我々はタバコ培養細胞BY-2からバクテリアのDNA ポリメラーゼ Iと相同なタンパク質をコードする遺伝子を二つ（NtpolI-like 1およびNtpolI-like 2）単離した。両遺伝子産物はいずれも分子量128kDa、アミノ酸レベルで互いに97.2%相同であり、122kDaに切断されて色素体に局在すると推定された。また、大腸菌内で発現させたNtpolI-like2のDNAポリメラーゼドメインはin vitroでDNA ポリメラーゼ活性を示し、その性質は単離色素体核（核様体）中に存在するDNAポリメラーゼの性質と一致した。これらの結果から、NtpolI-like 1/2遺伝子産物は、いずれも色素体で働くDNAポリメラーゼであることが強く示唆された。しかし、作成したNtpolI-like2に対する抗体を用いたウエスタン解析の結果、単離色素体核だけではなく単離ミトコンドリア核中にも抗体によって認識される分子量約120kDaのタンパク質が存在することが明らかになった。この結果は、NtpolI-like1/2遺伝子産物のどちらか、または両方がミトコンドリアでも機能しているか、あるいはそれに極めて類似したミトコンドリア型DNAポリメラーゼが存在することを示し、植物のミトコンドリアと色素体のDNAポリメラーゼは互いに酷似しているという我々のこれまでの主張に合致する。現在、NtpolI-like1/2遺伝子産物の細胞内局在、ならびに両オルガネラに存在するDNA ポリメラーゼの異同について、さらに検討を進めている。

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シグマ因子は、葉緑体のバクテリア型RNAポリメラーゼ(PEP)のプロモータ認識因子として働く。我々は、シロイヌナズナの葉緑体シグマ因子AtSIG5が、光応答プロモータpsbD LRPを特異的に認識するシグマ因子であることを明らかにしてきた。本研究では、　AtSIG5を過剰発現する核形質転換タバコと葉緑体形質転換タバコを作成し、葉緑体遺伝子転写への影響を解析した。いずれの形質転換体でも、psbD LRPからの転写産物量は、AtSIG5の発現量に依存して増大していたが、AtSIG5の発現レベルが格段に高い葉緑体形質転換体において、最も顕著なpsbD LRPの活性化が見られた。興味深いことに、AtSIG5大量発現葉緑体形質転換体では、葉が非常に早く退色した。核形質転換体ではこのような表現型は認められなかった。葉緑体遺伝子の転写産物量を調べると、葉緑体形質転換体では、psbD、psaA、ndhDなどが増大する一方、psbB、rrn23などの一部のPEP依存遺伝子の発現量が大きく減少していた。これは、AtSIG5大量発現により生じたシグマ因子間の競合作用に起因すると考えられる。本研究の成果は、核コード葉緑体蛋白質の機能解析において、葉緑体形質転換法を用いることの有効性を強く支持している。

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葉緑体分裂には、進化的に保存されたバクテリア様分裂因子群と真核生物特有のダイナミン様タンパク質が関わる。バクテリア様因子のうちMinDとMinEの二種はバクテリアでは細胞分裂の位置決定に関わる。最近、シロイヌナズナMinE相同因子(AtMinE1)が第三の葉緑体分裂因子として機能すること、またシロイヌナズナ葉緑体分裂異常変異体arc11 (accumulation and replication of chloroplasts 11)がMinD相同遺伝子(AtMinD1)の機能欠失変異体であることが示された（参考文献1,2）。arc11変異体及びAtMinE1のシロイヌナズナ形質転換系統は、通常条件下で正常な生育を示したものの、葉肉細胞中に様々な大きさまたは形状の葉緑体を含んでいた。また発達中の緑色組織には異常極性伸長した葉緑体が多数存在しており、それらの葉緑体は長軸方向に沿って複数の狭窄部位を形成していた。さらに、複数配された狭窄部位は不規則な間隔で位置しており成熟細胞の異形葉緑体が分裂位置異常により生じる過程が推測された。以上の観察結果は、高等植物のMinDとMinEがバクテリア因子と同様に、オルガネラの分裂位置決定を司ることを強く示唆した。
参考文献[1] Itoh et al. (2001) Plant Physiol. 127, 1644-1655. [2] Fujiwara et al. (2004) J. Cell Sci. 117, 2399-2410.

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葉緑体（クロロプラスト）は、核とは別に120～150kbpの独自の2本鎖環状のDNAを持ち、これは核様体構造を形成している。植物には、クロロプラストの他にエチオプラスト、アミロプラスト、クロモプラストなどさまざまなプラスチドが存在するが、多くの組織細胞では、プラスチド核様体を観察することは容易ではない。プラスチド核様体を可視化する手法として、PENDタンパク質のN末端側とGFPとの融合タンパク質を発現するシロイヌナズナの安定な形質転換体を作成した。PENDタンパク質は、葉緑体包膜のDNA結合タンパク質であり、N末端近くにbZIP様のDNA結合ドメインをもち、N末端領域を含むGFP融合タンパク質は主に核様体に局在することがわかった。安定な形質転換体でも同様の局在が見られた。この安定な形質転換体を用いて、これまで固定した植物材料を用いてしか観察されていなかった核様体を選択的に生きたまま観察することに成功した。今までプラスチド核様体だけを観察することが困難であった緑でないプラスチドを持つ根、花、花粉などについても蛍光顕微鏡で観察した。トライコームにおける核の周りでのプラスシドの早い動きや、根の師管の中を通るアミロプラスト、根端のコルメラ細胞付近のプラスチドなどのダイナミックな挙動をリアルタイムで観察した。さらに、プラスチドの分裂に伴う核様体の形態の変化や分配のされかたについても報告する予定である。

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ミトコンドリアと葉緑体の数や形態はその分裂によって制御されているが、細胞がどのようにしてその分裂をコントロールしているかは分かっていない。これまでの研究によってミトコンドリアと葉緑体の分裂機構においてFtsZが位置決め、 PD/MD ringが収縮、そしてdynaminが分断に関わるという共通性が明らかにされた。原始紅藻Cyanidioschyzon merolae（シゾン）はミトコンドリアと葉緑体を一つずつ持ち、その分裂を細胞分裂とともに同調でき、かつゲノム情報が明らかにされている優れた材料である。今回の研究ではオルガネラ分裂と細胞周期との相関を明らかにするため、シゾンにおいて蛍光抗体染色による微小管の局在、同調培養でのチューブリン蓄積量の変化、DNA合成阻害と微小管破壊によるオルガネラ分裂への影響について解析した。その結果、オルガネラと細胞分裂の発現段階における制御は異なっていること、DNA合成が阻害されると葉緑体は分裂を繰り返し、ミトコンドリアは分断が抑制されるのに対し、微小管が破壊されるとミトコンドリアと葉緑体は一度きり分裂することが分かった。このことから、ミトコンドリアの配置と分裂は微小管を介して物理的に細胞分裂と協調していることが示唆され、オルガネラ分裂の各段階は細胞周期の異なるチェックポイントによって制御されていると予想された。

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Cyanidioschyzon merolae（通称シゾン）は核、葉緑体、ミトコンドリア、マイクロボディ、ゴルジ体を1つずつしか持たない単純な形態をしており、オルガネラの増殖の研究に用いられてきたが、これまでリソソームは同定されていない。私達はシゾンに存在する、DAPIにより黄色に染色される顆粒状の構造に着目して解析を行った。DAPIはポリリン酸と結合すると黄色の蛍光を発することが知られている。他の生物において液胞にポリリン酸が豊富に存在するという報告があることから、この構造がリソソームである可能性が考えられた。この構造は細胞内に複数個存在し、細胞によってその数に差が存在することが分かった。また、細胞分裂時には細胞質から細胞核の下に位置するミトコンドリアの上部へと移動し、娘細胞にほぼ均等に分配されることが分かった。この構造の同定を行うため、酸性小器官を染色するキナクリンにより染色した結果、同様な形態、挙動、数を示す構造が染色されること分かった。また、電子顕微鏡観察により、電子密度の高い物質を含む単膜で包まれた器官が同様の挙動を示すことが分かった。これらのことからこの構造が単膜系の酸性の小器官であり、リソソームである蓋然性が高いと判断された。この構造の単離を行い、現在、解析を進めている。

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　植物・藻類では、オルガネラゲノムの複製酵素は同定されていない。塩基配列が決定されたArabidopsis thalianaやCyanidioschyzon merolaeには、ミトコンドリアの複製酵素と考えられているDNAポリメラーゼγは存在していない。C. merolaeの核ゲノムから、大腸菌のDNAポリメラーゼIと相同なDNAポリメラーゼをコードする遺伝子が2個見つかった (PolA、PolBと呼ぶ) 。PolAとPolBの細胞内局在を、免疫ブロット分析で調べた。この結果、PolAはプラスチド、PolBはプラスチドとミトコンドリアの両方に局在することが示唆された。GFPを用いた実験の結果もこれと矛盾しなかった。PolAとPolBを大腸菌において大量発現し精製した。PolA、PolBのDNA合成活性における至適条件、耐熱性、また、PolA、PolB、C. merolaeのプラスチド、ミトコンドリアのDNA合成活性に対する阻害剤の影響等、を調べ性質を比較した。C. merolaeの同調培養を行い、PolAとPolBの発現パターンを調べた。PolAは細胞周期に依存した発現量の変化は見られなかったが、PolBは分裂時期に合わせて発現量が増加した。この結果から、C. merolaeにおいてPolBがオルガネラの複製に関与する可能性が示唆された。

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Functional aberrations in isolated mitochondria and regulation of AOX1 gene were investigated in tobacco cells (Nicotiana tabacum L.,nonchlorophyllic) under aluminium (Al) stress. Respiratory functions and ATP synthesis showed a greater inhibition in mitochondria isolated from SL (Al-sensitive) cells as compared to ALT301 (Al-tolerant) cells after 18h of Al treatment. A decrease in AOX-pathway and CYT-pathway capacities was seen in SL cells under Al stress. Whereas, 15 % increase in AOX-pathway capacity was observed in ALT301 cells mitochondria. An increase in mitochondrial ROS was observed in SL cells upon Al treatment. But a seemingly decrease in mitochondrial ROS production was observed in ALT301cells. Al stress downregulated the expression of AOX1 gene in both cell lines. However, Aox protein level confirmed through western blot remained high in ALT301 under Al stress as compared to SL suggesting a post-translational modification that might confer Al tolerance traits.

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Fd is a 2Fe-2S protein, which is the final electron acceptor of the photosynthetic electron transport chain and the only soluble electron transport protein in the chloroplast stroma. Following photoreduction, Fd donates electrons to many plastid enzymes essential for cellular processes, including carbon assimilation, nitrogen assimilation, sulphur assimilation, amino acid synthesis, fatty acid synthesis, haem synthesis and redox regulation. The purpose of our work is to identify all proteins involved in Fd electron donation within the chloroplast proteome, including novel interactions. Using a column comprising recombinant Arabidopsis Fd, we have developed a technique to rapidly isolate soluble proteins that interact with Fd from Arabidopsis leaves. Exploiting the abundant genomic information for Arabidopsis, these proteins were identified by MALDI-TOF mass spectrometry.

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　硝酸イオンの取り込みは硝酸同化経路の最初に位置し、経路全体の律速段階となっている。我々は、相同組み換えによる遺伝子機能解析が容易に行えるセン類ヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）を材料として硝酸イオン輸送に関する解析を行っている。NRT2は硝酸イオン能動輸送体の本体であると考えられており、既に5つの遺伝子を同定している。クラミドモナスにおいては一部のNRT2の機能発現にNAR2と呼ばれるタンパク質が必須であるとされていることから、本研究ではまずヒメツリガネゴケにおいてNAR2のホモログをコードする遺伝子を3個同定した。次にこれらの硝酸イオン輸送系遺伝子群の窒素源による発現制御の解析を行った。アンモニア培地から硝酸培地または亜硝酸培地に移した場合の発現を比較したところ、両者に差が見られた。このことは、硝酸同化系遺伝子群の発現は硝酸イオンだけではなく亜硝酸イオンによっても誘導されることが明らかになった。亜硝酸イオンによる誘導機構は他の生物においてよく研究されている硝酸イオンによる誘導機構とは異なるものであることが示唆された。また、5つのNRT2と3つのNar2はこれらの発現誘導を強く受けるものと、誘導の効果が比較的弱く窒素欠乏で発現するものという2つのグループに分類されるということを見出した。それぞれの機能の違いについて考察する。

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ラン藻 Synechococcus sp. PCC7942 は、硝酸イオンに対して非常に親和性の高い（K_m=1μM）ATP-Binding Cassette 型の輸送体 (NRT)を介して硝酸イオンを細胞内に取り込んでいる。この NRT を欠失させた変異株は硝酸イオンを取り込めなくなり、硝酸イオン(2mM)を含む培地では生育できない。硝酸イオン(2mM)を含む培地でこの変異株を数カ月培養し続けたところ、2mMの硝酸イオンを取り込めるようになった疑似復帰変異株が得られた。この擬似復帰変異株の硝酸イオン輸送に関わる遺伝子の同定を行ったところ、3つの遺伝子が関与していることが示された。これら3つの遺伝子は、輸送体の本体としてはたらくと推定される硫酸イオン輸送体様タンパク質、DNA 結合ドメインを持たないレスポンスレギュレーター、そしてハイブリッドヒスチジンキナーゼをコードしていた。擬似復帰変異株においては、ハイブリッドヒスチジンキナーゼの788番目の Gln がストップコドンに変異しており、C末端に存在する2つのレシーバードメインをもたないヒスチジンキナーゼが発現していた。この変異が硝酸イオン輸送活性に重要であることは、硫酸イオン輸送体様タンパク質の制御にリン酸リレーが関わっていることを示唆している。

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高等植物の根では、細胞質型グルタミン合成酵素(GS1)が、NH₄⁺の初期同化を担っている。本研究では、シロイヌナズナ及びイネの根で発現する全てのGS1遺伝子の酵素特性、細胞局在性、窒素応答性を明らかにすることにより、個々のGS1分子種の生理機能、及びその調節機構の解明に成功した。シロイヌナズナの根において発現するGS1タンパク質は、NH₄⁺に対する親和性の違いにより、低及び高親和型GS1に分類された。窒素欠乏条件では、高親和型GS1であるAtGLN1;1が表皮で誘導された。しかし、窒素十分条件では、低親和型AtGLN1;2が、表皮において発現量を増加させた。AtGLN1;2遺伝子が欠失した変異体の根では、GS活性の低下に伴いOルタミンの蓄積量が減少していた。一方、イネの根で発現するGS1分子種は、全て高親和型GS1であり、窒素欠乏時には、最大活性が高いOsGLN1;1が表皮や皮層において発現した。しかし、NH₄⁺の供給により、相対的に活性が低いOsGLN1;2の発現が表皮及び維管束において誘導された。以上の結果は、窒素栄養環境に適応したGS1の活性及び遺伝子発現レベルでの制御がNH₄⁺同化の恒常性維持に重要であることを示している。

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ラン藻の一種Plectonema boryanumは、2種類のグルタミン酸合成酵素(GOGAT)を持ち、電子供与体としてフェレドキシン(Fd)とNADHを用いる。これまでの研究で、Fd-GOGATの発現量を制御することで炭素同化量の増減に見合うよう窒素同化量を調節していることを明らかにした。今回、発光細菌Vibrio harveyiのルシフェラーゼ遺伝子を利用したプロモーターアッセイ系を用いて、Fd-GOGAT遺伝子の発現調節に関わるシグナル及びプロモーター領域の検討を行った。Fd-GOGAT遺伝子のプロモーター（約2kbp、500bp、130bp）制御下にルシフェラーゼ遺伝子をおき、光・外部窒素量・炭素量を変動させることで、この遺伝子の応答の変化を調べた。その結果、窒素源・炭素源や光量によってレポーター活性が変動し、特に窒素・炭素同化のバランスが重要な制御シグナルとなっていることが結論された。また、プロモーター領域の長さによって応答様式が異なることが観察されたので、今後はシス領域の特定を目指して解析を進める予定である。

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　大腸菌のPIIタンパク質は、細胞内のグルタミンと2-オキソグルタル酸の濃度比に応答して、窒素代謝系遺伝子群の発現や翻訳産物の機能制御を担うセンサーならびにトランスミッターとして機能している。高等植物でもグルタミンを介した情報伝達系の存在が示唆されているが、その分子実体は不明である。演者らは、イネにおけるPII様タンパク質 (OsGlnB) に着目し、相互作用する因子の探索を行った。あわせて、RNAi法によるノックダウンイネを作出し、PII様タンパク質の機能解析を目指した。イネcDNAライブラリーを用いた酵母Two-hybrid法により、イネPII様タンパク質との相互作用候補因子として、N-acetylglutamate kinase 1 (OsNAGK1) とPII様タンパク質を同定した。RT-PCR解析、およびGFP融合タンパク質の一過的発現解析により、OsNAGK1とPII様タンパク質は、葉緑体内で相互作用する可能性が示唆された。OsGlnBノックダウンイネと野生型イネの葉身における遺伝子発現を網羅的に解析した結果、発現に変化が認められた多くの興味深い遺伝子をスクリーニングできた。また、遊離アミノ酸含量を調べたところ、OsGlnBノックダウンイネの葉身中の総遊離アミノ酸含量は、野生型イネのそれとほぼ同程度であったのに対し、遊離アルギニン含量は減少していた。

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根粒菌は宿主植物の根に共生しバクテロイドに分化後、エネルギー源として光合成産物を使い大気中N₂を固定しNH₃を作りだしている。ダイズ根粒において、根粒バクテロイド特異的に誘導されるタンパクを網羅的に明らかとするため、ダイズ根粒菌B.japonicum USDA110の共生、非共生状態でのプロテオーム解析を行った。タンパク同定にはかずさDNA研究所によって決定されたゲノムDNAデータベースを利用した。
タンパクは培養菌体とダイズ根粒から密度勾配遠心で分離したバクテロイドから抽出し、二次元電気泳動を行った。タンパクの同定は、N末端アミノ酸配列解析及びMALDI-TOFMSを用いたペプチドマッピング法を用いて行った。マッチングの結果、多くのタンパク質の発現が両者で異なっていた。バクテロイドで特異的、あるいは発現量が増加しているタンパク質61のスポットを同定した。これらは根粒特異的代謝酵素タンパクやNifHのようなニトロゲナーゼタンパク、ABC transporter群であった。同定されたタンパクには未だ機能のよく分かっていないものも含まれていた。現在はバクテロイドで発現の強かったタンパク及び機能の分かっていないタンパクについて機能解析を行っている。

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動物・酵母の小胞輸送に機能するタンパク質が次々に明らかにされていく中、高等植物から対応する遺伝子群を単離同定する試みが進められ、SNARE複合体に関与する遺伝子がシロイヌナズナ、タバコ、マメ科植物などから単離されている。我々はマメ科植物のミヤコグサ(Lotus japonicus)の根粒形成に発現するSNAREタンパク質を検索し、そのタンパク質の機能解析を行うことを目的とした。根粒で強く発現しているSNARE遺伝子を検索した。その結果、1つの遺伝子(Sn6)が他の器官に比べ根粒で強い発現を示した。In situ hybridizationの結果、根粒形成初期過程では根粒原基の周辺で発現しており、根粒が成長すると皮層細胞の部分で強い発現を示した。Sn6遺伝子は酵母の小胞体からゴルジ体への小胞輸送に関わるSed5遺伝子と高い相同性がみられた。次にSn6タンパク質の機能解析を目的としてSn6遺伝子の発現を抑制したミヤコグサと過剰発現したミヤコグサを作製した。その結果、アンチセンスミヤコグサT1種子の重さは非形質転換体に比べ約60-70%だった。アンチセンスT1種子を播種し感染後の生育を調べると、非形質転換体に比べ生育が遅く、この根粒を組織染色すると根粒皮層細胞が細胞内に入り込んだ様な現象が観察された。現在マクロアレー解析を行い、どのような遺伝子群の発現が増加・減少しているのか調べている。

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一酸化窒素(NO)や二酸化窒素(NO₂)の窒素酸化物 (NOx) は、従来は大気汚染物質と生物との関わりの範疇で認識されてきた。他方、近年では、NOは活性窒素(RNS)として動物、微生物、植物でのシグナルトランスダクションに重要な役割をもつことが明らかに成りつつある。しかし、大気中のNOxの生物RNS作用、あるいは他のシグナル・ストレス物質との協調作用などその生理作用の実態は未解明な部分が多い。Nicotiana plumbaginifoliaをNOx汚染空気で栽培すると、NOxフリー（NOx<5 ppb）の空気で栽培した場合よりもバイオマス、葉面積、C、N、S、P、K、Ca、Mg、遊離アミノ酸、粗タンパク質含量が、NOxフリー（NOx<5 ppb）で栽培した植物と比較して約2倍高かった。また、NOxが植物葉中の全窒素に占める割合は、3-5％であり、窒素肥料としてのNOx由来の窒素の寄与は無視しうる程度であった(昨年度本大会)。本研究では、シロイヌナズナについて調査した。自然光下、22℃、湿度70%の条件に設定した暴露チャンバー内で150および250 ppb NOxで4週間栽培した。その結果、NOxフリー（NOx<5 ppb）で栽培した植物体に比べ、シュートバイオマスは1.7倍、根バイオマスは1.4倍上昇していた。これらの結果について報告する。

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　S-ニトロソチオール (SNO) は，一酸化窒素 (NO) をはじめとする活性窒素酸化物 (NOx) とチオール化合物の反応で生じるレドックス活性分子である。代表的な生体 SNO である S-ニトロソグルタチオン (GSNO) は，動物の NO シグナリングに関わる生理活性物質で，新規なタンパク質機能の調節機構である Cys 残基の S-ニトロソ化を媒介するといわれている。植物におけるその実体や生理作用は不明であるが，SNO は私たちが発見した未解明窒素化合物の物質的基盤を説明する分子群の1つとして数えられる。2,3-ジアミノナフタレンを用いた蛍光法により，NOx 処理したシロイヌナズナでは SNO レベルが著しく増大し，その多くは高分子量画分に回収されることが分かった。植物で唯一報告されている SNO 代謝関連タンパク質である GSNO 還元酵素 (GSNOR) を過剰発現させたシロイヌナズナでは，SNO レベルが著しく低下するとともに，NOx 処理による SNO レベルの上昇も抑制された。一方，シロイヌナズナの GSNOR 遺伝子破壊株では，SNO レベルが増大するとともに，顕著な生育阻害が観察された。以上の結果は，GSNOR が植物における SNO 代謝の鍵酵素であること，またその生理学的重要性を強く示唆する。

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我々は、植物体内に取込まれた二酸化窒素 (NO₂) あるいは硝酸由来の窒素の約三分の1が、ケルダール法によって定量的に回収されない窒素 (UN) へと変換されること見いだした¹⁾。これまでに同定されたUNを含む化合物 (UN 化合物) のなかで、UN化合物Aは、硫黄原子一個と窒素原子二個および炭素原子二個からなるヘテロ五員環化合物(Δ²-1,2,3-チアジアゾリン誘導体) ²⁾であった。本化合物は鈴木らにより構造決定されたが、SciFinderで検索できない新規化合物であることが分かった。我々は、このチアジアゾリン化合物は、植物における窒素代謝と硫黄代謝の合流を示す化合物ではないかと考え詳細な調査を進めている。本化合物の全合成はまだ成功していない²⁾。しかし、チアジアゾリン環内にオレフィン結合をもつ有機合成的な中間体は合成されているので、本中間体を植物に添加、抽出しLC/MSおよびNMR法などにより解析を進めている。これらの結果について報告する。
1) H. Morikawa et al., (2004) Planta 219:14-22
2) K. Miyawaki et al., (2004) Org. Biomol. Chem. 2: 2870-2873

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樹木への電離放射線照射の影響と照射に対する応答反応を調べるため、ポプラ（Populus nigra var. italica）の苗木に総線量10-300Gy（20時間）のガンマ線を急照射し、その後10週間育成した。10-50Gy照射では、樹高伸長の遅延が見られるものの、乾燥重量は非照射個体とほぼ同様であった。100Gyでは、成長が低下あるいは停止する個体が現れるが枯死する個体はなかった。成長が停止した個体では、後に土中の茎から萌芽を生じ、茎葉部を展開した。150-200Gyの照射により、成長は完全に停止し、照射後4-10週間に多くの個体が枯死した。300Gyでは、全ての個体が照射後4-7週間に枯死した。葉の断裂、葉序の異常、茎頂の分岐等の形態異常が50Gy以上の照射により現れることがあるが、これらの変異は一時的かつ局所的なもので、その後の成長に伴う形態はほぼ正常であった。また、ガンマ線照射は、茎や葉柄からの不定芽の誘導および培養細胞の増殖も阻害した。これらのガンマ線の影響は主にDNAの損傷によるものと考えられるが、ガンマ線を照射したポプラでは、Rad51やDNAリガーゼIVといった損傷DNA修復系の遺伝子の発現量が増加していた。これは、ポプラ細胞内でガンマ線により損傷したDNAの修復が進行していることを示唆している。

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植物体の内部には光、とりわけ遠赤色光、を効果的に伝送する組織が存在する。これまでに観察した限り、この組織はシロイヌナズナを含むすべての植物体に備わっている。私たちはすでにこの組織を通る遠赤色光は根においてアクアポリンの遺伝子発現に強い影響を及ぼすことを示してきた。アクアポリン遺伝子の活性化は植物体内の水分布やその動態を変化させることが予測された。ここから、植物体を傷つけることなく内部の水状態を経時的に測定することが必要となった。そこで、シロイヌナズナについて、非破壊・非接触な測定が可能なNMR顕微鏡によって可視化するとともにその経時変化の追跡を試みた。従来、¹H NMR‐イメージング法はシロイヌナズナのように細く小さな個体には適用が困難であったが、我々は小さな植物体の根においても十分なS/Nを得ることが出来る手法を開発した。またNMR内で明暗の光周期およびFR照射が行える実験系を開発し温室内の光環境を再現した。3日間の暗順応を行った実生にNMR上部からFR照射を行い、照射前後において根部の水分布にみられる変化を数値化することによって比較検討を行った。また、これらの制御に深く関わると思われる光受容体についても併せて考察したい。

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乾燥・強光ストレス下の植物は、酸化や高温などのダメージに対処するために種々の分子応答を行う。本研究では、C3光合成型の乾燥・強光耐性植物である野生種スイカ（Citrullus lanatus sp. No101117-1）の葉を用いて、ストレス下におけるタンパク質の挙動をプロテオミクスの手法を用いて明らかにした。強光下で生育した野生種スイカの葉の可溶性および膜タンパク質を二次元電気泳動により分離したところ、総数で約900個のタンパク質スポットが検出され、そのうちの約9％のタンパク質の蓄積量が乾燥処理を施すことにより増加し、また約3％は減少した。それら増減タンパク質を質量分析器により解析した結果、増加したタンパク質の約4割は、ヒートショックプロテイン（HSP）であり、全5ファミリーを含む19種類が同定された。このようなHSPの挙動は他の植物において報告がなく、野生種スイカが高温や酸化等によるタンパク質変性を抑制・修復する能力に優れていることを示唆している。そのほかの増加タンパク質として、抗酸化酵素、タンパク質合成・分解関連因子、シグナル伝達因子などが同定された。また、small G proteinのRabとArfが10倍以上増加しており、共同してストレス下の小胞輸送に関与していると思われる。以上の結果より、野生種スイカが乾燥・強光ストレスに対する特殊な防御機構を発達させていることが示唆された。

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シロイヌナズナのアクアポリン遺伝子TIP2;2は、暗順応した植物体の根で多量に発現し、遠赤色光（FR）に応答して一過的に発現が減少する。このFR応答は、植物体の地上部（シュート）または地下部（根）のどちらで光が受容されて引き起こされるのだろうか？シュートまたは根のみにそれぞれFRを照射し、TIP2;2のノザン解析を行ったところ、野生型株（Ler）及びphyB突然変異体では、シュート・根のどちらからFRを照射しても、根においてTIP2;2 mRNA量が減少した。一方、phyA突然変異体では、シュートから光を照射した場合にこのような減少がみられなかった。したがって、シュートにFR照射したときのTIP2;2遺伝子発現調節にはphyAが関与していると考えられる。しかし、根に直接光を照射した場合には、phyA突然変異体でも減少がみられたため、phyA及びphyB以外の光受容体の関与が示唆された。根のFR応答のメカニズムを知るために、非常に興味深い結果である。タンパク質レベルでの発現変動や水透過性についても解析中であり、あわせて報告したい。

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シロイヌナズナのDREB2Aタンパク質は乾燥・塩・低温などのストレス応答に関与する遺伝子発現を制御するシス因子DREに結合する転写因子である。DREB2Aを植物中で過剰発現しても、形質の変化は見られず、DREB2Aの活性化にはストレス時に起こる翻訳後のタンパク質の修飾が必要であると考えられている。
本研究ではトウモロコシよりDREB2A相同性のZmDREB2Aを単離した。2種類のcDNAが得られ、このうちひとつはイントロン含んでいた。T87細胞のプロトプラストを用いた実験系でこのcDNAをエフェクターとして転写活性能を調べたところ、DREを介した転写活性がみられなかった。もう一方はイントロンを含まず、プロトプラストの中で非常に強い活性を示した。また、トウモロコシの植物体中のこれらのmRNAのレベルをRT-PCRで解析すると、イントロンを含まないmRNAはストレス時にのみ検出された。このことから、ZmDREB2Aはスプライシングにより活性が調節されている可能性が考えられた。ZmDREB2Aは乾燥や塩ストレスにより発現が増加し、特に急激なストレスをかけたときに強く誘導される。このZmDREB2Aの機能を明らかにするために、この遺伝子を導入した形質転換シロイヌナズナを作成し解析をおこなった。得られた形質転換植物は成長の遅れを示すとともに、乾燥に対する耐性の向上が見られた。また、形質転換植物中で発現が誘導される遺伝子をマイクロアレイ法やノーザン法で解析した。

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SnRK2は植物の水分ストレス応答に関わる重要なプロテインキナーゼとして、近年、注目されている。我々は、シロイヌナズナSnRK2の一つであるSRK2E/OST1が、アブシジン酸（ABA）および浸透圧ストレスにより活性化されること、そして、ABAによる孔辺細胞の閉鎖に強く寄与することを報告してきた。また、SRK2E/OST1の活性化がabi1-1により強く抑制されること、自身のC末端領域がABAによる活性化に重要であること、ABAと浸透圧ストレスによる活性化はそれぞれ異なる経路により調節されていることを昨年の年会にて発表した。今回我々は、そのC末端領域が実際に植物体の水分ストレス適応に強く関与することを明らかにした。急激な湿度低下に対して感受性を示すsrk2eにC末端領域を欠いたコンストラクトを導入したところ、ABA応答に重要な319-357のアミノ酸を欠いたSRK2E/OST1はsrk2eのwiltyの表現型を相補しないことが明らかにされた。また、幾つかのシグナル伝達因子との結合活性を酵母を用いた系で検討したところ、ABI1との強い結合が確認された。興味深いことに、ABI1のSRK2E/OST1への結合部位はABA応答に重要なC末端領域（319-357）であった。この領域は、既に報告されているソラマメAAPKあるいはイネのSAPK8にも保存されており、シロイヌナズナにおいてもSRK2E/OST1に近縁なSRK2D、SRK2Iでも保存されていた。今後、この領域がABAのシグナル伝達にどのように機能するか興味深い。

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