植物におけるグルタチオンの生理機能とその制御機構を解明するために、我々は、これまでにシロイヌナズナ培養細胞においてグルタチオン結合タンパク質を同定した〔Ito et al.(2003) Plant Cell Physiol. 44: 655 〕。その一つが、葉緑体型フルクトース1,6―ビスリン酸アルドラーゼ(FBA)であり、その酵素には4つのシステイン残基が存在した。グルタチオンの結合するシステイン残基を特定し、その結合とFBA活性との関係を調べるために、4つのシステイン残基のうち1つをアラニンに置換した変異型FBAを4種類作製した。野生型及び3種の変異型FBAは、GSHにより活性が阻害されたのに対し、残り1つの変異型FBAの活性はGSHによって影響を受けなかった。このことから、特定のシステイン残基とGSHの結合によってFBA活性が制御されると考えられた。一方、GSSG存在下では、野生型、及び4つの変異型FBAともに、その活性は阻害を受けなかった。このことから、グルタチオンによるFBAの活性制御はFBA分子内に存在するシステイン残基の単純なレドックス制御ではないと考えられる。現在、さらに詳細な解析を行っている。

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In chloroplasts, Fd forms an electron transfer complex with redox enzymes, such as Fd:NADP⁺ oxidoreductase(FNR), sulfite reductase, nitrite reductase and glutamate synthase. Fd therefore influences redox metabolism through the formation of intermolecular electron transfer complexes, and these are the subject of our research.
Two maize leaf FNR isozymes;L-FNR1 and L-FNR2, have previously been described and we have also identified a new L-FNR. Chloroplast fractionation revealed L-FNR1 was located at the thylakoid membrane, new L-FNR in the stroma and L-FNR2 in both fractions. Using Fd-affinity chromatography with wild type and mutant Fd-resin columns we found interaction of different FNR isoenzymes strongly depend on specific Fd amino acid residues. Therefore, despite very high sequence homology, these L-FNR isoenzymes vary dramatically in location and Fd interaction.

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ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（PEPC）はC4植物において葉肉細胞の細胞質に局在し初期炭酸固定を行う鍵酵素であり、N末端近傍の特定のセリン残基の光依存的リン酸化により活性化される。我々はこれまでに、このリン酸化に関与するPEPC特異的リン酸化酵素（PEPC-PK）cDNAをC4モデル植物のFlaveria trinerviaからクローニングすることに成功している。さらに、組換え体PEPC-PKがレドックス制御されることを示してきた。ここでは、この制御機構に関する2つの実験結果について報告する。
（1）酸化処理により不活化したPEPC-PKは、NADPH/チオレドキシンレダクターゼ/チオレドキシン系によって効果的に活性回復した。また、チオレドキシンアイソフォームの中で細胞質に局在するチオレドキシン-hが特に顕著な効果を示した。
（2）レドックス制御に関与するシステイン残基を同定する目的で、存在する6つのシステイン残基をセリン、もしくはアラニンに置換した種々の変異酵素を作製した。その結果、6つのシステインの中、Cys53及びCys250をアラニンに置換したもので、レドックス制御が見られなくなった。
　以上の結果より、 F. trinervia PEPC-PKはCys53とCys250の間のジスルフィド結合の開閉によりレドックス制御されており、その制御にはチオレドキシン-hが関与することが示唆された。酸化による不活化の分子機構をCys53とCys250の立体構造上での位置関係から考察する。

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ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（PEPC）はPEPCキナーゼ（PEPC-PK）によってリン酸化を介してその活性が制御されている。当研究室では既に、精製したPEPC-PKを用いて、in vitroレベルでチオレドキシンを介したレドックス制御が存在する可能性を示してきた。しかしそれは、PEPC-PKは分解されやすく、合成／分解というレベルで制御されているタンパクであるというこれまでに考えられてきた仮説とは異なり、翻訳後の調節機構が存在することを示唆している。そこで本研究では、C4植物であるトウモロコシに実際に酸化ストレスを与えることによって、in vivoレベルでレドックス制御機構が存在する可能性について検討した。光条件下において、適温で栽培したトウモロコシを、酸化ストレスを引き起こすと考えられる低温状態にさらすと、その直後から急激にトウモロコシ葉におけるPEPCのリン酸下レベルが低下した。また、光化学系の阻害剤であるDCMUや酸化剤であるdiamideなどをトウモロコシ切り取り葉に処理すると、光合成の阻害のみならずPEPCリン酸化状態の低下が観察された。diamide 処理個体の粗抽出液ではPECP-PK活性が低下していたが、さらに還元剤であるDTTを処理することでその活性が回復することを確認し、PEPC-PKは可逆的に制御されていることが分かった。これらの結果から、PEPC-PK翻訳後調節機構としてin vivoでレドックス制御が働いている可能性が示唆される。

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高等植物において、MGDG合成酵素(MGD)は光とサイトカイニンにより制御されていることが知られている(Yamaryo et al. PCP, 2003)。しかし、同じ光でも波長が700 nm以上の遠赤色光の場合では、遺伝子発現が誘導され、活性の増大が起こるにもかかわらず、MGDGが蓄積しない。その一方、600 nm 以上の赤色光の場合では白色光と同様な糖脂質合成がみられる。このことから、MGDG合成には600-700 nmの赤色光が必須であると考えられる。MGDが以前より活性の維持に還元剤を必要することが知られていたため、光合成由来の還元力がMGDの活性発現には必要ではないかと考えられた。そこで、大腸菌で発現させた組み換え酵素(rMGD)を用いて還元剤やチオレドキシンによる効果を調べた。TagをもつrMGDをアフィニティー精製した後、酸化剤で酵素内のSH基を酸化した。そこへ外部より還元剤を添加することで、MGD活性への直接の効果を調べた。その結果、チオレドキシンがMGD内のジスルフィド結合を効果的に還元することが判った。また、rMGDを用いて膜脂質、特にPAがMGDを顕著に活性化することを明らかにしたので、合わせて報告する。

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糖シグナリング機構を明らかにするためシロイヌナズナの糖高感受性変異体ghs1 (glucose hyper-sensitive 1)の遺伝学的・生理学的解析を行った。Col.は7％のグルコースを含んだ培地上において本葉の展開の阻害やアントシアニンの蓄積、クロロフィル合成の抑制などの糖応答を示すがghs1変異体では5％以上のグルコースを含んだ培地上でこれらの応答が観察された。原因遺伝子単離の結果、GHS1遺伝子はプラスチド30Sリボソームタンパク質S21をコードした遺伝子にT-DNAが挿入されることで生じた劣性変異体であることが明らかになった。この変異体において、1) RBCLとRBCSのタンパク量の減少、2) 光合成活性の減少、3) 発芽初期におけるクロロプラストの発達障害が観察された。これらの結果から、GHS1遺伝子はプラスチドのタンパク合成や光合成に機能することが示され、クロロプラストの機能と糖シグナリング機構の関係が示唆された。

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糖リン酸を主としたリン酸含有化合物のイオンクロマトグラム法による網羅的解析を可能にする手法として、チタニアカラムによるリン化合物の特異的分離－イオン交換分離－パルスドアンペロメトリー(酸化還元能の)検出の組合せ法を確立した。本法をシロイヌナズナ植物体に適用し、種々のリン酸栄養条件下における糖リン酸濃度の変動を測定するとともに、リン酸代謝の突然変異体として知られるpho1, pho2変異体を用いて、糖リン酸代謝がどのような影響を受けるか比較検討した。ここで測定した糖リン酸は二つのグループに分けられ、一つのグループでは植物体の無機リン酸濃度に比例した形で細胞内濃度が変動するが、もう一つのグループではそのような関係がみられず、むしろ無機リン酸濃度と反比例するように振る舞うことを見出した。さらに、突然変異体のデータと比較したところ、最初のグループに属する糖リン酸は正常植物体でも突然変異体でも同様の振る舞いをするが、二番目のグループに属する化合物は、無機リン酸の濃度変動との関係が、突然変異体では正常植物体と異なっていた。これら糖リン酸濃度の変動から、植物体の可能なリン環境認識機構について議論する。

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　高等植物におけるZ,E混合型長鎖ポリイソプレノイドは、炭素数50-60、75-120(天然ゴムに至っては10⁵以上)と、同一個体中に多様な分布で豊富に存在していることが知られているが、これらの生理的意義については不明な点が多い。また、Z,E混合型長鎖ポリイソプレノイドの生合成を触媒するシス型プレニル鎖延長酵素（CPT）の生成物鎖長制御機構についても未だに解明されていない。本研究ではシロイヌナズナよりCPT遺伝子を単離し機能解析することで、CPTの反応制御機構とその生成物の生理的意義を解析する事を目的としている。
　既に報告されている一種類のCPT遺伝子を含め、シロイヌナズナのゲノム配列上には9種類のCPTの相同遺伝子が存在する。RT-PCRにより各組織における発現パターンを解析した結果、7種類の遺伝子の発現が確認でき、それらのcDNAを単離することができた。これらを出芽酵母のCPT遺伝子の一つであるRER2の変異株で発現させたところ、温度感受性の表現型を相補した。また、これら形質転換酵母の粗酵素抽出液を用いたアッセイの結果、in vitroにおいて実際にプレニル鎖延長酵素活性を示すことが明らかになった。各々の反応の生成物を解析した結果、各タンパク質の一次配列間の比較的高い相同性にもかかわらず、最終産物であるプレニル二リン酸の炭素鎖長はC₅₀からC₁₀₀まで非常にバラエティに富んでいた。

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ラビリンチュラ類は、クロミスタ界に属する、遊走子世代を持つ菌類様原生生物である。植物のセルロース等の陸源有機物を分解するため、沿岸生態系において重要な役割を果たしている。近年、高度不飽和脂肪酸、特にドコサヘキサエン酸（DHA）を細胞内に蓄積することから注目されている。ラビリンチュラ類の脂肪酸組成やDHAの生合成経路に関する生化学的、分子生物学的データはあるが、DHA生成過程の細胞学的研究は皆無であった。SR21株はとりわけ高いDHA生産性で知られ、脂質含有量は細胞乾燥重量の50%にのぼり、その40%がDHAであることが報告されている。我々はSR21株を用いて、ナイル・レッド染色により蛍光顕微鏡下で脂質滴を観察し、遊走子が着床し栄養細胞として生長する過程で、細胞が脂質を急速に蓄積することを観察した。急速凍結置換法で作製した電子顕微鏡試料では、DHAを2位に、パルミチン酸を1、3位に持つトリアシルグリセロールは、特有の縞模様を呈する脂質滴を形成すると考えられている。そこで、遊走子と栄養細胞を電子顕微鏡法で観察した結果、栄養細胞でDHAと特定できる特有な油滴が多かった。さらに、細胞の脂肪酸含量、組成を解析した結果、脂肪酸含量は遊走子では少なかったが、栄養細胞では増加した。一方、DHAの脂肪酸に占める割合は遊走子で栄養細胞より高かった。

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シロイヌナズナのホスファチジルコリン（PC）合成は，CDP-コリン経路の鍵酵素CDP-コリン合成酵素をコードする2つのイソ遺伝子（AtCCT1およびAtCCT2）の支配をうける．我々はこれまでに，低温におけるPC増加にはAtCCT2の発現増大が関与することを明らかにした．しかし予想に反して，AtCCT2のT-DNA挿入破壊株cct2株においても低温でのPC含量が野生株と同じく増加することを前回報告した．今回，cct2株では，AtCCT1が低温で発現レベルを変化させることなくCCT活性増加に貢献することを見出したので報告する．
cct2株のロゼット葉破砕液を遠心分画し，各画分に含まれるAtCCT1タンパク質レベルとCCT活性を比較した．その結果，150 k x g膜画分では，低温処理によってAtCCT1タンパク質の量はほとんど変化しないにも関わらず，CCT活性が増加することを明らかにした．この結果は，シロイヌナズナの低温でのPC合成は，AtCCT2の発現増強と，AtCCT1タンパク質の活性調節という2つの異なる仕組みによって支配されることを示唆する．AtCCT1およびAtCCT2の両遺伝子の二重破壊株は，長期間の低温で生育の遅延を示し，野生株と同レベルのPC含量を維持できなかった．これらの結果は，シロイヌナズナの長期の低温環境への馴化には，少なくとも一方のCCTイソ遺伝子のはたらきによるPCレベルの維持が必要であることを示している．

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植物葉緑体あるいはその起源とされるラン藻のチラコイド膜は唯一のリン脂質としてphosphatidylglycerol (PG)を有する。我々はCDP-diacylglycerol synthase遺伝子(cdsA)を破壊することで、ラン藻Synechocystis sp. PCC6803からPG合成能欠損株(SNC1)を作製し、その解析から既にPGが生育、及び正常なクロロフィル含量の維持に必須であることを示している。そこで、このPG合成能欠損がクロロフィルをcofactorとする光化学系複合体の構築過程や機能発現に及ぼす影響を調べた。先ず、SNC1株をPG添加条件下で前培養し、PGを細胞内に取り込ませた後、PG非添加条件に移行し培養することで、細胞内PG含量を経時的に減少させた。これにより細胞当たりのクロロフィル含量が低下したが、同時に光化学系(PS)Iコア複合体のサブユニットであるPsaA、PsaB等の存在量の低下が認められた。しかし、PSII反応中心複合体のサブユニットであるD1タンパク質量は一時的に増加し、クロロフィル量とは異なる挙動を示した。一方、PSI複合体としてtrimerの存在量の低下が観察されたと同時にPSI活性の低下が認められた。以上の結果は、PGがPSI複合体のtrimerの構築過程やPSI活性の維持に必要であることを示している。

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ナデシコ科、ザクロソウ科を除くナデシコ目植物では、アントシアニンが存在せず、その赤色はベタシアニンにより発色されている。我々は、なぜナデシコ目植物にはアントシアニンが存在しないのかという問題に対し、フラボノイド合成系においてアントシアニン合成のLate stepを触媒する酵素に注目し、分子レベルでの解析を試みている。これまで我々はナデシコ目植物のホウレンソウ、ヨウシュヤマゴボウの2種から、DFR (dihydroflavonol 4-reductase) のcDNAを単離した。これらのDFR cDNAは、約40 kDa の蛋白質をコードしており、アントシアニンを合成する植物のDFRと62-82%の相同性がみられた。さらに、これらにはDFRに特徴的な NADPH結合領域も保存されていた。大腸菌で発現させたrecombinant DFRは、dihydroquercetinを還元し、leucocyanidinに変換した。このことより、ホウレンソウ及びヨウシュヤマゴボウでは、機能を保持したDFRが存在、発現していることが明らかになった。

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　これまで、ベタシアニンはアグリコンであるベタニジンが生成された後に配糖化されることによって合成されると考えられてきた。しかしながら、オシロイバナ（Mirabilis　jalapa L.） の花弁から調整した粗酵素液においてベタニジンの前駆体物質である cyclo-DOPA を配糖化する酵素活性が見出された。このことにより、ベタシアニンはベタニジンというアグリコン中間体を経ずに合成される経路が存在することを示した。そこで、本研究においては cyclo-DOPA をコードする遺伝子の単離及びその解析を試みた。
　フラボノイド配糖化酵素遺伝子の共通のモチーフをもとにdegenerate プライマーを設計し、オシロイバナの花弁から構築した cDNA ライブラリーを鋳型とするPCR 法を用いて、13種類のフラボノイド配糖化酵素相同遺伝子を獲得した。それらを大腸菌発現系を用いて酵素タンパク質を発現させ、cyclo-DOPA 配糖化酵素活性について検討したところそれらのうちの1種類について、この活性が検出された。そこで、この cDNA をについてノーザンブロット解析を行ったところ、各組織及び花の各ステージにおいてベタシアニンの蓄積量との相関が見られた。このことから、植物においてベタシアニンは cyclo-DOPA の段階で配糖化されてから合成される経路が存在することが強く示唆された。

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これまでの研究において、カーネーションから花色変異を引き起こす要因のひとである転移因子dTdic1を単離し、20～30コピー存在するdTdicファミリーの構造解析を行ってきた。カーネーションは中心子類ナデシコ目の植物であり、百花繚乱の花色はフラボノイド色素によるものである。しかし中心子類に属する植物の多くはベタシアニン色素を産出する。中心子類アカザ目に属するオシロイバナもベタシアニン色素を産出する植物のひとつで、花にはカーネーションと同様に転移因子によると思われる多くの花色変異、すなわちベタシアニン合成系変異をもつ。転移因子は生物界に広く分布しており、構造的特徴なども類似している。生物はなぜゲノム上に転移因子を持つのか、またこれらがどのように伝播してきたのか未だ不明な点が多い。一方で近縁種であるカーネーションとオシロイバナには、比較的近似した転移因子がゲノム内に存在し、これらの変異を引き起こしていることが考えられた。そこでカーネーションTdicの塩基配列をもとにした PCRにおいて、オシロイバナからAc/Ds型転移因子(Tmn1)を単離した。このTmn1には5ユ端近傍に既知の転移因子には見られないドメイン配列が存在することが明らかとなった。またこのTmn1が挿入した近傍遺伝子について詳細な解析を行ない、オシロイバナの花色とTmn1の挿入による遺伝子発現の変化について調べた。

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アントシアニンの生合成にMADS-box遺伝子が関与している可能性がある。アラビドプシスにおいてMADS-box遺伝子が、同じフラボノイドであるプロアントシアニジンの生合成を制御しているためである。そこで我々は、サツマイモの赤く染まった根からのMADS-box遺伝子の単離を試みた。MADS-box遺伝子において最も保存されているMADSドメインのアミノ酸配列を基にディジェネレートプライマーを設計し、3’-RACE法を行った。その結果、新規のMADS-box遺伝子であるIbMADS1の単離に成功した。さらに5’-RACE法によってIbMADS1のORF全長の塩基配列を決定した。ノーザンブロット分析によってIbMADS1の発現解析を行った。IbMADS1は花芽、赤く染まり始めた根、完全に赤く染まった根で強く発現しており、発達途中の塊根ではわずかに発現していた。開花した花、芽、葉、茎、生育初期の白い根では発現していなかった。アントシアニン合成酵素遺伝子であるCHS、CHI、F3H、DFR、ANS、UFGTの発現解析も行い、IbMADS1の発現様式と比較した。これらの結果を基に、IbMADS1のアントシアニン生合成に関与している可能性について報告する。

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PAP1 はフラボノイド生合成系遺伝子の発現誘導に関わるMyb様転写因子をコードするシロイヌナズナの遺伝子である。本研究では、詳細なフラボノイド蓄積機構の解明のために、PAP1 遺伝子が過剰発現したアントシアニン高蓄積変異株 (pap1-D) について、蓄積代謝物の網羅的解析(メタボロミクス)および遺伝子発現の網羅的解析(トランスクリプトミクス)を行い、PAP1遺伝子制御下の蓄積に至るまでの代謝系間ネットワークを詳細に解析した。
　シロイヌナズナの野生型株、pap1-D 変異株および PAP1 遺伝子cDNA過剰発現形質転換体のロゼット葉および根を用いて、HPLC-PDA-MSおよびFT-MSによる代謝物の網羅的解析を行った。その結果、PAP1 過剰発現体群において、葉では11種類、根では6種類のcyanidin誘導体が高蓄積していることが確認された。また、アフィメトリックスDNAチップによる約23,000遺伝子のトランスクリプトーム解析を行った結果、PAP1 過剰発現体群では、フラボノイド生合成の酵素遺伝子の他、アントシアニン蓄積に関与すると考えられる特定遺伝子群の発現誘導が認められた。以上の結果から、PAP1 遺伝子はアントシアニン蓄積を特異的に制御する転写因子であることが示された。また、アントシニン蓄積に関与すると考えられる修飾転移酵素遺伝子、輸送系遺伝子や転写因子についての情報を得ることができた。

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　アクティベーションタグラインpap1-Dは、Myb様転写因子をコードするpap1を過剰発現している変異体であり、アントシアニンおよびフラボノールを特異的に高蓄積する。したがって、この変異体で発現が増加している遺伝子はアントシアニンの生合成および蓄積に関与していると考えられる。転写産物のマイクロアレイによる解析を行ったところ、野生型と比較してアントシアニン生合成経路を構成する酵素群、およびMybやWRKYなどの転写因子をコードする遺伝子の発現が増加していることが確認された。これらに加え、機能不明の配糖化酵素、アシル基転移酵素、グルタチオンS-転移酵素をコードする遺伝子の発現も増加しており、これらがアントシアニンの修飾および蓄積に関与することが示唆された。
　本研究では、転写産物と蓄積代謝物の網羅的解析の統合の結果を詳細に解析し、機能が推測される遺伝子について、その機能の解析を行った。特に誘導体化に関与すると推測された糖転移酵素遺伝子群の機能の解析を行った。
　大腸菌で発現させた組み換えタンパク質を用いて、各種アントシアニジン誘導体を基質とした配糖化酵素の活性を検出した。これら糖転移酵素の基質特異性の解析により、植物体中でシアニジンが受ける修飾の経路について論じる。さらにこれら遺伝子の欠損したシロイヌナズナ変異株における蓄積代謝物の網羅的解析を行い、当該遺伝子が植物体内において果たしている機能を特定する。

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植物の葉においてアントシアニンの合成が誘導され蓄積していく過程は我々にとって非常に身近な現象である。それに関する研究は古くから行なわれているが，温度、光、水分などの様々な外的要因が絡みあっていることから、その機構や要因については未解明な点が多い。トレニア (Torenia fournieri Lind) はトランスジェニックのモデル植物として、様々な遺伝子の発現や花色に関する解析に利用されている。これまでの研究において、このトレニアのリーフ・ディスクからシュート再生時に、高濃度のショ糖を含む培地に移植することによって、アントシアニン合成を誘導するモデル実験系を確立した。また、植物ホルモンのABAがこのアントシアニン合成の誘導に重要な役割を果たしている事が示唆されている。そこで本研究では、この実験系においてアントシアニン合成誘導時に特異的に発現している遺伝子の解析を行うため、アントシアニン合成を誘導した植物体と、誘導していない植物体を用いてcDNAサブトラクションを行った。この方法によって得られたcDNAをクロ－ニングし、ランダムに選抜したクローンについて行ったマクロアレイ解析によって、アントシアニン合成を誘導した植物体においてより強く発現している遺伝子を単離した。

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Phenylalanine ammonia-lyase (PAL)は一次代謝系から二次代謝系へと導入する初発の酵素であり、これ以降の複雑な広がりをなす二次代謝系の流れを左右する律速酵素として重要であることから、その発現機構について注目されている遺伝子である。先の研究により、ニンジン培養細胞系においてニンジンPAL遺伝子(gDcPAL1)の発現は希釈効果、エリシター、UV-Bなどにより誘導されることが明らかにされている。またgDcPAL1のプロモーター領域にはフェニルプロパノイドおよびフラボノイド（アントシアニン）合成系酵素群のプロモーター上流に広く存在するL-boxと類似する配列（L₁-box、L₅-box）が存在し、中でもL₁-box、L₅-boxがgDcPAL1の発現制御に大きく関与していることが明らかにされた。本研究において、Yeast one-hybrid法によりgDcPAL1の発現制御に関与するL₁-box、L₅-boxに結合する転写調節因子として、MYBタンパク質をコードするcDNAを単離した。このMYBタンパク質について、ニンジン培養細胞等を用い、in vivoでの転写活性化能、結合配列の特異性および核局在性等について解析を行ったのでその結果について報告する。

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　アントシアニンは紅葉や花色に関わる赤色色素として植物界に広く分布している。アントシアニン合成は分化特異的及びストレス特異的に発現することから、これを調節する転写調節因子の単離、解析も行われつつある。アントシアニン合成系路の初発のkey enzymeであり、ニンジン培養細胞において代謝的分化時に特異的に誘導されるPAL 遺伝子（gDcPAL3）は、そのプロモーター上流域（-252bp～-194bp）の欠失により、プロモーターの活性が低下することが見出され、この領域に発現制御に係わるcis-elementが存在することが示唆されていた。この領域中にはAP2/ERFドメインを有する転写因子であるERFファミリーがcis-elementとして特異的に結合するGCC boxに似た配列が存在する。我々は以前に、この配列と相互作用しAP2/ERFドメインを有するDcERF1、DcERF2を yeast one-hybrid 法により単離した。しかし、その機能に関しては未だ詳細に明らかにされてなかった。本発表では、トランジェントアッセイによりDcERF1、DcERF2の機能について解析し、新しい知見を得たので報告する。

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富栄養化した湖沼において大繁殖するアオコの生育を支配する環境因子について、これまで光強度、明暗周期、温度などが検討されてきた。また主要な培地成分である窒素およびリンなどが生育に及ぼす影響についても報告がなされている。しかし、アオコの生育に対するナトリウムやカリウムイオンの影響についてはほとんど検討がなされていない。そこで、本研究においては生育に及ぼすカリウムイオンの影響について調べた。ミクロシスティスNIES102細胞をKCl濃度0-40mMの培地で培養したところ、0, 0.5, 1, 2.5mM　KClにおける平均世代時間は各々22, 27, 23, 32時間であり、5-40mM KClの場合にはほとんど生育が観察されなかった。また、10mM NaClと5mM K₂SO₄の培地で培養したところ、前者においては通常の培地とほぼ同じ生育を示したのに対して、後者においてはまったく生育しなかった。そこで光合成活性に対するカリウムイオンの影響を0 mM KClと40 mM KClの培地で測定したところ、光合成における見かけ上のKm(NaHCO₃)値は各々56, 279μMとなり、最大活性は各々129, 133μmoles O₂・mg Chl_-1・h_-1となった。以上のことから、ミクロシスティスNIES102細胞におけるKClの生育の抑制効果は、カリウムイオンが本株の光合成を阻害するためであることが示された。

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高等植物の葉緑体局在型アスコルビン酸パーオキシダーゼ(APX)は、基質であるアスコルビン酸欠乏下では過酸化水素により速やかに失活する性質を有し、このことが活性酸素関連ストレスによる葉緑体損傷の原因となっている。そこで、本酵素の失活機構を探った。【方法・結果】タバコおよびホウレンソの葉緑体ストロマ局在型アイソフォーム、および紅藻Galdieriaの過酸化水素耐性型アイソフォーム等の組換えAPXを材料とした。葉緑体APXには過酸化水素耐性型APXアイソフォームには存在しないループ構造が存在する。このループ領域を耐性型APXに挿入したところ過酸化水素感受性が上昇した。このことはこのループと活性部位との相互作用が過酸化水素による失活に関与することを示唆する。さらに、葉緑体APXの失活は補酵素ヘムとアポタンパク質との複雑な共有結合を伴うことをHPLC分析により見出した。この現象は上記のキメラAPXにおいても同様であった。このときヘムと共有結合するアミノ酸残基を質量分析により同定した。このような活性部位の構造変化が、過酸化水素によるAPXの失活の原因と思われる。

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緑藻クラミドモナスは、CO₂欠乏条件下で複数の遺伝子を発現し、能動的に無機炭素を取り込む無機炭素濃縮機構を誘導する。この誘導に関わるCO₂シグナル伝達機構を明らかにするため、我々は低CO₂誘導性を示す炭酸脱水酵素遺伝子Cah1のプロモーターとレポーター遺伝子Arsを用いて、遺伝子タギング法により、低CO₂条件でのCah1遺伝子の誘導に欠陥をもつ変異株C44を単離している。C44株では、低CO₂条件でCah1の誘導が正常に起こらず、宿主株に比べて生育速度の低下ならびに無機炭素に対する親和性の減少が認められた。
　C44株ではタグの挿入が1箇所で、その挿入と変異表現型は連鎖していた。タグ近傍の配列を解析し、相補実験によって変異原因遺伝子LciR1を同定した。LCIR1はアミノ末端側にMyb-like DNA結合ドメインを一つ持ち、低CO₂誘導性遺伝子であるCah1とLci1の発現を調節していた。LciR1自身の発現も低CO₂条件で誘導され、無機炭素濃縮機構を制御するCcm1遺伝子によって調節を受けていた。LCIR1タンパク質のDNA結合特異性については現在検討中である。

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　光化学系IIは酸化ストレスに対してきわめて感受性が高い。これまでその主要な原因は、活性酸素が光合成装置を攻撃して失活に導くためであるとされてきた。これに対し私たちは、活性酸素の標的が光化学系IIではなく、光化学系IIを修復させるプロセスであることをラン藻を用いて明らかにしてきた。しかしながら、葉緑体でも同じメカニズムが起こっているかどうかは不明である。そこで本研究では、真核藻類であるクラミドモナスを用いて光化学系IIに対する活性酸素の影響をin vivoで調べた。
　Chlamydomonas reinhardtiiの細胞に活性酸素誘発剤であるメチルビオロゲン、過酸化水素、ローズベンガルの存在下で強光を照射すると、光化学系IIの活性が著しく低下した。しかし、その際にクロラムフェニコールを共存させてタンパク質合成を阻害すると、これらの化合物の影響は低濃度ではほとんど見られなくなった。このことは、スーパーオキサイド、過酸化水素、一重項酸素などの活性酸素が光化学系IIに直接損傷を引き起こすのではなく、光化学系IIを修復させるプロセスを阻害していることを示唆している。すなわち、ラン藻と同様に葉緑体でも活性酸素の最初の標的が修復系であると推測される。

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グリシンベタイン（ベタイン）は適合溶質（compatible solute）の一つで、様々な生物種でストレス条件に応答して細胞内に蓄積される。これまでの形質転換株を用いた解析から、ベタインが様々なストレスに対する耐性を与えることが示されてきている。codA遺伝子は、ベタイン合成酵素の一つコリンオキシダーゼをコードしており、codAを導入したラン藻Synechococcus sp. PCC7942は、コリン存在下でベタインを合成し細胞内に蓄積することにより塩と低温ストレスに対する耐性を獲得している。我々はすでにこの株を用いた解析から、塩ストレス条件下での光阻害において、ベタインは光化学系II（系II）反応中心タンパクD1の光損傷後の分解を促進し、その結果系IIの修復の効率を上昇させることを報告した。本研究では、ベタインと塩ストレスがD1タンパクの新規合成に与える影響について調べた。強光照射下で[³⁵S]メチオニンを用いてパルスラベルを行ったところ、D1タンパクの合成は塩ストレス条件下では強く阻害されたが、ベタイン存在下ではわずかな阻害効果しか見られなかった。従ってベタインは、塩ストレス下での光阻害においてはD1の分解と合成の両者を促進し、系IIの代謝回転の効率を上昇させていると考えられる。psbA遺伝子の転写におけるベタインと塩ストレスの影響も、合わせて報告する。

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The research of simultaneous measurements of CO₂ exchange and growth have been continued to evaluate the impact of photosynthesis on biomass. Plants of radish, cv White Cherrish with big storage root were grown for 6 days under 4 different conditions (1: ambient CO₂ of ca. 380 ppm and 23 molE/m²⁺/day, 2: elevated CO₂ of ca. 750 ppm and 23 molE/m²⁺/day, 3: ambient CO₂ of ca. 380 ppm and 15 molE/m²⁺/day, 4:elevated CO₂ of ca. 750 ppm and 15 molE/m²⁺/day) and the rates of CO₂ exchange were monitored continuously during whole periods of growth analysis. The results of growth analysis of RGR, NAR, LAR, LWR, SLA, leaf area, rates of photosynthesis and respiration, and water use efficiencies under 4 different conditions will be discussed comparing the results with radish cv. Kosena with small storage root which was presented last year.

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ラン藻は植物のものにくらべCO₂に対する親和性の低いルビスコを持つが、無機炭素濃縮機構を持つことで大気条件でも効率的に光合成を行うことができる。無機炭素濃縮機構は、無機炭素取り込み機構による細胞内へのHCO₃^-の蓄積と、ルビスコが局在している細胞内構造体カルボキシゾームにおけるCO₂の固定の二つの段階から構成されていると考えられている。無機炭素取り込み機構に関しては現在までに詳細な解析が行われているが、カルボキシゾームに関しては、ルビスコとともにカーボニックアンヒドラーゼ(CA)が実際に存在することから、細胞内に高濃度に蓄積されたHCO₃^-を酵素反応的にCO₂に変換し、ルビスコ近傍のCO₂濃度を上昇させていると考えられているにすぎず、カルボキシゾームに関する詳細な生化学的解析はされていない。本研究は、カルボキシゾームの炭酸固定に関わるCAの機能を解析するために、野生株及びカルボキシゾームCA欠損株から抽出したカルボキシゾーム画分の炭酸固定活性を測定した。その結果、野生株のカルボキシゾーム画分から炭酸固定活性が確認され、CAを欠くカルボキシゾーム画分の炭酸固定活性は著しく低下していた。これらの結果は、カルボキシゾームが炭酸固定の主要な場であり、カルボキシゾームが効率的に炭酸固定を行うためにはカルボキシゾームにルビスコとともにCAが存在しなければならないことを示している。

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ラン藻Synechococcus sp. PCC 7942は炭素欠乏下で、RuBisCOをコードしているrbcLSオペロンの転写を活性化する。これまで、このオペロンの炭素欠乏に応答した発現制御機構を調べるために、rbcLSオペロンのプロモーター領域とVibrio harveyiのluxABを連結してルシフェラーゼ活性をモニターする系を構築し、プロモーター領域に塩基置換を導入して炭素欠乏への応答に必要なCbbR認識配列を明らかにした。Synechococcusでは二つのCbbRホモログが見つかっており（CmpRとRbcR）、CmpRを欠損してもrbcLSオペロンの発現量は減少しないので、RbcRがrbcLSオペロンの制御因子である可能性が示唆されてきた。rbcRはいかなる条件下でも欠失することができないため、今回、rbcRをシャトルベクターを用いて過剰発現させたところ、過剰発現させていない株に比べてrbcオペロンの転写産物量が2倍に上昇した。このことから、RbcRは、炭素欠乏下でrbcオペロンの転写活性化を行っていると結論づけた。

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珪藻は、地球全体の炭素固定の約25％を占めている。藻類は二酸化炭素欠乏環境でも効率よく炭素固定を行うために無機炭素濃縮機構（CCM）を持っており、珪藻においてもそれは確認されている。CCMにおいて、カーボニックアンヒドラーゼ（carbonic anhydrase : CA）は、重要な役割を担う因子の一つである。我々は、海洋性珪藻Phaeodactylum tricornutumからβ型CA（PtCA）をすでにクローニングしている。前回、この遺伝子の発現がCO₂濃度の変化によって誘導され、光はその発現量を増大させる効果があることを報告した。この光による発現調節機構を解明することを目的に、今回、光応答性のシスエレメントの同定を試みた。PtCAの上流約1.3kbを段階的に824, 484, 225, 115, 70, 30bpとなるように短くしたものとGUS遺伝子をそれぞれ連結させたこれらのDNA配列を含む形質転換ベクターをP. tricornutumに導入し、GUS活性を指標としてプロモーターの機能解析を行った。光環境下では、PtCAの発現を抑制するために高CO₂環境で成育させた細胞をAir環境へ移すと、PtCAの発現が誘導された。形質転換珪藻において、PtCAの上流域が50bp以上のものは、Air環境へ移すとGUS活性の誘導が確認された。1292, 824, 484, 225, 115, 70bpのPtCA上流域を含む形質転換珪藻を用いて、高CO₂環境及びAir環境下でのGUS活性発現の光による応答について報告する。

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我々は、C4光合成をより深く理解する一助として、既知のC4光合成関連タンパク質以外にどのような因子がC4光合成の成立に関与しているのかを追求している。今回、同族内にC3種からC4種、中間種の光合成特性を示す植物を内包するフラベリア属の二種の植物C4型フラベリア（F.trinervia）とC3型フラベリア（F.pringlei）を実験に用い、この二種間における遺伝子発現解析からC4種により多く発現していた新規遺伝子をディファレンシャルスクリーニング法により単離した。それらは29種の遺伝子群に分類され、既知の遺伝子と相同性を示す19種、示さない10種の遺伝子をコードしていた。これら遺伝子の多くは、おもに明期の葉に発現がみられ、それらの機能が光合成と関連していることが示唆された。なかでも葉緑体やミトコンドリアに局在する可能性が示されたクーンを中心にしてにいくつかの遺伝子ついて、葉の発達時期・葉内における組織特異的遺伝子発現・タンパク質の細胞内局在性などを調査した。既知のC4光合成関連遺伝子と比較した結果を合わせてこれらの新規遺伝子産物の機能とC4光合成との関連性を議論する。

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植物の光合成能力は栽培温度に馴化し、低温で栽培すると光合成の最適温度が低温側にシフトする。Farquharらは、光合成の最適温度のシフトは2つの光合成部分反応、RuBPカルボキシレーション反応とRuBP再生反応とのバランスの変化により生じると提唱した。また、最近の研究によって、栽培温度は後者の温度依存性そのものにも影響を与えることが示された。本研究では、光合成系の温度馴化における分子メカニズムを明らかにするため、光合成の様々な性質を15℃と30℃で栽培したホウレンソウ葉について比較した。
CO2濃度360μL L-1、光飽和下における光合成速度を解析したところ、個葉の光合成最適温度は15℃葉で18℃、30℃葉では27℃だった。また、RuBP再生反応の最適温度は15℃葉で30℃、30℃葉では36℃だった。そして、栽培条件によってそれほど変化しないと考えられてきたカルボキシレーション反応の温度依存性にも大きな違いが見られ、15℃葉の最適温度は18℃、30℃葉では24℃だった。
二次元電気泳動解析の結果、栽培温度の違いにより、Rubisco small subunitの泳動像に違いがあった。これらの結果から、低温に移したホウレンソウ葉では、低温側で効率よく働くRubiscoの発現、もしくは、Rubiscoの翻訳後の修飾などが関与して、光合成の最適温度を低温側にシフトさせるという可能性が考えられる。

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Sink-limit状態でのサツマイモsource-sinkモデル植物の光合成CO₂固定速度低下はRubiscoに活性阻害物質が結合することに主に起因し、その物質は既知のRubisco活性阻害物質と同様に糖リン酸であると示唆された（岩船ら2002年度学会）。我々はsink-limit状態にあるサツマイモ葉のextract中に含まれるこの阻害物質を活性化したRubiscoに結合させて回収するという方法を試み、昨年度には糖リン酸分析用のHPLC上で単一のピークが得られるまでの精製が可能であることを示した（2003度学会）。
しかし、サツマイモ葉の中に多量に含まれるフェノール性物質がRubisco活性を阻害し、そのことによりRubiscoと阻害物質の結合が阻害されるため、フェノール性物質除去をPVPP、charcoalを用いて試みた。また、HPLC上で単一のピークが得られるまでに精製した阻害物質について、カルバゾール硫酸法でそのペクチン含量を調べたところ、多量に含まれていることが分かった。このことにより、精製された阻害物質はイオン化しにくい状態となっており、NMRやGAS MASSなどでの質量分析の妨げとなっていることが分かった。以上のようなことから、HPLC上で単一ピークの物質の精製は出来たが、その中にはまだ様々な物質が混入していることが分かった。目的とする阻害物質を高純度で得るために、混入物が何であるのか、またその除去方法について検討中である。

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　葉の老化過程やストレス条件下では、葉緑体における活性酸素の生成が助長されることが知られており、活性酸素がタンパク質分解の引き金として関与している可能性が提案されている。実際に光合成のキーエンザイムであるRubiscoは、活性酸素によって直接的に断片化されることが実証された。しかしながら、これらの報告はin vitroでの実証に留まっており、in vivoでもこの現象が起こりうるのかどうかは不明のままである。そこで本研究では、活性酸素によるRubiscoの断片化がin vivoにおいても起こりうるのかどうかについて検証した。
　低温感受性植物であるキュウリの葉切片を低温弱光下でインキュベートした際に、Rubisco-LSUが断片化され、主に5つの分解フラグメントが生じた。さらに、ヒドロキシルラジカルの捕捉剤であるn-propyl gallateと、スーパーオキシドの捕捉剤であるtironを添加すると、それぞれ断片化が抑制された。またFeSO₄の存在下では断片化が促進され、金属キレート剤を添加すると断片化は抑制された。さらに、キュウリ葉から精製したRubiscoをヒドロキシルラジカル発生系にさらしたところ、その分解物は分子量、等電点において葉切片で見出されたものと一致した。これらの結果から、in vivoにおいてもRubisco-LSUは活性酸素によって直接断片化されることが強く示唆された。

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　Rubisco量やその他の光合成タンパク質量が、葉の展開中の窒素の供給量により大きく左右されることが詳細に調べられている。 (1) 。しかしながら、葉の完全展開以降の窒素の栄養処理による光合成関連タンパク質への影響はほとんど調べられていない。そこで、本研究では、イネ第8葉身を材料に、葉の完全展開時及びその1週間後から、1 mM N 区と4 mM N 区の2区を設けて、窒素の供給量の違いが葉の老化過程における主要な光合成関連タンパク質に与える影響を調べることを目的とした。サンプリングは、窒素処理開始後1週間、1日おきに行った。分析は、葉身全窒素含量、葉身への窒素流入量、Rubisco量、Chl量、LHCII量、CF₁量について調べた。その結果、全ての分析対象は、処理時期の違いに関わらず、4 mM N 区では1 mM N 区よりも量的な増加が認められた。また、葉身全窒素含量に対するRubisco量の割合は、両処理時期共に、4 mM N 区において、より高い値を示していた。一方、葉身全窒素含量に対するLHCII量、CF₁量、Chl量の割合は、4 mM N 区と1 mM N 区の間に、大きな差はなかった。以上から、葉の完全展開以降においても窒素の供給に対して、Rubisco量は、LHCII量、CF₁量、Chl量よりも大きく影響されることが分かった。
(1) Makino et al., Plant Physiology 105: 173-179 (1994)

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アサガオの獅子(feathered ; fe)突然変異体は江戸時代の文化文政期に起源し、その表現型は、植物体全体がうねり葉は裏側を表にしたように抱える。また花冠は裂け、しばしば折り返されて風鈴状になる。実際、組織の観察において葉の裏側の表皮で気孔の数が減少するなどの向軸化が観察された。獅子の体細胞復帰変異体を材料にトランスポゾンディスプレイ法の一種であるSTD法をもちいて獅子突然変異の原因遺伝子を単離した。獅子遺伝子は、植物固有の転写因子であるGARPドメインを持つタンパク質をコードし、シロイヌナズナのKAN1遺伝子ともっとも高い相同性を持っていた。そのため獅子もKANと同様に側生器官の裏側で発現し、背軸側の特徴を決定していると予想される。転写産物の解析の結果、変異体では野生型に比べて転写量の増加や、挿入しているTpnの内部でスプライシングされたと考えられる長い転写産物がみられた。これらの結果が獅子変異体が優性であることの原因かもしれない。ゲノム構造の解析から獅子突然変異は単一起源であることが示唆されるが、系統によって表現型がかなり異なっている。また、交配実験からも強い変異体は2つ以上の変異による多重変異体である証拠が得られており、もとの獅子突然変異に加えて表現型を強めるような新たな突然変異をもっていると考えられる。

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　維管束植物は、二倍体世代において葉等の側生器官を繰り返しつけるシュートを作る。これに対し、コケ植物は一倍体世代にシュートを作り、二倍体世代は軸の頂端にただ一つの胞子嚢を作る。我々は、シロイヌナズナにおいてシュート形成に重要な役割を担う遺伝子であるSHOOT MESISTEMLESS(STM)のセン類における相同遺伝子(KNOX class1遺伝子)がどのような役割を持っているかを解明することを目的とした。
　セン類のヒメツリガネゴケは3つのKNOX class1遺伝子(PpKN1/MKN2, MKN5, MKN4)を持つ。PpKN1とMKN5の3'端にレポーター遺伝子(uidA)を挿入したヒメツリガネゴケを作出し、レポーター遺伝子の発現を調べたところ、いずれも一倍体シュートでは発現が見られず卵および若い二倍体組織においてのみ発現が見られた。PpKN1をシロイヌナズナにおいて35Sプロモーターの制御下で発現させると葉が切れ込む表現型を示した。このことから、PpKN1とMKN5は二倍体に一時的に存在する分裂組織の形成維持に関与していると推測される。PpKN1の遺伝子破壊株を作出したがはっきりした表現型は確認できておらず解析中である。現在、MKN4-GUS株およびMKN5・MKN4との二・三重破壊株を作出中である。

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　細胞伸長は、植物形態形成において必須である。細胞伸長過程では、微小管配向制御や細胞壁合成等の様々な現象が起きている。それらの現象に関わるタンパク質をコードする遺伝子の発現は、制御因子により厳密に制御されていると考えられる。近年、細胞伸長変異体を用いた分子遺伝学により、細胞伸長に関与する遺伝子が明らかにされつつあるが、ゲノムレベルでの細胞伸長に関わる遺伝子群の発現情報や、それらの発現制御メカニズムに関する知見は乏しい。我々は、細胞伸長に関与する遺伝子群の発現情報を網羅的に取得するため、アラビドプシスを用いオリゴマイクロアレイによる解析を行った。
　マイクロアレイは、Agilent社製のArabidopsis 2 Oligo Microarrayを使用し、蛍光データの取得と数値化は、Agilent社製のScannerとFeature Extractionソフトで行った、データ解析はRosetta Biosoftware社のLuminatorで行った。これまでに、シロイヌナズナ野生株やセルロース合成変異体を用い、下胚軸・ロゼット・花茎における細胞伸長期の遺伝子発現プロフィールを調べた。現在、細胞伸長期に共通して発現誘導される遺伝子群を選抜するため、得られた結果の解析を進めている。

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植物の葉は薄く平坦であるが、2次元的な広がりだけでなく、ある程度の厚さも持っている。葉の厚さを決める要因は、葉肉細胞や表皮細胞の形状や大きさ、葉肉細胞の層数である。シロイヌナズナでは酸素濃度の低下、ポプラでは二酸化炭素濃度の増加、シロザでは強光により、葉肉細胞の層数が増加することが報告されているが（Ramonell et al, 2001; Oksanen et al, 2001; Yano and Terashima, 2001）、その詳細な分子メカニズムは明らかになっていない。今回、シロイヌナズナの葉肉細胞の厚さが変化する突然変異体を単離するために、レーザー変位センサを用いた葉の厚さ測定装置を作成した。これにより、我々の栽培・測定条件では、C24野生型の葉の厚さは115±33μmというレベルで再現性よく測定される。
この装置によるスクリーニングの過程で、葉肉細胞の層数が増加する突然変異体N374を単離することができた。N374は葉肉細胞の層数が増えるだけでなく、細胞サイズや葉の面積の減少が見られる。細胞のサイズが減少することから、層数の増加と葉の厚さの増加は一致しない。この突然変異体を解析することで、葉肉細胞の並層分裂の制御の一端を解明できると期待できる。本大会では、N374における最新の解析結果を報告する。

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As the only member of C-terminal binding protein (CtBP) family in Arabidopsis thaliana, ANGUSTIFOLIA (AN) has not only D-isomer-specific 2-hydroxy acid dehydrogenase (D2-HDH) motif which is conserved among CtBPs, but also LXCXE motif, PEST motif, cell-cycle-specific phosphorylation site and nuclear localization signal.* We carried out the comparative analysis of AN protein with authentic CtBP/BARS family, focusing on the above-mentioned AN-specific motifs which are not found in CtBPs. AN did not show ability of interaction with the C-terminal region of E1a. Moreover, AN-specific C-terminal region was found to be required for self-association. Although AN has LXCXE motif, AN did not interact with Rb in yeast two-hybrid system. Various types of mutated ANgene were constructed and the ability of complementation of the an mutation was examined for each mutated AN. Our data strongly suggest that AN has evolved different molecular function from CtBPs.

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葉の葉身部分は扁平な構造を持ち、その形態形成は、有限かつ2次元的な細胞増殖に依存している。我々はシロイヌナズナの細葉変異株であるangustifolia3 (an3)を用いた解析を進めている。その結果、葉原基の細胞増殖方向は、初期のPhase I で主に縦方向に、後期のPhase II では縦、横両方向へと変化することを見出した。AN3 の機能欠損により、Phase II の細胞増殖能は著しく低下するが、細胞増殖の方向性は影響を受けない。AN3 はヒトの転写コアクチベーターであるSYT と相同性を有し、Phase II で強く発現する。これらのことから、細胞増殖の方向性と増殖活性が密接に制御されることで、葉身における細胞数の縦横比が決定されることが示唆される。この仮説をさらに検証するため、AN3の過剰発現体を作出したところ、葉の細胞数と葉のサイズが野生株よりも増加した。また、AN3 とともに働く転写因子と推定されるGRL を同定し、その過剰発現体の作出と、組織特異的な発現様式の解析を進めている。これらの解析結果を踏まえ、AN3 とGRL の葉形態形成に果たす役割について議論したい。

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托葉とは、葉の基部付近に生ずる葉身以外の葉的器官の総称であり、エンドウのように大きく発達するものから、一見全く形成が起らないもの、あるいは、一旦形成されても、比較的早い時期に脱落するものなど、形態も種によって様々である。我々は、マメ科モデル植物であるミヤコグサを用い、托葉形成機構を解明しようと試みている。
　ミヤコグサの葉は野生型において、2枚の托葉と、3枚の小葉からなる三出複葉とで構成される。これに対し、#1448および#216変異株では、托葉の形成がみられず、複葉を構成する3枚の小葉は、各々異なった程度で棒状化あるいは杯状化する。解剖学的解析の結果、これら棒状化した小葉では向軸側の性質を持つ細胞が見られないことから、キンギョソウphan変異体に見られる棒状葉と似た性質を持つことが明らかになった。そこでまず、この劣性変異の原因を探る目的で、ミヤコグサより2コピーのPHAN/AS1/RS2ホモログを単離し、発現部位、及び変異の有無について解析を行った。本大会では、解析結果をもとに、それらホモログが両変異株における原因遺伝子かどうかについて議論したい。

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高等植物の葉は、茎頂メリステムから発生分化する扁平で左右相称的な器官である。葉の形態形成の分子機構を明らかにするため、我々は葉の左右相称性と扁平性に異常があるシロイヌナズナのasymmetric leaves1 (as1) とasymmetric leaves2 (as2) 変異体を解析してきた。その結果、AS1とAS2は、左右相称性の中心としての中肋の発達と、葉におけるClass 1 knox ホメオボックス遺伝子群（未分化細胞の維持に関わっていると考えられているBP/KNAT1, KNAT2, KNAT6）の発現抑制に関わり、側生器官の中心軸形成をになっていると考えられた。AS1 は、MYB repeats を持つタンパク質であり、AS2は、cysteine repeats と leucine zipper 様配列からなる新奇なドメイン（AS2ドメイン）構造を持つAS2ファミリーのメンバーであること、またyeast two hybrid 系とin vitroでは相互作用することがわかっている。今回、in situ hybridization によるAS1とAS2の発現解析の結果と、AS1とAS2のタンパク質レベルでの解析結果について報告する。また、遺伝学的組織学的解析からAS2が葉の発生過程においてAS1依存的に葉原基の向軸側の細胞増殖の制御に関わっていることが示唆されたので報告する。

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Recessive mutations in ASYMMETRIC LEAVES2 (AS2) display asymmetric leaf-shape, altered venation pattern, higher potency of regeneration and ectopic expression of class1-KNOX in leaves of arabidopsis. AS2 is a plant-specific novel protein that belongs to novel AS2/LOB-family. To investigate the function of AS2 protein, we constructed and analyzed 35S:AS2-GR transgenic arabidopsis. Transiently expressed AS2-GFP-GR fusion proteins localized in nuclei of BY-2 cells dependently on Dex. High amount of AS2-GR fusion proteins were accumulated in 35S:AS2-GR transgenic arabidopsis independently from Dex. 35S:AS2-GR transgenic arabidopsis exhibited hyponastic leaves or growth-arrest when they were treated with 10 nM or 100 nM Dex, respectively. Finally, 35S:AS2-GR transgenic plants could exhibit flat and symmetric leaves dependently on Dex even in as2-1 background. Thus we concluded that AS2-GR fusion protein was functional and that AS2 was nuclear protein. Recently, we are analyzing the effects of chemical compounds on the phenotype of 35S:AS2-GR transgenic and as2 mutant plants.

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エンハンサートラップ法を用いて、シロイヌナズナの前形成層や維管束で発現する遺伝子を同定し、それら遺伝子の機能を逆遺伝学的に解析することを進めている。GFPをレポーター遺伝子とし、pBluescript IIを含む、エンハンサートラップT-DNAコンストラクトを構築した。レポーターにGFPを用いているので、T1形質転換体で発生段階を追って発現パターンの観察を行い、エンハンサートラップ系統を選抜することができる。また、T-DNAにpBluescript IIを含んでいるので、T-DNA挿入ゲノムDNAを、プラスミドレスキュー法を用いて単離することも可能になる。これまでに、約20,000のT1形質転換体から、実体蛍光顕微鏡下でGFP蛍光が観察される562個体を選抜し、その中から、前形成層や維管束で蛍光が観察されるものを346個体見いだした。これらは、前形成層と維管束で蛍光が観察された組織別に、本葉105個体、根209個体（特に根端の前形成層では10個体）、地上部及び根16個体、本葉以外の地上部16個体に分類された。現在、T1形質転換体のスクリーニングと並行して、T2世代を用いてGFPの蛍光パターンを詳細に観察すると共に、挿入T-DNAに隣接するゲノムDNAの塩基配列を決定し、挿入部位近傍の遺伝子を同定している。

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維管束分化の空間的制御機構を解明するため，我々はシロイヌナズナから葉脈パターンに異常のある変異体(van1～van7)を単離し解析している．今回，細脈が著しく断片化した状態で形成されるvan3変異体について，精密マッピングに基づく原因遺伝子のクローニングを行ったので報告する．
精密マッピングの結果，van3変異は第5番染色体上，30 cMの位置，約89kbの範囲に存在することがわかった．この領域の野生型及びvan3変異体ゲノムDNAを比較したところ，推定CDSの一つに，van3変異に伴うG→Aの1塩基置換が見出された．van3変異のホモ接合個体は抽苔せずに枯死する．そこで塩基置換の発見されたCDSとその周辺域を含む野生型ゲノム断片を，van3変異に関するヘテロ接合個体に導入し，T2世代においてvan3変異形質の分離と導入遺伝子の存否との関係を調べた．その結果，導入ゲノム断片が変異形質を相補することが確認された．そこでこのCDSがVAN3遺伝子に相当すると判断した．VAN3の推定遺伝子産物は827アミノ酸残基からなり，小胞輸送の調節因子Arf GTPase-activating protein（ArfGAP）と高い相同性が認められた．またシロイヌナズナゲノムには，配列上VAN3と相同な遺伝子が他に3つ存在した．

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我々はシロイヌナズナにおいて葉脈の連続性を制御するVAN3 遺伝子を同定した。VAN3は ArfGAPドメインを持つタンパク質をコードしており、小胞輸送の調節因子であることが予想される。本研究では VAN3の機能を明らかにするためにGTPase 活性の測定、および細胞内局在に関する解析を行った。
　VAN3の GTPase 活性を示すために、in vitro で VAN3の酵母の Arf1p に対する GTPase 活性を測定した。するとGTPase 活性が実際に認められ、このことから VAN3はシロイヌナズナにおいてARFと相互作用し、小胞輸送を制御しうることが示唆された。次に VAN3が小胞輸送の如何なる過程を制御しうるのかを明らかにするために VAN3の C 末端に Venus を融合させたコンストラクトを作成し、CaMV35S プロモーターの制御下で一過的に発現させた。すると、細胞内において小さい輝点が観察された。この輝点はFM4-64 を用いて染色される細胞内小器官と共局在することから VAN3 はエンドソームに局在すると考えられた。現在、VAN3と GNOM ArfGEFの細胞内での共局在性及び VAN3遺伝子の発生段階での発現解析を行っており、このことと併せて報告する予定である。

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維管束分化の空間的制御機構を解明するため，我々はシロイヌナズナから葉脈パターンに異常のあるvan3突然変異体の解析を進めている。VAN3遺伝子はArfGAPモチーフを持つタンパク質をコードしており、エンドソーム様の膜上で複合体を作って機能することが示唆されたため、本研究ではVAN3活性を制御しうる因子の探索を行った。酵母Two Hybrid Systemを用いたドメイン解析から、VAN3タンパク質のBARドメインはホモダイマー形成に必要十分であることが示された。さらに、酵母Two Hybrid Systemを用いたVAN3結合タンパク質の探索を行った結果、GTPaseドメインを有するADL1A　dynaminが単離された。ADL1Aは魚雷型胚において維管束で特徴的な発現が観察された。ADL1A::ADL1A-GFP形質転換体を用いた細胞内局在の結果、ADL1Aタンパク質はエンドソーム様構造上にも局在することが明らかとなった。adl1a突然変異体はトライコームや柱頭毛形成、さらには維管束の連続性に異常を示した。また、adl1a, adl1e二重突然変異体は前形成層形成不全を起こし、胚性致死を示すこと等から、ADL1Aは単細胞が特殊化した細胞へと分化する課程で共通して機能し、その一部はVAN3による活性制御をうける可能性があることが示唆された。

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植物におけるクロマチン構造と遺伝子発現制御の関係を理解するため、シロイヌナズナ植物体と培養細胞を用い、HSP18.2、ヒストンH4、PCNA、V-ATPaseとADH遺伝子について、プロモーター周辺のクロマチン構造の凝集度合いをDNase I感受性として評価した。その結果、これらの遺伝子の発現の有無に関わらずDNase I感受性は遺伝子間、さらに葉と培養細胞間でほぼ一様であったが、ADH遺伝子以外の各遺伝子プロモーター内に局所的なDNase I高感受性部位が葉と培養細胞において同様な位置に見出された。次に、これら高感受性部位を調べるため、熱処理の有無によりHSP18.2遺伝子の転写活性・不活性な状態にある培養細胞を用いDNase I感受性とヌクレオソーム構造を解析した。その結果、転写活性化に伴いDNase I高感受性部位が下流に広がること、またヌクレオソームのポジショニングがその近傍で変化することが明らかになった。さらに、ADH遺伝子プロモーターについては培養細胞では高感受性部位が検出されたが葉では見出されなかった。以上の結果と、ABAによりADH遺伝子は培養細胞では誘導されるが葉では誘導されないことを考え合わせると、これら高感受性部位の存在はヌクレオソーム構造を介して転写活性化因子のプロモーターDNAへの接近性を制御することにより、転写制御に機能していることが示唆された。

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　Upstream ORF（uORF）の中には下流の ORFの 翻訳を抑制する例がいくつか知られている。この過程でリボソームは uORF の翻訳終了後に一旦解離し、下流の ORF の開始コドンで翻訳を再開始すると考えられている。私たちはこれまでに翻訳の再開始に関与する L24 リボソーム蛋白質遺伝子の1つが欠損したシロイヌナズナ突然変異体を単離し、この突然変異体では雌ずいのパターン形成に異常が観察されることを報告した（2001、2002本大会）。一方よく似た雌ずいの表現型を示す突然変異体として ett と mp が知られており、これらの原因遺伝子も uORF を持っていた。このことから ETT と MP の uORF はリボソームにより翻訳されることで下流 ORF の発現を抑制的に制御しており、L24 突然変異体ではその過程で翻訳の再開始が効率よく行われないため、雌ずいのパターン形成が異常になるという仮説をたてた。この可能性を検証するために、uORF を含む 5′UTR と、点突然変異により uORF を無くした 5′UTR をそれぞれレポーター遺伝子につないだ融合遺伝子を作製し、葉肉細胞プロトプラストで一過的に発現させてレポーター活性を測定した。その結果 uORF を含む融合遺伝子を導入した場合、uORF を含まないものに比べてレポーター活性の減少が認められた。このことから、ETT と MP の uORF は下流 ORF の発現を抑制していることが示された。

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7SL RNA は Signal Recognition Particle (SRP) の RNA 成分である。tRNA から派生したものと考えられ、RNA ポリメラーゼ III で転写される。植物の 7SL RNA は転写制御配列として転写領域上流に USE (Upstream Element) と TATA を持ち、tRNA や 5S rRNA のような内部プロモーター配列は存在しないと考えられている。また、ヒトの 7SL RNA には 5' 側にプロペラー型の2次構造が存在し、その構造によって転写を自己制御する考えられている。そこで、シロイヌナズナ由来の 7SL RNA 遺伝子配列に点変異を導入し、タバコの in vitro 転写系による解析を行った。結果、内部プロモーターの存在を強く示唆する結果を得ると同時に、シロイヌナズナにも存在する 7SL RNA のプロペラー構造を壊すと、安定性が著しく減少することが明らかとなった。

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