシンが乾燥，塩ストレスに応答して増加し，その合成には律速酵素のarginine decarboxylase(ADC)をコードするAtADC2が重要であることが予想された．そこで，シロイヌナズナadc2-1変異体の解析を行ったところ，adc2-1変異体はコントロール植物の約25%のプトレスシン量しか蓄積せず、ストレス下での増加も起こらなかった。このことからAtADC2はストレス下だけでなく通常時のプトレスシン合成に関しても重要な遺伝子であることが示唆された。さらに，adc2-1変異体は乾燥ストレスに対する応答が遅く，塩ストレスに対する耐性が弱くなることが明らかになった．以上の結果からポリアミンの1つであるプトレスシンが，植物の乾燥，塩ストレス応答に必須な物質であり，その蓄積にはストレス応答性のAtADC2が鍵になる遺伝子であることが考えられた．現在AtADC1，AtADC2の2重変異体の解析を行っており，その結果についても合わせて報告する．

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　シロイヌナズナ耐塩機構を解明するために，耐塩性光合成生育突然変異系統pst (photoautotrohic salt tolerance) を選抜した (Plant Cell, 11, 1195-1206, 1999)．これらのうち耐塩機構が未知のpst2について解析した．　　
　無ストレス下で生育させたpst2および野生系統に対し，cDNAマクロアレイおよびオリゴマイクロアレイを行い，pst2において発現が高い遺伝子を特定した．この1つであるbHLH転写因子候補をリアルタイムRT-PCRで測定したところ，塩ストレス特異的に新たな増幅産物が得られた．これらのそれぞれの塩基配列を決定した結果，これらは選択的スプライシングによるものであることが判明した．RACEにより，この遺伝子の転写開始点は1箇所と予想された．塩ストレスで誘導されるmRNAは，2つ存在するイントロンのうちのC末側が正常に削除されずに残っており，残った領域に存在する停止コドンとそれに引き続く開始コドンにより，無ストレス下に合成されるタンパク質分子種が二分された形のタンパク質が発現することが予測された．塩ストレスの有無により発現するタンパク質分子種の差異をイムノブロット解析した．また，それぞれのタンパク質分子種を強制発現するシロイヌナズナ形質転換系統を作製した．これらを用いて，bHLH転写因子の機能および耐塩機構への関与を検討した．

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植物は塩ストレスなどの環境ストレスによって活性酸素を発生する。活性酸素の発生に伴い、それを消去する抗酸化酵素の活性も上昇するが、カタラーゼ(CAT)については活性が低下することがある。CATはサリチル酸(SA)との結合により阻害されるという報告から、ストレスで蓄積したSAがCAT活性を低下させることが示唆された。よって、塩ストレス下におけるSA蓄積とCAT活性低下の関連性および、SAを合成する安息香酸2水酸化酵素(BA2H，チトクロームP-450の一種)の誘導・阻害機構を調査した。
イネのNaCl処理によるCAT活性の変化は処理濃度の増加に伴って経時的に低下していた。SA含量は処理1日目から処理濃度の増加に伴って増加しており、SAの蓄積とCAT活性低下に相関性が見られた。BA2H活性はNaCl処理によって1日目から上昇しており、塩ストレスによって誘導されることが明らかとなった。よって、BA2Hの活性化がSAの含量を増加させたと考察した。また、BA2Hの阻害が期待される各種薬剤のin vitroでの阻害効果は、ジベレリン合成阻害剤が最も阻害率が高かった。P-450の代謝標的である除草剤では、活性が誘導されていた。また、基質類似物による阻害率は低かった。よって、P-450の直接的阻害剤がBA2Hの阻害にも有効であることが示唆された。

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　演者らはヒルギ科マングローブ植物の一種である Bruguiera sexangula の耐塩性機構を遺伝子レベルで解明するために、大腸菌を用いた機能スクリーニング法で大腸菌の耐塩性を強化するタンパク質をコードするcDNAの探索を進めてきた。このスクリーニング法で既に単離された新奇耐塩性強化因子「マングリン」は大腸菌の他、タバコ培養細胞の耐塩性を向上させる機能を有することが既に確認されている。一方、B. sexangula 懸濁培養細胞におけるマングリンmRNA の含量は極めて高く、塩ストレスに応答してその発現量が増大することも確認されている。このことから、マングリンだけでなく、そのプロモーター領域も耐塩性植物を作出するための有用なツールになると期待できた。そこで本研究では、マングリン及びマングリン周辺領域をコードするゲノムDNAのクローニングを試みた。PCRにより得られた配列を解析した結果、マングリン遺伝子には2つのイントロンが含まれている事が確認された。また、そのプロモーター上流域には、4つのW-box likeのエレメントの存在が示唆された。そこでさらに本研究では、マングリンプロモーター領域のデリーションクローンとレポーター遺伝子(GUS)を繋いだベクターを作成し、これらをタバコに導入して、得られた形質転換体におけるプロモーター活性の解析を試みた。

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Betaine is an important osmoprotectant in many plants, but its transport activity has only been demonstrated using a proline transporter (LeProT) from tomato, a betaine non accumulating plant. Weisolated two full length and one partial transporter genes from betaine accumulating mangrove Avicennia marinar. Their homologies to betaine transporters from bacteria and betaine/GABA transporters from mammalian cells were low, but high to proline transporters from Arabidopsis and tomato. Two full length transporters could efficiently take up betaine and proline with similar affinities and maximum velocities. The uptakes of betaine and proline were significantly inhibited by mono- and di-methylglycine, but only partially inhibited by betaine aldehyde, choline, and GABA. Sodium- and potassium-chloride markedly enhanced betaine uptake rates with optimum concentrations at 0.5 M whereas sucrose showed only modest activation.

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Amaranthus tricolor is an unique C₄ plant which produces three-colors in leaves, green apices, yellow middle, red basal regions before the onset of flowering. We previously reported that the yellow and red regions possessed greatly reduced levels of Chl, less than 10 % of the green regions although the net photosynthetic CO₂ fixation rates of yellow and red regions were about 40 % of the green regions (Plant Cell Physiol. 40, 668-674 (1999)). Here, we examined the expression of choline monooxygenase genes from Amaranthus tricolor. Upon salt stress, the levels of choline monooxygenase and betaine increased in both green regions as well as red and yellow regions. Changes of the levels of glycinebetaine and choline monooxygenase upon the changes of salinity were investigated. We also examined the efects of choline precursors on the accumulation levels of glycinebetaine. These results will be presented.

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アッケシソウ（Salicornia europaea）は、アカザ科に属する一年生草本で、塩湿地に群落を形成する最も強力な耐塩性を有する塩生植物の1つである。秋には紅葉するため、サンゴ草とも呼ばれている。本種は海岸の開発により減少傾向にあることから、絶滅危惧種に指定されている。本研究ではアッケシソウのもつ強力な耐塩性機構を細胞レベルで解析することを目的とし、その培養細胞系の確立を試みた。滅菌したアッケシソウの葉を用いてカルス形成条件を検討した結果、明 (16h)／暗 (8h) 条件下、Murashige-Skoog培地に 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid を1×10^-7 M、6-Benzylaminopurineを1×10^-6 M添加した寒天培地上において最も良好なカルスの形成が確認された。得られたカルスの継代培養した結果、緑色カルスの他、ベタレイン色素を蓄積する赤色カルスが得られた。これらのカルスの耐塩性を検討した結果、300mM 以上のNaCl存在下でも生育できることが確認された。これらのカルスを暗条件下に置いた場合、それぞれの色素含有量は急激に減少することも明らかとなった。本研究ではこれらの培養細胞を用い、耐塩性、細胞内イオン組成、細胞内イオン含量に関する詳細な検討を試みた。

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植物は硫黄欠乏にさらされると適応反応を示し、欠乏の度合いが軽度ならば見かけ上正常に生育することができる。筆者らは、硫黄栄養の供給を通常より減らして栽培した、見かけ上正常に生育しているシロイヌナズナのトランスクリプトームおよびメタボロームを解析することで、適応反応の全体像を明らかにしようとしている。これまでに短期的応答におけるジャスモン酸の関与の可能性などを明らかにしてきたが、制御ネットワークの解明のためには、外部環境の硫黄が欠乏してから植物の内部環境がその条件におけるあらたな平衡状態に達するまでの時系列データが必要であると思われる。
　野生型シロイヌナズナを、硫酸イオン濃度1.5 mMの通常培地で約3週間栽培したのち、通常培地または硫酸イオンを含まない培地に移植して、3，6，12，24，48，168時間後にロゼット葉と根をサンプリングした。168時間後までの間にどちらの培地に移植した植物も見かけ上正常に生育した。マイクロアレイにより21,500遺伝子の葉と根における発現の変化を調べた。またフーリエ変換イオンサイクロトロンマススペクトロメトリー(FT-MS)により葉と根の非ターゲットメタボローム分析を、HPLCやキャピラリー電気泳動によりアミノ酸や糖、有機酸などのターゲット代謝物プロファイリングを行った。これらのデータに基づいて、硫黄欠乏に適応する機構について考察する。

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シロイヌナズナにおいて、メチオニン生合成の鍵酵素であるシスタチオニンΓ-シンターゼ（CGS）遺伝子の発現は、メチオニンの代謝産物であるS-アデノシルメチオニン (SAM)に応答して mRNA 安定性の段階でフィードバック制御される。この制御には CGS 遺伝子自身の第1エキソンによってコードされるアミノ酸配列が関与し、その中でも植物間で保存されている領域の十数アミノ酸（MTO1領域）が特に重要な働きをしている。この制御は翻訳阻害剤によって阻害され、また、CGS 第1エキソンのアミノ酸配列が自身をコードする mRNA に対してシスに働くことから、この制御は翻訳中に働くと考えられる。この制御は小麦胚芽抽出液を用いた in vitro 翻訳系においても、SAM に応答して誘導される。その際、誘導条件下では、MTO1 領域近傍までの部分翻訳産物の蓄積がみられた。このことから、SAM によってこの制御が誘導されると、MTO1 領域近傍で翻訳の停止が起こると考えられる。さらに、ポリソームプロファイル解析によって、CGS 第1エキソンを含む mRNA の5'側を欠いた分解中間体はリボソーム画分にのみ検出されたことから、in vivo においても CGS の転写後制御が誘導される際には mRNA 上でリボソームの停止が起こることが示唆された。

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シスタチオニンγ-シンターゼ（CGS）は、メチオニン生合成において鍵となる段階を触媒している酵素である。シロイヌナズナのCGS遺伝子の発現はメチオニンの次の代謝産物であるS-アデノシルメチオニンによってmRNAの安定性の段階で制御されおり、これまでの解析からこの制御は小麦胚芽抽出液のin vitro翻訳系で再現されることが示されている。また、植物間でCGSのアミノ酸配列を比較すると、第1エキソンは全体的に保存性が低いが一部高度に保存されている領域（保存領域）が存在する。in vitro翻訳系においてCGS第1エキソンを持ったmRNAを翻訳反応させると全長より300塩基程度短いRNAが検出された。この短いRNAは5’側を欠いており、CGS　mRNAの分解中間体と考えている。また、CGS第1エキソンの欠失変異を作製し、in vitro翻訳系を用いて短いRNAの生成に必要な領域を調べたところ、CGS第1エキソン内の保存領域が必要であることが示された。保存領域のみを用いた場合にも短いRNAの5’末端は第1エキソン全長を用いた場合と同様の位置であった。現在、この短いRNAがエンドヌクレアーゼで切断されているのか、エキソヌクレアーゼで分解されているのか調べるために、5’側のRNA断片の検出を試みている。

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ホウ素は植物にとって必須元素である。しかし、過剰量のホウ素は植物の生育を阻害することが知られている。ホウ酸過剰土壌は世界に広く分布している。それらの地域での作物の生産性を向上させるためには、植物のホウ素耐性機構の理解が重要である。
　今回我々は、酵母にホウ酸耐性を付与するシロイヌナズナ遺伝子の単離を試みた。通常、酵母は80mMのホウ酸を含むSD培地上では生育できない。そこで、シロイヌナズナの発現ライブラリーを酵母に導入し、この条件下で生育してくるものを選抜した。これまでに120万コロニーの酵母をスクリーニングし、ホウ酸耐性を示す酵母を4つ取得している。これらの酵母の持つプラスミドに存在するシロイヌナズナcDNAクローンの配列を決定したところ、それらの中の1つはPoly(A)-binding protein PAB2をコードしていた。PAB2はmRNA のpoly(A)に結合し、そのmRNAの安定性、翻訳効率の調節に関わることが明らかにされている。現在、PAB2を発現させた酵母においてホウ酸耐性機構に関する解析を進めている。

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ラン藻 Anabaena sp. PCC 7120は、窒素固定を専門的に行うヘテロシストを有する。窒素固定を行うニトロゲナーゼは酸素によって不活性化されるため、ヘテロシスト内は嫌気状態に保たれる。このような生理現象には、酸素の感知が重要な役割を果たすと考えられる。バクテリアの酸素センサーとして、根粒菌のFixLや大腸菌のDOSなどのタンパク質のヘムPASドメインが知られている。我々は、これまでに、Anabaena 7120のゲノムから、ヘムPASドメインを含むAlr2428タンパク質を見出し、COS (Cyanobacterial oxygen sensor) と名付け、そのドメインが酸化還元状態を感知しうることを生化学的に示した。このCOSタンパク質は、11個のドメインから成り、ヘムPASドメインのC末端側にヒスチジンキナーゼドメイン、N末端にレスポンスレギュレータードメインと、OmpR型DNA結合ドメインを持つ、特異なドメイン構造を有していた。本研究では、このようなマルチドメインタンパク質の酸素感知機構を詳細に解析するために、ヘムPASドメインとヒスチジンキナーゼドメインとの部分タンパク質、レスポンスレギュレータードメインとOmpR型DNA結合ドメインとの部分タンパク質をそれぞれ発現、精製した。前者に関しては、酸化状態、還元状態におけるリン酸化能、後者に関しては、アセチルリン酸存在下、非存在下におけるDNA結合能をそれぞれ測定した。これらの結果から、このタンパク質の酸素感知機構について議論する。

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青色光やレドックスのセンサードメインとしてフラビンなどを結合するPASドメインスーパーファミリーが知られている。大腸菌のAerタンパク質は、FADを結合したPASドメインがレドックスのセンサーとしてエアロタキシスを調節していることが知られている。このようなセンサーPASドメインをシアノバクテリアSynechocystis sp. PCC 6803のゲノム上で探索したところ、Slr1759タンパク質を見いだした。Slr1759は、2つのPASドメインと1つのGAFドメイン、Hisキナーゼ、レスポンスレギュレータドメインをあわせ持つマルチドメインタンパク質で、そのN末側にあるPASドメインはAerのFAD結合ドメインと相同性が認められた。これらのドメインを含む領域をHisタグ融合タンパク質として大腸菌で発現させ、可溶性画分から精製を行った。こうして得たSlr1759部分タンパク質は、フラビンタンパク質に特徴的な吸収スペクトルを示したが、Aerタンパク質の吸収スペクトルとは違っていた。現在、このフラビンのレドックスの応答性とslr1759遺伝子の破壊株の表現型を検討しているので、あわせてフラビンの役割を議論する。

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シアノバクテリアは他種のバクテリアに比較して多くのフィトクロム様の構造を持つタンパク質の遺伝子を有するが、これらの生理機能について得られている知見は非常に少ない。我々はフィトクローム様タンパク質による光応答性の遺伝子発現制御を解析するため以下に実験を行った。Synechocystis sp. PCC6803のフィトクロム様タンパク質をコードする遺伝子sll0821, sll1124, sll1473, slr0473, slr1212, slr1393, slr1805, slr1969の破壊株の細胞を12時間暗黒下に置き、その後に1時間光を照射した際に野生株では暗所から明所の移行により発現量が2倍以上に増加もしくは半分以下に低下するがフィトクロム様遺伝子破壊株では光応答性の変動の割合が野生株の1／2以下に減少した遺伝子をフィトクロム様光受容体により発現制御されている遺伝子の候補としてDNAマイクロアレイ解析により選別した。その結果sll1473がcpcG2遺伝子の光応答性を特異的に制御していることが明らかとなった。他のフィトクローム様タンパク質遺伝子破壊株においても連続光照射下では観察されなかった特徴的な影響が観察された。sll1473に制御される光応答遺伝子cpcG2の発現制御機構についてはさらなる解析を進めているので合わせて報告する。

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植物のさまざまな情報伝達系に、Ca²⁺透過性伸展活性化陽イオンチャネルが関与する可能性が示唆されている。例えばタバコ培養細胞BY-2に浸透圧ショックを与えると、細胞質のCa²⁺濃度が一過的に上昇し、また感染シグナルによる生体防御反応誘導過程におけるCa²⁺動員の制御には、細胞骨格系が関与する可能性が示唆された。しかしこうしたCa²⁺チャネルの分子的実体は明らかでない。シロイヌナズナのAtMID1Aは、出芽酵母のCa²⁺透過性伸展活性化陽イオンチャネルMID1の欠損変異株の致死性を相補する（中川祐子ら、本大会発表）。単子葉のモデル植物イネや、Ca²⁺シグナル伝達機構の細胞生理学的研究が進んでいるBY-2細胞から、酵母MID1の機能を部分的に相補するAtMID1Aの相同遺伝子OsMID1、NtMID1A/Bを単離した。OsMID1はイネのゲノム中に単一の遺伝子として存在していた。植物のMID1ファミリーの機能を解明するため、過剰発現株や、発現抑制株を作製し、さまざまな刺激やストレスを与えたときの応答性の変化を網羅的に解析している。また植物のMID1ファミリーと、他種類のCa²⁺チャネルとの相互作用の可能性を検討した結果についても議論したい。

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　ホスホリパーゼD(PLD)は細胞膜などの生体膜の主成分であるリン脂質ホスファチジルコリンを分解し、ホスファチジン酸とコリンを生成する酵素であり、膜成分の細胞内輸送や膜脂質を介したシグナル伝達を担っていることが知られている。
　シロイヌナズナにはPLD遺伝子が12種存在しており、植物特有のドメイン構造を持った植物型と、動物の持つPLDとよく似たドメイン構造を持つ動物型の2種類に大別される。植物型のPLDには10種類が属しており、おもに環境ストレスのシグナル伝達に関与していることなどが知られている。一方動物型のPLDはζファミリーに属する2種類のみである。AtPLDζ1は根毛形成に関与していることが明らかとなっており、細胞形態の制御において中心的な役割を果たしている。本研究ではもう一つの動物型PLDであるAtPLDζ2について解析を進めた。
　AtPLDζ2のプロモーター部分約3kbpをクローニングし、GUS遺伝子につなぎ植物体で発現させたところ、AtPLDζ1では根を含む広範囲の組織でGUS活性が確認されたのに対して、AtPLDζ2では花の雄蕊、雌蕊を含む花器官を中心にGUS活性が観察された。このようにAtPLDζ2はAtPLDζ1と異なる発現様式を示すことが明らかとなった。

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Peroxynitrite (ONOO^-) is a reactive nitrogen species (RNS) that can be produced through the reaction between the reactive oxygen species (ROS) superoxide and the RNS nitric oxide (NO). ONOO^- has been considered to be the most toxic RNS in mammalian systems because of its capability to nitrate tyrosine residue. Here we report that as similar to tyrosine, plant phenolic compounds also can be nitrated by an ONOO^--independent mechanism. The phenolic compound p-coumaric acid (p-CA) was nitrated in the presence of horseradish peroxidase (HRP), NaNO₂ and H₂O₂. The nitrating reaction was inhibited by KCN, an inhibitor for HRP. The antioxidant ascorbate suppressed p-CA nitration and its suppression time strongly depended on ascorbate concentration. The results suggest nitrogen dioxide radical is involved in the HRP-dependent p-CA nitration.

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Bacteria colonize the exterior and interior habitat of leaves, or phyllosphere, nourished by sugars and other products of plant metabolism. To establish a population on a leaf, a bacterium must be able to overcome several abiotic and biotic stresses including plant-derived potentially toxic hydrogen peroxide (H₂O₂). Here we report that H₂O₂ tolerance of Rhodococcus sp. strain APG1, in relation to nitric oxide (NO) production by cells cultured on a variety of C sources. Relative to cells grown on other sources of C, sucrose-grown cells were found to reach lower growth yields and show higher tolerance to H₂O₂ that correlated with increased formation of NO. The results suggest that sucrose may enhance H₂O₂ tolerance of Rhodococcus APG1 by increasing cellular NO producing capacity. We propose a regulatory role for NOS in promoting tolerance of Rhodococcus APG1 to oxidative stress in the phyllosphere.

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　NOxは化石燃料の燃焼や自動車の走行時に発生するガスで、大気汚染物質の一つであり、生物に害を及ぼすと考えられてきた。植物葉内に取り込まれたNOx由来の窒素の大半は還元態窒素まで代謝される。他方、ごく最近NOxは植物からも発生されることが報告された。大気中NOxは、植物にとってN源となるまたは害作用をもつことに関する報告はあるが、シグナル作用に関する報告はない。
　本研究では、Nicotiana plumbaginifoliaを100-200 ppb NOx存在下で数ヶ月間栽培し、バイオマス、葉面積、C、N、S、R、K、Ca、Mg、遊離アミノ酸、粗タンパク質含量を分析し、NOxフリー（NOx<5 ppm）で栽培した植物と比較した。その結果、いずれの量もNOxフリーで栽培した植物に比べ約二倍大きくなっていた。一方、NOxが植物葉中の全窒素に占める割合は、3-5％と非常に小さく、植物の全窒素に対するNOx由来の窒素の寄与は非常に小さく無視しうる程度であった。また、これらの現象は、施肥する硝酸態窒素濃度に関係なく観察された。これらの結果は、大気中NOxは植物ホルモン様シグナル作用をもつことを強く示唆するものである。

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我々は、植物に取り込まれた窒素酸化物(NOx)由来の窒素の約3割は、ケールダール法では回収できない未知の窒素化合物（Unidentified nitrogen：UN）になることを見いだした。この結果は、植物体内には未解明の窒素代謝経路が存在することを強く示唆すると考えられた。そこで、本研究では、硝酸態窒素からも同様なUNが生成するかについて、モデル植物であるタバコ、4種のマメ科植物のアカクローバ、シロクローバ、アルファルファ、レンゲとイネ科植物のエンバク、オーチャード、チモシーについて研究した。その結果、いずれの植物でもUNが検出された。UNを含む化合物(UN化合物)の候補としては、ニトロ、ニトロソ、アジド、ヒドラゾ、オキシム化合物などが考えられる。蛍光法によりS-ニトロソチオール含量を解析した。その結果、シロイヌナズナ葉を4 ppm NOx で暴露(4時間)すると、S-ニトロソチオール含量は約5倍増加することが分かった。また、抗ニトロチロシン抗体を用いたウェスタンブロット解析により、NOx暴露した植物において特異的バンドが検出された。これらの結果より、UN化合物の候補としてニトロ化合物やニトロソ化合物が考えられる。以上の結果は、UN化合物を生成する未解明の窒素代謝経路が存在するとの我々の仮説を支持するものである。

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　ほとんどの高等植物は，マメ科植物に固有な共生型のヘモグロビン（レグヘモグロビン）とは遺伝的にも構造的にも異なる非共生型のヘモグロビンを持つ。根粒菌との共生とは無関係なヘモグロビンの植物界における普遍的分布は，このヘムタンパク質の植物生理機能上の重要性を強く示唆するものであるが，その存在意義や生理機能は未だ解明されていない。私たちは，植物の非共生型ヘモグロビンの機能，特に無機窒素・活性窒素代謝におけるその関与を検証することを目的に研究をすすめ，シロイヌナズナの非共生型ヘモグロビンの1種（AtGLB1）について以下の点を明らかにした。
（1）AtGBL1 の mRNA レベルは硝酸および亜硝酸により増大する。
（2）大腸菌から精製した組換え AtGBL1 タンパク質（rAtGLB1）はペルオキシダーゼ活性を有する。
（3）rAtGLB1 は亜硝酸を電子供与体としたペルオキシダーゼ反応により，自身のチロシン残基に特異的なニトロ化をうける（亜硝酸から二酸化窒素の生成を示す）。
　以上の結果から，AtGLB1 が亜硝酸代謝に関与している可能性が示唆された。硝酸同化経路の中間体である亜硝酸は活性窒素の1つに数えられ，植物組織で蓄積すると毒性を発揮すると考えられるので，亜硝酸毒性からの防御の観点から AtGLB1 の生理学的役割を議論したい。

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日本型イネの日本晴とインド型イネのカサラスに由来する、98系統のBILsを用いた解析より、第二染色体上のDNAマーカーC777近傍に、穂重量を規定しているQTL が統計学的に検出された。このQTLは、カサラスの対立遺伝子が穂重を増加させる効果があることが判明した。そのQTLを含む約50 cMの領域のみが、カサラス由来の染色体に置換された系統C-22を選抜し、ガラス室内にて基肥窒素処理を行い、育成した。遺伝背景であるコシヒカリに比較して、C-22の個体あたりの分げつ数、穂数、穂重量はいずれも有意に増加していた。C-22における穂重量の増加は、穂数の増加に起因しており、栄養成長初期の分げつ数の増加が穂数の増加につながったことが考えられた。本研究では、イネの穂数を規定している遺伝子の同定を目的として、QTL領域を狭めるために組み換え個体の選抜を行うとともに、幼植物期での分げつの抽出に関する連鎖解析を行った。
C-22のカサラス置換領域内で、染色体の組み換えが認められた9系統を選抜し、遺伝子型が固定されるまで育成した。幼植物期の分げつの抽出に関して連鎖解析を行ったところ、穂数を規定しているQTLは、DNAマーカー2-S152と2-S173の間、約10 cMの領域に検出された。現在、両マーカー間で組み換えが認められた系統を選抜、育成し、さらなるQTL領域の限定を行っている

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本研究の目的は、植物におけるアミノ酸代謝制御、特に光呼吸系におけるアミノ酸代謝の解析をおこなうことである。グルタミン酸グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（GGAT）は、グルタミン酸＋グリオキシル酸→グリシン＋2-オキソグルタル酸の反応をになう。光呼吸系で働くペルオキシソーム局在型GGATは、光呼吸、アミノ酸代謝に直接関わる重要な酵素である。
我々はアラニンアミノトランスフェラーゼ様タンパク質の遺伝子破壊株の解析から、この遺伝子(GGAT1と命名)が光呼吸系で働くペルオキシソーム型GGAT遺伝子として機能することを明らかにした（Igarashi et al. Plant J 33, 975-987 2003）。
ここでは、GGAT過剰発現株を作出し、アミノ酸代謝と光呼吸に対する機能を解析したので報告する。様々なGGAT1mRNA発現量の過剰発現株を得たところ、セリン含量が野生型の最大20倍に増加していた。GGAT1mRNA発現量とGGAT活性、さらにセリン含量に顕著な相関が認められ、セリンの増加はGGAT1mRNAの過剰発現によるGGAT活性の増加によるものと推察された。またセリン以外のアミノ酸含量も器官や栽培条件に応じ大きく変化した。この結果はGGAT1が植物におけるアミノ酸含量の調節に関与する可能性を示唆する。

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Reduction of nitrate and oxalate content in spinach has become the major concern in the breeding program in terms of their toxicity to the human health. Although various experiments have already been performed to determine the nitrate and oxalate contents in spinach, no definitive factors that affect their contents have been elucidated. In the present study, we have determined genetic factors that affect nitrate and oxalate contents in spinach using 200 varieties by growing them in fall, winter and spring from 2002 to 2003 under the same cultural condition (N=10kg/10a) in vinyl houses. In both nitrate and oxalate, a wide range of variations was detected not only among the varieties but also the growing season. Interestingly, amount of nitrate negatively correlated with that of oxalate. Further results will be discussed.

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硝酸イオンの取込みは、硝酸同化経路の最初に位置し、経路全体の律速段階となっている。我々は、相同組み換えによる遺伝子機能解析が容易に行えるヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)を材料として、硝酸イオン能動輸送体をコードする5つのNRT2遺伝子の発現について解析を行った。まず、硝酸イオン添加時および窒素欠乏時における発現の経時変化を調べたところ、いずれの場合にも数時間以内に5つ全てのNRT2の発現量が大きく増加し、その後減少した。このことから、5つのNRT2は全て誘導性であることが判明した。また、発現のピークに達するまでの時間はCO₂濃度が高いと短縮された。さらに、暗条件では発現が抑制されたことから、NRT2の発現は炭素同化と密接に関連していると考えられる。一方、窒素同化産物がNRT2の発現を抑制することは以前より知られていたが、直接作用する物質が何であるかについては明確な解答は得られていなかった。そこで我々は、アンモニア同化に関するグルタミン合成酵素とグルタミン酸合成酵素のそれぞれの阻害剤MSXとDON を用いて発現解析を行った。その結果、5つのNRT2の発現に対するアンモニアによる抑制はMSXによって解除されたが、DONの存在下ではこの効果が得られなかった。この結果は、NRT2の発現を抑制するのはアンモニアではなくグルタミンであることを示唆している。

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多くのラン藻は、フェレドキシン依存型硝酸還元酵素(NR)を持ち、硝酸イオンを窒素源として利用できる。硝酸イオンは、能動輸送体によって細胞内に取り込まれた後、NRによって亜硝酸イオンに還元され、さらに亜硝酸還元酵素(NiR)によってアンモニアにまで還元されたのちに、有機物へと同化される。単細胞性のラン藻Synechococcus sp. strain PCC7942では、これまでに硝酸還元に必要な3つの遺伝的領域(narA、narB、narC)が解析されている。narBの領域にはNRの構造遺伝子であるnarBが、narAとnarCの領域にはNRの補酵素であるモリブデン補酵素の合成に関わる遺伝子群が存在している。我々は、硝酸イオンを窒素源として生育できない変異株の解析から、NRの活性発現に必要な新規遺伝子narMを単離した。narMは、161アミノ酸残基からなる親水性タンパク質をコードしており、NRを有するラン藻にのみ保存されていた。narM欠失株では、NiR活性は発現しており亜硝酸イオンを窒素源として生育できたが、NRの活性は検出されず硝酸イオンを窒素源として生育できなかったことより、narMはNRの活性発現に特異的に関わっていることが示された。また、narBおよびモリブデン補酵素の合成に関わる遺伝子群は、narM欠失株でも野生株と同等に発現していたことから、ラン藻のNRの活性発現には新規な因子が必要であることが示唆された。

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Cyanobacterial PII protein is modified by phosphorylation/dephosphorylation in response to the cellular nitrogen status. Formerly, we found high-level expression of the ammonium assimilation genes in a PII-deficient mutant of Synechocystis sp. PCC 6803 and proposed the presence of a hitherto unknown mechanism that specifically regulates the ammonium assimilation genes. In this study, to further investigate this mechanism, we examined the ammonium assimilation activity of the PII-deficient mutant. It was found that the PII-deficient mutant grows much slower than the wild-type strain on ammonium under the conditions of high light and glucose supplementation. The rate of ammonium assimilation increased under these conditions in the wild-type strain but not in the PII-deficient mutant. These results suggested that the ammonium assimilation activity is upregulated by high light and glucose in the wild-type Synechocystis strain in a PII-dependent manner.

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陸棲ラン藻Nostoc commune（イシクラゲ）は広く地球上の陸地に分布し、数珠状に連なった細胞がゼリー層に包まれたコロニーを形成している。岩の表面のようなむき出しの環境に生息するため、定期的な乾燥に耐えて光合成機構を保持する仕組みをもつと考えられる。本研究ではN．communeの光合成活性の乾燥ストレス耐性について調べた。野外から採集したN．communeを、実験室で風乾し材料として用いた。光合成的酸素発生能は、クラーク型酸素電極を用いてCO₂を最終電子受容体として測定した。乾燥したサンプルは光合成能を示さなかったが、水を与えると光合成能を示した。乾燥と水和を繰り返しても酸素発生能はほぼ100％に保たれた。乾熱オーブンを用いて乾燥させ重量変化を調べたところ、乾燥重量あたり約10％の水が取り除かれた。乾熱乾燥後、大気にさらすとすみやかに重量が回復した。乾熱オーブンを用いて強度の乾燥ストレス処理を行っても、約60％の酸素発生能が残存していた。ゼリー層が光合成活性の乾燥耐性に関与しているかどうかを調べるため、細胞とゼリー層を分離する手法を検討した。水和させペースト状にした後、目の粗いフィルターでろ過することで、ゼリー層と細胞を分画できた。ゼリー層を取り除いた細胞は光合成活性を示したが、風乾処理したところ、活性は著しく低下した。これらの結果は、光合成活性の乾燥耐性においてゼリー層が重要な役割を果たしていることを示している。

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われわれはAnabaena sp. PCC 7120をもちいたラン色細菌による光生物的水素生産の遺伝工学的改良において、取り込み型ヒドロゲナーゼHupの遺伝子破壊が有効であることを示した。この方法が他のラン色細菌株においても有効であるか否かを調べるため、内外の株保存センターが保有するヘテロシスト型15株について水素生産活性と、Hup及び双方向性ヒドロゲナーゼ(Hox)の分布を活性及び遺伝子の両方から調べた。Nostoc sp. PCC 7422株は比較的高い水素生産活性を示し、またHox活性が極めて低かったので、これを材料としてhupの破壊と、その水素生産に及ぼす影響を検討した。hupの遺伝子破壊のために、ゲノムライブラリを作成し、hupSLのクローニングおよび遺伝子配列の決定を行った。また、その転写開始点を5’-RACE法により調べた。Nostoc sp. PCC 7422には2種の制限酵素が存在することが報告されているので、制限酵素部位を除去した破壊プラスミドを作成し、これを用いて接合法により破壊株（ΔhupL株）を作製、単離した。ΔhupL株は野生株の約10倍の水素生産活性を示し、最大活性は50-70 μmoles H₂ (mg Chl) ^-1 hr^-1に達し、このラン色細菌株においてもhupの破壊がニトロゲナーゼに基づく水素生産性の向上に有効であることが示された。

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光合成生物は、環境の変化に応じて二つの光化学系の量比を調節することで効率的な電子伝達を行っている。強光にさらした場合、生物は過剰な電子伝達を防ぐ為に光化学系IIに対する光化学系Iの相対的な量を減少させることが知られている。光化学系量比の調節に関して、生理学的な知見は蓄積しているが、分子レベルの研究例は少ない。シアノバクテリアSynechocystis sp. PCC6803においては、これまでの研究で光化学系量比の調節に関わる因子としてpmgAが同定されている。この遺伝子の変異株では、強光に移行した時にも光化学系IIに対して系Iの量が減少しないため、適切な量比調節が行われない。今回、sll1961とglnAの二つの遺伝子の変異株で、それぞれ強光に対する光化学系量比の調節が行えなくなっていることを見いだした。これらの変異株とpmgA変異株では、培地にグルコースを含んだ光混合栄養条件下で、生育に阻害が見られた。光化学系量比の調節に異常のある変異株三種で全てグルコース添加による生育の変化が見られること、そしてそのうちの一つの原因遺伝子が窒素代謝に関わるグルタミン酸－アンモニアリガーゼをコードするglnAであることから、炭素と窒素のバランス(C/N ratio)が光化学系量比調節に影響することが示唆された。

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過去の年会において、シアノバクテリアSynechocystis PCC6803の光合成色素であるクロロフィルの蛍光を測定することにより、光合成に直接関与しない遺伝子の欠損をも検出できることを報告した。先の研究では無作為な変異導入により遺伝子破壊株を作製したが、小さなORFが破壊される確率が低い、生育の遅い変異株は測定以前の段階で取りこぼしてしまうという欠点を持っていた。本研究では、特定の遺伝子を破壊することでゲノムワイドな破壊株セットを作製し、それらの蛍光挙動から多くの遺伝子について機能による分類を行なうことを想定している。12月の時点で、23の変異株を作製し、それらの蛍光挙動を測定した。その結果、野生株と明らかに異なる蛍光挙動を示すもの4株、わずかな違いを見せるもの5株を確認した。以前の手法では、野生株と異なる蛍光挙動を示した変異株は5％未満であったが、今回採用した手法では4割近くが野生型と異なる蛍光挙動を示した。今後は更なる遺伝子破壊株の作成を行い、蛍光挙動の測定することにより、遺伝子機能の分類が可能になると考えている。

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