植物では限られた窒素資源の有効利用のため、細胞間、そして細胞内のアミノ酸輸送は厳密に制御されていると考えられている。細胞膜上のアミノ酸トランスポーターについては、老化、種子形成などで器官間の窒素転流に密接に関与しているとされる。一方、細胞内でのアミノ酸移動に関わる分子（各オルガネラのトランスポーター）の実体は殆ど知られていない。たとえば、液胞内でタンパク分解によって生じたアミノ酸を細胞質へ供給したり、逆に過剰なアミノ酸を液胞に取り込む仕組みなどよく分かっていない。近年の液胞タンパクのプロテオーム解析でもアミノ酸トランスポーターの候補が見つかってはいるが、実際に液胞膜局在、さらにアミノ酸輸送能が証明されたトランスポーターは未だ報告がない。今回我々は、植物から初めて液胞膜アミノ酸トランスポーターを機能的に同定することに成功したので、結果を報告する。
出芽酵母Avt3は液胞からの中性アミノ酸の排出を担う輸送体である。シロイヌナズナにもAVT3ホモログ(AtAVT3a)が存在し、植物細胞でも液胞膜局在が観察された。さらにAtAVT3aは酵母avt3 変異体における液胞アミノ酸輸送能の欠損を機能相補できることを確認した。現在、植物個体における液胞膜アミノ酸輸送の生理的意義を明らかにするため、遺伝子破壊株の表現型解析を進めている。

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H⁺-ピロホスファターゼ（H⁺-PPase）は、ピロリン酸の加水分解反応に共役してH⁺を膜輸送するプロトンポンプであり、植物をはじめ、ある種の微生物や寄生原生生物、古細菌にも存在する。植物の液胞膜に存在するI型H⁺-PPaseはV-ATPaseと共に液胞の酸性化を担うことが知られているが、生理機能未知のアイソフォームもあり、異種発現系での機能検定から活性にK⁺を必要としないII型として分類されている。H⁺-PPaseの機能構造は、大腸菌発現系が利用可能な放線菌H⁺-PPaseについて、システインスキャニング法により膜トポロジーが決定され、網羅的なランダム変異酵素解析により基質分解、プロトン輸送、両反応の共役に関与するアミノ酸が特定されている。本発表では，植物I、II型のH⁺-PPaseの構造的特徴、蓄積量および局在性の違いを示す。放線菌酵素の知見からトポロジーモデルを作製し、機能的に重要なアミノ酸について比較・検証し、植物H⁺-PPaseの構造上の特徴を明確にした。さらに免疫化学的解析により、I、II型の存在量を葉、茎、花部、根などの組織別に算出し，II型の量が極めて少ないことを明らかにした。ショ糖密度勾配遠心法による局在解析では、II型はゴルジ体指標であるTriton-stimulated IDPaseと、ER指標であるBipのピークと酷似し、局在箇所はこの2箇所に絞られた。

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北海道・夕張岳に自生するNi超集積性植物タカネグンバイについて、我々は以前この植物から二種類のZn/Cdトランスポーター（TjZNT1/2）を単離し、両トランスポーターが酵母細胞にNi耐性能を付与することを報告した（Mizuno et al. 2005）。しかし、発現酵母によるNi排出能は確認できておらず（Mizuno et al. 2007）、両トランスポーターの発現が酵母にNi耐性能をもたらすメカニズムは不明のままであった。TjZNT1/2は極めて高い相同性を示す一方で、両者にはNi耐性能のほかZn/Cd輸送能に明確な違いが存在し、基質の違いとNi耐性能になんらかの関係があることが推測された。そこで本研究では、TjZNT1/2の各種キメラ遺伝子を構築し、発現酵母の金属輸送能から両トランスポーターの基質選択およびNi耐性に関する領域の同定を試みた。その結果、TjZNT1のN末端領域（1-7a.a.）が高親和性Zn輸送能を与える領域であることが明らかとなった。また、TjZNT2にZn輸送能は認められないが、先端の1-36a.a.を欠如したTjZNT2にはZn輸送能が認められたことから、このN末端領域はTjZNT2のZn輸送における自己疎外領域であることが示唆された。さらに、同領域のNi耐性能への関与も示唆されたことから、現在このN末端領域の機能について詳細な解析を進めている。

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植物は野外で発生するオゾンにより葉にクロロシスを生じたり、光合成や生長が阻害されたりしている。我々はこのような植物のオゾン障害や応答・耐性の分子機構を解明するため、シロイヌナズナを用いてオゾン感受性突然変異体を単離、解析している。そのうちの一つにozs (ozone-sensitive) 1 変異体があり、その原因遺伝子OZS1はTDT(Tellurite resistance/C₄-dicarboxylate transporter)ファミリーに属するトランスポーター様タンパク質をコードしていることがわかっている。ozs1変異体の過酸化水素、低温や強光ストレスに対する感受性は野生型と差がないのに対し、ガス状大気汚染物質（オゾンや二酸化イオウ）には感受性であることから、ガスの吸収量が野生型と異なる可能性が考えられた。そこでozs1変異体の気孔コンダクタンスと気孔開度を測定したところ、これらの値が野生型より高いことがわかった。さらにozs1変異体の気孔は、野生型に比べて常に開度が高い状態で日周変動しており、乾燥ストレス下では、ozs1変異体は野生型に比べ萎れやすいことが明らかになった。また光、ABA、高濃度の二酸化炭素(1000 ppm)などの処理に対して、ozs1変異体は野生型同様正常に応答していた。以上の結果から、OZS1タンパク質はこれらのシグナルに対する応答に関与するのではなく、常に気孔を閉じた状態に保つ方向に作用することが示唆された。今後OZS1の作用メカニズムを明らかにしていく予定である。

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ブドウ果皮に蓄積するレスべラトロールは、灰色カビ病などに対するファイトアレキシンであり、機能性成分としても注目されている。レスべラトロールはスチルベン骨格をもつテルペノイド系化合物であるが、これまでに植物におけるテルペノイド系化合物の輸送体として、PDRファミリーに属するABC輸送体がタバコ（NpABC1）やウキクサ（SpTUR2）で報告されている。そこで我々はブドウ果皮にレスべラトロールを分泌するPDR輸送体が存在することを想定し、ブドウのゲノムデータベース（Genescope）にNpABC1に相同性が顕著に高いホモログ（VvPDR1）を見出し、ブドウ果皮から抽出したtotal RNAを鋳型にRT-PCRを行い全長cDNAを得た。VvPDR1はABC輸送体に特徴的なwalker’s A、walker’s B、ABC signatureなどのモチーフをもち、シロイヌナズナのPDRファミリーの中ではsclareolを輸送することが報告されているAtPDR12と最も高い相同性を示した。ブドウ果皮中のレスべラトロール含量は紫外線照射により上昇するため、ブドウ果実に紫外線照射を行い果皮におけるVvPDR1の発現をみたところ、スチルベン合成酵素の発現とともにVvPDR1の発現が上昇した。このことからVvPDR1がブドウ果皮におけるレスべラトロールの分泌に関与している可能性が考えられた。

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ショ糖は高等植物において同化産物の転流で用いられ、光合成炭酸固定の主要かつ必須の物質である。こうした転流の過程でショ糖輸送体が重要な役割を果たしている。そこで我々はタバコ培養細胞BY-2株を用い、マイクロアレイの解析やEST情報をもとに、植物細胞において局在が明らかとなっていないショ糖輸送体（NtSUT）ホモログの細胞内局在と発現制御について研究を行った。まず始めにその抗体を作製しショ糖密度勾配遠心法により膜画分を単離、分画しSDS-PAGE後ウエスタンブロティングしたところ、既知のオルガネラと異なる構造体に局在すると思われる分布を示した。さらにショ糖輸送体-GFPをつなげたコンストラクトを作製し、タバコ培養細胞に導入し形質転換体を作出し細胞内の局在を調べたところ、細胞内に点在するドット状の蛍光が見られた。また，非形質転換細胞を用いて、免疫電子顕微鏡法及び免疫蛍光染色法で解析した際にもも同様の結果が得られた。
これらの解析と平行して、ショ糖輸送体の細胞増殖過程での変動を検討した。その結果、輸送体は細胞増殖期に多く存在し、定常期にはタンパク質量当り定常期のほぼ半量に減少した。また糖欠乏条件下では、輸送体の分解が誘導された。現在、この分解機構と細胞内局在について詳細な解析を行っている。

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生物にとって生長は基本的かつ重要な生理現象だが，植物では細胞分裂後の細胞体積の増加が特徴的であり，生長量の大部分を占める．それゆえ，細胞体積の大半を占める液胞は植物の形態形成のみならず，植物体の生長に重要な役割を果たしている．しかし，植物細胞の生長に伴う液胞発達の機構には不明な点が多い．液胞は最終的に吸水によりその体積を増加させることから，本研究では植物細胞の生長に伴う液胞の発達機構を解明するために液胞膜型アクアポリンに着目し，その生理機能の解析を行った．タバコ培養細胞BY-2において発現する液胞膜型アクアポリン（NtTIP1;1）を同定し，NtTIP1;1-GFPを過剰発現するタバコ培養細胞（BY-TIPG）を作出した．液胞発達過程を同調的かつ詳細に追跡できるミニプロトプラスト培養系を用いて，NtTIP1;1の過剰発現が液胞の発達に及ぼす影響を解析した．その結果，NtTIP1;1過剰発現細胞では野生株と比較して液胞の発達が促進された。その後の細胞体積増加を統計的に計測したところ，BY-TIPG細胞の方がその増加速度が亢進していた．さらに，プロトプラストから細胞伸長を高頻度に誘導する条件で培養したところ，BY-TIPG細胞では細胞伸長が促進されたのみならず，分裂した細胞の割合も約2倍に増加していた．以上の結果から，NtTIP1;1は細胞の肥大生長および細胞分裂に関与している可能性が示唆された．

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アクアポリン遺伝子の発現はイネの耐冷性と関係が深いことが報告されている。我々は耐冷性イネ品種で特有の発現パターンを示す細胞膜局在性のアクアポリン(PIP)遺伝子の性質について詳細に調べた。イネ苗を常温(25℃)から低温(4℃)に移し、さらに、低温から常温に戻した時、耐冷性品種のイネ苗は低温障害を受けず、健全に生育する。この時の全アクアポリン遺伝子(33種類)の発現を調べたところ、PIP1群の遺伝子OsPIP1;1, OsPIP1;2, OsPIP1;3が低温から常温にかけて、明らかな発現の上昇が認められた(V型発現パターン)。他方、低温感受性イネ品種は低温から常温にかけて明らかな発現低下が認められた(L型発現パターン)。このようにV-L型を示す遺伝子はPIP1群以外にOsTIP2;2等数種に限られ、イネの耐冷性と密接な関係があると考えられる。低温感受性イネにPIP1群の遺伝子(PIP1;1とPIP1;3)を過剰発現させた形質転換イネを作製した。これらのイネ苗のPIP遺伝子群の発現を調べたところ、V型発現パターンを示した。

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高い水透過性を示す膜タンパク質アクアポリンは様々な生物に存在し、特定の疾病や生理的な機能に大きな影響を与えていることが知られている。近年、コウジカビ（Aspergillus oryzae）RIB40株の全ゲノムの解析が完了し、コウジカビにもアクアポリン遺伝子とされる配列が示された。コウジカビは日本の伝統的な発酵・醸造に利用される有用な重要な微生物の一つであり、このアクアポリンの機能解明と形質転換系の作出はコウジカビの機能の向上や応用に有用と考えられる。そこで本研究ではコウジカビを用いて以下の研究を行った。
1．アクアポリンと定義された遺伝子を分離し、アフリカツメガエル卵母細胞によるアクアポリン発現実験を行った。卵母細胞の膨張率を求めたところ、このアクアポリンはきわめて低い水透過性を示した。
2．上記のコウジカビ菌株を用いて、他生物由来のアクアポリン遺伝子を導入し発現させる実験系の確立を試みた。形質転換用のベクターにα－アミラーゼプロモーター(amyB)に繋いだ外来アクアポリン遺伝子を組み込み、プロトプラスト-PEG法を用いて形質転換を行った。現在、形質転換株についてアクアポリンが過剰発現するための栄養および培養条件について検討中である。また形質転換株のプロトプラストについて、アフリカツメガエル卵母細胞との比較を予定している。

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チューリップ花弁(Tulipa gesneriana)の温度依存的開閉機構を解明する一環として、花弁からPlasma Membrane Intrinsic Protein (PIP)をコードする4種類の全長cDNAをクローニングし、それぞれをTgPIP1;1, 1;2, TgPIP2;1, 2;2と名付けた。4種類のホモログのうち、Xenopus oocyteの発現系ではTgPIP2;2のみが、Pichiaでの発現系ではTgPIP2;1と2;2が水チャンネル活性を示した。水銀やタンパクリン酸化/脱リン酸化の阻害剤が両方の水チャンネル活性に影響した。部位特異的に変異導入し、Pichiaで発現させた後のスフェロプラストバースト実験から、PIP2;2のSer-35, Ser-116, Ser-274がリン酸化される部位であることが示唆された。RT-PCRで4種類のホモログの発現量を比較した結果、TgPIP2;2は、いずれの器官においても最も発現量が多く、このホモログの産物がリン酸化/脱リン酸化の制御を受けながら、チューリップのなから、茎、花弁への水輸送を担っている可能性が高いと結論された。

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KAT1は孔辺細胞や維管束組織に発現するK⁺チャネルであり、リン酸化によってK⁺透過の制御機構を調節している可能性が考えられている。KAT1の細胞質側には、Protein Kinase Cでリン酸化される可能性のある12カ所のSer/Thrが存在する。このSer/ThrをAlaまたはAspに置換した変異体を作製し、アフリカツメガエルの卵母細胞に発現させ、two-electrode voltage clamp 法を用いたK⁺電流の測定による電気生理学的解析を行った。卵母細胞のPKCを活性化した後の電流値の変化を野生型のチャネルと変異型チャネルで比較した。これまで、そのうち3つのアミノ酸がK⁺チャネル輸送活性に影響を与えることを報告した。12個のアミノ酸のうち、残りのアミノ酸においてSer/ThrをAla又はAspに置換した変異体を作製し、アフリカツメガエルの卵母細胞に発現させ、K⁺電流の測定を行った。その結果、数個のアミノ酸のK⁺電流変化率が野生型と比較して変化した。KAT1の細胞質側に存在するC末端領域のペプチドを作製し、大腸菌から精製したシロイヌナズナのリン酸化酵素を用いてリン酸化の検出を行ったところKAT1ペプチドのリン酸化が確認された。KAT1輸送活性の調節に関与するアミノ酸のリン酸化による、チャネル活性調節について考察する。

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ラン藻Synechococcus elongatusには、ABC型の硝酸イオン輸送体(NrtABCD)に加えて、潜在的に硝酸イオンを輸送することのできるSulfate Permease型輸送体(LtnT)が存在し、LtnT輸送体の活性はC末端領域に存在するドメインよって負に制御されている。LtnT輸送体の生理的な役割は未だ不明で、硝酸イオンに対する親和性は元来低いために、この輸送体が十分に機能するためには 2 mMの硝酸イオンが必要である。LtnT輸送体の基質親和性に関わるアミノ酸残基を解析するために、硝酸イオンに対する親和性の向上したLtnT輸送体を得ることを目指した。C末端ドメインを除いた領域をコードするltnTを複製エラーを伴うPCRによって増幅し、変異を生じさせたltnTを硝酸イオン輸送活性のないSynechococcusに導入し、50 μMの硝酸イオンを含む培地で生育できる株を選別した。得られた変異株のltnT遺伝子を解析した結果、LtnT輸送体の基質親和性を向上させるアミノ酸変異を5つ特定した。また、これらのアミノ酸変異を組み合わせることで、LtnT輸送体の硝酸イオンに対する親和性が相乗的に向上されることが示された。

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イネから5個のクロライドチャンネル遺伝子を見いだしているが、そのなかのOsCLC-1およびOsCLC-2についてTos17の挿入によりそれぞれの遺伝子が破壊されたイネを用い、これらが担う機能を解析した。高塩濃度環境では植物体内に多量のNa⁺ を蓄積する。この時カウンターイオンとしてCl^-も蓄積する。OsCLC-1破壊イネでは耐塩性に影響が無く、OsCLC-2破壊イネでは根、葉ともに耐塩性が低下した。Cl^-含量が低下せずCl^-輸送が阻害されたためではない。OsCLC-2破壊に由来することを確かめるためOsCLC-2あるいはOsCLC-1 cDNAを導入し耐塩性を調べたところ、いずれのcDNAによっても耐塩性が回復した。これら遺伝子破壊イネでは栄養要求性にも差が見られた。水耕法による生育において栄養成分を低下させるとOsCLC-2破壊イネ根の生長が大きく阻害された。それぞれのイオンに対する要求性が大きく低下することはなかったが、硝酸イオンに対する要求性が高くなっていた。耐塩性の場合と同様OsCLC-2あるいはOsCLC-1 cDNAの導入により要求性が回復した。OsCLC-1の破壊による栄養要求性に変化はなかった。施肥量を0あるいは1／10に減少させた圃場における生育調査においてもOsCLC-2破壊イネの生長が抑制され、節間長、種子形、稔実率などに差異が見られた。OsCLC-1破壊イネおよびOsCLC-1、-2がともに破壊された二重変異体では、生長に大きな差はなかった。

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植物の生育は乾燥や高塩や低温のような環境ストレスの影響を受ける。シロイヌナズナのDREB1/CBFはシスエレメントDRE/CRTに結合し、多くのストレス応答性遺伝子の発現を制御している転写因子である。我々はイネのDREB1ホモログ遺伝子としてOsDREB1を単離した。これまでに、OsDREB1A遺伝子は低温誘導性を示し、この遺伝子を過剰発現したイネでは多くのストレス誘導性遺伝子の発現が上昇して、乾燥・高塩・低温ストレス耐性になることを報告した。さらに昨年度の植物生理学会においてイネはOsDREB1遺伝子ファミリーとして10遺伝子を保持しているが、乾燥・高塩誘導性のものがあること、9遺伝子は転写活性化因子としての機能を持つこと、DNA結合特性に違いがあることを報告した。
今回、我々はOsDREB1Aを過剰発現するイネをアジレント社の44kマイクロアレイを用いて解析したところ、約50の遺伝子が3倍以上誘導された。さらに他のOsDREB1ファミリー遺伝子を過剰発現するイネについても、マイクロアレイやノーザン解析による発現解析を行い、標的遺伝子に差異があることを確認した。これらの結果は、同じOsDREB1ファミリーに属する転写因子の間にもDNA結合特性に差異が存在し、植物体内での機能に差異があることを示唆している。

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植物は、乾燥、低温といったストレスにさらされると、ストレス耐性の向上に関与する遺伝子の発現を誘導することによって耐性を獲得し，生存を維持している。これまでに、最も重要な環境ストレス誘導性シス因子の一つであるDRE/CRT（A/GCCGAC）配列を同定し、この配列に特異的に結合する転写因子であるDREB遺伝子を単離して解析を進めてきた。一方、最近の研究から、DREB2Aは乾燥、塩ストレスのみならず、高温ストレスによっても誘導されることが示された。しかしながら、これらストレス応答時にDREB2A遺伝子がどのような発現調節を受けているのかはほとんど明らかにされていない。そこで本研究では、DREB2Aプロモーター上に存在する乾燥ストレス及び高温ストレス応答性シス配列の同定を試み、それらシス配列に結合して機能する転写因子の探索を行う。これまでに、高温ストレス応答には、DREB2Aプロモーターの-161から-147bpの領域が重要であることを明らかにした。この領域にはHSE配列（GAAnnTTC）が存在しているため、何らかのHeat shock factorが、DREB2Aの発現調節に関与していると予想される。一方、乾燥ストレス応答では、DREB2Aプロモーターの-147から-54bpの領域に未知のシス配列が存在することが示された。

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シロイヌナズナLeucine-rich repeat (LRR) Receptor-like Protein Kinase1, RPK1について、これまで欠失変異体を用いた解析結果から、種子休眠、根の伸長抑制、気孔閉鎖等に対しABA非感受性を示すことを明らかにした。RPK1がABA応答反応に関与するシグナル因子の一つであることが考えられた。RPK1タンパク質の過剰発現植物体は、生育抑制を示すとともに、ABAによる根の伸長抑制、気孔閉鎖等に対しABA高感受性を示した。活性酸素(ROS)はABAシグナル伝達経路の重要な二次シグナルである。RPK1欠失株rpk1-1およびRPK1過剰発現体において, ROSに対する応答性を解析した結果、 rpk1-1では酸化ストレスに対し弱くまたRPK1過剰発現体では耐性を示した。さらに、rpk1-1とRPK1過剰発現体では、 _H2O2応答性遺伝子および乾燥ストレス応答性遺伝子の両方の発現レベルが、それぞれ減少または増大していることが明らかになった。また、RPK1過剰発現植物体は乾燥ストレスに対し耐性を示し、ABA生合成変異体を用いてRPK1を過剰発現した植物では耐性を示さないことから、RPK1の機能には内生のABAの合成が必要であることが明らかになった。以上の結果から、RPK1はROSを制御しABAおよび水分ストレスに応答して機能すると考えられた。さらに、酵母のツーハイブリッド法によりRPK1の相互作用因子を単離したので、本報告ではこれらの因子が関わる水分ストレスシグナル伝達経路における役割について考察する。

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受容体様キナーゼ（RLK）はシロイヌナズナゲノム中で大きな遺伝子ファミリーを形成しており、植物の生長や発達だけでなくホルモンやストレスに対する応答においても重要な役割を担っている。マイクロアレイ解析により選抜し、ノーザン解析により低温ストレス条件下で顕著に発現が誘導されることが確認されたロイシンリッチリピートを持ったRLK（LRR-RLK）をLIK1（LOW TEMPERATURE INDUCED RECEPTOR-LIKE PROTEIN KINASE）と名付けた。LIK1は低温ストレス1時間後に発現誘導されることが示された。次にLIK1pro：LIK1-sGFPを形質転換した植物体を用いてLIK1の組織特異性や細胞内局在を解析した。根端、根の維管束組織、茎頂分裂組織で細胞膜上に蛍光が観察され、低温処理した植物の根でより強い蛍光が観察されたことから、LIK1はこれらの組織で機能すると考えられた。次に35SプロモーターとLIK1を結合して過剰発現させた植物体及びLIK1欠損変異株（lik1-1，lik1-2，lik1-3）を用いて凍結耐性試験を行った結果、どちらも野生株と耐性に変化が見られなかった。一方、長日条件下で生育したLIK1過剰発現植物では、野生株に比べてロゼット葉の数が多くなり花成に遅延が見られた。また2週間以上の長期の低温条件で生育した植物をさらに通常生育条件に移した場合に、lik1では生育に遅延が見られた。これらの結果からLIK1は低温ストレスにより誘導され、花成や生長を制御する可能性が示唆された。

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アブシジン酸（ABA）は、種子の休眠、成長抑制や、気孔閉鎖等の様々なストレス応答の鍵を握る植物ホルモンである。最近、葉緑体に局在するMg chelatase H subunitや、花成に関わる核内RNA結合タンパク質であるFCAがABA受容体として機能することが報告されたが、孔辺細胞や種子アリューロン細胞等ではABAが細胞膜上でも認識されることが示唆されている。我々は、ビオチン化ABAと蛍光標識アビジンを用いて、ABA結合部位の可視化実験系やフローサイトメーターを用いた定量化実験系を構築し、ソラマメの孔辺細胞プロトプラストやオオムギのアリューロン細胞プロトプラストの細胞膜上にABA受容部位が存在することを示した(Yamazaki et al., 2003; Kitahata et al., 2005)。そこで本研究では、細胞膜上のABA受容体を単離・同定することを目的とし、シロイヌナズナcDNA libraryを用いたファージディスプレイ法により、ビオチン化ABAと結合する因子のスクリーニングを行った。単離した候補因子について、pull-down法を用いたin vitro でのABA結合特性、GFP融合タンパク質を用いた細胞内局在性、T-DNA挿入変異体を用いたABA誘導性の気孔閉鎖、種子休眠、根の伸長抑制等のABA感受性の解析結果について報告する。

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種子植物においてアブシジン酸 (ABA)は、植物種子の発達制御や乾燥・浸透圧・塩などの水ストレス応答において重要な働きを担っている。2C型脱リン酸化酵素(PP2C)をコードするシロイヌナズナABI1は、上記のABA機能の多くを制御する重要なシグナル伝達因子である。一方、基部陸上植物であるコケ植物ヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)においてもABAが存在することが明らかとなっているが、その生理的役割については不明な点が多い。我々はABI1相同遺伝子（PpABI1A）がヒメツリガネゴケにも存在し、PpABI1Aの遺伝子破壊株（PpABI1A KO）がABA高感受性を示すことを明らかにし、コケ植物においてもPP2Cを介したABAシグナル伝達系が存在することを昨年度大会で報告した。コケ植物におけるABAの生理的役割を明らかにするために、ABA高感受性であるPpABI1A KO株の示す表現型について解析を行ったところ、現在までに塩ストレスに対して、PpABI1A KO株がWTよりも強い耐性を示すことが明らかとなっている。このことは、初期の陸上植物においてABAシグナル伝達系による塩ストレス応答がすでに確立されていたことを示唆している。

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2C型脱リン酸化酵素 (PP2C) をコードするABI1は、シロイヌナズナにおけるアブシジン酸 (ABA) シグナル伝達系の負の制御因子として機能する。abi1-1はABI1の1アミノ酸置換により脱リン酸化活性が低下するにもかかわらず、より強力な負の制御因子として機能することが知られている。これまでにABI1と相互作用するタンパク質が複数報告されているが、ABI1およびabi1-1による負の制御機構を説明するには至っておらず、ABI1によるABAシグナル伝達系の制御機構は未だ明らかにされていない。現在までに我々は、シロイヌナズナとは進化的に遠く離れたヒメツリガネゴケ (Physcomitrella patens) においてもABI1相同遺伝子PpABI1Aを介したABAシグナル伝達系が存在することを明らかにしている。ヒメツリガネゴケ原糸体は2種類の細胞のみからなる均一な細胞集団であり、かつ明確なABA応答を示す。このことを利用して、今回我々はPpABI1Aと相互作用する因子を酵母ツーハイブリッド (Y2H) 法によりスクリーニングすることを試みた。Baitタンパク質としてはPpABI1Aにabi1-1と同様の変異を導入したppabi1a-1を用いた。これまでに70万クローンを検定にかけ、約250の陽性のクローンを得ている。本報告では得られたクローンの解析結果について報告する。

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環境応答におけるシグナル伝達にはタンパク質のリン酸化、脱リン酸化が重要な役割を担っている。シロイヌナズナにおいては、タンパク質脱リン酸化酵素タイプ2C(PP2C)であるABI1、ABI2、HAB1、AtPP2CA/AHG3がABAシグナル伝達に関与することが報告されている。我々は酵母のPP2CであるPTCと高い相同性を持つAPC4と名付けたシロイヌナズナのPP2Cに着目し、機能解析を行っている。PTCは浸透圧ストレス応答性シグナル伝達経路を負に制御することが報告されており、相同性の高いAPC4遺伝子もシグナル伝達への関与が期待される。これまでに我々はAPC4のPP2C活性を確認しており、次に生体内での機能を明らかにする目的でT-DNAタグラインよりスクリーニングを行い、異なる挿入位置を持つT-DNA挿入変異ラインを2系統単離した。このT-DNA挿入変異ラインのうち1系統ではホモ個体が得られておらず、ヘテロ個体の割合も異常に低い値を示した。また、ヘテロ個体でのノーザン解析から、T-DNA挿入によりAPC4の短いmRNAが発現しており、ドミナントネガティブに働いている可能性が示唆された。現在、過剰発現体も含めてAPC4の機能解析を試みている。

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我々はこれまで、植物ホルモン・オーキシンの作用に関わるシロイヌナズナ新奇変異体を分離するため、アンチオーキシンとして知られるPCIB(パラクロロイソ酪酸)を用いて根の伸長を指標に変異体のスクリーニングをおこなってきた。その結果、TIR1やAtCUL1といったオーキシン作用に関連した既知遺伝子の変異体に加え、少なくとも3種類の新奇変異体を得ることに成功した。
その中のひとつであるaar3は、根の伸長試験において、PCIBのみならず2,4-Dにも感受性が低下した変異体であった。その原因遺伝子AAR3は、DUF298(Domain of Unknown Function 298)という機能不明のドメインを持つタンパク質をコードしていた。このタンパク質は核局在シグナルと思われる配列を持ち、プロトプラストを用いた一過的発現解析で、核に局在することが確認された。また、このタンパク質はDUF298領域を介してDCN-1(DEFFECTIVE IN CULLIN NEDDYLATION 1)タンパク質と相同性を有していた。しかし、オーキシン応答マーカーであるDR5:GUSおよびHS:AXR3NT-GUSを用いた2,4-D感受性試験では、野生型とaar3の間で明確な違いが観察されず、AAR3がこれまでに知られている作用機構とは異なる機構で2,4-Dの感受性に関与している可能性が示唆された。

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AtPCaP1はシロイヌナズナで発見された新規のカチオン結合タンパク質である。この分子は膜貫通領域をもたない親水性タンパク質でありながら細胞膜に結合しており，特定の酵素との配列類似性はみられない。さらに，金属や病害ストレスに応答して発現レベルの上昇がみられた。これらの知見からPCaP1は細胞情報伝達に関与している可能性が推察されたが，詳細な生理機能は明らかでない。そこで本研究では，この分子の生理機能解明を目的とした。PCaP1のT-DNA挿入変異株を作製し，この変異株と野生株を用いて金属ストレス処理による表現型の解析を行った。通常の金属イオン組成のMS培地に対して鉄および銅が過剰または欠乏の固体培地を作製し，植物体を播種して2から4週間後に植物体地上部の生重量を測定した。破壊株は，鉄欠乏ストレスには大きな変化を示さなかったが，銅の過剰，欠乏のどちらのストレスに対しても感受性が高くなることが示唆された。さらに，植栽密度を高めた密集ストレスに対する表現型を解析したところ，野生株と破壊株の間に統計的に有意な差が見られた。また，PCaP1プロモーター::GUSを導入した株を作製し，病原菌エリシターであるflg22を与えたところ，塗布部分で顕著なPCaP1発現増大が見られた。以上のことから，AtPCaP1が多面的なストレスへの応答に関与する分子である可能性が示唆された。

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ホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸[PtdIns(4,5)P₂] は膜上で局所的シグナルとして働き細胞骨格の再構成と膜輸送を調節する。PtdIns(4,5)P₂ は根毛と花粉管では先端に局在するため、植物細胞の局所的な伸長(先端伸長)に関係することが示唆される。しかしながら、これらの細胞の先端でPtdIns(4,5)P₂の時空間的分布がどのようにして確立されているのか、また先端伸長をどのようにして調節しているのかは明らかでない。我々はシロイヌナズナのPIP5K3 が根毛細胞で優先的に発現し、PtdIns(4,5)P₂の生成の鍵酵素であるホスファチジルイノシトール4-リン酸5-キナーゼをコードすることを発見した。PIP5K3の発現が減少したT-DNA 挿入変異体は野生型に比べて有意に短い根毛を形成した。一方で過剰発現形質転換体では野生型より長い根毛を形成し、また複数の突出部位を持つ根毛細胞が高頻度で観察された。PIP5K3 プロモーターの支配下で黄色蛍光タンパク質(YFP)融合PIP5K3は変異体の根毛の表現型を相補し、伸長する根毛先端の細胞膜と細胞質空間に局在した。これらの結果は、伸長する根毛の先端へのPtdIns(4,5)P₂の局在にPIP5K3が関わっていること、またPIP5K3が根毛の先端伸長を開始・促進する鍵調節因子であることを示している。

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植物は乾燥ストレスにさらされると、アブシジン酸（ABA）産生が誘導される。ABAは孔辺細胞内で、活性酸素種（ROS）の産生、細胞内Ca²⁺濃度（[Ca²⁺]_cyt）の上昇などを引き起こし、気孔閉口を誘導する。タンパク質脱リン酸化酵素2A（PP2A）の調節AサブユニットのRCN1がABA誘導気孔閉口シグナル伝達のポジティブレギュレーターとして、[Ca²⁺]_cytの上昇より上流で機能することが示された（1）。一方、ABAと同様に気孔閉口を誘導することが知られているジャスモン酸メチル（MJ）は、ABA誘導気孔閉口シグナル伝達経路のROS産生より上流でクロストークすることが報告された（2）。そこで、本研究ではABA、MJ誘導気孔閉口シグナル伝達におけるRCN1の役割をさらに解明することを目的とし、シロイヌナズナのRCN1遺伝子ノックアウト変異体（rcn1変異体）を用いて実験を行った。rcn1変異体は、以前の報告通り気孔閉口に関してABAに非感受性を示した。また、MJにも非感受性を示すことが分かった。さらに、rcn1変異体はABA、MJによって孔辺細胞内でROSを産生しないことが分かった。以上より、RCN1はABA、MJ誘導気孔閉口シグナル伝達経路においてROS産生より上流で機能することが示唆された。

(1) Kwak et al. Plant cell (2002) 2849-2861
(2) Munemasa et al. Plant Physiol. (2007) 1398-1407

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多くの生物においてCa²⁺は非常に重要な情報伝達因子として機能しており、様々な生理学的過程が細胞質中のCa²⁺濃度（[Ca²⁺]_cyt）の変化に依存している。植物において、[Ca²⁺]_cytの変化は気孔開閉や根の成長、花粉管の伸長、光感知などの際に生じることがわかっており、その役割が幅広く研究されている。しかし、動物に比べて植物におけるCa²⁺シグナリング機構の多くは未解明のままである。本研究では、気孔開閉制御におけるCa²⁺の役割について着目し、植物におけるCa²⁺シグナリングの解析を行った。孔辺細胞における[Ca²⁺]_cytの動的変化を観察するため、蛍光Ca²⁺指示タンパク質であるイエローカメレオンを発現させたシロイヌナズナを用いて実験を行った。さらに、細胞外Ca²⁺による気孔閉口応答が欠損したシロイヌナズナ変異体における孔辺細胞[Ca²⁺]_cytオシレーションの解析結果にについても併せて報告する。

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植物において、葉で合成される糖(C)と根から吸収される窒素(N)の代謝はクロストークしていることが知られている。そこで、CとNの相対量比(C/Nバランス)を感知しCとNの代謝を制御するC/Nバランサーの存在が示唆されている。
その分子の探索のために当研究室ではC/Nバランス応答異常変異株ssv1-D (super survival 1-D )の単離を行った。この変異株ではSSV1遺伝子が過剰発現しており、野生株が生育不能な高糖濃度/低窒素濃度(300m M Glc./0.1mM N)条件においても耐性を示した。
SSV1はシロイヌナズナのATLファミリーに属し、そのホモログが複数存在する。そこでATLファミリーのC/Nバランス応答への関与についての解析，ノックアウト変異体の解析等を進めている。さらにATLファミリーとSSVIにおける機能分担を詳細に検討するため、植物体におけるATLファミリーの器官別の発現の比較や細胞内での局在についても解析を進めており、本発表ではATLファミリーがC/N応答にどのように関与しているのかについて議論したい。

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MAPキナーゼ情報伝達系は真核生物に高度に保存された細胞内情報伝達系であり、細胞増殖制御・細胞分化・ストレス応答等の様々な刺激の受容・伝達に関わっている。植物においては動物・菌類とは異なる進化・役割を担っていることが示唆されているが(TEY型MAPKの機能分化及びTDY型MAPKの存在)、その詳しい機能は未だ不明である。そこで我々は、Chlamydomonas reinhardtii を単細胞性の最も単純なモデル植物と位置付け、その全MAPキナーゼの解析から植物型MAPキナーゼ情報伝達系の全体像を明らかにすることを目的に研究を進めてきた。クラミドモナスにおけるMAPキナーゼ相同遺伝子の機能を個別に解析する一方、近年、Ostreococcus sp., Volvox carteri や Chlorella sp.(現在未公開)など様々な藻類・植物種のゲノム情報が解析・公開されてきたことから、MAPキナーゼ相同遺伝子の種間における保存性の比較により、各MAPキナーゼ情報伝達系の機能推定を行えるようになってきた。本発表では、それら植物ゲノム間での植物型MAPキナーゼ情報伝達系の保存状況の比較から、各MAPキナーゼ情報伝達系の進化と機能の推定について報告する。

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CO₂は濃度依存的に気孔の開閉を誘導するシグナル因子の一つであり、低CO₂条件下で気孔は開口し、高CO₂条件下では閉鎖する。ht 1 (high leaf temperature 1) は低CO₂条件下でも気孔開度が小さい変異株である。ht 1の気孔の開閉異常はCO₂特異的であり、青色光やABAに対する反応はほぼ正常である。HT 1はプロテインキナーゼをコードしており、気孔を構成する孔辺細胞特異的に発現している。In vitroにおける解析によりht 1 変異はHT1キナーゼ活性を低下させることが明らかとなっている。本発表では新たに単離した優性の変異体ht1-3Dについて報告する。ht1-3Dは常に気孔の開度が高くCO₂非感受性であるが、劣性のht 1と同様、気孔の開閉異常はCO₂特異的であり、光やABAに対する反応はほぼ正常であった。このことはHT1が気孔のCO₂応答性と密接にリンクしていることを示唆している。劣性ht 1変異はHT1のキナーゼ活性を低下させることから、逆の表現型を示すht1-3DではHT1キナーゼ活性を上昇させる変異である可能性が考えられる。

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我々は最近シロイヌナズナ変異体を用いた解析から、新規受容体様キナーゼCERK1（Chitin Elicitor Receptor Kinase）がキチンエリシターシグナル伝達に必須な分子であることを示した1)。イネにはCERK1と類似した配列を持つOsLysM-RLK遺伝子が10個存在するが、この中で最も高い相同性をもつOsLysM-RLK9に着目し、そのノックダウン形質転換体（OsLysM-RLK9-RNAi）を用いて解析を行った。得られたOsLysM-RLK9-RNAiラインは、いずれもOsLysM-RLK9の発現量が非形質転換体に比べて減少したが、細胞表面のキチンエリシター受容体であるCEBiP（Chitin Elicitor Binding Protein2））の発現量には変化が認められなかった。またこれらのOsLysM-RLK9-RNAiラインではほぼ完全にキチンエリシターに対する活性酸素応答が消失し、モミラクトンBなどのファイトアレキシンの生成もほぼ完全に抑制されていた。これらの結果は、OsLysM-RLK9が何らかの形でCEBiPと共同することによりイネのキチンエリシターの細胞内へのシグナル伝達を行っていることを示唆している。 1)Miya et al., PNAS, in press; 2)Kaku et al., PNAS, 103, 11086 (’06)

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To understand the G-protein related signal transduction system of plant in detail, we tried to obtain various controlling factors influencing on the function of G-protein α subunit in vivo. For this, we designed the efficient vector system, having the TAP tag cassette for isolating the highly purified protein complex and fused with GFP not only to localize the protein but to screen the transformants rapidly with the western blot. Moreover, we used Arabidopsis sgs mutant as a host, not to reject the foreign gene introduction. To test the capability of newly constructed vector, we coexpressed GPA1 with a marker protein, H⁺-ATPase into the Arabidopsis protoplasts. Result showed that the two proteins were observed at the plasma membrane with the fluorescence microscope. After isolation of the GPA1-interacting proteins by this vector system, they were analyzed by MALDI-TOF Mass Spectrometry. Now, we examine the role of individual proteins in the signal network.

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BLUFドメインは、フラビンを結合する青色光センサードメインである。シアノバクテリアSynechocystis sp. PCC6803では、BLUFタンパク質が走光性の制御を行う。BLUFタンパク質は、室温での光照射によりフラビンの吸収スペクトルが約10 nmの長波長シフトし、暗所で元へ戻る光反応サイクルを示す。フラビン近傍のGln50とTyr8残基が、この光反応サイクルに重要な役割を持つことが、これまでの室温付近での反応解析から報告されている。本研究ではThermosynechococcus elongatus BP-1が持つBLUFタンパク質TePixDの反応解析を行った。低温分光測定によるTyr8変異型TePixDの測定から、以下の結果を得た。(i) Y8FとY8A変異型でも、80 K での光照射により長波長シフト型の吸収変化がトラップされ、野生型と類似した反応が見られた。(ii)ただし、Y8F変異型での長波長シフト形成の反応収率は、野生型より43倍低く、収率は約半分であった。(iii) 一方、150 K、283 Kでは、Y8FとY8A変異型ともに長波長シフト型の吸収変化はトラップされず、光還元が起こった。これらの結果から、Tyr8残基は正常な反応を効率的に進めるための役割を持つと考えられる。野生型の低温での光反応過程と比較し、光シグナル変換の分子機構を議論する。

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The bending of a plant toward the direction of intense light is called phototropism. This directional growth response is caused by the plant growth regulating substances. In this aspect, Bruinsma-Hasegawa hypothesis (1990) stated that the gradient of growth-inhibiting substances in the illuminated side is a key factor of bending during phototropic curvature. The symbolic growth inhibitors, cis- and trans-raphanusanins have been isolated from radish hypocotyls. These compounds were dramatically accumulated on the side of blue light illumination. To understand the role of raphanusanins in phototropic curvature and the responsible genes for the growth inhibition, DD-PCR was performed between the raphanusanin applied and control hypocotyls. We could trace some candidate genes indicating a close linkage between raphanusanins and phototropic curvature. The detailed roles and functional impacts of these genes for the growth inhibition in response to phototropic stimulation will be presented.

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シダ植物アジアンタムの気孔は光に応答して開口するが、種子植物と異なり青色光に依存した気孔応答を示さない（Plant Cell Physiol., 47:748-755, 2006年 ）。光に対する気孔開口のメカニズムを明らかにするため、光と二酸化炭素に対する気孔応答をアジアンタム生葉で測定した。青、緑、赤色光により効果的に気孔は開口し、光合成の作用スペクトルと一致した。赤色光（656±18nm）と遠赤色光（723±12nm）は気孔開口に対し顕著な相乗効果を示した。高等植物では、葉肉細胞光合成により低下した葉内二酸化炭素濃度（Ci）に反応して気孔は開口するが、アジアンタム気孔はCiに対して応答しなかった。さらに気孔開口に必要な光強度は気孔が存在する裏面を照射した時5 µmol m,^-2 s^-1、表面を照射した時20 µmol m^-2 s^-1であった。このことは孔辺細胞が光に直接反応して気孔開口を引き起こしている事を示している。そこで表皮断片に赤色光を照射すると気孔が開口し、同時にK⁺の蓄積が見られた。これらの反応は光合成電子伝達阻害剤により完全に抑制された。またこの開口はK⁺チャネルブロッカー、CsClにより阻害された。以上の結果はアジアンタム気孔は孔辺細胞の光合成に依存してK⁺を取り込み開口を誘導する事を示している。

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青色光による気孔開口では、孔辺細胞に発現する青色光受容体フォトトロピン（phot1, phot2）が青色光を受容し、細胞膜H⁺-ATPaseの活性化を引き起こすことにより、気孔開口の駆動力を形成することが知られている。しかしながら、フォトトロピンからH⁺-ATPase活性化に至るシグナル伝達機構は多くの部分が未解明である。本研究では、青色光受容体フォトトロピンのシグナル伝達に関連した気孔開口の突然変異体を単離することを目的として、気孔開度に依存した葉面温度をサーモグラフィーにより検出するスクリーニングを行った。スクリーニングは、青色光に依存した気孔開口が見られないフォトトロピン2重変異体と野生型の葉面温度差が、光照射下で区別できる条件で行った。その結果、EMS処理を行ったシロイヌナズナ約4万株より、野生株と比較して気孔が開いていない変異体10株を単離した。単離した変異体の1つについて詳細な解析を行った結果、phot1の下流因子であることが既に知られているrpt2であることが明らかとなり、本スクリーニングにより実際にフォトトロピンのシグナル伝達に関連した変異体を単離できることが示された。また、気孔が顕著に開口した変異体も5株単離しており、これら変異体の気孔開度実験の結果についても報告する予定である。

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クロレラのヘキソース輸送系はヘキソースで誘導されるが、ヘキソキナーゼの基質とはならない6-deoxy -D-glucose添加によっても誘導される。今回、ヘキソース輸送系だけでなく、アミノ酸・硝酸輸送系に対して、グルコース以外に6-deoxy-D-glucoseが誘導効果を示すか検討した。その結果、アミノ酸（グリシン）輸送系は6-deoxy-D-glucose添加により顕著に誘導されたが、硝酸輸送系には影響がなかった。従って、ヘキソース・アミノ酸輸送系の誘導は、エネルギーを必要としないシグナルによる誘導の存在が考えられる。またgrowing phaseの細胞の硝酸輸送系はグルコースにより顕著な抑制が認められ、青色光照射によっても同様な抑制が認められた。この細胞は高い硝酸還元酵素活性を示し、青色光によるその活性化により細胞内にアンモニアを蓄積する。そこで細胞内のアンモニア蓄積を検討した結果、グルコース処理細胞で顕著なアンモニア蓄積が確認された。さらに外部からのアンモニア添加は硝酸輸送系を顕著に抑制した。これらの結果は硝酸の利用が、細胞内のアンモニア量によって制御されることを示す。アミノ酸・硝酸輸送系に対する、糖・6-deoxy-D-glucose・青色光の作用・アンモニアの役割を議論する。

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コケ植物であるヒメツリガネゴケでは、phy1からphy4の4つのフィトクロムが知られており、分枝形成、光屈性、葉緑体光定位運動に関わると考えられている。本研究では、ヒメツリガネゴケにおけるフィトクロム各分子種の役割を明らかにするためにYFPとフィトクロムの融合タンパクを発現する過剰発現株を作製し、光反応の変化、細胞内局在を解析した。
ヒメツリガネゴケは原糸体の先端成長と分枝形成を繰り返して成長、発達し、分枝形成は、青色光及び赤色光によって調節される。PHY2, 3過剰発現株においては誘導される分枝の数が野生株に比べて発現量依存的に増えていた。従って、phy2, 3は分枝形成に役割を持つと考えられる。さらに、phy:YFPの細胞内局在も分子種間で異なっていた。白色光培養条件下では、全ての分子種の過剰発現株において、phy:YFPは核と細胞質に見られる。核ではスペックルが観察されるが、核スペックルの頻度は分子種間で異なっていた。核スペックルは暗所で培養した原糸体にも見られ、スペックルを持つ細胞の頻度は分子種間で異なっていた。これらの結果から、フィトクロム分子種によって仲介する光反応の機能メカニズムが異なることが示唆される。

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植物の赤色・遠赤色光受容体であるフィトクロムには、複数の分子種が存在する。アラビドプシスではphyAからphyEまでの5分子種の存在が知られているが、イネにはphyA, phyB, phyCの3分子種があり、比較的簡単な構成になっている。これらは、多岐にわたる光応答反応で協調しながら、時に役割を分担して機能すると考えられている。本研究では、イネにおけるフィトクロムの機能分担を解析するために、まず、3分子種について対応するゲノム領域からプロモーターをクローニングした。クローン化したプロモーターにそれぞれのcDNAをつないでフィトクロム変異イネに戻し、形質転換後代の幼植物について光形態形成を観察した結果、phyA, phyB, phyCそれぞれについて機能の回復が認められ、単離したプロモーターは十分な機能を持つことが明らかとなった。そこで、GUS遺伝子をレポーターとして遺伝子発現様式の解析を行ったところ、3分子種のプロモーターに発現の強弱の他に発現組織の優位性において差異があることを見いだした。また、分子種ごとの細胞内分布と核移行の光応答性について、GFP融合フィトクロム導入形質転換イネを用いて比較した。これらの結果について併せて報告し、イネにおける3分子種のフィトクロムの発現・存在様式の違いと機能分担について考察する。

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私は今までに、イネのクリプトクロムが青色光下で初期の光形態形成（幼葉鞘、葉鞘、葉身の伸長抑制、葉身幅の拡大、葉の傾斜）と開花に関与していることを明らかにしてきた。しかし、イネのクリプトクロムのシグナル伝達経路について詳細は不明である。
そこで青色光照射した時に特異的に発現量が変化する遺伝子をマイクロアレイ解析によって探索したところ、活性型ジベレリンを不活性化する酵素であるGA2ox遺伝子の発現が青色光照射によって顕著に増大することが分かった。この結果は個別のプライマーをデザインしてRT-PCRによっても確認することができた。また赤色光によっては誘導されないことも明らかになった。
次に、7日間暗所で生育させた後に24時間青色光照射したイネの芽生えのジベレリンの内生量を計測したところ、活性型ジベレリン量が青色光照射によって減少していることが確認された。これらの結果から、暗所では活性型ジベレリンが蓄積してイネの幼葉鞘、葉鞘を伸長させるが、そこに青色光を照射すると活性型ジベレリンが不活性化されることにより伸長が抑制される可能性が示された。

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光は植物にとって重要な環境因子であり，植物は光受容体によって光を感知することで様々な生理作用を誘導し環境に対応している．これまでに，シロイヌナズナの 10～20 % もの遺伝子が光受容体フィトクロムの制御下にあることが示されているが，それらの挙動は必ずしも同一ではなく，個々の遺伝子がどのように制御されているかは未だ不明である．
当研究室は進化の過程において寄生能を獲得し，光合成能が退化した寄生植物に着目した．寄生植物と光合成植物における光シグナル伝達経路の差異を明らかにすることで，植物の光シグナル伝達に関する新たな知見が得られると考えたからである．これまでに，我々は光合成を行わない Orobanche minor のフィトクロム遺伝子を単離し，その機能を解析してきた．本研究では，O. minor と近縁であるものの光合成能を失っていない半寄生植物 Striga hermonthica に着目した．光合成能の有無が異なる近縁種同士の比較によって，光合成の制御系におけるフィトクロムの役割と同タンパク質中のアミノ酸配列との関係をより明確に出来ると考えたからである．そこで，S. hermonthica より光受容体フィトクロム Aおよび B 遺伝子の単離を行った．今後，S. hermonthica において発芽，胚軸の伸長，および，単離したフィトクロム遺伝子の発現に光が与える影響を検証する予定である．

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葉緑体光定位運動は光によって制御される反応の一つであり、光の強さに依存して葉緑体は細胞内を移動する。この現象の光受容体は明らかになっているが光受容後の信号伝達系については全くわかっていない。そこで信号として伝達される物質の性質や伝達システムを推測する目的で、体制が単純で細胞レベルでの観察が容易なホウライシダ配偶体を用いて実験を行った。
ホウライシダの原糸体・前葉体細胞の一部に様々な光強度の赤色光あるいは青色光の微光束を照射して葉緑体集合反応を誘導し、葉緑体の光照射部位からの距離に対して葉緑体が光照射部位へと動き出すまでの時間との関係を調べ、信号が細胞内を伝わる速さを測定した。その結果、信号が伝わる速さは波長や光強度にかかわらず一定であり、前葉体細胞では約1.0μm/min、原糸体では基部方向と先端方向とでは異なりそれぞれ約2.3μm/min、0.8μm/minであった。また葉緑体の移動速度を1分間ごとに測定した結果、光照射部位から遠くに離れている葉緑体ほど速く動き得ることがわかった。

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葉緑体は、光環境に応じて細胞内の配置を変化させることが知られている。葉緑体は、細胞内で、弱光に集まり強光から逃げる。これらは、それぞれ集合および逃避反応と呼ばれ、光合成の効率化や葉緑体のダメージの軽減のために重要であると報告されている。暗黒下では、暗黒定位と呼ばれる定位運動が確認されており、ホウライシダの配偶体では隣接細胞の接着面に、シロイヌナズナでは細胞の底に移動することが報告されている。このような葉緑体の定位運動に関する研究は100年以上前から行なわれている。しかしながら、光以外の要因による葉緑体の細胞内配置の変化に関しては殆ど研究されていない。本研究では、ホウライシダ配偶体の葉緑体配置が温度によって変化することを見出した。配偶体を25℃・弱光下で処理したところ、集合反応が誘導されて、葉緑体は細胞の表面に集まった。配偶体を4℃・弱光下に移動させたところ、葉緑体は暗黒定位に似た配置をとった。我々は、この反応を低温定位と命名した。顕微鏡下で低温定位の経時観察を行なったところ、暗黒定位とは異なり、葉緑体は細胞壁の数カ所に分かれて凝集した。照射する光強度を上げたところ、反応が促進された。変異体を用いた解析により、光受容体フォトトロピン2が関与していることが分かった。以上、ホウライシダの葉緑体低温定位運動がフォトトロピン2を介して制御される低温応答性の現象であることが示された。

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オオセキショウモは淡水産の単子葉植物で、葉の表皮細胞では青色強光によって葉緑体の逃避運動が誘導される。暗順応後の細胞では葉緑体が遠心力に対して抵抗するが、青色強光照射直後には抵抗しなくなる。この葉緑体のアンカーの解除は葉緑体の逃避運動に先立って起こる。
いくつかの植物で、青色光による細胞質Ca²⁺濃度の一過的上昇が報告されている。シロイヌナズナでは、この上昇は葉緑体運動の青色光受容体であるフォトトロピンを介して起こる（Harada and Shimazaki 2007）。一方で、光環境の変化に応じて、葉緑体がCa²⁺の取り込み／放出をおこなうという報告がある。
我々は、オオセキショウモ表皮細胞における青色強光による葉緑体逃避運動誘導にCa²⁺が関与している可能性について、阻害剤の効果を調べた。細胞膜Ca²⁺チャネルブロッカー（La³⁺）、細胞内ストアからのCa²⁺放出を引き起こすホスホリパーゼCの阻害剤（U73122）、光合成電子伝達阻害剤（DCMU）は、葉緑体逃避運動に対して、それぞれが加算的な抑制効果を示し、三種類の阻害剤が同時に存在すると逃避運動は全く起こらなかった。一方、青色強光による葉緑体のアンカーの解除はLa³⁺とU73122との同時処理で阻害されることが分かった。以上より、葉緑体の逃避運動誘導に、異なるストアからのCa²⁺動員が関与している可能性が示唆された。

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本研究室では、シロイヌナズナにおいて新規のCa²⁺結合タンパク質を発見し、CCaP1 (cytosolic Ca²⁺-binding protein)、CCaP2、CCaP3と命名した。本研究では、各CCaPとGFPの融合タンパク質を培養細胞で発現させることにより、CCaPが細胞質に存在する可溶性タンパク質であることを明らかにした。プロモーターGUS解析と免疫ブロッティングにより、CCaP1は葉柄特異的に、CCaP2、CCaP3は根特異的に発現蓄積することを明らかにした。次に、様々な条件でシロイヌナズナを生育させ、CCaP1、CCaP2の転写レベルを定量解析した。CCaP1、CCaP2は暗条件で転写レベルが増加し、さらに暗条件を続けると20時間後には日中レベルの10倍程度まで増加すること、また転写レベルはジベレリンによっても増加することが明らかになった。増加した転写レベルは光を照射すると数時間以内に日中レベルまで急速に低下することを発見した。発芽直後の実生においても、CCaP1、CCaP2は同様の発現応答を示した。フィトクロームおよびクリプトクローム遺伝子破壊株での変動についても報告する。これは転写の促進と抑制において異なる機構が働いていることを示唆している。転写レベル制御に必要な光の波長と、タンパク質レベルでの解析も行っており、その結果についても報告する。

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280―320nmの波長領域の光（UV-B）は環境ストレスとして植物に様々な影響を引き起こす。我々はこれまでに，連続的なUV-B照射は，キュウリ（山東四葉2号）子葉の表面の退緑と，子葉の表面に存在する先端が尖ったトライコームの基部またはその下の細胞の分裂を促進することを明らかにしている。しかしながら，連続的なUV-B照射が，キュウリ子葉の内部に及ぼす影響については不明である。そこで，本研究では，連続的なUV-B照射がキュウリ子葉の内部に及ぼす影響を詳細に解析するために，UV-B照射開始後7日目および15日目のキュウリ子葉を樹脂包埋した後，ウルトラミクロトームを用いて切り出し，光学顕微鏡を用いて解析を行った。その結果，UV-B照射7日目の子葉では，柵状組織を構成する2層の細胞の縦方向の伸長成長が阻害され，また，柵状組織を構成する細胞の細胞壁は波打つような形となった。さらに，UV-B照射15日目の子葉では，柵状組織を構成する細胞の縦方向の伸長成長が，さらに阻害され，また，柵状組織の崩壊が顕著となった。また，表皮細胞については，表面の平滑化と個々の細胞の肥大が認められた。今後は，この現象について経時的に解析するとともに，UV-B照射と細胞死の関係について，分子レベルで解析を進めていく。

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Cytochrome P450（P450）は、原核生物から真核生物まで広く生物界に分布するモノオキシゲースで、NADPから電子伝達系を通して供給される還元力により酸素分子を活性化し、疎水性有機化合物の水酸化を触媒する（RH+O₂+NADPH₂⁺→ROH+H₂O+NADP⁺）。P450遺伝子の数は生物種によって大きく異なり、分裂酵母で2種、ヒトで57種であるが、植物では数百種と膨大な数のP450遺伝子が存在することがわかっている。これは植物ゲノム遺伝子の約1％を占める最大のファミリーで、これまでに植物のP450が脂質合成、色素合成、植物ホルモン生合成などの多岐に渡る二次代謝産物合成の過程に関与していることが報告されている。しかし、多くのP450遺伝子の生理機能は未知のままである。
OsCYP-10はCYP84Aサブファミリーに分類され、イネの組織全体で恒常的に発現する遺伝子である。CYP84Aには、フラボノイドやリグニン、シナピン酸エステルなど多くの二次代謝産物を合成するフェニルプロパノイド生合成経路で機能する可能性が示唆されるタンパク質が含まれている。OsCYP-10の発現を抑制した形質転換体は、通常の生育条件では野生型植物と比較して顕著な表現型は呈さなかったが、紫外線（UV-B）照射により成長が阻害されることがわかった。このことから、OsCYP-10はフェニルプロパノイド合成経路で機能し、UV耐性を付与する何らかの機構に関与している可能性が推測された。

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紫外線UVB量の増加は、イネの生育傷害、収量の減少や玄米の小粒化、さらには玄米タンパク質の増加（食味の低下）を引き起こす。このような、UVB生育傷害の主要因は、UVBによって誘発されるDNA損傷、シクロブタン型ピリミジン二量体（CPD）の蓄積であり、CPDを修復するCPD光回復酵素の活性を増加させることで、UVBによる生育傷害を軽減させることができることを実証してきた。このような有害紫外線UVBは、今日の自然環境下でも太陽光から降り注がれており、イネ葉内のDNA上には、3-6 CPD/Mb程度のDNA損傷が生じている。本研究では、太陽紫外線がイネの生育・収量に及ぼす影響を評価することを目的に、コシヒカリと、コシヒカリのCPD光回復酵素が座位する第10染色体のみをコシヒカリよりもCPD光回復酵素活性が低下しているインド型イネ・カサラスの第10染色体で置き換えた部分置換系統（SL-229 系統）を材料に野外環境試験を行った。なお、カサラスはコシヒカリと比較して、CPD光回復酵素の遺伝子型の違いによってCPD光回復酵素活性が低下しており、SL-229系統はUVB感受を示す。栽培は2006年5～9月にかけて、宮城県大崎市の実験圃場にて行い、生育収量調査を行った。SL-229系統はコシヒカリと比較して、玄米100粒重の低下、葯の稔性の低下、さらには玄米が小粒化している傾向が認められた。以上の結果から、今日の太陽紫外線もイネの生育に傷害を引き起こしている可能性が示唆された。

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UVBによって誘発されるDNA損傷（シクロブタン型ピリミジン二量体: CPD）を修復するCPD光回復酵素の活性は、植物のUVB抵抗性を左右する重要な因子である。我々はこれまで、イネ葉から精製したCPD光回復酵素の諸特性について解析した結果、約54kDaと56kDaの2つのタンパク質が含まれていることを見出した。さらに、この2つのタンパク質の違いを明らかにするため、精製したCPD光回復酵素に対し、タンパク質脱リン酸化酵素を反応させところ、イネのCPD光回復酵素はリン酸化修飾を受けていることを見出した（寺西ら：本大会口頭発表予定）。これまでに、CPD光回復酵素がリン酸化修飾を受けているという報告は一切ない。そこで、リン酸化CPD光回復酵素の機能を解析するため、本研究では、CPD光回復酵素のリン酸化修飾が酵素活性に与える影響について、以下の方法により解析を行った。(1) タンパク質脱リン酸化酵素を反応させ、脱リン酸化型のCPD光回復酵素のみとした後、活性を測定し、リン酸化型を含むCPD光回復酵素の活性と比較した。(2) リン酸基の金属親和性を利用したリン酸化タンパク質結合カラム (Phosphate Metal Affinity Chromatography) を用いて、リン酸化CPD光回復酵素のみを特異的に精製した後、酵素活性を測定した。本発表では、これらの解析結果について報告する。

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葉緑体内包膜に存在する2-オキソグルタル酸(2-OG)/リンゴ酸交換輸送体(OMT)とジカルボン酸輸送体は協調して機能し，炭素代謝と窒素代謝を仲介する重要な役割を担っていると考えられている．我々は，OMTがストロマからの還元力輸送を行うリンゴ酸バルブにおいても機能していると推察し，シロイヌナズナOMT遺伝子破壊株（omt1-T2）を用いた解析を行ってきた．その結果omt1-T2株では葉緑体への2-OG取り込みが低下し，ストロマのGS/GOGAT回路が十分に機能せず，以降のアミノ酸合成が抑制され，生育遅延が起こることが明らかになっている．本研究では，OMTとリンゴ酸バルブとの関連性を明らかにするため，omt1-T2株の強光に対する応答性を調べた．omt1-T2株を強光に曝すと，野性株に比べてFv/Fm値の有意な低下が見られた．またomt1-T2株では，強光処理に伴いストロマ局在性NADP-MDHの活性化率が素早く上昇した．したがってomt1-T2株では，強光により葉緑体ストロマ内にNADPHが過剰蓄積し，光阻害を受けやすくなっていると考えられた． 一方，omt1-T2株の相補株ではアミノ酸代謝異常および生育遅延が解消され，強光処理による光阻害も野生株と同程度まで回復した．したがってこれらの表現系の原因遺伝子はOMT遺伝子であることが確認された．

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高等植物の葉緑体には、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ（APX）がチラコイド膜（tAPX）とストロマ（sAPX）に局在し、常時発生するH₂O₂レベルを調節している。しかし葉緑体型APXは、他のAPXアイソザイムと比較して非常に不安定である。近年、H₂O₂はシグナリング因子として注目されてきている。そこで、葉緑体型APXの不安定性によるH₂O₂の動向が細胞内レドックス制御系に及ぼす影響について解析するため、tAPXおよびsAPXの遺伝子破壊シロイヌナズナ（KO-tAPX, KO-sAPX）を単離した。野生株と比較して、KO-tAPXでは膜結合型APX活性が約70%、KO-sAPXでは水溶性APX活性が約40%低下したが、他のAPXアイソザイムおよび葉緑体に局在する抗酸化酵素の転写レベルに変化は認められなかった。野生株、KO-tAPXおよびKO-sAPXに25 uMのパラコートを噴霧した結果、野生株やKO-sAPXと比較して、KO-tAPXではパラコートに対する感受性がわずかに増加したが、顕著な差は認められなかった。よって、シロイヌナズナ葉緑体型APXの遺伝子破壊は何らかの防御機構により相補可能であることが示唆された。そこで次にレドックス制御系について詳細に解析するため、エストロゲン誘導型RNAi法によるtAPX発現の一過的抑制系を構築した。エストロゲン依存的にtAPX発現を抑制させた結果、いくつかの酸化的ストレス応答性遺伝子の発現に誘導が認められた。

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