ヒルガオ科の寄生植物であるネナシカズラは、寄生根と呼ばれる吸収器官を形成して宿主植物に寄生する。寄生根分化は、茎の特定部位での皮層細胞の分裂に始まり、頂端分裂組織と類似した分裂細胞群がつくられ、それが伸長・分化して寄生根が形成される。我々は、ネナシカズラ芽生えに寄生根を同調的に誘導させる系を開発し、寄生根分化に関わる遺伝子について研究を行っている。昨年度の本学会では、シュート頂分裂組織の形成と維持に働くクラス1KNOX遺伝子がネナシカズラ寄生根形成過程において発現していることを報告した。
本年度は、クラス1KNOX遺伝子の発現調節に関わるAS1の相同遺伝子や頂端分裂組織の幹細胞形成とその維持に働くWUSCHELの相同遺伝子といった、頂端分裂組織形成に関わる遺伝子について寄生根形成過程での発現を報告する。頂端分裂組織形成に関わる遺伝子が寄生根形成過程においてどのような発現パターンを示すのかをRT-PCRによって調べた結果、クラス1KNOX遺伝子と同様に、いくつかの遺伝子で寄生根分化に伴った発現の上昇がみられることが明らかとなった。また、寄生根分裂組織形成と細胞分裂周期との関連についても、細胞分裂に関わる遺伝子の発現パターンから解析した。これらの結果をふまえて、寄生根分裂形成過程に関わる遺伝子とその働きについて議論する。

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埼玉大学周辺から単離した数種のミカヅキモを寒天培地上で培養したところ、増殖に伴い著しく移動する種と、1ヶ所で塊として増殖する種に分かれた。著しく移動する種はいずれも細胞外への粘液分泌に方向性があるなどの特徴が見られた。移動の著しい種であったClosterium acerosumを用い、走光性により寒天培地上を一方向に移動する際の粘液分泌と細胞内構造の変化を観察することを目的とした。
寒天培地上にミカヅキモを1個体置き、7日間16時間明期、8時間暗期下で培養した。この時、ミカヅキモは約20細胞に増え、様々な方向へ移動していた。ここで、1方向からのみ光を当てると、ミカヅキモは走光性を示し、光の方向へ移動した。走光性により一方向へ移動しているミカヅキモの粘液分泌、ゴルジ体、液胞等の細胞内構造の局在と変動を明らかにするために、細胞の方向性を維持したまま、カルコフロール、キナクリン、DiOC₆ニュートラルレッドなどで染色し、蛍光顕微鏡、光学顕微鏡を用いて観察した。粘液は進行方向に対し後方に向かって勢いよく噴出しており、前方では明らかに分泌量が少なかった。さらに寒天培地上で、走光性の方向を維持したまま化学固定した試料を樹脂包埋し、切片を作成した。この切片上で過ヨウ素酸‐ヘキサミン銀法により多糖成分を染色し、透過電子顕微鏡を用いて粘液の分泌過程の観察を行った。

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ムジナモは、かつて、南北米大陸を除く世界各地に自生していたが、第二次世界大戦以降、自生地から次々に姿を消し、現在では国際的に絶滅危惧種に指定されている。C.ダーウィンの紹介もあり、ムジナモの形態や捕虫のメカニズムの研究が広く行われてきたが、ムジナモは栽培が難しく、極めて稀にしか花をつけず、腋芽を形成して殖え、秋に頂端部が休眠芽となり越冬し、晩春に発芽することから、年間を通して、コンスタントに実験材料としてのムジナモを得ることがこれまで困難であった。そこで、本研究では、in vitroでムジナモの培養・増殖を行い、これを野外に出して、ムジナモの消滅の原因やムジナモ保全の方策を探った。
ムジナモのシュートの先端部を切り出し0.5％NaClO₃水溶液で滅菌した後、1/10 MS液体培地で培養した。ムジナモは良好な生育を続け、腋芽を形成し捕虫葉を発達させて、1ヶ月で約2倍に増え、in vitroでの系統保存が可能になった。これらのムジナモを約300個のコンテナを用いて、野外で育てたところ、活発に成長を続け、生活環を回すことができた。しかし、多くの場合、野外では藻類の繁茂によりムジナモの生育が阻害され消滅したことから、藻類が繁茂しないで、ムジナモの生育を抑制しない条件下でムジナモを育てたところ、ムジナモは成長・増殖を続け、野外でもムジナモを系統保存する道が開かれた。

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ムジナモは、ミジンコなどの水生小動物が捕虫葉表面の感覚毛に触れると迅速に葉を閉じて捕らえ、消化腺毛から分泌した消化酵素で分解し、吸収毛で分解物を吸収する。ムジナモは入手の難しい稀少な植物であり、維持・栽培も困難であったために、その生活環における微細形態の詳細は不明であった。本研究ではin vitroで培養・増殖させたムジナモを野外に出して生活環を回し、茎頂、花、種子形成、種子発芽、冬芽、及び捕虫葉に形成される消化腺毛、感覚毛、吸収毛の微細形態を明らかにすることを目的とした。
直接SEM観察と、通常の化学固定および急速凍結置換法により調製した切片の、光顕とTEMによる観察を行った。ムジナモの茎頂は葉原基に覆われておらず裸出していた。極めて稀に花をつけるが、雄蕊と雌蕊は近接していて自家受粉が行われていた。種子の貯蔵小器官は、胚乳ではアミロプラストとプロテインボディ、胚ではリピドボディとアミロプラストが主であった。ムジナモは根のない水生植物と記されているが、発芽時に根が現れることが観察された。冬芽には発達したアミロプラストが多数存在していた。捕虫葉の消化腺毛ではER、タンニン液胞及びラビリンチン壁の発達が観察された。感覚毛では細胞間連絡とERが特に発達し、吸収毛ではゴルジ体の著しい発達が確認された。さらに、セリウム法を用いて、消化腺毛の発達段階における酸性フォスファターゼの局在をTEMで観察した。

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　シロイヌナズナBOR1は根から地上部へのホウ素輸送の主要な役割を担っている。BOR1を発現した酵母での菌体内ホウ素濃度の低下、根の内鞘細胞での強い発現から、BOR1はホウ素のxylem loadingに働く排出型トランスポータと考えている。
　BOR1の内鞘細胞での特異的発現の生理的意味を検証するため、BOR1 またはBOR1::GFPをCaMV 35S RNAプロモーターで発現させる形質転換体を12および20ラインを作成した。T2植物をカナマイシンを添加したホウ素濃度3μMの低ホウ素条件で生育させると、耐性を示した植物の一部で上位の葉が萎縮し、bor1-1変異株と似た生長抑制を示した。複数の独立な形質転換ラインで生長抑制が観察され、ホウ素濃度30μMでは観察されなかった。
　BOR1::GFPを発現する形質転換体でGFPの蛍光は植物体全体で観察され、western解析ではBOR1::GFPに相当するバンドが検出された。また、BOR1::GFPを発現する酵母ではBOR1を発現する酵母と同様に菌体内ホウ素濃度が低下し、GFP融合タンパク質でも細胞外にホウ素を排出する能力を維持していることを確認した。
　本来の発現部位とは異なる場所に存在するBOR1タンパクが細胞内から外へのホウ素排出を行い、地上部への正常なホウ素輸送ができないために、低ホウ素条件下で生育が阻害されたと推定している。

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シロイヌナズナのゲノム上には硫酸イオントランスポーターをコードする遺伝子が14種存在する。これらのうち、Sultr1;3は高親和型硫酸イオントランスポーターのグループに属し、酵母の硫酸イオントランスポーター遺伝子欠損変異株の硫酸イオン吸収機能を相補する。Sultr1;3プロモーターによりSultr1;3とクラゲ緑色蛍光タンパク質の融合タンパク質を発現させたシロイヌナズナの解析より、Sultr1;3は子葉、胚軸及び根の篩部で発現することが示された。硫黄欠乏条件で生育した植物ではSultr1;3 mRNAの蓄積量が増加した。Sultr1;3のT-DNA挿入変異体に³⁵Sラベルした硫酸イオンを与え、硫酸イオンの器官間輸送効率を測定した。変異体における子葉から他器官への硫酸イオンの輸送効率は、野生型植物の約30 %であった。従って、Sultr1;3は篩管への硫酸イオンの吸収を仲介し、硫酸イオンの器官間輸送を調節していると考えられる。

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　シロイヌナズナのゲノム上には14種類の硫酸イオントランスポーター遺伝子が存在し、トランスポーターごとに発現部位や硫酸イオンの吸収活性が異なることから、植物体内における硫酸イオン輸送の制御機構の解明には、各トランスポーターの機能の解明が不可欠である。今回、演者らは、酵母の硫酸トランスポーター欠損株を用いて、グループ3に属するSultr3;5に硫酸イオン吸収活性のあることを初めて明らかにした。また、Sultr3;5プロモーター-GFPを用いた解析より、Sultr3;5は根の内鞘細胞や木部柔細胞で発現することが示唆された。同組織にはSultr3;5に加えて低親和型硫酸トランスポーターSultr2;1が局在する。両トランスポーターについて、それぞれのアンチセンス、ノックアウト植物体を作成して機能の解析を行った。³⁵[S]硫酸イオンを含む水耕液に植物体の根を放置し、一定時間後の地上部への放射活性の移行を測定したところ、Sultr2;1アンチセンス、Sultr3;5ノックアウト植物体では、野生株に比較して、硫酸イオンの地上部へ移行が促進されることが示された。以上の結果は、中心柱における導管への硫酸イオンの輸送の過程で、Sultr2;1やSultr3;5は、アポプラスト中の硫酸イオンを内鞘細胞内に取り込むことにより、地上部への硫酸イオンの移行を抑制していることを示唆している。

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In the nitrate assimilation pathway of plant, nitrite, produced after nitrate reduction by cytosolic nitrate reductase, enters into the chloroplast and is reduced to ammonium. Nitrate at a physiological concentration could be taken up to the chloroplast by an active transport. The transport of nitrite into chloroplast seems to be an important step in nitrogen metabolism in plants that use nitrate as major nitrogen source.
CsNitr1 cDNA was cloned and characterized as a plastid transporter for a nitrogenous compound. In this study, we analyzed the function of CsNitr1 by detecting quantitatively the translate using specific antibodies that were raised against hydrophilic region of CsNitr1. The expression of CsNitr1 was induced in green tissues by nitrate and nitrite only under the light depending on chloroplast integrity, suggesting that the function of CsNitr1 links with photosynthesis, especially with nitrite reduction in it.

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Plant utilizes nitrate and/or ammonia as nutrient. There are plant species having preference to nitrogen sources: rice likes ammonia whereas cucumber prefers to nitrate. We consider that such preference arises from the different rate of nitrite uptake by chloroplast. We cloned a cDNA, CsNitr1, which encodes a putative nitrite transporter of chloroplast envelope in cucumber leaves and introduced it into rice (Oryza sativa L. cv. Nipponbare) to modify the transport process of nitrite in the nitrate assimilation pathway.
Transgenic rice grew hydroponically with nitrate or nitrite as well as non-transformed rice with ammonia. However, the latter died after the replacement to new hydroponic medium that contained nitrate as a sole nitrogen source. Uptake of nitrate by the transgenic rice was higher than that by non-transformed ones indicating that the metabolic speed of rice for nitrate could be improved by the introduction of CsNitr1.

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Among root membrane proteins of tomato we found a metal binding protein and cloned its cDNA, LeGlp1. Two Cys residues at N-terminus may coordinate to metal ions. In this report, we constructed pBI121 vectors that express LeGlp1 mutants with the Cys residues mutated to Ser. LeGlp1 mutants were isolated from the leaves of transgenic tobacco and examined its metal binding by the affinity to Ni(II) column.
LeGlp1 mutant was synthesized as well as the native LeGlp1 but with rather unstable structure than the native one. Any of the mutants that lost one of the two Cys residues could not bind to the Ni(II) column indicating that the Cys is involved in the metal binding. Green-fluorescence protein fused with the N-terminal extension of LeGlp1 was localized at the Casparian band, which suggests the role of LeGlp1 in the uptake of metal ions.

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ヘビノネゴザは日本在来の重金属（特にカドミウム、亜鉛など）耐性・蓄積植物である。他の植物が生育できないような高濃度に重金属の含まれる土壌に生育できることから、鉱山のそばなどに群生し、古くは鉱脈を発見するための指標植物として利用されていたらしい。我々は、その重金属蓄積・耐性能の遺伝的背景を解明し、ファイトリメディエーション用植物の開発に資することを目的として、まず、安定的、かつ均質な増殖・育成条件を整えるためにその組織培養法の確立を行った。ここでは、カルス化と植物体再生条件、および得られたカルスにおけるカドミウムに対する耐性・蓄積能について検討を行った結果を報告する。カルス化のための外植体には、成植物体の羽葉、葉軸を用いた。MS基本培地に、シュークロースと寒天を添加し、これにカイネチンと2，4－Dの濃度を種々に組み合わせてカルス化の効率を検討した。さらに、得られたカルスについては、培地から植物ホルモンを除き、植物体再生能を検討した。さらに得られたカルスを用いて、種々の濃度でカドミウムを含むMS寒天培地、および液体培地における増殖量とカドミウムの取り込み量について検討を行った。その結果、ヘビノネゴザはカルスにおいても成植物体と遜色のないカドミウム耐性・蓄積能を示し、その能力が維管束等を介した組織依存的・外因的なものではなく、個々の細胞が持つ内因的なものであることが明らかとなった。

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オオムギ、トウモロコシ、イネを材料にPETIS(Positron emitting tracer imaging system)法を用い、　⁵²Feの吸収・移行の動態を非破壊リアルタイムで計測した。全ての結果において最初に強く⁵²Feが蓄積する部位は茎葉部の基部にあたるdiscrimination center(DC)であった。1)鉄欠乏1週間目と鉄十分条件下のオオムギ(品種：エヒメハダカ)にそれぞれ⁵²Fe-デオキシムギネ酸(DMA)を経根投与した。鉄欠乏区におけるDCへの⁵²Feの蓄積量は鉄十分区の約12倍であった。2)鉄欠乏4日目と鉄十分条件下のオオムギにそれぞれ⁵²Fe-DMAを葉の切断面から投与した。どちらも地上部からの⁵²Feが根の先端や最新葉に移行した。3)鉄欠乏1週間目のオオムギで0.1 mM ABAを2時間前処理したものに52Fe-DMAを経根投与したところ、ABA処理をしなかった鉄欠乏のオオムギに比べて約60%にまで地上部への移行が抑えられた。4)「鉄・ムギネ酸」のトランスポーターであるYS1を欠損したトウモロコシの変異株ys1と野生種(品種：Alice)を鉄欠乏条件で育て、⁵²Fe-ムギネ酸を経根投与したところ、地上部への移行はys1の方が野生種に比べて20%にまで減少した。5)出穂後3週間目のイネ(品種：日本晴)において、1週間鉄欠乏処理したものと鉄十分条件で育てたものに⁵²Fe-DMAを経根投与したところ、鉄欠乏区は穂や止め葉において鉄十分区に比べて約5～10倍の⁵²Feが蓄積した。

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　植物のアポプラスト(AP)液に含まれる物質は細胞の成長・分化に決定的な影響を持つと考えられる。維管束を通る物質の分析に関しては、茎を切断しEDTA溶液に浸け、滲出する方法が知られている。しかしこの方法ではAP液を効率よく短時間で採取することが難しい。本研究では元々水ポテンシャルの測定に用いられていたプレッシャーチェンバーでAP液を加圧採取する方法を開発した。播種後7～10日目のアサガオ(Pharbitis nil cv. Violet)の芽生えから採取したAP液にシンプラスト(SP)液がどれくらい混入するのか調べた。同一個体を0、0.5、1.0、1.5 MPaで加圧しAP液を採取した。残った個体を液体窒素で凍結融解し、遠心してSP液を得た。両液の糖組成はHPLC-PADで分析し、一部はSDS-PAGEにかけタンパク質の泳動パターンの比較をした。AP液の体積はSP液の約5％であった。AP液の主な糖組成はGlc、Suc、Fruで、それぞれ約68、25、7%であったが、SP液では約50、20、30%であった。またSDS-PAGEの泳動パターンを比較すると、SP液の分子量約120 kDaのバンドはAP液になく、AP液の約20 kDaのバンドはSP液になかった。以上の結果、AP液にSP液の混入は少ないと考えられる。

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　維管束を通る物質の種類や濃度の日変化の知見は限られている。本研究では水ポテンシャルの測定に用いられていたプレッシャーチェンバーでアポプラスト(AP)液を効率的に短時間で加圧採取する方法を開発した。材料に播種後7～8日目のアサガオ(Pharbitis nil cv. Violet)を用いた。16h L、8h Dの光条件で育てた芽生えから4時間おきにAP液を0、1 MPaで採取し、糖・タンパク質濃度および糖組成の変化をHPLC-PAD、GCなどで調べた。1 MPaのAP液の液量は明期に減少し、暗期に増加した。糖・タンパク質量は日周運動を示した。1 MPaのAP液の糖濃度は暗期(約1.5mg/ml)から明期(約4.5mg/ml)へ3倍上昇した。タンパク質濃度は暗期(0.3mg/ml)から明期(0.75mg/ml)に2.5倍上昇した。HPLC-PAD分析の結果、明期ではGlc、Suc、Fruの比が80：11：9だったが、暗期には45：33：22になった。AP液を加水分解し、GC分析をすると、Glc、Rhaがそれぞれ64、33％を占めていた。他にXyl、Ara、Man、Galが少量含まれていた。0 MPaのAP液に大きな濃度変化はなかった。シンプラスト(SP)液の糖濃度は15～40 mg/mlの幅で、タンパク質濃度は2～3.5 mg/mlの幅で明確な周期はなかった。SP液のGC分析ではGlcが95％を占めていた。

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It has been demonstrated that some pumpkin phloem proteins moved long distance in the organ-selective manner when introduced into rice sieve tube via insect stylet (Aoki et al., Plant Cell Physiol. 43: s192). Here we report the identification and primary structure analysis of pumpkin phloem sap proteins showing organ-selective long-distance movement. Biotinylated protein spots corresponding to long-distance movement signals were excised from 2D-electrophoresis of Q-sepharose bound fraction of the pumpkin phloem sap protein, and excised spots were subjected to in-gel digestion. Peptide fragments were then separated by micro HPLC and their primary structures were determined by internal peptide sequencing and peptide mass analysis. The protein moved specifically to the shoot was identical to the CmPP16-1. One of the two proteins which moved both to the shoot and root was identified as CmPP16-2, and the other was Cucurbita maxima ortholog of silver leaf whitefly inducible protein 1 (SLW1).

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A genomic clone of Wiv-1 gene for wound-inducible cell wall-bound acid invertase was isolated from tomato. The 5' upstream region (4kbp) of the gene contained some regulatory elements for phloem-specific expression. This region was fused to the beta-glucuronidase (GUS) gene, and then the chimeric gene was introduced to tobacco. In leaves of the transgenic tobacco, GUS activity continued to increase for 96 h after wounding. A strong GUS staining was observed in pollens and vascular tissues of stems close to petioles in transgenics grown in a greenhouse. These data suggest that the cell wall-bound enzyme encoded by Wiv-1 involves in the regulation of transport of sucrose in leaves and in the sink activity of pollens. In addition, results of some experiments for the induction of Wiv-1 gene expression by sugars will be reported as well.

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To identify the genes responsible for grain filling, we compared the transcription profilling of genes in superior (SS) and inferior (IS) spikelets in rice on 1, 7 and 13 days after flowering using a microarray system. Genes involved in carbohydrate metabolism were mainly analyzed and classified into 3 groups according to their expression patterns. Group1 gene expression decreased accompanying the spikelet development. It includes starch- and sucrose- synthases, and sugar transporters. Their expression in IS delayed than SS, which may delay the spikelet development in IS. Group2 gene expression increased accompanying the spikelet development. It contains branching enzymes, glutelins and prolamins. They expressed higher in SS than IS. It might bring better grain filling in SS. Group3 genes which expressed higher in IS than SS include alpha-amylases. They catalyze starch degradation and may cause poor grain filling in IS.

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ペプチド性エリシターであるクリプトゲインは10 kDaの単量体タンパク質で，効果的にタバコ細胞に過敏感細胞死を誘導する．我々はこれまでクリプトゲインの構造や，他のエリシチンのアミノ酸配列と比較して，クリプトゲインの部位特異的変異体K13V，N93Aを作製し，細胞外液のアルカリ化や細胞死の誘導能について，活性の低下率が異なることを見出してきた．
最近，クリプトゲインは脂質と結合したものが細胞死誘導活性を持つことが報告された．このクリプトゲイン－脂質複合体の立体構造は脂質を包含するシリンダーのようであり，我々が注目したLys-13とAsn-93はこのシリンダーの両端に位置する残基である．
本研究では，変異体K13V，N93Aの細胞死誘導活性の低下率と脂質結合能に相関があるかを明らかにするため，蛍光プローブであるdehydroergosterolを指標としてクリプトゲインの脂質結合能を測定した．その結果，N93Aは野生型のおよそ半分に脂質結合能が低下していた．また，K13Vはほとんど脂質と結合しないことが示された．N93Aの細胞死誘導活性は野生型の39％，K13Vは野生型の11.5％に低下していることから，変異体の脂質結合能が細胞死誘導活性に影響していると考えられる．本講演では，さらにLys-13とAsn-93の立体構造上の位置からクリプトゲインの細胞死誘導機構を考察する．

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　イネ培養細胞系では，特定サイズ以上のキチンオリゴ糖（N-アセチルキトオリゴ糖）が，エリシターとして種々の生体防御反応を引き起こす．我々はこの系において，キチンオリゴ糖エリシター処理後数分で発現が誘導される2つのGRASファミリー遺伝子，CIGR1, 2 を単離した．これまでに両遺伝子は，活性型ジベレリン処理でエリシター処理と同様の発現が誘導されるが，不活性型ジベレリンでは誘導されないこと，オカダ酸やラベンダスチンAなどの阻害剤処理でジベレリンによる発現誘導のみが阻害され，エリシターによる誘導が阻害されないことなどを報告し，キチンオリゴ糖エリシターとジベレリンのシグナルが異なる経路を通り両遺伝子に伝達されていることを示した．今回，両遺伝子がイネ植物体でどのように発現しているのかを，in situ hybridization 実験およびノザン分析により解析した．キチンオリゴ糖エリシターもしくは活性型ジベレリンを4-5葉期のイネに噴霧処理し，葉身における両遺伝子の発現を調べたところ，処理後30分で有為な発現誘導が確認された．また，CIGR1は表皮の亜鈴型細胞に局所的に発現していること，CIGR2は葉肉細胞に全体的に発現していることがわかった．さらに，イネいもち病菌(Magnaporthe grisea) を接種したイネ植物体において両遺伝子がどのように発現しているかもあわせて報告する．

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我々は、植物病原菌Alternaria alternataの培養上清をタバコ培養細胞BY-2に作用させることで、キチナーゼおよびグルカナーゼが誘導されることを見出している。そこで本研究では、A. alternata培養上清中に含まれるエリシター活性成分の同定を目的として実験を行った。
A. alternata菌体培養液をオートクレーブ処理後、菌体を除去した。培養液の99%メタノール不溶画分を、除蛋白、アルカリ抽出、メタノールによる分別沈殿を行い、さらにゲルろ過によってエリシターの精製を行った。エリシター活性は、BY-2キチナーゼの誘導活性を指標とした。
分子量4,000以上の画分に得られたエリシター活性成分は、糖含有量が95%以上であり、200μg/mlで顕著なキチナーゼの誘導活性を示した。また、活性成分の構成単糖を決定するために、加水分解後TLCによる解析、および加水分解物のアルジトールアセテート誘導体を調製し、GC-MSによる解析を行った。その結果、活性成分はマンノース、グルコース、ガラクトースを含んでおり、A. alternata由来エリシターはこれらを構成単糖とするヘテログリカンであることが推定された。現在、本エリシターの詳細な構造解析を行っている。

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タバコ培養細胞BY-2に対して、Alternaria alternataの培養上清を作用させた際に、細胞内外に複数のキチナーゼアイソザイムが誘導されることを既に見出している。今回我々はBY-2グルカナーゼに注目し、BY-2に対して、A. alternata培養上清及び12種類の化学的ストレスを作用し、細胞内β-1,3-グルカナーゼ酵素活性を測定した。
酵母懸濁液を基質に用い活性を測定した結果、A. alternata培養上清により顕著なグルカナーゼ活性の上昇が認めたれたほか、サリチル酸、ラミナリンなど数種の化学物質によっても誘導が確認された。また、ジャスモン酸、アブシジン酸処理による誘導は認められなかった。A. alternata培養上清により誘導されるグルカナーゼ活性は、処理後12～24時間で活性の上昇が確認され、約60時間で活性は最大となった。A. alternata培養上清よって誘導されるBY-2キチナーゼの活性が3時間で最大となるのに対し、グルカナーゼは異なる応答パターンを示した。現在、これらストレス応答を遺伝子発現レベルで解析するために、既知のタバコグルカナーゼの塩基配列を元に、BY-2よりグルカナーゼcDNAのクローニングを行っている。

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イネに対して非親和性であるAcidovorax avenae　N1141株のべん毛構成タンパク質フラジェリンは、イネ培養細胞に対して過敏感細胞死や抵抗性関連遺伝子の発現などの抵抗性反応を特異的に誘導する。本研究では、イネにおけるフラジェリン認識機構を解明することを目的として、フラジェリンの認識部位に関する解析を行った。はじめに、シロイヌナズナにおいてエリシター活性をもつことが知られているフラジェリンN末端部分の保存された配列より作られたペプチド（flg22）とA. avenaeでflg22部分に相当するペプチドを作成し、イネ培養細胞に処理したところ、共にエリシター活性を示さなかった。次に、様々なドメインごとに分けたフラジェリン断片を作成し、そのエリシター活性について解析を行った。その結果、フラジェリンのC末端部分の断片をイネ培養細胞に処理したときにのみ活性酸素や抵抗性遺伝子の発現が誘導され、イネはシロイヌナズナとは異なる認識システムを有していることが示唆された。そこで、イネに存在するフラジェリン認識物質を明らかにすることを目的として、フラジェリンのイネミクロソーム膜画分に対する結合実験を行った。BS³で架橋化されたタンパク質を抗フラジェリン抗体によって検出した結果、約45kDaのフラジェリン結合タンパク質が確認された。現在、この45kDaタンパク質について解析をすすめている。

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　単子葉植物を宿主とする植物病原細菌Acidovorax avenaeのイネ非親和性菌株はイネ培養細胞に過敏感細胞死や抵抗性関連遺伝子の発現等の抵抗性反応を特異的に誘導するのに対し、親和性菌株はこのような抵抗性反応を誘導しない。我々はこれまで、イネによるこの菌の特異的認識と抵抗性反応誘導に、この菌のフラジェリンやType III分泌機構によって輸送されるhrpY、hrpWが分子パターンとして関与していることを明らかにしている。そこで本研究では、イネの抵抗性反応誘導における個々の分子パターンの関与を明らかにするため、非親和性菌株のフラジェリン、hrpY、hrpW、hrc (Type III)のそれぞれの欠損株を作製しcDNAマイクロアレイを用いてこれら認識物質の下流に存在する遺伝子群の解析を行った。それぞれの菌接種0.5、1、2、3、4、5、6時間後のイネ培養細胞からmRNAを精製し、独自に構築したイネcDNAマイクロアレイ（3353クローン）を用いてそれぞれ遺伝子の発現変動を調べた。その結果、非親和性野生株接種によって誘導される遺伝子の中で、フラジェリン欠損株で約8%、hrpY欠損株で約4%、hrpW欠損株で約2%、hrc欠損株で約23%の遺伝子の誘導が消失していることが明らかになった。現在、個々の分子パターン認識シグナルの下流で制御される遺伝子について詳細な解析を行っている。

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植物の本質的な防御機構を解明するため、ニホンナシに感染する病原糸状菌Alternaria alternata Japanese pear pathotypeとシロイヌナズナを用いて研究を行った。A. alternataをシロイヌナズナ葉に接種したところ、胞子は葉上で発芽して付着器を形成し、penetration pegを形成したが、植物細胞内へ侵入することは出来ず、感染は成立しなかった。これに対して、植物は菌の侵入を感知し、速やかにパピラを形成したが、活性酸素の生成や、過敏感細胞死等の過敏感反応を示さなかった。一方、cDNAマイクロアレイを用いてA. alternataの攻撃に対するシロイヌナズナの発現遺伝子の網羅的解析を行った。その結果、128の遺伝子が菌接種により発現誘導され、86遺伝子が発現抑制された。本報告において、これら遺伝子群の防御応答における役割について考察する。

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In rice, the small GTP binding protein OsRac1 is thought to play a key role in defense signaling by regulating NADPH oxidase, which generates reactive oxygen species (ROS) during oxidative burst. The expression of a metallothionein, OsMT4, an ROS scavenger, was reduced in rice cultured cells that overexpress the constitutive active form of OsRac1. Transgenic plants that overexpress OsMT4 showed increased susceptibility to bacterial blight and blast fungus. Furthermore, OsMT4-overexpressing cells showed reduced elicitor-induced hydrogen peroxide (H₂O₂) production. In contrast, Tos17::OsMT4 insertional mutant and RNAi-OsMT4 transgenic cells, which were deficient in OsMT4 expression, showed increased elicitor-induced H₂O₂ production compared to the wild type cells. Furthermore, in vitro assay showed that recombinant OsMT4 protein possesses superoxide scavenging activity. OsMT4-GFP fusion protein was localized at the cytosol indicating, OsMT4 functions primarily in the cytosol. The results suggest that OsRac1 downregulates OsMT4 expression, thereby potentiating ROS accumulation and disease resistance.

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Plants respond to various biotic stresses by activating NADPH oxidase to generate reactive oxygen species (ROS) which are used to kill invading pathogens directly or to trigger defense signaling, or both. Although, rboh genes encoding NADPH oxidase have been cloned from various plants, the molecular regulatory mechanism of NADPH oxidase activation remains to be understood. In our previous studies, a small GTP-binding protein, OsRac1, was shown to regulate NADPH oxidase-dependent ROS generation in the rice cells during defense response. In the present study, we report that OsRac1 could interact with plant rbohs in yeast two-hybrid system. In addition, a sphingolipid elicitor, which induces OsRac1-dependent ROS production in rice cell cultures, was able to induce rboh mRNA expression. We will discuss the possibility of NADPH oxidase as a downstream target of OsRac in plant defense signaling.

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MAP kinase (MAPK) cascades are major components downstream of receptors or sensor that transduce extracellular stimuli into intracellular response. In plant, MAPK are activated by abiotic stress and by pathogen. A MAPK cascade functions downstream of the elicitor receptor FLS2 in Arabidopsis, and tobacco MAPKs are involved in reactive oxygen species production, cell death and defense gene activation. Rice MAPK genes are induced by rice blast (Magnaporthe grisea) and fungal elicitor, however little is known about MAPK cascade and disease resistance.
We are characterizing a new rice MAPK quickly activated by rice blast elicitor in cell culture and by incompatible rice blast infection in plant. This MAP kinase shows high homology to the plant NtSIPK and AtMPK6 involved in cell death and disease resistance. Therefore we are using multiple approaches (transgenic plants, transient assay) to further investigate the role of this MAPK in cell death and defense signaling in rice.

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　これまでに我々はブラシノライド(BL)処理が植物の病害抵抗性(BDR; brassinosteroid-mediated disease resistance)を誘導することをタバコ、イネ、アラビドプシスで明らかにした。アラビドプシスにおける作用機構の解析から、BDRは全身獲得抵抗性(SAR)の下流で働くNPR1タンパク質を介して誘導されることが示された。しかし、BL処理ではSARマーカー遺伝子の発現は誘導されず、BDRはSARとは異なる機構で誘導されていることが明らかとなった。Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000の感染はPR-1の発現を誘導するが、これはBL処理により促進された。これは、BLが植物のprimingを誘導していることを示している。また、BDRはecotype Col-0とLandsbergには誘導されるが、エチレン非感受性ecotype WS-0とRLDには誘導されなかった。エチレンの非感受性突然変異株ein2においてもBDRは誘導されなかった。以上の結果から、BDRの発現にはエチレンが重要な機能をしていることが示唆され、現在BDRにおけるprimingとエチレンの関連性について検討している。

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植物の自己防御反応の1つである全身獲得抵抗性（SAR）は、病原菌感染の刺激からサリチル酸(SA)生合成を介して全身に誘導されて二次感染に対して免疫的に働く。これまでに数種の低分子化合物がSAR誘導化合物として見出され、SAR誘導機構の解析に有効な分子プローブとなることが示されている。我々は、新たにピラゾール誘導体がSARを活性化して病害抵抗性を誘導することを明らかにしたので、その作用機構について解析を行った。本化合物は、タバコ、アラビドプシスにおいて強い病害抑制効果を示し、SARの分子マーカーであるPR遺伝子の発現を誘導した。また、SA内生量の上昇させたことから、SAよりも上流に作用していることが明らかになった。アラビドプシスについてマイクロアレイ解析を行った結果、遺伝子の発現誘導パターンは類似の作用機構を有するプロベナゾール(PBZ)とは異なっており、新規の作用点を有するSAR誘導化合物であることが示唆された。

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Hypersensitive cell death plays a critical role in the plant defense system, constituting a major component of HR to restrict pathogen multiplication. Screening early responding genes during HR against TMV infection, we identified that encoding ornithine decarboxylase (ODC). Subsequent analyses showed not only ODC but also other genes involved in polyamine biosynthesis to be up-regulated, resulting in accumulation of polyamines in apoplast of TMV-infected leaves. Treatment of inhibitors for polyamine biosynthesis reduced the rate of HR and accumulation of polyamines. These results suggested polyamines to have critical role(s) in HR. This was experimentally confirmed, showing that H2O2 was generated in leaves infiltrated with polyamines. Further analyses revealed that accumulated polyamines were indeed degraded by polyamine oxidase detected in apoplast. It was concluded that, when HR is triggered, polyamines are synthesized, transported to apoplast, and degraded to induce H2O2, eventually resulting in hypersensitive cell death.

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　光合成電子伝達系のシトクロムfとP700の間では，プラストシアニン（PC）とシトクロムc₆（Cyt.c₆）のどちらかが電子伝達体として働いている．高等植物などにはPCが存在し，紅藻や褐藻などにはCyt.c₆が存在する．一方，緑藻やシアノバクテリアでは銅を含む条件で培養するとPCをつくり，銅を含まない条件ではCyt.c₆をつくる種が知られており，その切り替わりの仕組みに興味が持たれる．
　今回，緑藻Eudorina elegans Ehrenberg var. elegans NIES-456におけるPC遺伝子の構造と発現について調べた結果を報告する．（1）PCとCyt.c₆が培地中の銅濃度に依存して切り替わることをSDS-PAGEとウェスタンブロット法で確認した．（2）他の緑藻のPC遺伝子の塩基配列をもとに作製したプライマーを用いたPCRと3' RACEによりPC遺伝子の部分塩基配列を決定した．Eudorina PCの推定アミノ酸配列は，緑藻Chlamydomonas reinhardtiiのPC配列と最も高い相同性を示した．（3）銅添加および無添加のVT培地で培養した細胞から全RNAを抽出し，PCR産物をプローブとしてノーザンブロット分析を行ったところ，銅無添加条件では銅添加条件に比べてmRNA量は大きく減少していた．また，銅無添加条件ではmRNAバンドが低分子量側に広がっていることから，mRNAの分解によりPC量が調節されている可能性が示唆された．

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　緑藻クラミドモナスは、環境中のCO₂濃度変化を感知して、複数の遺伝子発現を調節する。炭酸脱水酵素遺伝子Cah1の発現調節変異株を用いて、CO₂応答の機構を明らかにしようと考えた。Cah1のmRNAは低CO₂条件（0.04％）で蓄積し、高CO₂条件（5％）では蓄積しない。また、この発現には通常光照射が必要である。さらにCO₂応答に関わる発現調節領域を既に見い出している(1)。DNAタギング法によって単離した株I39は、Cah1を含む複数の低CO₂誘導性遺伝子の発現が5％のCO₂条件で抑制されなかった。しかしCO₂濃度を15％まで上げると、これらの遺伝子の発現を抑制できたので、I39株は無機炭素の絶対量を検知する所に問題があった。また本来、発現に光が必要であるCah1遺伝子が、I39株では暗所でもCO₂濃度の低下に応答して誘導された。これらのことから、I39株の原因遺伝子はCO₂の絶対量の検知に関わるだけでなく、光シグナルの伝達に関わることが示唆された。I39株へのタグの挿入は複数あったが、これらは同一染色体上に存在し、表現型と連鎖していた。1) Kucho et.al. Plant Physiol. (1999) 121: 1329-1337.

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無機炭素濃縮機構は、光存在下でCO₂欠乏の際に誘導される。CCMの誘導は光強度に対してどの程度依存するのかを知るために、光強度とCO₂濃度を変化させて、光合成速度と無機炭素に対する親和性を測定した。1.2％ CO₂条件では、光強度を上げるに従って、無機炭素に対する親和性が上昇した。cDNAマクロアレイを用いて、光とCO₂の変化に応答した遺伝子発現を網羅的に調べた。クラミドモナス細胞を5% CO₂、120μEm^-2s^-1であらかじめ培養し、光強度を1000μEm^-2s^-1に変化させた。また、CO₂欠乏条件には0.04% CO₂の通気を行った。 両ストレス処理後、0.3, 1, 2, 6時間後の各サンプルからRNAを抽出しアレイ実験に用いた。391遺伝子の発現が変化し、132遺伝子が強光応答性を、317遺伝子が低CO₂応答性を示した。強光応答シグナルと低CO₂応答シグナルのクロストークについて議論する。

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無機炭素濃縮能をもつ生物における光呼吸の重要性はこれまで明らかではなかった。Phosphoglycolate phosphatase(PGPase)は、光呼吸経路の最初の反応生成物であるphosphoglycolateをglycolateへ変換する。その変異株pgp1は高CO₂要求性を示す。これは低CO₂でphosphoglycolateが蓄積し、光合成が阻害されるためと考えられてきた。しかし同時にCCMが誘導されていない可能性もあった。そこで、pgp1でのCCM関連遺伝子の発現を調べるために、cDNAマクロアレイを用いて低CO₂条件下での遺伝子発現を網羅的に調べた。pgp1では低CO₂条件で誘導されなくなった遺伝子(Ccp1:葉緑体胞膜タンパク質遺伝子)や、誘導はされるが発現レベルが低下した遺伝子（Mca：ミトコンドリア炭酸脱水酵素遺伝子）が認められた。影響を受けたこれらの遺伝子がpgp1の高CO₂要求性に関与している可能性が考えられた。またCah1のように変異の影響を受けなかった遺伝子も存在した。今回、光呼吸系の主要酵素の変異が多くの遺伝子の発現レベルに影響を与えることが明らかになった。

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珪藻は、地球全体の炭素固定の約25％と言われている。カーボニックアンヒドラーゼ（carbonic anhydrase : CA）は、炭素固定を行う上で重要な役割を担う因子の一つである。本研究では、海洋性珪藻Phaodactylum tricornutumを用いて、CO₂と光によるCA発現の影響と、CAの局在性を調べた。光照射下あるいは暗下で、HighCO₂環境成育細胞をAir環境へ24時間順化させたところ、mRNA・タンパク質レベル共に光の有無に関係なく発現量は増大したが、光存在下の方が発現レベルは高かった。HighCO₂細胞をAir環境へ5日間順化させたところ、約24時間周期で発現の増減が見られ、また、時間の経過とともに発現量が増加する傾向が見られた。これらの結果から、CAは環境CO₂濃度変化が発現の引き金になり、光は発現量を促進すること、発現は細胞周期と関わっていることが考えられる。CAの局在を見るために、CA前駆体のN末端46アミノ酸配列をGFPの上流に連結したキメラコンストラクトを同細胞内に発現させ解析を行ったところ、葉緑体に存在することが分かった。

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　藻類は、水圏における炭素固定に重要な役割を果たしていると考えられている。無機炭素濃縮機構（CCM）は、藻類細胞が無機炭素に対して極めて親和性の高い光合成を行うために中心的な役割を果たす機能である。本研究では海洋性珪藻の一種Phaeodactylum tricornutumの細胞内β型carbonic anhydrase (CA ; EC 4.2.1.1)が、生育環境中のpCO₂変化に鋭敏に反応して発現制御を受けることに注目し、この遺伝子プロモーターの解析を行った。Inverse PCRにより単離したCA上流領域にGUS遺伝子をつなげたコンストラクトを作製し、パーティクルガンで細胞に導入した。その結果、大気レベルのpCO₂環境で生育した細胞では、5％pCO₂環境で生育した場合と比較して約15～25倍程度のGUS活性の上昇が見られた。現在上流配列を欠失させたレポーターコンストラクトの導入により、生育環境中のCO₂濃度変化に応答した遺伝子発現調節に必要なシス領域の解析を行っている。

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哺乳類のNa⁺/胆汁酸輸送体（NBT）に対して、アミノ酸レベルで高い相同性もつ遺伝子がシロイヌナズナやイネで見つかっている。それらの機能については未知であるが、昨年度本学会で京都大学の山口らは、NBTホモログと思われる遺伝子の発現が、Flaveria属のC3型種に比べC4型種で高くなっていることを報告した。このことはこのNBTホモログがC4経路と何らかの関係を持つ可能性を示唆している。
我々は、通性多肉植物型酸代謝（CAM）植物アイスプラント（Mesembryanthemum crystallinum）のESTデータベースに、NBTホモログに由来すると思われるESTを複数見い出した。そこで、この遺伝子（McNBT）の全長cDNAを単離しその塩基配列を調べたところ、418アミノ酸残基をコードするORFを持ち、シロイヌナズナで存在するNBTとは72%の相同性が見られた。また、その高次構造を予測すると、8個の膜貫通ドメインと思われる領域が見い出された。さらにC3型とCAM型のアイスプラントの葉と根を用いて、mRNAレベルを半定量的RT-PCR法により調べたところ、CAM化によりMcNBTの葉での発現レベルが大きく上昇した。一方、根ではCAM化と関係なく低いレベルでしか発現していなかった。現在、大腸菌中でこの遺伝子を過剰発現させて、そのタンパク質の機能の解析を進めている。

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　葉におけるRubisco量の変動は、光合成機能、窒素経済と深い関わりを持つ。イネ葉のRubisco含量は、展開中の窒素栄養レベルにより大きく左右される。本研究では、イネ葉身を材料に、窒素栄養レベルとRubiscoの遺伝子発現の関係を探ることを目的とした。イネ（Oryza sativa L. cv. Notohikari）をその第8葉身の出葉直後から異なる窒素濃度（多、標準、欠）の培養液に移して栽培を続けた。第8葉身におけるRubiscoの合成量、rbcS , rbcL のmRNA量は窒素栄養処理に応答して速やかに増加し、窒素レベルによらず、両者共に処理開始の翌日には最高値を示した。そして、それらの値は窒素栄養レベルに従ったものであった。その一方で、rbcS 及びrbcL DNA量には、これらmRNAに見られた程の窒素栄養レベルによる差違は認められず、最高値を示した時のrbcS及びrbcL mRNAに対するrbcS及びrbcL DNAの量比は、窒素供給量が多いほど大きかった。以上の結果は、葉身の完全展開以前における窒素栄養レベルに応答したrbcS及びrbcL
mRNAの量的変動が、rbcS及びrbcLのテンプレート（DNA）量によって一義的には支配されていなことを示唆している。

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　葉の老化過程においてRubisco量の減少は葉緑体数の減少よりも先だって起こっている事から、Rubiscoは葉緑体内か、もしくは葉緑体外に排出されて分解されると考えられている。本研究では、コムギ葉の老化過程におけるRubiscoの量的変化と細胞内における局在の変化を調べることにより、Rubiscoが葉緑体外で分解される可能性について検討した。
　免疫電顕法による観察の結果、老化葉においてはRubisco-LSUが葉緑体ストロマだけでなく、細胞質に存在する直径0.4-1.2 μmの小胞にも局在していることがわかった。このRubiscoを含む小胞 (Rubisco-Containing Body, RCB) は、急速凍結置換法により作成した試料においても観察された。RCBにはRubisco以外にもストロマタンパク質であるGS2が局在していたが、チラコイド膜タンパク質であるLHC II, Cyt f, CF₁は局在していなかった。また、葉緑体からストロマ画分を囲い込んだ包膜の突出が観察されたことから、RCBは葉緑体由来であることが示唆された。RCBの数は、葉の一生においてはRubisco量が減少をはじめる老化初期に増加していた。これらの結果よりRCBが葉の老化過程において、Rubiscoを分解のために葉緑体外へ運び出す役割を担っている可能性が示唆された。

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酸性雨が植物の光合成機能や生育に及ぼす影響については現在にいたるまでに多くの研究がなされている。しかし、酸性ではないほぼ中性の降雨が光合成機能に大きな影響を与える場合があることはあまり知られていない。例えば、雨滴が付着しやすい表面構造をもつインゲンの葉では、葉面が濡れるとすぐに光合成機能が30％ほど低下し、濡れが長期間に及ぶと顕著な成長阻害が生じることが分かっている。本研究では、ストレス要因として葉面の濡れに注目し、人工降雨装置を使って光合成機能や成長の低下を引き起こすメカニズムを明らかにすることを試みた。その結果、インゲンの葉面の濡れによる光合成機能の低下は、酵素Rubiscoの量が減少することが原因である可能性が高いこと、また濡れによってRubiscoの分解が促進されていることが分かった。すなわち、葉面の濡れによる光合成機能低下は、従来考えられていたような気孔要因だけではなく、光合成の機構そのものの変化によって引き起こされていることが明らかになった。

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　Sink-limit状態でのサツマイモsource-sinkモデル植物の光合成低下はRuBPcaseに活性阻害物質が結合することに主に起因し、その物質は既知のRuBPcase活性阻害物質と同様に糖リン酸であると示唆された（岩船ら昨年度学会）。
　この活性阻害物質の構造決定と作用機構の研究にはこの物質の大量精製を行う必要がある。材料には温室で栽培したサツマイモの茎にガードリング処理を施し、その葉を用いた。この葉中の同化産物量は大きく増加し、光合成速度は低下し、RuBPcaseのtotal activityも低下したが、maximum activityは未処理の植物体とほぼ同じ高い値を示した。この結果から、ガードリング処理を施した植物体でもモデル植物と同様、sink-limit状態になることが明らかとなった。葉を過塩素酸ですりつぶした阻害物質を含む粗抽出液に活性化したRuBPcaseを加えて阻害物質を結合させた（Parry et al.1994）。その後、阻害物質の結合したRuBPcaseを回収し、変性させて阻害物質を分離した。この方法によってSink-limit状態で形成されるRuBPcase活性阻害物質の高純度精製が可能になった。

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夜間の呼吸がイネの乾物生産に与える影響を明らかにするため、夜温のみ異なる環境下で植物を生育させ（高夜温区 27℃、対照区 22℃、低夜温区 17℃）、個体の乾物生産量と個体のCO₂ガス交換速度を栄養生長期と登熟期で比較した。昼温は 27℃、光条件は 1000 μmol m^-2 s^-1、相対湿度は 60%とした。
　栄養生長期では、夜温の高い方が乾物生産量は増加した。光合成から呼吸を差し引いた個体当たりの1日における正味の同化量は夜温の高い方が大きかった。夜温が高いことは生育初期の葉面積の増加に関係していた。一方、低夜温区では乾物生産量は減少した。夜間の呼吸によるCO₂の放出は抑えられたが、光合成の減少も大きく正味の同化量は減少していた。
　登熟期については、開花 7日前（止葉完全展開時）から処理を開始し、高夜温区と対照区を設定した。その結果、乾物生産量には両区でほとんど差がなかった。登熟期でも夜温が高いと夜間の呼吸は促進されたが、光合成の増加量はそれよりも大きなものであった。これは、高夜温区では葉の老化が遅れ、生葉の葉面積が維持されることで個体の光合成速度の減少が小さかったためであった。このように夜温が高いことは最終的な乾物生産量には影響を与えなかったものの、呼吸の促進につながり、葉の老化の遅れが生葉面積の維持に関連するものであることが示唆された。

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　我々は短い根を持つ新しい突然変異株SS93を単離した。この変異株では、根端のみならず茎頂のメリステムでも細胞列が乱れ、葉序および葉の形態の異常や花茎の帯化が観察される。ゲノム情報を用いた原因遺伝子の精密マッピングを行ったところ、原核生物のDNAポリメラーゼIのポリメラーゼドメインと、ヘリカーゼに保存されたモチーフの両方を持った単一ポリペプチドをコードする、4番染色体上の遺伝子に欠失変異が見つかった。このような構造を持つタンパク質はこれまでにショウジョウバエやヒトなどでみつかっている。ショウジョウバエのホモログをコードするmus308遺伝子の欠損株は、DNA鎖間架橋剤に対して高感受性になることから、MUS308タンパク質はDNA鎖架橋の修復に関与すると考えられている。
　SS93変異株の表現型は分裂組織の形態異常を見せるfasciata(fas)突然変異株に類似している。FAS遺伝子は遺伝子発現を制御するクロマチン重合因子(CAF-1)のサブユニットをコードしており、これまでの動物での知見から、CAF-1はDNA修復および複製に関わると考えられているので、我々はSS93とfasの原因が部分的に重なっているのではないかと考えている。今後は、SS93における細胞分裂への影響の観察および発現の解析を行う予定であり、その結果についても報告したい。

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　我々はオーキシンを介した側根形成の分子機構を解明することを目的として、側根を完全に欠失するシロイヌナズナの優性変異体solitary-root（slr）と原因遺伝子IAA14（オーキシン誘導性Aux/IAA遺伝子）の解析を行なってきた（Fukaki et al., Plant J. 2002, 29, 153-168）。本大会では、slrの側根欠失表現型を抑圧するサプレッサー変異体ssl2（ suppresor of slr 2）の解析結果について報告する。ssl2は単一劣性変異で、これまで独立に4つの変異体アリル（ssl2-1～ssl2-4）を単離した。 ssl2 slr二重変異体では、slrの側根欠失表現型が一部回復し、側根を形成するが、slrの他の表現型（根毛形成異常・重力屈性異常）の回復がみられない。この結果から、SSL2遺伝子は側根形成特異的にSLR/IAA14と遺伝的に相互作用すると考えられる。SSL2遺伝子座の高精度マッピングにより、ssl2-1～ssl2-4変異体すべてにおいてAt2g25170遺伝子に変異を見い出した。At2g25170遺伝子は、SWI2/SNF2 ATP-dependent chromatin remodeling factor のCHDサブファミリーに属するCHD3(Chromodomain-helicase-DNA-binding3)/Mi-2ホモログで、CHR6/PICKLE/GYMNOSと同一産物をコードしていた。この結果から、オーキシンを介した側根分裂組織形成にクロマチン再構築因子CHR6/SSL2/PKL/GYMが関わることが示され、植物の根系構築における新たな制御機構の存在が強く示唆された。

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一般に、組織培養におけるシュート形成は、再分化能の獲得（脱分化）、シュート形成の誘導、シュートの形態形成と生長の3つのステージから成ると考えられている。AP2/ERFクラスの転写制御因子であるシロイヌナズナESR1は、シュート形成時に一過的に発現が誘導されること、強制発現により、シュート形成効率が飛躍的に上昇することなどから、ESR1はシュート形成の開始を制御していると考えられている。我々は、ESR1の発現誘導からシュート形成に至る分子機構を明らかにするために、ESR1のターゲット遺伝子の検索を行っている。エストロゲンを培地に添加することにより、ESR1を強制発現できる形質転換シロイヌナズナを用いて、シュート形成過程において、エストロゲンを加えた時に特異的に発現量が上昇するcDNAライブラリーをサブトラクション法により作製した。野生株では、ESR1はシュート形成時に一過的に発現が誘導されることから、ESR1のターゲット遺伝子も野生株では、同時期、あるいはやや遅れて発現が誘導されると考えられる。現在、そのような発現パターンを示す遺伝子をサブトラクションライブラリーから検索している。また、in vitroにおいてESR1が結合するDNA配列が決定されているので、それらの遺伝子のプロモータ中にESR1の結合配列があるかどうかもESR1のターゲット遺伝子かどうかの判断基準になる。

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　花では、つぼみの段階で花弁、雄ずい、雌ずいの3つの器官はがく片に覆われている。これはがく片が進化の上で生殖器官である雄ずい及び雌ずいの保護器官として発達してきたことを反映していると考えられる。また花芽分裂組織から花器官が形成される際、まず4枚のがく片が形成された後に残りの花器官原基が形成される。この器官発生順序からもがく片が保護器官として機能していることが推測できる。
　がく片が保護器官として機能するには、つぼみを覆うことができる幅を維持することが必要と考えられる。fl51突然変異体ではがく片が細くなり、つぼみの段階でがく片間にすき間が生じる。また成熟したfl51突然変異体の花では野生型に比べがく片が長くなっている。がく片のアイデンティティには異常が見られないことを考え合わせると、FL51遺伝子はがく片の横方向と基部－先端部方向の発生機構に関与することが考えられる。
　これまでの解析から、FL51遺伝子は1番染色体の上腕に存在することが分かった。表現型の解析から考えられるFL51遺伝子の機能及びクローニング経過について報告する。

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　我々は単子葉植物であるイネにおける花器官決定機構の解明に向けて解析を進めている．まず初めのアプローチとして，心皮が雄蘂へとホメオティックに転換する dl 変異体に着目し，これまでの報告で DL は転写因子をコードする YABBY ファミリー遺伝子であり，心皮の予定領域および原基で特異的に発現することを明らかにした．
　今回我々は，イネ花器官決定機構における DL および ABC 遺伝子間の相互作用に関して分子遺伝学的解析を行ったので報告する．ホメオティック変異体や形質転換体を用いたこれら遺伝子の発現解析により，DL はクラス B 遺伝子と転写レベルで相互に負に制御しあい，心皮決定に必要不可欠な機能を持つ事を明らかにした．また クラス A 遺伝子により負に制御される可能性，そしてクラス C 遺伝子とは独立もしくは下流で機能する可能性が考えられた．
　DL が心皮決定に重要な機能を持つ一方，クラス C 遺伝子の心皮決定における役割，DL との相互作用については興味深い問題であり，現在クラス C 遺伝子の機能喪失系統の単離を進めている．

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食用アスパラガスの花はwhorl1と2に花弁状の花被を形成する同花被花植物である。同花被花の花被形成メカニズムについてはModified ABCモデルが提唱されており、このモデルによるとBクラス遺伝子がwhorl2、3だけでなくwhorl1まで発現することにより、whorl1においても花弁状の器官を形成すると説明される。しかし、このモデルが全ての同花被花の花被形態形成を説明できる普遍的なモデルであるかはまだ明らかではない。そこで本研究では形質転換が可能である食用アスパラガスを用いて、Bクラス遺伝子の単離を試みた。その結果、1種類のDEF-like遺伝子（AODEF）と2種類のGLO-like遺伝子（AOGLOA, AOGLOB）が単離された。サザンブロット解析の結果、これらの遺伝子は全て単一コピーであることが確認され、ノーザンブロット解析の結果、花だけで特異的に発現することが明らかになった。さらに、in situ hybridizationによる花発達における発現パターンを調べた結果、食用アスパラガスのBクラス遺伝子はwhorl 2と3のみで発現が観察され、whorl1においてはシグナルが検出されなかった。これらの結果から、食用アスパラガスの花被形態形成はModified ABCモデルでは説明できず、食用アスパラガスのBクラス遺伝子は花被形態形成には関与しない可能性が示唆された。

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温度は種子の発芽にとって重要な環境シグナルとなっている。冬型一年性であるシロイヌナズナの種子発芽は夏の高温で抑制され、秋の低温により誘導される。私達は、アブシジン酸（ABA）合成阻害剤がシロイヌナズナ種子の高温阻害を緩和すること、種子のABA感受性が高温条件で高まることなどから、高温阻害にはABA合成の制御とシグナリングの制御の両者が関与することを示唆してきた。そこで、ABA関連遺伝子の発現に対する高温の影響を定量PCR法により調べた。ABA合成を担うZEP、NCED、ABA2、AAO3の発現は、いずれも22℃では34℃よりも低いレベルとなり、34℃では吸水12時間以降に顕著な誘導が認められた。ABAシグナリングに関わるABI3とABI5遺伝子の発現は22℃で低下したが、34℃では顕著に誘導された。したがって、シロイヌナズナ種子ではABA合成とシグナリングに関わる遺伝子の高温による発現誘導が、ABA量の増加とABA感受性の昂進をもたらしていると考えられる。

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種子の発芽は、種子自身の休眠性と周囲の環境条件により決定される。温度は発芽を決定する重要な環境要因であり、シロイヌナズナ種子の発芽は高温で阻害され、低温処理で促進される。温度による発芽調節に関わる遺伝子を見出すことを目的として、シロイヌナズナ種子における遺伝子発現をマイクロアレイにより解析したところ、活性型ジベレリン合成の最終段階を触媒するGA3酸化酵素（GA3ox）遺伝子の発現が、常温（22℃）に比べて高温（34℃）で明らかに低下していることを見出した。定量PCR法を用いた発現解析により、AtGA3ox2の発現は22℃に比べ34℃で大きな低下が認められた。発芽時のGAシグナリングに関わるRGL2遺伝子の発現は、常温では吸水12時間をピークに大きく低下したのに対し、高温では24時間後まで増加し、48時間後まで高いレベルを維持した。したがって、高温で吸水したシロイヌナズナ種子では活性型GA合成の抑制とGAシグナリングを負に制御する因子の蓄積が起こり、これらが発芽の高温阻害に寄与していると考えられる。

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