我々はゼニゴケY染色体の塩基配列決定により、DNAメチルトランスフェラーゼ (DNMT) の触媒ドメインをもつ新奇なレトロトランスポゾン、DRE （DNMT-containing repetitive element） を見出した。DREは LTR (long terminal repeat) を有し、そのgag-polにコードされている遺伝子の配置はTy3-gypsy型レトロトランスポゾンと同じであった。また、転移の際に生じたと考えられる4～6塩基対のtarget site duplicateが見られた。しかし、DNMT触媒ドメインをもつこと、DREのコピー間で相同性が見られない約3 kbの領域 (UCR, unconserved region) が存在すること、3' LTRが別の反復配列LTR 2に挟まれている等、これまでのレトロトランスポゾンにはない特徴的な構造を有していた。DNMT触媒ドメインには8個の保存されたモチーフが存在するが、DREのDNMT触媒ドメインにおける保存モチーフの順序は動物型であり、特にほ乳類においてゲノムインプリンティングに重要な役割を担うDNMT3aと高い相同性を示した。また、異なるDREコピーのUCRには異なるmRNAに由来すると考えられる配列が見いだされた。DREは雄ゲノムのみならず雌ゲノム中にも存在し、いずれの場合もコピー数は約150と見積もられた。

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昨春、新学習指導要領（いわゆるゆとり教育）による高校教育を受けた学生が大学に入学した。東京大学では、これに関連して以前から大学1、2年次における教育のあり方を検討するとともに、論理（モデルを立てる）と実証（実験によって確かめる）のサイクルを伴う自然科学導入プログラムの開発に取組んできた。
東京大学教養学部生物部会においては、従来の生命科学系（東京大学では理科2類、3類）の学生対象の実習「基礎実験（生物）」の内容を吟味し、新たに「基礎生命科学実験」として新規3種目の開発を含む全11種目の全面的改訂を行った。また今春より、生命科学系の学生に加えて文系と理工系（理科1類）の学生にも実習選択の門戸が開かれるのにともない、教育背景が多様な学生にも効果的に実習内容を伝えられる副教材（DVD教材）を作製した。
本大会では新規種目であるシアノバクテリアを用いた「電気泳動による光合成関連タンパク質の分離」と緑藻、シダ植物、被子植物を用いた「植物の多様性と生殖様式」、改訂種目であるインゲンマメを用いた「被子植物の維管束構造」について紹介する。また、DVD教材付きの新教科書についても展示する予定である

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矮性トマト品種であるマイクロトムは、蛍光灯下の実験室の棚でも約3ヶ月で生育し、栽培が容易な品種である。我々は、マイクロトムの葉と果実に由来する完全長cDNAライブラリーの作製を進めてきており、現時点で、57,271個のESTの配列を得ている(Acc. BW684914-BW692959, DB678295-DB727670)。そして、これらのESTを元に、非冗長なcDNA配列をもつクローンを選抜し、完全長配列の解読を行っている。現時点では、1673個のクローンの完全長のドラフト配列が得られており、順次、国際塩基配列データベースから公開を進めている（Acc AK224591-AK224910, AB211518-AB211526）。得られたESTと完全長配列は、アミノ酸配列データベース(nr)、および、イネとシロイヌナズナのアミノ酸配列に対して相同性を調べると共に、完全長配列に対しては、InterProを用いたタンパク質機能ドメインなどの推定を進めている。また、完全長配列は、ゲノム構造の解明に有用な情報であるため、国際コンソーシアムの下で進行しているトマト・ゲノム解読プロジェクトから提供されているゲノム配列と比較し、エクソン-イントロン領域の予測も行っている。これらの結果は、構築したデータベースKaFTom (http://www.pgb.kazusa.or.jp/kaftom/)から閲覧が可能である。

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Fagopyrum esculenthum は、強いアレロパシー特性を持つ作物の一つである。すでに我々は、ソバから8種のアレロパシー化合物を同定しているが、その中でも重要な2種の化合物、ルチンと没食子酸について、マイクロアレイを用いて分析した。ルチンは最も強い全活性を、没食子酸は最も強い比活性を示す化合物である。解析は、20日齢のシロイヌナズナの遺伝子発現について、Affymetrix社のGeneChips ATH1を用いておこなった。上記の化合物に6時間暴露したところ、没食子酸では168の遺伝子が、ルチンでは55の遺伝子が、それぞれ高発現したことがわかった。しかし、両者に共通して高発現となったのは、14遺伝子のみであった。本研究により、ストレスに反応して植物を制御する重要な遺伝子のいくつかが明らかになった。誘導された遺伝子は、異なる機能に分類されるもので、代表的なものは、「代謝」、「細胞レスキュー・細胞防御および毒性」、「細胞間情報伝達機構」および「転写」などである。本研究は、今後、雑草の生物的防除を進めるにあたって必要な「アレロパシー化合物」の作用機構の解明に寄与するものである。

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シロイヌナズナを始めとする様々な植物のゲノム情報の整備が進んできた今日では、異種植物間の遺伝子発現量の進化的保存性を明らかにすることは植物の遺伝情報の多様性解明の一環である。本研究では、その第一段階として、葉と根におけるシロイヌナズナとトマトのAffymetrix GeneChip発現データの比較を行った。シロイヌナズナ全タンパク質とトマトUNIGENE（～40,000）の配列に基づいて推定した4,274個のオーソログペア間の遺伝子発現強度に葉で0.52-0.54、根で0.51-0.57の統計学的に有意な正の相関が認められたことは遺伝子発現量の進化的保存を意味する。進化的保存の程度と遺伝子機能の関係を明らかにするため、Gene Ontology分類毎の遺伝子発現パターンを調べたところ、”electron transport or energy pathways”などの遺伝子群では発現量が高度に保存されていること、”cellular component unknown”などの遺伝子群は発現量の保存性が低いことがわかった。同様に代謝経路毎の遺伝子発現パターンを解析したところ、”Glycolysis/gluconeogenesis”などの代謝経路で発現量が高度に保存されていること、”Sterol biosynthesis”の遺伝子群はトマトで強い発現を示す傾向にあることが明らかとなった。これらの結果はシロイヌナズナとトマトの遺伝子発現量の進化的変化には遺伝子機能に依存したバイアスが存在することを示唆する。

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Recent genomic analyses revealed that plants contain a large number of genes that are predicted to be involved in the ubiquitin/26S proteasome pathway. For example, nearly 700 F-box proteins have been annotated in Arabidopsis. These observations strongly indicate that ubiquitination contributes to various biological processes in plants. Indeed, genetic analyses have shown that the ubiquitin/26S proteasome pathway components regulate embryogenesis, hormonal responses, circadian rhythms, floral homeosis, photomorphogenesis, trichome differentiation, senescence, and pathogen defense. However, only a few target proteins for ubiquitination were so far identified.

Here, we present a novel method for identifying ubiquitinated proteins from plants. Ubiquitinated proteins were enriched by an affinity column that utilizes ubiquitin-binding domains isolated from Arabidopsis. After trypsin digestion, peptides were separated and analyzed by 2DLC-MS/MS. 2D separation was performed online with a strong cation-exchange chromatography followed by a reverse-phase chromatography.

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二次元電気泳動法はプロテオミクスにおけるタンパク質分離ツールとして広く活用されている。しかしながら、適切なタンパク質抽出法や等電点電気泳動法を選択しないと、様々な組織から再現性良く高解像度の二次元電気泳動像を得ることは難しい。また種々の界面活性剤を用いることで効率的にタンパク質を抽出する事ができるが、これらが等電点電気泳動を妨げるために、等電点電気泳動に供する前処理として溶媒置換を行う必要があり、タンパク質調製のステップが増えることで結果としてタンパク質のロスが多くなる。そこで本発表では、界面活性剤を含むタンパク質抽出液により抽出したタンパク質を、煩雑な前処理を行うことなく等電点電気泳動に供し、高解像度な二次元電気泳動像を得るためのノウハウについて紹介する。また、タンパク質に対して非常に強い可溶化剤であるSDSを含むタンパク質抽出液を用いて調製したサンプルを等電点電気泳動に供した場合において、高解像度な泳動像が得られるSDS濃度の許容範囲と、SDS濃度依存的に分離されるタンパク質の違いについて比較検討を行った。

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ペルオキシソームには植物生理機能を担う多くの代謝系が存在する。しかし、ペルオキシソーム膜輸送系の詳細な解析はなされていない。我々はこれまでにシロイヌナズナ及びダイズ由来ペルオキシソームのプロテオーム解析により、ペルオキシソーム局在型タンパク質の同定を試みてきた。しかし、同定されたタンパク質はマトリックスタンパク質が主であり、膜タンパク質はほとんど同定できていない。そこで本研究ではペルオキシソーム膜タンパク質の可溶化条件を改良し、ペルオキシソーム膜タンパク質の同定を試みた。
暗所で生育させたダイズ黄化子葉からIodixanol密度勾配遠心法によりペルオキシソームを精製した。精製ペルオキシソーム標品から界面活性剤可溶性タンパク質を回収してBlue Native-PAGE法とSDS-PAGE法による二次元電気泳動に供した。泳動後のゲルを銀染色して検出されたタンパク質を酵素消化し、これらのペプチドをMALDI-TOF型質量分析計で分析した。得られた結果とダイズESTデータベースを用いてPMF法により解析し、タンパク質の同定を行なった。同定されたタンパク質には既知のペルオキシソームタンパク質の他に新規タンパク質が含まれていた。現在、検出された新規タンパク質のペルオキシソームへの局在について蛍光タンパク質との融合タンパク質を用いて確認しており、その結果を合わせて報告する。

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イネにおける茎葉伸長はジベレリン（GA）との関わりから遺伝学的、分子生物学的解析により明らかにされつつあり、幼苗基部はイネの成長に必要なタンパク質群を発現していることが明らかになったがその機構は不明な点が多い。幼苗基部におけるGAの役割を明らかにするために幼苗基部で発現するタンパク質を包括的に解析した。幼苗期イネはGAにより処理濃度、時間に依存して節間が伸長し、5 μM GA₃ 24時間処理において顕著であった。本条件を用いて幼苗基部よりタンパク質を抽出し、2D-DIGEによって発現を比較した結果5個の増加、1個の減少するスポットを検出した。質量分析計による解析の結果、elongation factor 1 beta、21 kDa polypeptide、abscisic acid, stress and ripening 5(ASR5)、fructose-diphosphate aldolaseであった。GAにてタンパク質レベルで濃度依存的、経時的に顕著に変動するASR5は、転写レベルではGA処理で変動しなかった。さらに、ASR5のポリクローナル抗体を調製し、GA、ABA処理による発現量、核における局在を調べたところ、GAとABA両方の処理において上昇し、また、核と細胞質の両方に存在した。以上のことより、イネにおいてASR5はGA、ABA両方の制御をうけることが示唆された。

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光化学系II反応中心複合体は、20種類以上ものサブユニットタンパク質から構成される複雑な複合体である。しかも、反応中心タンパク質D1、D2は、疎水性インデックス（GRAVY値）が0.3を超える、疎水性の非常に高いタンパク質であり、その他のほとんどのサブユニットタンパク質も疎水性の膜タンパク質である。また、電子伝達系に関わる多くの構成体は、やはり疎水性膜タンパク質である。環境要因の変化に伴うこれらのタンパク質の発現状況の分析には、タンパク質の網羅的な分析が有効であり、等電点二次元電気泳動が多用される。しかし、このような疎水的な膜タンパク質は、従来の等電点電気泳動では充分に分離されず、明瞭な二次元電気泳動像を得ることが困難であった。そこで本研究では、疎水性膜タンパク質の分析を目的として、等電点電気泳動システムの開発を行った。種々の検討の結果、一次元目の等電点電気泳動の担体としてアガロースゲル、界面活性剤としてドデシルマルトシドを採用した。
このシステムでは、D1、D2、CP43、CP47が、表在性タンパク質PsbO、PsbU、PsbV等とほぼ同レベルのスポットとして捉えられた。結晶構造モデルでは、これらの膜タンパク質および表在性タンパク質は、反応中心当たり1コピーずつ含まれるので、合理的な結果である。本発表では、このシステムによる光化学系II複合体の等電点二次元電気泳動像を紹介する。

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近年注目の集まっている植物のメタボローム解析の応用展開のひとつとして、植物の生産する有用物の機能性・生産性の向上が挙げられる。その目的を達成するには、植物体全体の代謝ネットワークと各代謝産物の流量を解析する手法(＝フラックス解析)が不可欠である。そこで我々は原子情報選択性の高い核磁気共鳴装置(NMR)法による代謝フラックス解析法の構築を目指している。昨年度の大会では、シロイヌナズナT87培養細胞の継代する時期や培地の容量等培養条件の最適化を行い、フラスコ内の閉鎖系で炭素源(グルコース)の代謝による分配を経時的に解析するため、単純化したモデル系を立ち上げたことを報告した。今年度は、[¹³C₆]glucoseで代謝産物群の均一安定同位体標識化を施した植物細胞のリン酸バッファー粗抽出物を用い¹H-¹³C HSQC、HCCH-TOCSY、HCCH-COSY、HCACO等多種のNMR測定法を駆使し、検出可能な代謝産物群について行った一斉帰属について報告する。これらの方法により、シグナルのオーバーラップが回避され、ユニークに帰属される化合物数が増加する。さらに、上述の方法で同定された代謝産物群の経時的な動態変化を原子レベルで代謝経路に投影した、各化合物の¹H-¹³C HSQC交差シグナル強度を用いた新規フラックス解析法についても議論したい。

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近年の分析条件の最適化や質量分析機器の性能の向上によって，多種多様な代謝産物を高分解能かつハイスループットに分析するメタボローム解析が可能となりつつある．しかし，様々な性質を持つ代謝産物をGC-MSなどの単一の手法のみで全て分析することは不可能である．そのため理化学研究所メタボローム基盤研究グループでは，GC-MSおよびLC-MS，CE-MS，NMRなどの手法を用いてメタボローム解析を行い，それらの結果を組み合わせることによって出来るだけ多くの化合物種を網羅することを目指している．その中で我々は，CE-TOF/MSを用いたメタボローム解析法の基盤確立を目指している．CE-TOF/MSはイオン性化合物を高分解能で分離・検出することができる装置であり，アミノ酸や有機酸，核酸，糖リン酸などの定量解析を得意としている．標品に対して3種のメソッド（カチオン，アニオン，ヌクレオチド）を用いて分析を行ったところ，現在計129種の化合物の定量が可能となった．また，シロイヌナズナ葉を同様にして分析した結果，48種類の化合物が定量でき，さらに未同定ではあるものの3332種のピークが検出された．現在，同定・定量可能な化合物種を増やすべく標品の分析を進める一方，いくつかのシロイヌナズナの変異株についてメタボリックプロファイリング解析を行っている．

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NMRメタボミクスの展開により、基礎科学のみならず植物科学に新しい応用分野を開拓していく事が期待される。まず、1次元1H-NMR法による代謝プロファイリングを用いる事で、簡単な抽出操作やインタクト組織を試料とし、代謝変動という観点からフェノーム解析を遂行する事が可能になる。グローバルな代謝変動のフェノタイピングの次には代謝産物群の物質同定が必要である。我々は種々の多次元NMR計測を駆使する事で原子レベルでのシグナル帰属を試みており、そのための鍵となる植物細胞の均一安定同位体標識技術を確立し、シロイヌナズナ以外でも、すでにイネ、コムギ、ポプラといった実用作物、樹木でも標識技術を高度化してきた。さらに、安定同位体標識技術は代謝フラックス解析による代謝ネットワークの追跡にも展開できその有用性は広い。一方で、現在のメタボローム解析が可溶物のみを対象としていることに対し、我々はマジック角回転（MAS）法を導入する事により、可溶物に加えて不溶代謝産物解析も可能とし、これまで顧みられてこなかった不溶物質を含めた代謝物動態解析を可能にした。最後に、植物の安定同位体標識技術は、これを食餌とし動物への腸管吸収・代謝を追跡する目的でも活用できる。年会では、これらのNMRメタボミクス技術開発がもたらす将来、例えば有用形質の簡易的選抜法や、動植物界における物質循環計測の可能性等についても俯瞰したい。

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<背景・目的>窒素栄養がホウレンソウの代謝産物に与える影響として、硝酸イオン含有率と糖含有率の間に負の相関があることが明らかになっている。一方、これまでの研究では特定化合物に絞った報告が殆どであり、窒素栄養がホウレンソウの代謝に対してどのような影響を及ぼしているのか十分に解明されていない。本報告では水耕栽培条件でホウレンソウに窒素施用量及び窒素形態処理を行い、GC-MSによる代謝産物プロファイルへの影響を検討した。<方法>試験1では濃度をNO₃でそれぞれ1, 2, 4mmol L^-1の3段階で8日間処理した後、試験2ではNO₃:NH₄をそれぞれ10:0, 5:5, 3:7で8日間処理し、リーフディスクをサンプリングした。凍結乾燥した葉身の一部をメタノール：クロロホルム：水＝33：16：23で抽出後、水層を分取し凍結乾燥した。試料はTMS誘導体化した後GC-MSに導入した。各種代謝産物のクロマトグラム面積値を標準化後、主成分分析を行った。<結果>生育は良好に推移し、低窒素による葉色の低下は認められなかった。主成分分析を行った結果、培養液の窒素濃度及び窒素形態の違いに対応した主成分が抽出され、代謝産物プロファイルと窒素栄養状態の間に密接な繋がりがあることを示唆していた。主成分負荷量を解析したところ、糖及び有機酸類が培養液の硝酸イオン濃度に、アミノ酸類が培養液の窒素濃度及び窒素形態に対応していた。

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マメ科作物はイネ科作物と比較して窒素利用効率(単位窒素吸収量当たりの乾物生産量)が低い。この原因は主にイネ科作物と比較してマメ科作物において、葉の単位窒素当たりの光合成速度が低いこと、種子でのタンパク質合成による光合成産物の消費と考えられている。しかし、葉・種子におけるその詳しい代謝制御機構については明らかではなく、異なる代謝機構によって制御されているものと推定される。
イネ科・マメ科作物の代謝機構の差異に関わる代謝機構の基礎的知見を得るために、本研究では、イネ・ダイズの種子を経時的に採取し、その一次代謝産物の日周変化について比較調査を行った。代謝産物のプロファイリング解析についてはGC-MSを用いて分析、同定を行った。その結果、ダイズ種子でイネのものより、アミノ酸、有機酸が増加した。したがって、ダイズでのアミノ酸量の増加はタンパク質の集積量が多いことと関係があるものと考えられ、種子においてダイズでイネよりアミノ酸への炭素骨格供給が多くおこなわれているものと推定された。しかし、種子は転流などによる外部からの代謝産物の流入もあることから、さらなる調査が必要である。

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【目的】ニチニチソウ (Catharanthus roseus) は医薬価値の高いTerpenoid Indole Alkaloids（TIAs）を生合成し，TIAsの生合成機構の解明が望まれている．これまで，TIAs合成に関与する遺伝子のクローニング，発現局在についての研究は広くなされてきたが，実際に細胞内の代謝産物がどのように変動しているのか，TIAsと一次代謝物を含めた代謝物全体を見る解像度の高い解析はなされていない．そこで今回，メチルジャスモン酸処理時における代謝物プロファイリングを行い，TIAsの生合成が活性化された際の代謝変動を代謝産物レベルで解析することを目的とした．【方法】メチルジャスモン酸（MeJA）を添加した培地にニチニチソウ懸濁培養細胞およびシュートを植え継ぎ，MeJA処理を施した．処理開始から経時的にサンプリングを行い，代謝物を抽出精製し分析に供した．糖，アミノ酸, 有機酸をGC/MS分析, 糖リン酸，ヌクレオチド，CoA体等のアニオン性代謝物をCE/MS分析，またTIAsをUPLC/TOF-MS分析により測定した．現在，得られた代謝プロファイルを多変量解析に供し，代謝変動の相関を解析中である．

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シロイヌナズナのDREB1A遺伝子は低温に、DREB2A遺伝子は乾燥に応答して遺伝子発現が誘導される。この2つの遺伝子は、AP2/ERFタイプの転写因子をコードしている。DREB1A及びDREB2Aを恒常的に過剰発現させた形質転換植物は、低温・乾燥・塩ストレスに対する耐性が向上することから、この2つの転写因子が制御する下流遺伝子は、低温・乾燥・塩ストレスに対する耐性の獲得において重要な機能を果たしていると考えられる。
本研究では、DREB1A及びDREB2Aが制御する低温及び乾燥ストレス下で発現誘導される代謝関連遺伝子と蓄積量が増加する代謝産物に注目し研究を行った。DREB1A及びDREB2A が制御する下流遺伝子及び低温及び乾燥誘導性遺伝子をオリゴアレイ解析で同定し、Kappa-view、KEGG2、Aracyc等のデータベースを参考にして代謝関連遺伝子を選別した。また、DREB1A及びDREB2A過剰発現植物体と低温及び乾燥環境下のシロイヌナズナから代謝産物を抽出してLC/MS、GC/MS、CE/MSを用いて分析し比較解析を行った。低温及び乾燥ストレス下では、顕著に糖類、アミノ酸類、フラボノイド類が蓄積し、DREB1A及びDREB2A過剰発現植物体に蓄積する代謝産物と類似していることが示された。さらに、低温環境下で働いていると考えられる糖代謝酵素は、葉緑体内に局在していることが示され、現在、低温環境下における葉緑体内の代謝産物の蓄積量の変化を解析している。

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プロモーターとcDNAなど、2つのDNA断片を直接連結してクローニングできるシステムも非常に有用であり、プロモータースワッピングなどの実験に有効である。そこで今回我々はInvitrogenのMultisite Gateway Three Fragment Vector Construction Kitの手法を一部取り入れた新しい複数遺伝子クローニングベクターの開発を行った。今回作製したGateway Binary Vector(R4 pGWB)はattR4-CmR-ccdB-attR2の受容部位を持っており、L4-promoter-R1のエントリークローンとL1-cDNA-L2エントリークローン、そしてR4 pGWBの三者でLR反応を行うことにより、プロモーターとcDNAを連結してバイナリーベクターにクローニングすることが可能である。さらに適当なR4 pGWBを選んで用いることでC末にレポーター・タグを融合することを可能とした。Multisite Gatewayの方式と我々が従来開発してきたpGWBの方式の両方を用いるためHybrid Gateway Binary Vectorシステムと名付けた。
今回はこのベクターの使用例としてプロモータースワッピング解析とプロモーター解析の結果を紹介する。

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 植物では外来遺伝子の転写量が多い場合、RNAサイレンシングが誘導されるため、外来遺伝子の過剰発現が困難である。シロイヌナズナのsde1遺伝子は、RNAを鋳型としてRNAを合成するRNA dependent RNA polymeraseをコードしており、外来遺伝子によって誘導されるRNAサイレンシングの必須因子である。そこでシロイヌナズナで導入遺伝子の過剰発現する形質転換体を得る目的で、sde1遺伝子の発現をRNA干渉によって抑制した。
 sde1遺伝子の第一イントロン（約400 bp）を含む約1.5 kbの領域をクローニングした。転写後にhairpin dsRNAを生じさせるために、このDNA断片の5’側約1.1 kbを、イントロンを挟むinverted repeat構造をとるように3’側に接続した。このDNA断片をアグロバクテリウムを介して、シロイヌナズナに導入した。T3世代のロゼット葉から抽出した全RNAを鋳型としてsde1遺伝子に特異的なプライマーを用いてRT-PCRを行いsde1遺伝子のmRNAを検出した結果、sde1遺伝子のmRNAが野生株と比べて著しく減少した形質転換体が得られた。これらの株では、RNAiによってsde1遺伝子の発現が抑制されたと考えられ、外来遺伝子が過剰発現してもRNAサイレンシングの影響を受けない可能性がある。

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近年、酵母相同組換えを利用したDNAクローニング法が酵母two-hybrid法などの研究で、よく使われている。この方法により、目的のDNA断片を効率よくベクターに組込むことができる。特に、制限酵素とリガーゼを用いた従来のDNAクローニング技術では、複数のDNA断片や、数十kbp以上の大きなDNA断片をベクターに組込むことが困難であるが、この方法ではそういった断片のクローニングも容易にできる。しかし、非常に優れた方法であるにもかかわらず、従来の酵母相同組換えを利用した方法では、酵母複製起点のあるベクターにしかDNA断片をクローニングすることができなかった。そこで、最近、私たちは、植物の研究でよく使用されているpCAMBIAなどの酵母複製起点の無いベクターにも、酵母相同組換え利用して、DNA断片をクローニングする方法を開発した。ヘルパープラスミドpSU7とpSU23はベクターのKm耐性遺伝子と大腸菌複製起点の配列を利用して、酵母相同組換えにより、ベクターに酵母複製起点と選択マーカーを導入し、酵母で複製可能にする。そこで、ベクターと相同な配列を付加した目的DNA断片とベクターと共に、ヘルパープラスミドを酵母に形質転換すると、相同組換えにより、ベクターが酵母で複製可能になると同時に、そのベクターに目的のDNA断片が組込まれる。今回はこの方法の詳細な条件検討を行った。

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近年、地球環境の変化に伴い、温暖化の一要因である二酸化炭素を固定する必要がある。さらに、欠乏が予測されうる石油エネルギーに代わるエネルギーが求められている。これら二酸化炭素の削減、ならびにエネルギー資源確保のため、樹木、特にユーカリの植生拡大を目標としている。我々は、劣悪な環境下でも高成長・高品質であるユーカリを開発するため、遺伝子組換えによる分子育種に取り組んでいる。新品種ユーカリを開発するにあたり、特に根の機能性向上(環境ストレス耐性、養分吸収向上)を目的としている我々は、根における目的遺伝子、新規有用遺伝子の評価技術が必要である。現在の問題点として、従来の方法で形質転換したユーカリでは、根の機能解析は一年以上の期間を要する。そのため、短期間で組換え体を獲得できるとされる毛状根に着目した。ただし、草本植物と異なり、木本植物のユーカリにおいて、遺伝子機能解析のための毛状根形質転換の知見、技術はほとんど得られていない。本研究では、迅速に目的遺伝子の評価を行う技術として、ユーカリ毛状根を利用した評価系を開発した。今回、ユーカリ毛状根において、アグロバクテリウムの感染期間、感染組織の培養条件を検討した結果、1～2ヶ月で形質転換した毛状根が得られた。現在、この評価系を利用し、ユーカリ根におけるプロモーター解析ならびに有用遺伝子の効果評価を実施している。

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植物緑葉における葉緑体機能の構築過程は，光などの環境要因に加えて内的プログラムに依存する．このプログラムを解明するために，アクティベーションタギング法を適用し，シロイヌナズナのカルスにおいて光合成遺伝子RBCS が発現するようになった突然変異系統 ces102，ces103 ( callus expression of RBCS ) の選抜に成功した．ces102では、発現が最も促進されていたAt3g05490遺伝子を親系統に導入し発現させたところ，ces102の表現型が再現できた．したがって，CES102はAt3g05490であると考えられた．また，CES102とsGFPとの融合タンパク質を発現するコンストラクトを構築し，一過性発現させその細胞内局在を共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察したところ，CES102は小胞体に局在する可能性が示唆された．ces103においては，発現の促進されていたAt3g59860とAt3g59870遺伝子を親系統に導入し発現させると、どちらの形質転換カルスでもces103の表現型が再現できた．そこでリアルタイムRT-PCR解析によって，これらの形質転換カルスにおけるRBCSの発現量を測定した．At3g59860形質転換カルスにおいて ces103と同程度までRBCS発現の上昇が見られたのに対し，At3g59870形質転換カルスではces103と同程度まで発現が上がらなかった．したがって，CES103はAt3g59860であると考えられた．

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To investigate the feasibility for using the key enzymes of formaldehyde (HCHO) fixation from methylotrophs to generate the functional ornamentals which have enhanced HCHO detoxification capacity, we introduced the fused HPS/PHI gene from Mycobacterium gastri MB19 into ornamentals, petunia and pelargonium. Western blot analyses showed that the fused HPS/PHI was successfully expressed in the two ornamental plants. The two transgenic plants displayed better resistance to HCHO than the wild-type plants when they were grown on MS medium with HCHO or exposure to gaseous HCHO. Our measurements indicated that the HCHO assimilation ability of the transgenic lines was increased 30-40% than the wild-type plants. The transgenic ornamental plants also showed a 15-40% increase in their efficiency to take up exogenous HCHO as compared with wild-type. The results suggest that the fused HPS/PHI can be applied to ornamentals to produce functional plants for phytoremediation of HCHO pollution.

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近年、食料生産現場における遺伝子組換え作物の普及が拡大しつつあるが、組換え体作出の際に選抜マーカーとして導入される抗生物質耐性遺伝子等の生態系への拡散に対する危険性も懸念されている。そこで遺伝子組換え植物体の安全化技術の確立のために、植物自身のゲノムに由来する遺伝子を選抜マーカーとして利用するセルフクローニング技術の開発に着手した。
本研究では、遺伝子サイレンシング技術であるCRES－T法を用い、シロイヌナズナ転写因子に転写抑制ドメインを融合したキメラリプレッサーを発現させた植物体を種々の環境ストレス条件下で生育させ、耐性を有する植物体を探索する。これら耐性を示す植物体から、耐性を付与するキメラリプレッサーを同定し、選抜マーカーとなり得るキメラリプレッサーの単離を行う。
現在、選抜マーカーの候補遺伝子として、塩ストレスおよび浸透圧ストレス等の各種環境ストレス耐性および農薬耐性を付与する遺伝子を挙げ、キメラリプレッサー発現植物の選抜条件の設定には、主に各種ストレス条件を付加した培地上での種子発芽および実生の生育状態を指標に、野生型植物がほぼ完全に生育不能となる条件を検討している。
また各種環境ストレス条件に応答する転写因子を検索し、これらのキメラリプレッサー発現植物の作成および選抜を行い、耐性実験による評価を行っており、これらの結果について考察を行う。

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除草剤耐性遺伝子組換えセイヨウナタネ（Brassica napus、以下GMセイヨウナタネ）の野外における生育状況を継続して調査することは、遺伝子組換え植物のリスク評価のために必要である。これまでに、いくつかの港湾や関東地方の幹線道路沿いには、こぼれ落ちた種子由来と考えられるGMセイヨウナタネが生育していることが確認されている。今回、環境省請負業務として、2005年における西日本を中心としたセイヨウナタネと近縁野生種の在来ナタネB. rapa、カラシナB. junceaの生育状況、並びに導入遺伝子の拡散状況に関する調査を行なったので報告する。清水、四日市、堺泉北、宇野、水島、北九州、博多の7つの港湾と幹線道路、及びその後背地の河川敷における95か所で採集したセイヨウナタネ50個体、在来ナタネ82個体、カラシナ283個体の母植物のうち、四日市と博多の2地域の7か所で生育する12個体のセイヨウナタネから除草剤耐性の種子が検出された。そのうち四日市の国道23号線沿いで採集した2個体からは、2種類の除草剤耐性を同時に持つ種子が検出されたことから、2種類のGMセイヨウナタネ間での交配の可能性が示唆された。一方、これまでの調査と同様、在来ナタネ、カラシナからは除草剤耐性種子は検出されず、GMセイヨウナタネのこれら近縁種との交雑は確認されなかった。

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The cDNA for glutathione-dependent formaldehyde (HCHO) dehydrogenase (FALDH) from Arabidopsis and the fused gene for 3-hexulose-6-P synthase (HPS) and 6-phospho-3-hexuloisomerase (PHI) from a methylotrophic bacterium, Mycobacterium gastri MB19, were over-expressed in tobacco, respectively under the control of tomato rbcS-3C promoter. The FALDH and the fused HPS/PHI were expressed in the cytoplasm and chloroplasts, respectively in the transgenic tobacco. Our assay indicated that overexpression of the FALDH gene and the fused HPS/PHI gene led to an increase in FALDH and HPS/PHI activities in the two transgenic tobacco plants, respectively. The transgenic tobacco overexpressing fused HPS/PHI (HPS/PHI tobacco) showed higher tolerance to HCHO than the transgenic tobacco over-expressing FALDH (FALDH tobacco) when they were grown on MS medium with HCHO or treated with gaseous HCHO. Our measurement also suggested that the HPS/PHI tobacco had stronger ability for HCHO detoxification than FALDH tobacco.

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生物研究にとってリソースは必要不可欠な要素であり、特にゲノム解析が終了したモデル生物においては膨大なリソースが整備され研究推進に貢献している。2002年度に開始されたナショナルバイオリソースプロジェクト(NBRP)では動植物及び微生物の個体、細胞、遺伝子材料を保存するとともに国内外の研究者に配布してきた。植物リソースとしては、シロイヌナズナ／植物細胞・植物遺伝子（理研BRC）、イネ（遺伝研）、コムギ（京都大）、オオムギ（岡山大）、ミヤコグサ・ダイズ（宮崎大）、アサガオ（九州大）、広義キク属（広島大）、藻類（環境研）の各課題が選定されリソース事業を進めてきた。第1期NBRPの成功を受け、2007年度からは第2期のNBRPが開始される見通しとなり、本事業による生物研究への一層の貢献が期待されている。本発表ではNBRPの一環として理研BRCで進めてきたシロイヌナズナ／植物細胞・植物遺伝子の課題のこれまでの成果と現在進めているリソース高度化への取り組み、更には第2期NBRPにおける課題と計画について説明する。

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果実の成熟は農業的に重要な特質であり，生長の中で強度に制御かつ高度にプログラムされている．果実成熟機構を明らかにすることは，農業利用だけでなく植物の生長の制御機構を理解する上でも有意義であると考えられる．ゲノム研究が始まったトマトは、果実生理研究における優れたモデルシステムだと考えられる。機能解析において変異体は非常に有用なツールである。我々は成熟の分子機構に関する知見を得ることを目的として、極矮性系統である'Micro-Tom'にガンマ線や重イオンビーム照射し、変異誘発集団の整備を行った。
ガンマ線300Gyを照射したM2世代2,500系統についてスクリーニングを行い、果実形質に異常が見られる個体を選抜した。M3世代の解析から，桃色の果実色を示す株(pink)および葉色が淡い株(pale leaf)について形質の遺伝を確認できた．pink系統は，M3世代において，開花時期，着色開始時期および着色期間については，野生型と変わらなかった．果実表面色について，赤みを表すa*値は，着色開始後常に野生型より低く、明度を表すL*値は，着色開始後常に野生型より高かった。pale leaf系統は、葉色だけでなく果実色においてもa*値が低く、L*値と黄みを表すb*値が高いという形質を示した。これらの系統についてカロテノイド類の蓄積パターンおよび関連生合成系酵素遺伝子の発現などについて報告する。

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Real-time monitoring of gene expression using a bioluminescence reporter strain is one of the most powerful methods for the analysis of gene expression in living cells with a high sensitivity, a broad dynamic range, and a high time-resolution. The method allows easy isolation of a large number of mutants affecting the expressions of any genes in the genome. However, there were many problems in previous systems. We have developed a high-throughput real-time bioluminescence monitoring system, which consists of two types of high-throughput bioluminescence monitoring apparatus and the bioluminescence-analyzing program RAP. The system enables the automatic monitoring and analysis of bioluminescence from 4,800 individual samples in one assay under uniform light conditions.
Here, we will introduce the real-time bioluminescence monitoring system and the cloning and analysis the circadian clock genes in cyanobacteria and Arabidopsis.

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A series of cDNA clones encoding luciferases with four different colors was obtained from the bioluminescent click beetle, Pyrophorus plagiophalam. The click beetle genes have been developed as a reporter vector system and have become available commercially. The multi-color luciferases provide an ideal dual-reporter system because the two reporter enzymes are highly similar and because both signals are generated by D-luciferin treatment. To investigate the usefulness of multi-color luciferases as reporter genes in higher plants, we assayed the transient expression of luciferase genes by microprojectile bombardment. Although their expression levels were relatively low, luminescence from green and red luciferases were separable under the CCD camera equipped with interference filters. Results of time-course experiments and the inducible promoter assay suggest that the multi-color luciferase system is applicable to plant cells. We will present examples of the use of green and red luciferases to monitor regulated gene expression in higher plants.

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We have developed an imaging system and software for analyzing plant growth and development. To define specific developmental changes, a comprehensive analysis of visible phenotypes required a large-scale image database including more than a thousand growth images per plant that was acquired every minute. We also developed a software platform to observe serial images quickly, measuring growth parameters automatically.
We applied this method for early development of phytochrome-deficient mutants of rice, and analyzed the effects of mutation on growth. The results promptly showed us that the effects of light on either photoinhibiton of extension growth or photoinhibiton of revolving movement of coleoptiles are different according to their growth stages. These two photoresponses were not always simultaneously induced.
We would like to discuss potential opportunities of image processing techniques and statistical techniques to provide a framework for the analysis of future plant growth and development data.

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われわれは，イネの根の時空間的な成長特性を解析し，可視化するための
グラフィックツールを提供する．本ツールはモニタリング画像に対して以下の2つの機能をもつ．
（1）半自動的にイネの根の成長特徴を解析
（2）解析した成長特徴量を効果的に可視化
まず，時系列のモニタリング画像に対して時空間画像処理の技術を利用してイネの根の長さや，面積，分岐角度などの特徴量を解析する．次に，解析によって得られた特徴量を効果的に可視化する機能を提供する．ここでは時空間スペースに存在する植物の成長特性を直感的に捉えられるように，根の位置情報と発生時刻情報を併せて提示する．これによって，根の形状を把握しながら各領域での成長速度を観察したり，根の発生位置による長さの違いを観察したりできる． さらに多量のサンプル間の特徴を比較するための可視化機能も有している．大量のサンプル間の特性を比較するには，例えば数値化した成長量をグラフ化し，大量のグラフを総括的に把握して比較する必要がある．本ツールでは，グラフを半透明化して重ね合わせることで，サンプル全体の大局的な特徴と個々のサンプルの詳細な特徴を同時に把握できる．本ツールで提供するこれらの機能を組み合わせて使うことで，効率的に生長過程を観察することができる．

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異種間または遠縁系統間の交配によるF₁個体はしばしば親個体よりも量的・質的に優れた形質を示す。この現象は雑種強勢（ヘテロシス）と呼ばれ、農作物の育種手法として広く使われているが、農業形質以外の基本的な生長パラメータの精密な時系列解析はほとんど行われていない。一方で、種間雑種や遠縁間交配において、遺伝子発現の変化・不安定性などのエピジェネティックな現象が起こる例が報告されている。本発表では、このようなゲノム間相互作用やエピジェネティック変化のような多面的・複合的な影響を含む現象に対する時系列解析の試みとして、イネ遠縁間交配系統（ジャポニカxインディカ）を用いた、クロマチン修飾変化が初期生育における生長パラメータに及ぼす影響の解析を紹介する。ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤（TSA）で処理した植物体では、初期生育に全体的な生長遅延や生長阻害が観察される。しかし、TSA処理したF₁個体の初期生長を経時的に計測し、回帰計算により求めた生長パラメータを無処理F₁および親系統の生長パラメータと比較した結果、幾つかのパラメータでTSAに対してF₁特異的な反応が見られ、F₁の生長が親系統とは異なるクロマチン修飾依存性を持つ可能性が示された。

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Red clover is an important forage legume widely cultivated in most temperate regions. However, its usefulness is limited due to its short perenniality. Perenniality is determined by interactions among various factors, such as biotic abiotic stress and flowering characteristics, which are controlled by QTLs. Growth monitoring of red clover individuals during plant growth period should be efficient for revealing and splitting up the factors those contribute to perenniality. However, traditional growth analysis required sampling of plants, and it was impossible to chase individual growth habit of the field plants by nondestructive inspection. In this presentation, we reported the result of growth monitoring of red clover individuals on the field level using Field Imaging System and QTL detection with the obtained data. Field Imaging System was a measuring device of field plants, composed with personal computer, digital camera and software for picture filming and instrumentation.

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色素体蛋白質の大部分は、核内遺伝子にコードされており、細胞質で合成された後に色素体に輸送される。これらの蛋白質のほとんどは、アミノ末端に色素体移行シグナルであるトランジット配列を有する前駆体蛋白質として合成され、エネルギーに依存して色素体を囲む外・内包膜に存在する蛋白質輸送装置(トランスロコン)、Toc、Tic複合体を通って色素体内に取り込まれる。一部の蛋白質はさらに、チラコイド膜に到達する。チラコイド膜における蛋白質局在化機構に関しては、包膜透過機構とは別の細菌と似た膜透過機構が存在する。現在シロイヌナズナにおいてToc、Tic複合体を形成するToc因子やTic因子をコードする遺伝子に変異の入った変異株が多数単離されており、それらの多くが表現型としてペールグリーンを示すことから、蛋白質の色素体包膜透過が葉緑体分化にとって重要であることが示唆される。本シンポジウムにおいては、蛋白質の色素体包膜透過について、最近の知見をもとに考察する。

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光化学系2複合体の形成は、光阻害におけるD1タンパク質の速い代謝回転などの観点でよく研究されているが、そのしくみや経路はまだ不明な点が多い。われわれは常温性シアノバクテリアSynechocystis sp. PCC 6803と好熱性シアノバクテリアThermosynechococcus elongatus BP-1やT. vulcanusを用いて、系2サブユニットの構造機能解析を進めてきた。好熱性のThermosynechococcusは活性や二量体などを保持した複合体を単離することができる点で非常に優れていた。Thermosynechococcusの変異株から系2複合体を単離することで、これまでにpsbX, psbI, psbK, psbTc, psbH, psbM, psbZなどの低分子タンパク質の破壊株の系2複合体の解析から、次のことが明らかになった。PsbI, PsbK, PsbTc, PsbH, PsbMは二量体形成に重要な役割を果たしている。一方、特異的な知見として、psbTc破壊株ではPsbMの消失、psbH破壊株におけるPsbXの消失などが得られた。われわれはいくつかの破壊株から系2複合体を単離して結晶解析も進めている。一方、光化学系2は光阻害を受けやすく、とくに水分解系が不安定であることが問題とされてきた。最近、われわれは水分解系の不安定化に関わる遺伝子を見いだしたので、これについても紹介する。

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光合成電子伝達系の光化学系1（PSI）複合体は、集光と光化学反応の機能を果たす約700kDaの複雑な構造を持つ超分子複合体である。この複合体を構成する成分（ポリペプチド、光合成色素、キノン、鉄硫黄中心、脂質など）や光化学反応の分子機構の解析は活発に進められてきたが、構成成分が機能的な複合体へ形成される機構の解明は大きく遅れている。その理由として考えられるのが、（1）数多くの構成成分は効率よく分子集合するため、複合体形成の中間体の検出が容易でない、（2）形成過程を介添えする因子（分子シャペロンなど）の解析が遅れている、である。我々は分子遺伝学および生化学的解析が容易である緑藻クラミドモナスを用いてPSI複合体の形成を解析している。ここでは、タンパク質のパルスラベル法などの生化学的解析により、複合体形成の中間体を同定し、そのポリペプチド組成の解析からPSI複合体の形成過程のモデルを提案する。さらに、我々はPSI複合体の形成に必須である葉緑体にコードされたYcf3およびYcf4の複合体形成における役割について解析した。その結果、Ycf3とYcf4は複合体形成の初期に必須な成分であること、少なくともYcf4は巨大な分子集合装置の成分であること、などを明らかにした。さらに光化学系1複合体の形成の分子機構についての今後の展望について議論する。

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クロロフィルはチラコイド膜に存在する光化学系の主要な構成成分であり、光合成において光捕集や電化分離などの重要な役割を果たしている。そのため、光化学系やチラコイド膜の形成分解はクロロフィル代謝と密接な関係にある。黄化芽生えはクロロフィルを蓄積せず、またチラコイド膜の発達も見られない。緑化が進むにしたがってクロロフィルの合成が始まり、光化学系が形成され、チラコイド膜も発達する。その逆の過程が老化組織で見られる。クロロフィルが減少し、チラコイド膜も消失する。これらの結果は、色素タンパク質複合体がチラコイド膜に存在することを考えると当然の結果である。しかし、クロロフィルの蓄積とチラコイド膜の発達が単に一致しているだけなのか、クロロフィル代謝がチラコイド膜の形成崩壊を積極的に制御しているのか、またそれとは反対にチラコイド膜の形成がクロロフィル代謝を制御しているのかなど様々な可能性が考えられる。
我々は、クロロフィル代謝がどのようにチラコイド膜の形成崩壊を制御しているのかを検討するため、クロロフィル合成や分解の様々な変異株を作成し、葉緑体の発達と崩壊を調べた。その結果、クロロフィル代謝が積極的にチラコイド膜の形成崩壊を制御している可能性を得た。これらの結果をもとに、クロロフィル代謝とチラコイド膜の形成崩壊について議論したい。

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葉緑体の膜脂質の80％はモノガラクトシルジアシルグリセロール(MGDG)、ジガラクトシルジアシルグリセロール（DGDG）の2つの糖脂質で占められている。特にMGDGは葉緑体チラコイド膜の50％を占め、地球上で最も多量に存在する膜脂質であるといわれる。我々はシロイヌナズナより3つのMGDG合成酵素遺伝子（atMGD1, atMGD2, atMGD3）を単離し、その発現や機能の解析を行っている。その内、atMGD2, 3が葉緑体外包膜に局在しているのに対し、atMGD1は内包膜に局在し、また、光合成組織で最も高い発現を示すことから、チラコイド膜の構築に主要に寄与していると考えられている。最近我々はatMGD1の完全ノックアウト変異体(mgd1-2)を単離した。mgd1-2は緑化できず、光合成活性も認められなかった。また、生育も非常に遅く、約4週で矮小なまま生育が止まった。mgd1-2の脂質解析をしたところ、MGDGの割合が極めて低くなっていたことから、atMGD1はMGDG合成の大半を担っていることが示された。この変異体では、胚発生の段階で既に生育阻害が起こっていたことから、atMGD1は発芽後の生育のみならず、胚発生時の形態形成にも重要な役割を担っていることが示唆された。本発表ではこのmgd1-2の解析をもとに葉緑体チラコイド膜の合成機構とその意義について議論したい。

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我々は核コードの葉緑体タンパク質の機能を明らかにするために、シロイヌナズナのAc/Dsトランスポゾンタグラインより単離された色素体異常を示す変異体、apg変異体（albino or pale green mutants）の解析を行なっている。我々は現在までに約40のapg変異体を単離した。機能が予想される原因遺伝子の中には、光合成に関与するもの以外に、転写、翻訳や蛋白質のトランスロケーターなど、多くの葉緑体蛋白質に関与する遺伝子が多いことを明らかにした。これらの変異体のうち、apg3,4,5,11,12の5つの変異体について詳細な解析を行なったので報告する。これらのapg変異体のチラコイド膜欠損程度は様々であり、原因遺伝子の機能とチラコイド膜形成、葉緑体形成の関係について議論したい。
また、我々はプラスチド間の分化機構に関与するタンパク質の機能を解明することを目的として、Nycodenzを用いてシロイヌナズナから葉緑体、エチオプラスト、変異体プラスチドを、トマト（マイクロトム）からクロモプラストの単離方法を確立した。 単離した各種のプラスチドから可溶性タンパク質の抽出し、二次元電気泳動によるタンパク質の分離後、MALDI/TOFMSによりペプチド断片の質量を測定し、MASCOT Softwareでタンパク質を推定したので報告する。

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二成分制御系は、ヒスチジンキナーゼ（Hik）とレスポンスレギュレータ（Rre）の2つの構成成分からなる情報伝達系である。ラン藻にはゲノムサイズに比較して、二成分制御系を構成する因子が多数存在することが明らかとなっている。
これまでのラン藻Synechocystis sp. PCC 6803の、Hikと Rreの網羅的な機能解析により、Hik33と名付けたHikが、低温、高浸透圧、高塩濃度、強光、酸化ストレス条件下で、異なる遺伝子群の発現を制御する大変興味深いセンサーであることが分かった。また、高浸透圧、高塩濃度条件では主にRre31がHik33の下流で機能し、その他の条件ではRre26が機能すると考えられた。これらの結果は、Hik33は受け取るシグナルにより、少なくとも2つのRreへシグナルを分配する極めて特殊なセンサー分子であることを示している。
さらに興味深いことには、Hik33は新奇なタンパク質(Ssl3451)と特異的に相互作用し、Ssl3451が試験管内でのHik33タンパク質の自己リン酸化活性を10倍以上活性化する能力を有していることである。Hikの自己リン酸化・リン酸基転位反応の活性調節をする因子はこれまで報告がなく、Ssl3451は初めて見つかったHikの調節因子である。これらのラン藻に見られる二成分制御系のユニークさを紹介し、その意義について考察する。

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光合成生物は光酸化ストレスを常に受けており、通常のストレスと関連しながら影響を受けている。シアノバクテリアでも他の細菌と似た酸化ストレス応答システムをもつとともに独自の光合成調節機構をもっている。本発表では、ストレス応答性転写因子の観点から概観する。メチルビオローゲンや過酸化水素で応答する遺伝子のアレイ解析から、Slr1738(PrxR)–Sll1621(PrxA)、Sll0088(SufR)–Slr0074(SufB)、Slr1245–Sll1161などのレギュロンが明らかになった。このうち、Slr1738は鉄と亜鉛を結合する転写因子で鉄がレドクス応答していると考えられる。SufRは鉄硫黄クラスタを結合しており、レドクスに応答する。一方、LexAはDNA切断応答性プロテアーゼ型転写因子として有名であるが、Synechocystisでは別のしくみが考えられている。これら多くのストレス応答性転写因子はおもに酸化ストレス保護や傷害修復の誘導に関わっている。一方、大腸菌では傷害修復に関わるIscRのホモログはシアノバクテリアには広く分布するが、その機能は明らかではない。われわれはIscRホモログが光化学系1の遺伝子発現調節に関わっていることを明らかにした。これらの現状をふまえて、シアノバクテリアにおけるストレス応答の統一的理解について議論する。

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シアノバクテリアは原核生物において酸素発生型光合成をする唯一の分類群であるが、分子シャペロン遺伝子の保存性という点においても特徴的であることがわかってきた。特に代表的な分子シャペロンであるHsp70/DnaK, Hsp40/DnaJがマルチジーンファミリーを形成していることやHsp90/HtpGの保存性が高いことは原核生物において珍しい。我々はこれら分子シャペロンのシアノバクテリアにおける特徴を明らかにする目的で解析を行った。
シアノバクテリアSynechococcus elongatus PCC 7942株には、3種のdnaK 相同遺伝子と、4つのdnaJ 相同遺伝子が同定されており、我々はこれまでにDnaKタンパク質の必須性、局在性の違いからこれらの特異的な機能分担を示唆してきた。今回それぞれの発現調節機構について解析を行い、シアノバクテリアのいくつかの熱ショック遺伝子上流に保存された配列を見いだした。
また酵母2ハイブリッド法を用いたタンパク質間相互作用解析を手がかりに、DnaK、DnaJがRNase Eの分解活性を制御すること、HtpGがポルフィリン合成酵素であるHemEの活性を抑制する、といった分子シャペロンの新規機能を示す相互作用を見出した。これらの解析結果と共にシアノバクテリア分子シャペロンの生理的意義について考察したい。

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強光などの環境ストレスは、光合成反応の副産物である活性酸素の発生を促進し、酸化ストレス傷害を引き起こす。近年の研究により、活性酸素は光化学系の修復に必要なタンパク質の新規合成を翻訳伸長反応の過程で阻害することが明らかになっている。したがって、翻訳伸長に関与する何らかのタンパク質が活性酸素のターゲットになっていることが推測される。私たちは、ラン藻Synechocystis sp. PCC 6803からin vitro翻訳系を作製し、タンパク質合成系の酸化ストレス傷害のメカニズムを生化学的に解析した。翻訳伸長因子EF-Gに焦点を絞って、in vitro翻訳系の酸化ストレス傷害との関係を調べた結果、EF-Gが活性酸素のターゲットになっていることが明らかになった。さらに、SynechocystisのEF-Gを別種のラン藻Synechococcus sp. PCC 7942で過剰発現させると、タンパク質合成能および光独立栄養的生育における酸化ストレス耐性が増大した。この結果からEF-Gの酸化ストレス感受性が細胞の諸機能に影響していることが推察される。また、EF-Gはその酸化還元状態で機能が制御され、チオレドキシンと相互作用することが明らかになった。以上のことから、タンパク質合成系はEF-Gのレドックス状態により制御され、酸化ストレス条件下ではEF-Gの酸化によって阻害されることが示唆される。

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ラン藻は様々な塩ストレスの環境下で生育している。ラン藻の塩ストレス適応機構の解明は、過酷な条件でも生育できる重要作物の作出にも貢献きるものと期待されている。ここでは、地中海の死海から単離された耐塩性ラン藻Aphanothece halophytica の塩ストレス適応の分子機構に関する研究について報告する。Aphanothece halophyticaは0.25Mから2.5MのNaCl存在下で生育できる。NaCl濃度が高くなるとベタインを蓄積する。この耐塩性ラン藻はグリシンを基質として3段階のメチル化反応によってベタインを合成する。これに関与する2つのメチル化酵素は塩により発現が誘導された。また、このラン藻のベタイントランスポーターはベタインのみを輸送し、マングローブのベタイントランスポーターとは異なる基質特異性を示す。ベタインに対する親和性、共輸送するカチオン、輸送活性のpH依存性がマングローブとは異なった。ラン藻Aphanothece halophytica のNa⁺/H⁺アンチポーターは、植物と比較して単純であるが、NhaP型とNapA型アンチポーターを複数もつ。これらアンチポーターおよびCa²⁺/H⁺アンチポーターも塩ストレス防御に重要である。これらのことから、ラン藻の塩ストレス適応の分子機構について議論したい。

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The diversity of organisms arises through adaptation to the environment. Thus, how organisms have evolved and diversified may be understood by studying the diversity of organism's defense mechanisms against environmental stresses.
In this presentation, I will discuss about cyanobacterial responses to environmental changes such as temperature and nutrient availability, by focusing on functions of molecular chaperones. We have shown that molecular chaperones play important roles in acquisition of tolerance to various stresses. Through these studies, we started to think that light-harvesting phycobilisomes may be one of the major targets for molecular chaperones. Intriguingly, HtpG, a homolog of Hsp90, from E. coli, the model heterotrophic organism, did not protect components of phycobilisomes at high temperatures, although its cyanobacterial counterpart did. The results may indicate that cyanobacterial HtpG has evolved to interact with phycobilisomes in order to sustain photoautotrophic life.

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我々は、全ゲノム配列が決定されたAnabaena sp. PCC 7120のDNAマイクロアレイを作成し、環境ストレスに応答した遺伝子の発現系の調節について研究した。
DNAマイクロアレイによる解析の結果、Anabaenaでは窒素飢餓条件下に置かれると、まずヘテロシストの形成に関与する遺伝子の発現が誘導され、窒素固定に関連する遺伝子群 (Nif island)の発現が誘導された。この一連の遺伝子の発現は、NtcA、NrrA、HetRなどの転写因子の逐次的な発現によって調節されていた。一方、硝酸塩を与えて培養した細胞では、窒素固定は次第にその活性を低下させるが、cAMP結合タンパク質であるAnCrpAの働きで、窒素固定系の遺伝子発現の維持が計られていた。
陸棲のNostoc sp. HK-01はAnabaenaの近縁種であるが、際だった乾燥耐性能を示す。我々は、シグマ因子の一つSigIが乾燥耐性能力に深く関わっていることを発見した。AnabaenaでSigIを大量発現させたところ乾燥耐性能力の増加が見られた。また、Anabaenaでは乾燥ストレスによりトレハロース代謝系の遺伝子の発現が強く誘導され、これらの遺伝子の破壊は乾燥耐性能力が減少することが明らかとなった。
塩ストレスは非常に多くの遺伝子の発現に影響を与えるが、機能未知の転写因子OrrAが多くの遺伝子の発現に関わっていることが明らかとなった。

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植物の細胞質分裂装置であるフラグモプラストは主に微小管からなる構造体で、膜小胞を輸送することにより細胞板の形成に働く。細胞中央部に形成されたフラグモプラストが細胞板を形成しながら細胞表面に向かって広がることにより細胞質分裂は進行する。細胞質分裂の進行には新しい微小管がフラグモプラストの外縁に付加されることが必要なため、フラグモプラスト外縁の微小管の挙動を解析できれば細胞質分裂進行の分子機構が明らかになると考えられる。しかし、生きている植物細胞の深部で微小管を高分解能で観察することが難しいため、フラグモプラスト外縁の微小管の挙動はこれまで不明であった。我々は、微小管全長を標識するGFP-α-チューブリン、微小管プラス端を標識するGFP-EB1を発現させたタバコBY-2細胞を用い、ニポウ式共焦点ユニットに冷却CCDカメラを組み合わせたシステムでフラグモプラスト外縁の微小管の観察に成功した。微小管が付加される過程は、1）既存のフラグモプラスト微小管上での新しい微小管の伸長開始、2）赤道面をはさんで反対側で伸長開始した微小管との架橋、3）互いに架橋した微小管のフラグモプラスト外縁への付加、からなることがわかった。微小管の伸長開始過程には微小管への細胞質γチューブリンの結合（Murata et al.2005, Nature Cell Biology）が働いていることが予想されるため、現在γチューブリンの役割の解析を進めている。

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生体ナノシステムのサイズである1～10nmという大きさは、光学顕微鏡観察とX線解析の狭間であり、電子顕微鏡が必要な世界である。電子線トモグラフィーは、このサイズの生体ナノシステムを3次元的に見るのに必要な電子顕微鏡技術として注目されている。この技術に加圧凍結・凍結置換の手法を組み合わせることで、信頼性の高い3次元微細構造解析が可能となり、この組み合わせは細胞における膜系の動態解析に特に威力を発揮している。
分裂準備帯（PPB）は植物細胞の細胞分裂直前に出現する微小管の帯である。PPBは前中期に消失するが、PPBの存在していた位置で細胞板が親の細胞壁と接続するため、細胞板の挿入に必要な因子がPPBの位置に蓄積されると考えられている。PPBには古くから小胞が観察されている。最近のライブイメージングを用いた研究により、エキソサイトーシス小胞がこの蓄積に関わるという仮説は疑問視され始めている。そこで筆者らは、電子線トモグラフィーと加圧凍結・凍結置換の手法を組み合わせ、分裂準備帯における小胞輸送を微細構造レベルで定量的に解析した。その結果、分裂準備帯においてはエンドサイトーシスが活発に起こっていることがわかってきた。ここでは電子線トモグラフィーの方法論から実際の研究例まで含めて紹介する。

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細胞を構成するオルガネラ間では，活発な物質や情報のやり取りがなされており，この厳密な制御が細胞の生存にとって必須であることが知られている．さらに，このオルガネラ間の輸送が，植物の高次機能の発現と密接に結びついていることが近年続々と報告されている．特に，ポストゴルジ網と言われるオルガネラ群は，植物の様々な高次機能に関与していることが明らかとなりつつある．我々は，エンドソームを始めとするポストゴルジ網において機能するオルガネラに焦点を当て，その機能と動態の解析を行っている．
ポストゴルジ網には，トランスゴルジネットワーク，エンドソーム／液胞前区画，液胞などが含まれ，それぞれの間では厳密な時空間的制御を受けつつも活発な物質のやり取りが行われている．しかし，その分子機構の解析は始まったばかりであり，各オルガネラが独立した安定なものであるのか，あるいは成熟による機能変換を行い得るものであるのか，といった多くの基本的な問題が未解明のまま残されている．また，ポストゴルジオルガネラの機能と高次機能発現の関連についても，その詳細は現在のところ全く不明である．本シンポジウムにおいては，現在我々が進めているオルガネラ動態の高速・高感度解析プロジェクトにより得られた知見とともに，特に植物の高次機能発現におけるエンドソームの機能について紹介する．

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