植物細胞の増殖制御の機構を明らかにすることは、植物の発生過程を理解する上で不可欠である。植物体における細胞増殖の制御は、最終的にはサイクリンなどの細胞周期制御因子を介した個々の細胞の細胞周期制御に起因すると考えられる。私たちは、培養細胞を用いた単純な系を利用し、サイクリンの転写を制御する仕組みを研究してきた。タバコ培養細胞BY2の同調培養系を用いた一連の研究により、サイクリンB遺伝子の転写がG2期後期からM期に特異的に起こること、この周期依存的な転写にはMSAエレメントと名づけたシス配列が必要かつ十分であること、MSAエレメントは様々なG2/M期制御因子の転写に共通に関わっていることを明らかにしてきた。MSAエレメントに結合し転写制御を司る因子は三回の繰り返し構造をもつタイプのMyb（3RMyb）であった。これらには転写活性化因子としてはたらくMybと競合的な抑制因子として働くMybがあり、それらのバランスの変化によりG2/M期転写が実現しているという仮説を提唱している。現在、5個存在するシロイヌナズナの3RMyb遺伝子を逆遺伝学的に解析している。3RMybの遺伝子破壊株は細胞質分裂、核分裂、分裂面決定などのG2/M期に起こる事象の異常が原因と考えられる表現型を示した。培養系を用いた分子生物学で明らかにしてきたG2/M期転写制御機構が遺伝学的にも正しいことが明らかになってきた。

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硫黄はアミノ酸、タンパク質、脂質などの一次代謝産物を構成する必須元素であり主に硫酸イオンとして根から吸収される。植物における窒素、硫黄、リンなどの主要栄養元素の吸収と輸送は、異なった特性、機能を持つ複数のイオントランスポーターの組織・細胞・オルガネラレベルでの空間的配置により高度に制御されている。演者らはシロイヌナズナのゲノム上に存在する12種の硫酸イオントランスポーター(SULTR)について分子生理学的な解析を行い、硫酸イオンの吸収及び器官間輸送の制御に関わるSULTR分子種の生理機能を解明した。(1)高親和型硫酸イオントランスポーターSULTR1;1、SULTR1;2が根の表皮、皮層、根毛に局在し、硫黄欠乏による硫酸イオン吸収活性の増加に寄与することを明らかにした。(2)低親和型硫酸イオントランスポーターSULTR2;1がSULTR3;5と協調的に機能し、根維管束組織において地上部への硫酸イオン輸送の調節を行うことを明らかにした。(3)SULTR4;1、SULTR4;2が根の内鞘細胞、木部柔細胞の液胞に局在し、液胞からの硫酸イオンの排出を調節することを証明した。(4)篩部伴細胞に局在するSULTR1;3はシンク器官への硫黄転流に機能する高親和型硫酸イオントランスポーターであった。本講演では、植物個体レベルでの硫酸イオン輸送の諸過程について述べるともに、硫黄同化制御で鍵となるSULTR1;1及びSULTR1;2のmRNA発現制御、活性調節機構についても最近の知見を紹介する。

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　我々は日長感受性が無くなり早咲きになる等、多面的な表現型を示すtfl2突然変異体の解析を行い、TFL2遺伝子が花成の経路においてFTを特異的に抑制していることを明らかにした。また遺伝子クローニングにより、TFL2はアラビドプシスゲノム上で唯一のHeterochromatin Protein1 (HP1)ホモログであることを示した。また、TFL2はFT以外にもいくつかの花のホメオティック遺伝子を抑制していることを明らかにした。
　その後、TFL2がHP1とホモロジーを持つことに基づいて、アラビドプシスにおけるヘテロクロマチン制御への関与を調べた。しかしながら、染色体上の位置による遺伝子発現のプロファイルの変化や、ヘテロクロマチン領域にあるトランスポゾンの活性化はtfl2で観察されなかった。またTFL2タンパク質の局在をみたがヘテロクロマチン領域とは共局在していなかった。以上の様に、TFL2がアラビドプシスのヘテロクロマチン制御に関与していることを示す積極的な証拠は得られなかった。
　次にTFL2によるFTの発現抑制機構について解析を行った。その結果、FTは長日刺激によって葉の先端部の維管束でのみ発現するが、tfl2では日長によらず葉全域の維管束で発現することが明らかとなった。また、TFL2によるFTの発現抑制はCOなどの活性化因子により競合的に解除されることも分かった。

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ブラシノライドは最も活性の高いブラシノステロイド（BR）であるが、その合成酵素は同定されていなかった。ブラシノライドの直接の前駆体であるカスタステロンはシトクロムP450酵素CYP85A（C-6位酸化酵素）により6-デオキソカスタステロンから2段階の酸化を経て合成される。CYP85A1酵素を欠失するトマトのextreme dwarf (d^x)突然変異体は、そのBR欠損により茎葉の伸長抑制、葉の形態異常、および稔性の減少を引き起こすが、正常な大きさの果実を着ける。このd^xの果実における内生BR含量をGC-MSを用いて分析したところ、ブラシノライドが野生型と比較して非常に高濃度で蓄積していることが見出された。このことからトマト果実にはCYP85A1とは異なるC-6位酸化酵素が存在し，ブラシノライドを合成するものと考えられた。我々はd^x突然変異体の果実において発現するP450遺伝子を探索し、新規C-6位酸化酵素を同定した。このP450の転写産物はトマト果実に高いレベルで蓄積するが，茎葉と根では検出されない。この新規C-6位酸化酵素を生産する形質転換酵母に6-デオキソカスタステロンを代謝させたところ、カスタステロンばかりでなくブラシノライドへの変換までもが確認された。本研究によって，ブラシノライド合成酵素は三段階のC-6位酸化を行うP450酵素であることが初めて明らかにされた。

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植物ホルモン・ブラシノステロイド（BR）の情報伝達に関与するBRI1は、1つの膜貫通領域をはさんで、N末側の細胞外領域に25個のロイシンリッチリピート（LRR）と21番目と22番目LRRの間に70個のアミノ酸からなるアイランドドメイン（ID）、C末端の細胞内領域にセリン/スレオニンキナーゼドメインをもつ受容体型キナーゼである。これまでの研究により、BRI1はBRの受容において不可欠な因子であることが示されているが、BRがBRI1に直接結合しているのかどうかは不明であった。本研究では、光親和性BRプローブであるbiotin-tagged photoaffinity castasterone （BPCS）を用いてBRとBRI1の結合について解析を行った。その結果、BPCSは植物体より免疫沈降したBRI1に直接結合することが明らかとなった。さらに、BPCSの結合部位について、大腸菌で発現させ精製したBRI1断片を用いて調べたところ、IDとIDのC末端側の22番目LRRからなる94アミノ酸（ID-LRR22）が結合の最小領域であり、ID-LRR22断片はBPCSに対して全長BRI1と同じ親和性を持っていた。以上の結果は、BRI1はBRの受容体であり、BRはBRI1細胞外領域のID-LRR22に直接結合することを強く示唆するものである。

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　我々は既に発表したd61-1, d61-2を含め、これまでに10個のOsBRI1遺伝子欠損変異体のアリルを単離した。これらの変異体はアリルにより様々な強弱の表現型を示した。これらの変異体は表現型が強くなるに従い、葉鞘長、冠根数及び種子根の側根数が減少した一方で、葉身長や種子根長への影響は少なかった。これらのOsbri1の中で最も強い表現型を示すnullアリルのd61-4に着目し解析した。播種後一ヶ月のd61-4では活性型ブラシノステロイド(BR)であるカスタステロンが地上部で野生型植物の約30 倍に蓄積していた一方で、地下部では野生型と大きな違いは見られなかった。半定量的RT-PCRの結果、BR生合成経路のC6位酸化酵素をコードするDWARF遺伝子の蓄積も地下部よりも地上部の方が著しいことが分かった。地下部ではBRI1ホモログであるBRI2及びBRI3が発現しており、特にBRI3はd61-4で発現が野生型と比較して増加していることから、これらが相補的に作用することによりBRI1欠損による影響が緩和された可能性が考えられた。d61-4は受精後5日目以降の胚発生で発達に異常が見られ、野生型植物と比較してシュートと根が近接し、小型で奇形の器官を形成した。
　本研究の一部は生研機構基礎研究推進事業の支援で行われた。

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シロイヌナズナCYP90B1/DWARF4は、ブラシノステロイド生合成の主要なステップであるC22-水酸化を触媒する。我々はイネCYP90B1/DWARF4相同遺伝子OsDWARF4とその変異体osdwarf4-1を単離し、2002年度年会で報告した。しかしOsDWARF4の機能が完全に失われていると考えられるosdwarf4-1が、ブラシノステロイド欠損に伴う形態異常としては極めて弱い表現型しか示さなかったことから、同じ機能を持つ別の酵素がイネには存在していると考えられた。データベース解析で得られたOsDWARF4様遺伝子はシロイヌナズナCYP724A1と相同性示し、2004年度年会で田邊らにより報告されたイネ矮性変異体d11の原因遺伝子CYP724B1/D11と同一であった。CYP724B1/D11の機能が完全に失われていると考えられるd11変異体の表現型も弱かったことから、OsDWARF4とCYP724B1/D11の機能が重複している可能性が考えられた。今回はosdwarf4-1×d11二重変異体の解析を中心に、OsDWARF4とCYP724B1/D11の関係について考察する。

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　アブシジン酸 (ABA) は、ABA 8'-水酸化酵素で8'位を水酸化されると、自動的な環化でファゼイン酸となり不活化する。昨年ABA 8'-水酸化酵素遺伝子 (CYP707A) がシロイヌナズナからクローニングされた。そこでCYP707A3を発現させた昆虫細胞のミクロソームとABAアナログを用い、ABA 8'-水酸化酵素によるABAの認識部位を調べた。
　各部位を改変した45のABAアナログを基質とした水酸化反応及び酵素阻害試験を行った。阻害活性が高かったABAアナログに対しては、阻害形式と解離定数を求めた。その結果、酵素の反応部位周辺にあたる8'位と9'位は立体的な制約がある事が判明した。また6位と1'位水酸基は基質認識に必要でない一方で、1位カルボン酸は基質の結合に重要であった。3'位と7'位の改変は結合に大きく影響しなかった。側鎖がアキシアルである5'α,8'-cyclo-ABAは酵素を阻害したのに対し側鎖がエクアトリアルである5'β,9'-cyclo-ABAは阻害能がなかった事から、ABAは側鎖アキシアル型で酵素に結合している事が示唆された。今後はこの知見を元にABA 8'-水酸化酵素に特異的な阻害剤を開発していく予定である。

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ABAは、乾燥ストレス時の気孔閉鎖、種子の登熟と休眠性の維持に関わり、その内生量は生合成と不活性化のバランスにより調節されている。本研究は、シロイヌナズナでのABAの主要な不活性化経路に関わる4つのABA 8'位水酸化酵素（シトクロムP450 CYP707A1-4）の個々の生理的役割の解明を目的とした。植物体では、遺伝子の発現解析からCYP707A1とCYP707A3がABA量の調節に重要な役割を担っていると推測された。実際、変異体を用いた解析により、cyp707a1とcyp707a3では野生型と比べて内生ABA量の増加と乾燥耐性が見られ、この二重変異体はさらに強い表現型を示した。プロモーターGUSの解析結果から、植物体ではCYP707A1と CYP707A3が異なる場所でABAの不活性化に重要な役割を果たしていることが示唆された。一方、種子のABA量の調節においては、CYP707A2のみが重要であると考えられていたが、cyp707a1はcyp707a2よりも多くのABAを種子に蓄積しており、さらに二重変異体ではABAが野生型の50倍にまで蓄積した。遺伝子の発現解析から、種子ではCYP707A1と CYP707A2が異なる時期に異なる場所でABAの不活性化に重要な役割を果たしていることが示唆された。三重変異体の解析結果も合わせて、個々のCYP707A の役割について議論する予定である。

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気孔の開閉には種々のシグナル伝達物質が関わっているが、中でもアブシジン酸（ABA）は水分の不足を感知して気孔を閉鎖させることが知られている。ABAの作用には、気孔の閉鎖以外にも種子発芽の抑制が知られているが、この過程をエチレンは負に制御することが明らかとなっている。そこで、気孔閉鎖過程においてもエチレンが関与している可能性を考え、シロイヌナズナの表皮切片を用いてエチレンの効果を調べた。光照射により気孔を開かせた表皮切片にABAを処理すると気孔が閉鎖するが、同時にエチレンガスを処理するとこの気孔閉鎖作用が抑制されることが見出された。ABA添加後の気孔の開口度の変化を経時的に測定した結果、ABA添加により気孔は5分程度で閉鎖したが、エチレン及びその前駆体である1-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸（ACC）を処理すると、気孔が閉じる速度には大差が見られなかったが、気孔の閉鎖が途中で停止することが観察された。これらのことから、エチレンはABAによる気孔閉鎖反応を阻害している可能性が示唆された。また植物個体を用いて、乾燥条件における生重量の変化を測定したところ、エチレンガスを処理した個体では無処理の個体に比べて生重量の減少が大きいことがわかった。このことから、植物個体においても、ABAを介した気孔閉鎖をエチレンが抑制している可能性が示唆された。

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　アブシジン酸(ABA)は、種子登熟、気孔の閉鎖や環境ストレス応答に関わることが知られている。我々はこれまでにABA高感受性を示すahg変異体(ABA hypersensitive germination)を単離し、解析を行ってきた。今回はahg2変異体の解析結果について報告する。
　ahg2変異体は、種子発芽と植物体においてもABA高感受性を示し、種子休眠性も高まっていた。種子と浸透圧ストレス処理を行った植物体の内在性ABA量を測定したところ、ahg2は野生型に比べが約1.5倍高いことが分かった。また、ahg2は通常生育下において、根や茎が短いなど形態的にも多様な表現型を示した。マイクロアレーを用い、通常生育下での発現解析を行ったところ、いくつかのストレスやサリチル酸誘導性遺伝子がahg2で上昇していた。また、ahg2は種子発芽において、サリチル酸高感受性を示した。マッピングの結果ahg2変異体の原因遺伝子はpoly(A)-specific ribonucleaseをコードし、RNA分解に働いていることが分かった。AHG2遺伝子はABA、塩、浸透圧ストレスに対し発現誘導することから、AHG2はABA、やストレス応答に関与するある種の遺伝子のmRNAを特異的に分解しているのではないかと考えている。

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ABA応答に異常を示す突然変異体を得るためにシロイヌナズナCol株を対象にABA類縁体に感受性を示す突然変異体の探索を行い、ABA高感受性変異体ahg1～7を分離した。そのうちの一つであるahg3の解析について報告する。単離されたahg3-1は発芽においてABA、NaCl、KCl、マンニトールに高感受性を示した。発芽後の芽生えの生長においてはNaCl、KCl、マンニトールに感受性を示した一方、ABAに対する応答は野生株と変化がなかった。また生育3週間の植物体のABA・ストレス誘導性遺伝子の発現をノーザン解析によって調べたが野生株との変化はなかった。昨年の本大会で報告したように、ahg3-1の原因遺伝子はPP2CをコードするAtPP2CAであることがマッピングにより推定されていた。ahg3-1組換えタンパク質のPP2C活性は野生型の百分の一以下に低下していた。T-DNA挿入変異株であるahg3-2も発芽時においてABA高感受性であることがわかった。また、ABA情報伝達に関与するとされる他のシロイヌナズナPP2CのT-DNA挿入変異株との発芽時におけるABA感受性を比較したところ、ahg3-2の感受性が最も強いことがわかった。この結果から、AHG3/AtPP2CAは、ABA情報伝達経路の負の制御因子と推察されるPP2C群の中でも、発芽時において重要な役割を演じていると考えられる。

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ABA情報伝達経路に関わるさらなる知見を得るため、我々はABA応答に変化のあるシロイヌナズナ変異体の分離を行なった。ABA類縁体であるPBI-51を用いた変異体探索によりABA高感受性変異体がいくつか分離され、ahg (ABA hypersensitive germination)と名付けられた。ahg11は、種子発芽においてABAと塩に高感受性を示す劣性変異体である。ahg11の原因遺伝子がマップベースドクローニングにより同定され、PPR (pentatricopeptide repeat)タンパク質をコードしていることがわかった。PPRは高等植物において大きなファミリーを形成しており、それらの多くはタンパク質の一次配列から葉緑体やミトコンドリアへの移行が予測されている。また、RNAに結合するPPRがいくつか報告されている。GFP融合タンパク質の蛍光シグナル観察から、AHG11タンパク質はミトコンドリアに局在すると思われた。AHG11がミトコンドリアのRNAプロセシングに関与している可能性が考えられ、そのABA応答との相関は未知であり興味深い。現在、詳細な解析を進めている。

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イネのスターチシンターゼ(SS)には10種類ものアイソザイムが存在する。このうち、機能が解明されているのはアミロース合成に関わるGBSSI、我々がTos17ノックアウトイネから変異体を単離したSSIおよびインディカ米、ジャポニカ米のアミロペクチンの構造比較から明らかになったSSIIaのみである。トウモロコシでは登熟胚乳中の最も活性が高いSSはSSIとSSIIIである。SSIIIの変異体であるdull-1が古くから知られていたが、イネにおいてはトウモロコシのdull-1に相当する変異体が見つかっておらず、その機能は解明されていない。我々は、イネSSI変異体の単離に引き続き、同じノックアウト集団（約4万系統）からSSIIIa変異体を選抜し、その解析を行った。
　得られたSSIIIa変異体は、Tos17がエキソン1に挿入されたものであった。登熟胚乳の可溶性画分のNative-PAGE/SS活性染色を行うと、SSIバンドに加えて非常に移動度の遅い部分にバンドが検出される。SSIIIa変異体ではこのバンドが完全に欠失していたことから、これがイネにおけるSSIIIaバンドであることがわかった。SSIIIa変異体の胚乳アミロペクチンは、野生型に比べて、DP6-8, 17-18, 31-70が低下し、DP10-15, 20-29が増加していた。イネにおけるSSIIIaの機能について、議論する。

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Recent investigations have shown that most of ADPG linked to starch biosynthesis accumulates in the cytosol in source leaves, and is produced by sucrose synthase (SuSy). This finding is consistent with the occurrence of a gluconeogenic pathway wherein SuSy is involved in the de novo production of ADPG, whereas both plastidial phosphoglucomutase (pPGM) and ADPG pyrophosphorylase (AGP) play a prime role in the scavenging of starch breakdown products. To further test this hypothesis, we have compared the ADPG content in both Arabidopsis and potato WT leaves with those of the starch-deficient mutants with reduced pPGM and AGP. Importantly, ADPG levels in all the starch deficient lines were normal as compared with WT plants. Collectively, the accumulated data show that (a) SuSy exerts a strong control on the starch biosynthetic process and (b) SuSy, but not AGP, catalyzes the production of cytosolic ADPG linked to transitory starch biosynthesis in source leaves.

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Endocytosis as a mechanism for nutrient uptake in heterotrophic cells was investigated using suspension culture cells of Acer pseudoplatanus L, the endocytic inhibitors wortmannin and LY294002 and the fluorescent endocytosis marker Lucifer Yellow-CH (LY). Time-course analysis of sucrose uptake in intact walled cells revealed a two-phase process involving an initial 90 min wortmannin- and LY294002-insensitive sucrose uptake period, followed by a prolonged phase of rapid sucrose accumulation which was greatly inhibited by the two endocytic inhibitors. Rates of sucrose and LY accumulation were virtually identical. In addition, LY incorporation increased as a function of external sucrose concentration. When sucrose was substituted by other sugars or amino acids, uptake of LY greatly diminished, indicating that sucrose itself is the primary signal of endocytosis. These results demonstrate the existence of a sucrose inducible endocytic process as a viable mechanism for solute transport into the vacuole of storage cells.

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多年生草本のムラサキは、有用二次代謝産物としてナフトキノン系赤色色素のシコニンを根部で生合成し、その表皮細胞にのみ特異的にこれを蓄積する。シコニン生合成は様々な化学的因子によって調節を受けることが解明されており、物理的因子においては光によって特異的、かつ強力な抑制を受ける。この生合成調節において鍵となる反応段階は、GDP (geranyl diphosphate)のゲラニル基がPHB (p-hydroxybenzoic acid)に転移される反応であり、これを触媒する酵素がPGT (PHB: geranyltransferase)である。In situ法によってPGTをコードする遺伝子LePGTの発現解析を行った結果、本遺伝子の発現組織は主に根の表皮細胞であり、また光による発現抑制を受けることを明らかとした。その発現パターンはシコニンの蓄積局在性と良く一致するものであった。さらに、LePGTの発現調節機構のより詳細な解明を目指し、本遺伝子のプロモーターの光応答、および表皮細胞特異的発現を制御する領域の同定を試みた。TAIL-PCRにより本遺伝子のプロモーター領域約2kbを単離し、GUSおよびGFPをレポーター遺伝子とするレポーターアッセイ系を構築した。現在、アラビドプシスやタバコなどのヘテロな植物種における発現解析を進めている。

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　マメ科植物に特徴的な 5-デオキシ型フラボノイドの生合成には，カルコン合成酵素 (CHS) とともにカルコンポリケチド還元酵素 (PKR) が必須である．CHS に対する広範囲な研究の一方で，PKR 遺伝子の構造と機能に関する詳細な知見は得られていない．そこでモデルマメ科ミヤコグサの PKR 遺伝子について解析を行った．
　縮重プライマーを用いた PCR により 2 種の PKR cDNA 断片を得た．この配列を用いた TAC ライブラリーのスクリーニングにより，4 遺伝子 (PKR1-4) が 58 kb の範囲に存在することが明らかになった．PKR3 はその構造から偽遺伝子であると考えられた．特異的プライマーを用いた発現解析により，PKR4 は定常的に発現していること，PKR1 と PKR2 はミヤコグサの防御応答を引き起こすエリシター (還元型グルタチオン) 処理により発現が一過的に誘導されることが示された．これは PKR1, PKR2 のシス領域に，植物の防御応答に関わるモチーフ (W-box) が存在することと一致する．全長 PKR1 をコードする cDNA を導入したペチュニアでは花色に変化が見られた．これらでは PKR 転写産物が蓄積しており，フラボノイド成分を分析したところ，アントシアニンの減少と 6'-デオキシカルコンが確認された．

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カルコンシンターゼ (CHS) は発達段階や光、病原菌感染、物理的傷害、温度ストレスなどの環境刺激によって誘導され、その結果合成されるフラボノイド化合物の生理的機能も多岐にわたる。特にマメ科植物は、病原菌に感染されるとイソフラボンの一種で抗菌性のフィトアレキシンを合成することが知られている。ダイズCHS遺伝子族の中でCHS1はUV、エリシターにより発現が誘導されることがわかっており、そのプロモーター解析によりエリシターの応答に必要な領域が示されている。
我々はこれまでにタバコのbZIP型転写因子BZI-1のオーソログをコードする遺伝子SBZ1をダイズより単離し、この組換えタンパク質はin vitroでインゲンCHS15 とダイズCHS7のG-box、H-boxを含むTATA box付近のプロモーター領域に結合すること、またin vitroでリン酸化されることを示した。今回我々は、エリシター誘導性に関わるCHS1のプロモーター領域に注目し、SBZ1との結合についてゲルシフトアッセイにより解析を行った。その結果SBZ1はCHS1のプロモーター領域に結合し、さらにその結合はCHS7のプロモーター領域への結合より強いことから、SBZ1がCHS1のエリシターに応答した発現に関与することが示唆された。現在、CHS1プロモーター領域でのダイズbZIPタンパク質結合配列の決定を試みている。

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Phenylalanine ammonia-lyase (PAL) は一次代謝系から二次代謝系へと導入する初発の酵素であり、二次代謝系の流れを左右する律速酵素として重要である。ニンジン培養細胞系においてニンジン PAL 遺伝子 (gDcPAL1) の発現は希釈効果、エリシター、UV-B などにより誘導されることが明らかにされている。またそのプロモーター領域にはフェニルプロパノイドおよびフラボノイド合成系酵素群のプロモーター上流に広く存在する box-L と類似する配列 （box-L₁～box-L₅） が存在し、なかでも box-L₁、box-L₅ がその発現制御に大きく関与していることが明らかにされている。我々は gDcPAL1 のプロモーター上に存在する box-L₁、box-L₅ に結合する転写調節因子 DcMYB1 を単離し、その機能解析を行ってきた。トランジェントアッセイによる解析の結果、DcMYB1 による gDcPAL1 プロモーターの活性化には複数存在する box-L が必要であること、また、UV-B、希釈効果、エリシターといったストレスによる gDcPAL1 プロモーターの活性化には DcMYB1 の発現が必要であり、DcMYB1 が gDcPAL1 の発現を直接制御している転写調節因子であることが示唆された。

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オーウレウシジンなどのオーロンは鮮やかな黄色を呈するフラボノイドである。キンギョソウのオーレウシジン合成酵素遺伝子(AmAS1)はカルコンからオーレウシジンの合成を触媒するが、AmAS1を発現させた組換え植物ではオーロンは合成されなかった。今回、我々はキンギョソウ花弁からカルコンの4’位への糖転移を触媒する新規な酵素(Am4’CGT)を見出し、そのcDNAを取得した。Am4’CGT遺伝子は黄色キンギョソウ花弁においてAmAS1遺伝子と同調した転写パターンを示した。Am4’CGTとAmAS1を発現させた形質転換トレニアは花弁でオーレウシジン6配糖体を生成した。Am4’CGTとAmAS1を発現し、さらに（RNAi法により）アントシアニン生合成酵素の発現を抑制したトレニアの花弁は黄色を呈した。あわせて、Am4’CGTとAmAS1の細胞内局在性解析を行い、細胞内でのオーロン生合成機構を解明した。本報告は遺伝子組換え手法により明瞭な黄色花を作出した初めての報告である。

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目的　アジサイ（Hydrangea macrophylla）の花色変異の最大の特徴は、同一の成分（delphinidin 3-gulcoside, 3-acylquinic acid, 5-acylquinic acid, Al³⁺）から赤、紫、青色のいずれの色も発色することである。我々は、萼片からの着色細胞の調製と細胞の色測定、液胞のpH測定、および、有機・無機成分分析、さらには成分からの色の再現実験を組み合せ、アジサイの花色変異機構の解明を目指している。今回、紫色のアジサイガク片が青、紫、赤色細胞のモザイク状であることを見出したので、これを用いて単一細胞でのミクロ分析を行なった。
方法および結果　紫色ガク片をプロトプラスト化したところ、赤から青色までの様々な色の細胞混合物が得られた。顕微分光による単一細胞の吸収スペクトル測定と細胞内微小電極法による液胞pHの直接測定を組みあわせ、色と液胞pHの相関を調べたところ、単色の青色、赤色のガク片細胞とは異なり、両者に相関は認められなかった。しかし、助色素のアントシアニンに対する当量比、およびアルミニウムイオンの当量比には違いが認められた。青色細胞内で赤色よりも5-アシル化キナ酸が多いことと、アルミニウムイオンが多い傾向が認められた。現在、試験管内での色再現実験を進めている。

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植物の葉においてアントシアニンの合成が誘導され蓄積していく過程は非常に身近な現象である。それに関する研究は古くから行なわれているが，温度、光、水分などの様々な外的要因が絡みあっていることから、機構や要因については未解明な点が多いのが現状である。トレニア (Torenia fournieri Lind) はトランスジェニックのモデル植物として、様々な遺伝子の発現や花色に関する解析に利用されている。これまでの研究において、このトレニアのリーフ・ディスクからシュート再生時に、高濃度のショ糖を含む培地に移植することによって、アントシアニン合成を誘導するモデル実験系を確立した。また、植物ホルモンのABAがこのアントシアニン合成の誘導に重要な役割を果たしている事を示した。本研究では、この実験系においてアントシアニン合成誘導時に特異的に発現している遺伝子の解析を行うため、アントシアニン合成を誘導した植物体と、誘導していない植物体を用いてcDNAサブトラクションを行い，得られた1000クローンに関してcDNAマイクロアレイを用いて発現解析を行ったので報告する。

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ベタレイン色素合成において最も重要な酵素の一つは DOPA からベタラミン酸を合成する DOPA 4,5-dioxygenase (DOD) である。高等植物における DOD 遺伝子は 2004 年にマツバボタン (Portulaca grandiflora)の花弁を用いた cDNA サブトラクション法によって単離され、マツバボタン花弁におけるパーティクル・ガン法によってその活性が確認されている (Christinet, et al., Plant Physiol 134: 265-274)。しかしながら、in vitroでの DOD 活性についての報告は無く、その反応については未解明のままであった。本研究ではオシロイバナ （Milabilis jalapa） からこれまでに報告のある DOD 遺伝子に保存された配列から設計した degenerate primer を用いた PCR法によって DOD 相同遺伝子（MjDOD） cDNA を獲得した。 MjDOD の活性を検討するために、この cDNA を酵母発現ベクターに導入し、酵母に形質転換した。タンパク質誘導培地で培養した酵母の粗酵素液を用いて DOPA を基質として反応させたところ、反応液が黄色を呈し、その反応産物を HPLC を用いて分析したところ、ベタラミン酸が生成していることが確認された。また、この酵素反応の至適 pH は 7 付近であること、終濃度 50 mM 程度のアスコルビン酸の添加が DOD 活性を顕著に促進することがわかった。

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　高等植物の赤色は、多くの場合アントシアニンにより発色されるのに対し、ナデシコ科、ザクロソウ科を除くナデシコ目植物ではアントシアニンは合成されず、その赤色はベタシアニンによって発色されている。我々はナデシコ目植物のベタレイン生合成系について解析を行っており、今回、ベタシアニンの生合成酵素であるDODA (Dopa-dioxygenase) 、ベタシアニン蓄積と発現パターンに関連が見られるPAP (Phytolacca americana polyphenol oxidase) に注目し、解析を行った。
　ナデシコ目植物のヨウシュヤマゴボウからRACE法によりORFの全長 (DODA:798bp, PAP:1782bp) を含むcDNAを単離した。これと既知のcDNAとの構造をアミノ酸レベルで比較したところ、DODAにおいて、ビートとは71%、マツバボタンとは68%の相同性が見られ、ベタレイン合成植物のみに共通して見られる保存配列が確認された。一方、PAPにおいて、既知のPAP1とは95%、PAP2とは88%の相同性が見られた。また、DODAとPAPの発現パターンを半定量的RT-PCRで解析し、DODAはベタシアニン蓄積前に多く発現し、PAPはベタシアニン蓄積後に多く発現していることが分かった。

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タバコ（Nicotiana tabacum）の主なアルカロイドであるニコチンは防御物質としての役割をもち、根で生合成され転流により葉で蓄積される。根において生合成されたニコチンがどのような機構を介して細胞外へ排出、転流されるかは不明である。我々は低ニコチン変異タバコ（nic1nic2）において発現量が低下した2つの遺伝子（NtMATE1, NtMATE2）をクローニングした。これら2つの遺伝子は12の推定膜貫通領域をもつ類似したタンパク質をコードし、 multidrug and toxic compound extrusion (MATE) family のトランスポーターと相同性があった。これらの遺伝子の発現はニコチン生合成調節遺伝子NIC に厳しく制御され、根特異的に発現していた。NtMATE1やNtMATE1-GFP融合蛋白質を発現させた形質転換BY-2細胞においてこれらの蛋白質は液胞膜に局在することがわかった。NtMATE1プロモーター-GUSを用いた解析の結果、根の分化領域では表皮以外の細胞での発現が観察された。NtMATE1過剰発現BY-2細胞や発現抑制毛状根を用いた解析より、NtMATE1は液胞からニコチンの排出を促進している可能性が高いと考えられた。このことから、NtMATE1はニコチン生合成組織において液胞からニコチンを排出し、地上部への転流および根圏土壌への排出を促進していると推定している。

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【目的】ルピン系アルカロイド(キノリチジンアルカロイド)は分子内にキノリチジン環を有する一群の植物アルカロイドであり、マメ科植物に多く見出される。特に、Lupinus属植物はエステル型のルピン系アルカロイドを特徴的に産生する。このエステル型アルカロイド生合成を触媒し、アルカロイド蓄積パターンの決定に関わっている13α-ヒドロキシマルチフロリン/13α-ヒドロキシルパニン O-チグロイル転移酵素(HMT/HLT)遺伝子の単離と機能解析について報告する。
【方法・結果】L. albusよりHMT/HLTを精製し、その内部アミノ酸配列を決定したところ、植物由来のアシル基転移酵素間に保存されているアミノ酸配列のモチーフが存在した。この部分アミノ酸配列よりデザインしたプライマーを用いて増幅されたPCR断片をプローブとして、cDNAライブラリーからORF全長をコードするcDNAクローンを得た。このORF領域を発現ベクターに導入し、大腸菌内で発現した組換えタンパク質を用いて酵素活性を測定した。その結果、HMT/HLT活性が検出され、本cDNAがHMT/HLTをコードすることが示された。HMT/HLT遺伝子の機能解析として、基質特異性の検討、阻害剤実験、発現解析を行った結果について報告する。

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カルジオリピン(CL)は、主にミトコンドリア内膜に局在するリン脂質である。多くの生化学的、細胞生物学的解析から、CLがミトコンドリアの様々な生理機能と関わっていることが示唆されている。近年、ヒトにおいて、CLの再構成に関わる遺伝子がX染色体連鎖の劣性遺伝病であるBarth症候群の原因遺伝子であることが明らかにされた。しかし、真核多細胞生物において、CL合成酵素の遺伝子は未同定であり、CLのみ欠損した生物を使った解析は進んでいない。そこで私達は、シロイヌナズナにおいてCL合成酵素の遺伝子を同定し、その破壊株を解析することで、高等植物におけるCLの生理機能を解析している。
モチーフ解析とゲノム比較の結果、CL合成酵素遺伝子は広く真核生物のゲノムに各々1つずつ保存されていると推定された。そこで、シロイヌナズナにおいてCL合成酵素遺伝子と推定されるAtCLSを、CL合成活性の欠損した大腸菌で発現させ、AtCLSが真核生物型のカルジオリピン合成酵素であることを証明した。また、GFPを用いた解析からAtCLSはミトコンドリアに局在することを予測した。さらに、AtCLSが破壊された植物体を用いた解析から、cls/clsが胚性致死であることを示した。これは高等植物におけるCLの重要性を示すと考えられる。

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ユビキノン(UQ)はミトコンドリアの呼吸鎖の成分であり、キノン骨格とイソプレノイド側鎖より構成される。側鎖長は生物種によって異なり、その長さはプレニル2リン酸合成酵素の特性により決定される。本研究では、G. suboxydansのデカプレニル2リン酸合成酵素遺伝子(ddsA)をイネに導入することで、イネのUQ側鎖長を9から10に改変することを試みた。植物におけるUQ生合成は、ミトコンドリアまたはER-ゴルジ系で行われるとの報告がある。そこで本研究では、ミトコンドリア局在型(S14-DdsA)、ゴルジ体局在型(CTS-DdsA)、細胞質局在型(35S-DdsA)の3種類のDdsA過剰発現イネを作成した。ウェスタン解析により、S14-DdsAイネ及びCTS-DdsAイネについてはDdsAを高蓄積する個体が得られた。一方35S-DdsAイネについては、DdsAを蓄積する個体が得られなかった。S14-DdsAイネ及びCTS-DdsAイネの高発現個体について、葉身のUQ含量をHPLC解析により測定した。CTS-DdsAイネは野生型と差がなかったが、S14-DdsAイネにおいては、UQ-9の大部分がUQ-10に変換していた（UQ-10含量約10μg/gFW）。本研究により、我々は植物で初めてUQ側鎖長を変えることに成功した。得られた結果を元に、イネのUQ生合成について考察したい。

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高等植物において、ポリプレノールやドリコール等のZ,E混合型ポリイソプレノイドは、炭素数50-60、70-120という多様な鎖長分布で豊富に存在していることが知られているが、これらの生理的意義については不明な点が多い。我々はZ,E混合型ポリイソプレノイドの生理機能を明らかにすることを目的として、これらの基本骨格生合成を触媒するシス型プレニルトランスフェラーゼ（CPT）のcDNAをシロイヌナズナより6種単離し機能解析を行ってきた。本発表では、AtCPTファミリーのなかでもAtCPT4の機能解析を行った結果について報告する。
　酵母で発現させたタンパク質を用いたアッセイの結果、AtCPT4以外のAtCPTファミリーは炭素数75-110の長鎖ポリイソプレノイドを合成する活性を示したが、AtCPT4だけが炭素数50-65の中鎖Z,E混合型ポリイソプレノイドを合成する活性を示した。AtCPT4のDsトランスポゾン挿入変異株を解析した結果、長日条件で葉柄、胚軸が野生形より長くなる表現型を示した。一方で、暗所生育の場合は野生形と比較して有意な差は観察されなかった。また、AtCPT4遺伝子の発現は暗所下で抑制されており、光照射によって迅速に誘導されることが分かった。これらの結果から、AtCPT4とその反応生成物である中鎖Z,E混合型ポリイソプレノイドが光応答の成長制御に関与している可能性が示唆された?

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Molecualar mapping of a gene (Als1) responsible for Al resistance in rice was conducted by using a rice mutant(als1) sensitive to Al. F2 seeds were derived from a cross between the mutant and Kasalath. Bulk segregant analysis was performed by pooling equal amounts of DNA from 10 Al-sensitive or 10 Al-resistant F2 plants. A total of 59 InDel markers were selected to examine polymorphism among the Al-sensitive and Al-resistant bulk, the mutant, and the Kasalath. As a result, the marker R6M44 on the long arm of chromosome 6 was linked to this gene. Co-segregating analysis using the 27 Al-sensitive F2 plants showed that R6M44 had a distance of 24.7 cM from (Als1). To further map this gene, two polymorphic InDel markers MaOs0615 and MaOs0619 were developed. Linkage analysis showed that (Als1) was located between MaOs0615 and MaOs0619, with a distance of 3.8 cM and 1.9 cM, respectively.

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イネはコムギよりもAl耐性であると言われている。しかし、発芽後4日目の幼植物において、24時間のAl処理を行い日本晴れとET8（Al耐性コムギ）の根伸長を比較したところ、両者の根伸長率に差は認められなかった。　一方、吸水後の種子をAl溶液に直接播種した場合、ET8の初生根形成は50μM Al存在下において顕著に阻害されたのに対し、日本晴れにおいては、150μM Al存在下でも顕著な阻害は認められなかった。従って、イネは、初生根形成過程においてコムギよりも顕著に高いAl耐性を示す事がわかる。初生根形成過程におけるAl耐性を制御するイネ遺伝子を同定するために、日本晴れのTOS17による遺伝子破壊株1020系統を用いて、Al存在下で初生根形成が顕著に阻害されるAl感受性イネ変異体をこれまでに8系統選抜した。T3世代の表現型の分離比を調べた結果、Al感受性個体と非感受性個体が1：3に明確に分離する系統が2系統得られた。これらT3世代を非ストレス条件下で栽培し、成熟個体の草丈、および分げつ数を比較したところ、Al感受性個体、非感受性個体および野生型日本晴れの間に顕著な差は認められなかった。以上の結果より、これらの変異体は、正常な生育能力を維持しているが、初生根形成過程におけるAl耐性を失った劣性変異体と考えられる。

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　AtBCB gene (Arabidopsis blue copper binding protein) とNtGDI1 gene (tobacco GDP dissociation inhibitor)のAl耐性機構について植物と酵母の系で解析した。
　まず、植物細胞内での局在性をGFP融合蛋白として観察した結果、AtBCB蛋白質は細胞膜上に、またNtGDI1蛋白質は細胞質に小胞として存在した。
　さらに非形質転換体（Ler）はAl未処理下ではリグニンの集積はなかったが、処理下では根端部に集積した。一方AtBCB形質転換体では、Al非依存的に常時集積した。また、多重染色顕微鏡観察の結果からは、リグニン集積がAl処理由来の酸化ストレスの抑制と、細胞膜機能の保持に効くことが示唆された。
　一方、温度感受性sec19-酵母変異株の相補性試験はsec19遺伝子が酵母でのAl耐性機構に関与すること、この変異をNtGDI1遺伝子が相補することを示した。sec19遺伝子は酵母の小胞輸送系で機能するので、Sec19蛋白質を介した排出機構が耐性に関与する可能性がある。従ってNtGDI1蛋白質も同様の機能を有すると思われた。
　これらは、AtBCBがAlの吸収抑制に、NtGDI1が排出促進に関連することを示しており、有機酸以外の新たなAl耐性機構であろう。

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過剰な塩分は植物の生長を抑制する。しかし塩生植物は高塩環境に適応した種であり，耐塩性を発達させてきた。イネ科に属する羊草（Aneurolepidium chinense）は塩類腺やのう状毛のような外観上目立った形態的な耐塩性機構を有していないものの，500 mM NaClストレス下でも生存できるために，優れた耐塩性機構を有していると考えられる。我々は先に，塩ストレス下で強く発現が誘導されるplasma membrane protein 3（AcPMP3）遺伝子をクローニングし，その発現解析を行った。その結果，AcPMP3遺伝子は塩ストレスのみならず，乾燥や低温，ABA，H₂O₂処理でも発現量が増加することが明らかになった。出芽酵母の塩感受性株YR93-31（Δpmp3, Δnha1, Δpmr2）では塩ストレス下で過剰量の塩分を蓄積することにより，塩感受性を示す。そこで，酵母YR93-31株でAcPMP3遺伝子を過剰発現させ，高塩環境下における表現型を調査した。その結果，形質転換株では高濃度のNaClやKClストレス下で塩感受性が回復され，細胞内のNa⁺やK⁺の蓄積量も減少していた。AcPMP3遺伝子は塩ストレス下では葉の葉肉細胞や根の表皮細胞で強く発現しており，これらの細胞においてAcPMP3が塩の蓄積の制御に関与しているのではないかと推察された。

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cDNAマイクロアレイを用いて低リン条件に強く発現が誘導される遺伝子をスクリーニングした結果、これまでに全長375 bpからなる機能未知遺伝子OsPI1 (Oryza sativa Phosphate-limitation Inducible gene 1)を単離した。本研究はOsPI1遺伝子の機能を解析することを目的とする。OsPI1の発現はリン欠乏で非常に迅速に全身的に誘導された。その発現の特徴は、その他の特徴も類似するTPSI1/Mt4 familyと一致した。リン欠乏状態のイネを用いてin situ hybridizationを行った結果、よりリンを強く要求する若い組織においてOsPI1の強い発現が確認された。配列上の特徴とin vitro translationの結果から、OsPI1はポリペプチドをコードせずRNAのまま生体内で機能を果たしている可能性が示唆された。以上より、OsPI1遺伝子は他のリン酸欠乏応答遺伝子の発現制御に関与することによってリン酸欠乏適応機構において重要な役割を果たしている可能性が推測された。現在、RNAiによるOsPI1遺伝子の発現抑制系統を作成しており、リン欠乏条件下でのOsPI1遺伝子の発現抑制の影響についての知見についても発表する。

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植物の鉄吸収機構は、プロトンの放出による易溶化－3価鉄の還元－還元鉄の吸収というステップを経るもの（戦略1）と、ムギネ酸の生合成と放出－ムギネ酸／3価鉄複合体の吸収というステップを経るもの（戦略2）の2つに大きく分類される。本研究では、それぞれの戦略に関与する遺伝子の鉄欠乏応答性の違いを明らかにするために、タバコ二価鉄トランスポーター遺伝子（NtIRT1）とオオムギムギネ酸水酸化酵素遺伝子（HvIDS2）をそれぞれの吸収機構に関与する代表的な遺伝子として用い、その発現についてそれぞれの抽出元植物において3種類の鉄欠乏ストレス（a.完全栄養培地で一定期間栽培後ただちに鉄欠乏培地へ移植、b.同じく一定期間栽培後に根のアポプラズマ鉄を除去して鉄欠乏培地へ移植、c.同じく一定期間栽培後にただちにカドミウム100μMを添加した誘導性鉄欠乏培地へ移植）を与えて経時的な変化を調べた。その結果、NtIRT1はすでに報告のあるAtIRT1と同様に、アポプラズマに鉄のない条件では鉄欠乏条件下であっても発現が認められなかったのに対し、HvIDS2は、アポプラズマにおける鉄の有無に関わらず鉄欠乏条件下において常に発現していた。本報告ではさらに、HvIDS2p/GUS融合遺伝子をタバコに導入し、同様の鉄欠乏ストレスをかけて得られた結果を合わせて総合的な考察を行う。

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形質転換タバコを用いたオオムギの鉄欠乏誘導性遺伝子 IDS2 のプロモーター解析により、鉄欠乏誘導性発現を付与する新規のシスエレメント、IDE1 (iron-deficiency-responsive element 1) および IDE2を同定した。本研究では、これらのシスエレメントをさまざまに配置、重複してイネに導入し、発現を解析した。鉄欠乏により根および葉で顕著な発現誘導が検出された。IDE1とIDE2を1コピーずつ持つプロモーター断片が強力な鉄欠乏誘導性を付与するのに十分であった。発現は維管束組織と根の外皮細胞で特に顕著であり、イネのムギネ酸類を介した鉄吸収に関わる他の遺伝子の発現パターンとよく一致していた。一方、マイクロアレイ解析により見いだしたイネの鉄欠乏根で発現が誘導される遺伝子群の中には、メチオニンからのムギネ酸類の生合成、ならびにメチオニンサイクルの全てのステップをコードする遺伝子が含まれていた。さらに、これらの遺伝子のプロモーター領域には、IDE1およびIDE2の類似配列が鉄欠乏に応答しない遺伝子群と比較して高い割合で存在することが明らかになった。これらの結果から、イネは鉄吸収に関わる多数の鉄欠乏誘導性遺伝子の発現を共通のメカニズムによって制御しているものと推察された。

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膜脂質スルホキノボシルジアシルグリセロール (SQDG) は植物の葉緑体やラン藻における唯一の硫黄含有膜脂質である。これまで私達はSQDGの役割を光合成系で見い出してきたが（Sato 2004）、今回はその一環として硫黄欠乏条件下でのSQDGの生理的意義を緑藻クラミドモナスで検討した。クラミドモナスを硫黄飢餓条件に移すと、細胞全体の硫黄原子の約1割を占めるSQDGは元のレベルの約4%にまで減少した。このSQDGの減少はSQDG分解活性の誘導によりもたらされ、SQDGの硫黄はその分解後、他の細胞内画分へ取り込まれていた。またそのSQDG分解活性の誘導には葉緑体ゲノムではなく、核ゲノムにコードされたタンパク質の新規合成を必要とすることが示唆された。一方、硫黄飢餓条件下でもSQDG合成活性のcapacityは維持されており、それに対応してSQDG合成経路上の酵素、UDP-sulfoquinovose synthaseの遺伝子の転写産物量は増加していた。以上の結果は、クラミドモナスではS欠乏条件下、既存のSQDGが硫黄源としての役割を果たすと同時に、新規に合成されるSQDGが何らかの重要な役割を担う可能性を示している。
N. Sato (2004) Roles of the acidic lipids sulfoquinovosyl diacylglycerol and phosphatidylglycerol in photosynthesis: their specificity and evolution. J. Plant Res (vol.6).

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高親和型硫酸イオントランスポーターSULTR1;1はシロイヌナズナの根において外界からの硫酸イオン吸収を担っている。SULTR1;1の遺伝子発現は環境中の硫酸イオン濃度の減少に応答して増加する。このことは硫黄欠乏下(-S)で植物が硫酸イオンの吸収を増すための適応機構であると考えられているが、その分子機構についてはほとんど知られていない。そこで本研究ではSULTR1;1プロモーターに存在するシス配列の同定を試みた。ルシフェラーゼ遺伝子をレポーターとしてシロイヌナズナの形質転換体を作製し、5'デリーション解析を行ったところ、SULTR1;1の-S応答には上流-2777から-2761の間の16bpが必要であることが分かった。この16bpは単独でも-S応答を誘導することができ、この領域をsulfur responsive element (SURE)と名付けた。SURE内にはauxin response factor (ARF)結合配列が存在していたが、SUREはオーキシンには応答せず、そのS特異的な機能が示唆された。さらに塩基置換解析を行い、ARF結合配列内の5塩基(GAGAC)のコア配列が重要であることを明らかにした。マイクロアレイ解析を行い、短期間で-S応答を示す遺伝子について上流域を調べたところ、いくつかの遺伝子の上流域にコア配列が存在していた。このことから、今回同定したSUREが-S応答全般に機能している可能性が示された。

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代表的な土壌汚染重金属であるカドミウム (Cd) に対する植物の耐性には、グルタチオン (GSH) から合成されるファイトケラチン (PC) が知られているが、PC 合成酵素を過剰発現させた植物体は Cd 高感受性を示し、Cd 耐性能を付与することができないことが報告された。そこで我々は、PC 以外による Cd 耐性機構の解析を目的として、ランダムに大規模な欠損が予想されるカーボンイオンビームを変異原として用い、シロイヌナズナの Cd 高感受性変異体　(Cd sensitive mutant 1 ;cds1) を単離した。cds1 変異体は野生型株と比べ、Cd と Hg に高い感受性、Zn に対してわずかに高い感受性を示し、PC-GSH 合成系の変異体と同様の表現型を示した。しかし、cds1 変異体と PC 合成酵素欠損株との交配による相補性試験の結果、PC 合成酵素とは異なる原因遺伝子であることが判明した。また PC の基質である GSH 添加条件下でも、cds1 変異体は Cd 感受性を示すことから、PC-GSH 合成系とは異なる Cd 耐性機構に変異が起こっていることが示唆された。
cds1 変異体は劣勢の一因子支配であることが明らかとなり、現在変異遺伝子のマッピングを行っているので、その結果についても併せて報告したい。

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ラン藻Synechococcus sp. PCC 7942のメタロチオネイン様タンパク質SmtAは、Zn²⁺などを結合するキレーター型の重金属ストレス応答タンパク質である。SmtAのN末端側の領域(Met1～Cys47)には2個、C末端側の領域（Gly43～Gly56）には1個のZn²⁺が結合すると推測されている。本研究ではSmtAの N末端領域を連続的に接続したポリペプチドを作製し、分子改変したSmtAによる重金属結合能をin vivoおよびin vitroにおいて解析した。
　smtA 遺伝子にそのN末端領域のDNA断片を複数個接続し、これをGSTとの融合タンパク質として大腸菌で発現させ、最大で10個のN末端領域を含むペプチドを作製した。ICP発光分析によりZn²⁺結合数を調べた結果、野生型SmtAのZn²⁺結合数約3に対し、N末端領域を1つずつ増やしていくにしたがってZn²⁺結合数が増加した。例えばN末領域を10個接続したものには約26個のZn²⁺が結合した。酸の滴定よるZn²⁺の解離を調べたところ、結合したZn²⁺のほとんどはSmtAにおける本来の結合と同様な結合をしていると推測された。また改変したSmtAに結合したZn²⁺の約90％はCd²⁺と置換できた。SmtA あるいは改変SmtAを発現させた大腸菌の菌体には、野生株より数倍のZn²⁺が含まれており、改変タンパク質が細胞内における重金属蓄積に有効に機能すると考えられる。

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モモは、殺菌剤のボルドー液に含まれる銅に対して敏感に反応し、葉に穿孔が生じることが古くから知られている。一方、モモの重要病害である穿孔細菌病に罹病した葉には類似した病班が見られることから、銅による穿孔現象と耐病性機構との関連性について研究をおこなった。最初に、銅濃度と障害面積の関係を調べるために、CuSO₄をモモの葉に処理した。200μMでは外見上変化は見られなかったが、300μMより濃い濃度では穿孔が形成され、その面積は濃度によらず、ほぼ一定であった。次に、PCD（Programmed Cell Death）との関連を調べるために、PCDの実行因子であるカスペース活性の阻害実験を行った。500μM 銅をカスペース1阻害剤と一緒に葉に塗布したところ、銅のみで観察された病班の発生がとほとんど観察されなかった。さらに、耐病性機構を担っているファイトアレキシン合成に関与するPAL 、防御応答関連たんぱく質であるPGIP，β-1-3glucanase，Chitinase，PR-4ならびに酸化ストレスで誘導されるSODについて発現解析を行った。その結果、β-1,3-glucanaseと Chitinaseの発現量の増加が認められた。以上のことから、銅処理によって見られるモモの葉の病班の形成には、過敏感細胞死が関与することが示唆された。

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Glutamate dehydrogenase (GDH) catalyzes the amination of
2-oxoglutarate and the deamination of L-glutamate. After the discovery of glutamate synthesis cycle, the function of GDH has been debated. GDH of Brassica napus consists with a and b subunits that are encoded by two genes (gdh1, 2) and forms seven isoforms (GDH1~7). In this report, we examined to identify signals to change
the isoform patters and determined the expression of a subunit polypeptide and the corresponding gdh2 gene.
SA and JA treatments induced GDH7 significantly. Once, the leaf tissue was wounded, any SA, JA and ethylene inhibitors could not suppress the induction of GDH7. Treatment with SA and JA in acid solution induced GDH7 significantly and the isoenzyme patterns were almost identical to those of protoplasts. Changes in GDH isoenzyme patterns of protoplasts reflected the amount of a subunit and gdh2
mRNA.

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植物は、環境の変化に移動して対応できないため特有の生態防御反応を有している。高等植物では、様々なストレスによってペルオキシダーゼ（PO）活性が上昇することが報告されている。しかし、POは巨大な多重遺伝子ファミリーを形成しているため、個々のPOアイソザイムの機能や生理学的役割についてはほとんど解明されていない。そこで本研究では、モデル樹木であるポプラを用いて、PO遺伝子群の網羅的解析を試みた。
まず、様々なストレスを与えたセイヨウハコヤナギ（Populus nigra）の本葉由来の完全長cDNAのうちPO遺伝子と予想される198個について解析を行った。その結果、3'-UTRのスプライシングバリアントと推定される多数の重複発現が確認された。次に、アラインメントおよび系統解析によって選抜した11クローンについてノーザン解析を行った結果、重複発現が確認されたクローンは、各種ストレス（乾燥、高温、高塩など）により発現が誘導された。一方、通常条件下で生育したギンドロ（Populus alba）の本葉、材形成部および若芽からより3'-RACE法によりPOの部分cDNA配列を単離した。これらP. albaのPO遺伝子の発現についても、ストレス誘導性ならびに部位特異性を解析中である。

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傷害を受けた植物は、防御や細胞修復に関わる遺伝子を速やかに発現させる。これまで多くの遺伝子群が単離されたが、機能が未知なものも多く、傷害応答機構の分子機構には未解決な部分が少なくない。私たちは傷害の初期応答を探るため、蛍光ディファレンシャルディスプレイ法によって傷害処理後のタバコから多数のcDNAを単離した。本研究では、そのうちのひとつである機能未知遺伝子WI4の機能解析を行った。
WI4はN末端側にbHLH (basic Helix-loop-Helix)モチーフを持つ。BY2細胞を用いてdual-luciferase asssayを行ったところ、転写抑制活性を持つことが明らかとなった。GFPとの融合蛋白質、および細胞分画によって細胞内局在を解析した結果、WI4は一般的な転写因子のように核や細胞質ではなく、プラスチドに局在することが示された。WI4のmRNAおよび蛋白質の挙動を調べたところ、傷害処理後の葉では、処理後1時間目に傷害葉でのみ、一過的に上昇した。また、光合成器官の葉よりも非光合成器官である茎、根および花で強く発現していた。WI4を過剰に発現させた形質転換タバコは、葉が薄緑で、茎、根および花が形成されず致死性であった。これらの結果から、傷害応答性のWI4はプラスチド局在型の転写制御因子であり、光合成に関わる遺伝子の転写を抑制する可能性が示唆された。

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植物の傷に対する防御機構を明らかにすることは、農業生産において重要な課題である。しかし、その全貌はまだ明らかにされていない。タバコのWRKY型転写因子をコードするWizz (wound-induced leucine-zipper zinc-finger) は、傷害初期に発現する遺伝子として当研究室で単離された。傷害に応答した発現を調べるために、Wizzプロモーターとルシフェラーゼ（LUC）を組み込んだ株と35Sプロモーターで過剰発現させた株を作成した。それぞれを傷害処理し、LUC活性をVIMカメラで測定、比較した。さらに、Wizzプロモーター上のシス配列を探索した。その結果、プロモーター領域を270bpまで縮めても転写が起きることが明らかになった。そこでLUCをレポーター遺伝子としプロモーター領域をさらに縮めたランスジェニック体 (-217::LUC、-155::LUC、-97::LUC、および-TATA::LUC)を作成し、最小領域の特定を検討している。Wizzの標的、あるいは制御下にある遺伝子を同定するために、過剰発現株を作製し、マイクロアレイのスクリーニングをおこなった。使用したマイクロアレイは、N. sylvestrisから単離した約4000の単一遺伝子と当研究室で以前に単離された48の病傷害応答遺伝子を含み、現在、解析中である。

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　植物細胞は病気や傷などのストレスに対する防御応答系を備えている。そのシグナル伝達経路として、MAP Kinases (MAPK) cascadesが機能することは知られているが、その経路の最終段階は不明である。つまり、MAPKKによりリン酸化されたMAPKが標的とするタンパク質は明らかにされていない。本研究室ではタバコのMAPKであるWIPKと相互作用する転写因子NtWIF (Nicotiana tabaccum WIPK interacting factor)をyeast two hybridにより単離した（国際植物分子生物学会、バルセロナ2003）。
　本研究ではNtWIFの植物内での機能を明らかにするため、過剰発現植物体と発現抑制植物体 (RNAi)を作製した。傷による遺伝子発現パターンを野生株と比較したところ、過剰発現植物体では無処理の時からPR蛋白質遺伝子が過剰に発現していた。植物内のホルモン量の測定した結果、サリチル酸が過剰に生産されることが明らかになった。発現抑制株についても、検討中である。さらに、導入遺伝子によって影響をこうむった遺伝子群を網羅的に探索するために、マイクロアレイ解析をおこなった。

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イネのゲノムの配列解析が完成しつつあり、配列情報に基づく遺伝子ターゲティングは極めて有効な逆遺伝学法であり、遺伝子ノックアウトのみならず、遺伝子の機能モチーフを改変した変異イネ作出も可能となろう。我々は、イネで強力なポジティブ・ネガティブ選抜法を基本としたターゲティング法を澱粉合成に関わる Waxy遺伝子を標的モデルとして開発し、次いで本ターゲティング法の汎用性を確めるため、第11染色体短腕に約30kbの間隔で順方向に2コピー存在するアルコール脱水素酵素遺伝子 (Alcohol dehydrogenase )　 Adh1と Adh2のターゲティングを進めてきた。すでに Adh1と Adh2の両遺伝子について、相同組換えが生じた数系統のターゲット・イネ（T0）を得て、サザン解析の結果を2004年の本大会で報告した。 Adh2については、さらに系統数を増やすことができたので、再生世代（T0）と次世代（T1）の詳しいサザン解析について報告する。これまでの解析結果から、 Waxyのターゲティングに匹敵するする頻度と精度で相同組換えイネが得られたと考えられる。また、 Waxy 遺伝子ターゲティングでは見られなかった組換えの特徴がいくつか見出されたので、T-DNAの組換えを考慮したイネでの相同組換えの過程について考察する。さらに、 Adh1ターゲティングについても表現型に関する結果を得たので報告する。

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　我々は現在、工業原材料生産に関わる多種多様な植物での代謝制御方法の開発を最終目標として、シロイヌナズナの代謝関連遺伝子に関するハイスループットな遺伝子機能解析（トランスクリプトミクス・メタボロミクス）をシロイヌナズナ懸濁培養細胞T87株で行なっている。しかし、ハイスループットな遺伝子機能解析を行なうには、多数の遺伝子を短期間で培養細胞に導入し、なおかつ多数の形質転換培養細胞系統を効率良く保存するための技術が不可欠である。
　本研究では、シロイヌナズナ懸濁培養細胞T87株を材料に培養細胞の形質転換・超低温保存を可能とする種々の条件を検討し、培養細胞をハイスループットでビーズに包埋することで形質転換・超低温保存するための手法を確立した。アグロバクテリウム法による形質転換では、1人あたり24種類の遺伝子を5日間で培養細胞に接種することが可能であり、形質転換培養細胞の作出までを2～3週間で行なうことが可能である。また、予備凍結法による超低温保存では、1人あたり200バイアルを1日で超低温保存することが可能となった。今回確立した手法は、シロイヌナズナT87株の代謝関連遺伝子を始めとしたハイスループットな遺伝子機能解析を行なううえで重要な技術であると考えられる。さらに今回確立した超低温保存法は、他植物種・培養細胞系統にも応用することが可能である。

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本研究チームで作出した多数のシロイヌナズナ形質転換細胞系統を維持するために、アルギン酸ビーズを用いた凍結保存法を開発した（2004年度年会）。凍結保存を行った細胞を解析対象とする上で、本法が遺伝子発現および代謝産物の蓄積に与える影響を調べる必要があり、トランスクリプトームおよびメタボローム解析による評価を行った。
独立に凍結保存を行った3系統で、凍結前の細胞と凍結保存後に4回継代した後の細胞を、マイクロアレイ（Agilent社、21500プローブ）により比較した。2倍以上の変動が見られた遺伝子は、各248, 254, 345個であり、非凍結保存細胞による2回のセルフ実験（52, 70個）よりも変動が大きかった。また、3実験に共通して検出された遺伝子は46個であり、2回のセルフ実験（共通4個）よりも高確率であった。その注釈付けからは特に共通した機能分類は見つからなかったが、糖転移酵素、ホルモン合成系酵素、タンパク質リン酸化酵素などの他、PRタンパク質や転写因子なども見られた。ガスクロマトグラフ質量分析計を用いたメタボローム比較では、凍結保存前後の細胞で少数の代謝産物に変動が見られた。以上の結果から、本凍結保存法では何らかの遺伝子発現変動およびそれに伴う代謝産物の変化が生じていることが判明した。これらの知見を考慮することにより、凍結保存細胞を用いた解析結果を評価することが可能である。

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