シロイヌナズナ TCP10 遺伝子は、高等植物に固有の DNA 結合ドメインである TCP ドメインを持つ蛋白質をコードしている。TCP 遺伝子群は高等植物の器官の生長制御を通じて植物個体の最終的な形態決定に関与すると考えられており、その分子機構に興味が持たれている。TCP10 遺伝子の生物学的機能を解明するため、T-DNA 挿入変異株 tcp10-1 を単離した。この変異のホモ接合体は芽生え、葉柄、花茎や花器官において顕著な矮性形質を示す。変異体の花茎は野生株の約 1/8 程度にまで短縮するが、細胞の大きさや形状には特に異常は認められない。芽生えの胚軸においても表皮細胞の細胞数の減少が認められ、矮性表現型の原因が細胞伸長の欠如ではなく、細胞数の減少にあることがわかった。核内倍数性解析から、tcp10-1 変異体は野生株に比べて倍数性核の割合が減少しており、細胞分裂活性の低下を示唆する。一方で TCP10 過剰発現体は倍数性核の割合が増加し、胚軸表皮細胞の伸長、ひいては胚軸自体が伸長する表原型を示した。TCP10 遺伝子の発現は、発生後期の胚全体、本葉、茎頂分裂組織や花芽分裂組織などの分裂活性の高い部位で認められた。以上の結果は TCP10 遺伝子産物が、細胞周期の G1/S 移行に必要な因子であり、細胞分裂活性を正に調節することで植物の生長を制御するものであることを示唆する。

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　植物のさまざまな現象を司る遺伝子制御ネットワークにおいて、多数の遺伝子が分子遺伝学的手法等により単離され、またその機能が上位下位検定を中心に解析されている。しかしながら、このようなネットワークにおいて因子間の直接的な関係はあまり見出されていないことから、ネットワーク解明には相互作用因子の探索・機能解析が必須であると考えられる。本研究では茎頂分裂組織の遺伝子制御機構解明を目的とし、花成抑制因子TFL1に注目、その相互作用因子探索を行った。
　多くの方法があるなか、直接的な因子の単離方法として生化学的手法を選択することにした。大腸菌で発現させたGST融合型TFL1を固定したカラムに花序分裂組織抽出タンパク質を吸着させ、イオン強度の上昇に伴うカラムの洗浄によりTFL1相互作用タンパク質を解離・溶出させた。シロイヌナズナから花序分裂組織の大量調製は困難なことから、アミノ酸配列の相同性が非常に高いカリフラワーを初発材料として用いた。溶出タンパク質の泳動パターン比較からTFL1特異的に結合するタンパク質をLC-MS/MSにより同定した結果、Argonaute familyに属するタンパク質とtwo-hybrid法で既に獲得されていた14-3-3タンパク質であった。現在、前者の機能について解析を行っている。

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Arabidopsis terminal flower2 (tfl2) mutant shows an early-flowering phenotype in a day-length independent manner. Molecular cloning has revealed that TFL2 encodes a nuclear protein homologous to HP1, which is known to mediate heterochromatin formation and transcriptional repression of several euchromatic genes. We have shown that upregulation of a flowering gene FT causes the early flowering of tfl2, suggesting that TFL2 functions to regulate flowering time by repressing FT expression during non-inductive conditions. By using FT promoter::GUS transgenic plants, we found that the expression patterns of FT in tfl2 were less affected. Thus it is suggested that TFL2 functions to maintain low levels of FT expression during Arabidopsis development. It remains unclear, however, how the repression by TFL2 is cancelled when FT is activated. To address this question, we are now investigating the effect of TFL2 on FT activation by a direct transcriptional activator CONSTANS.

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　我々はフラベリアおよびシロイヌナズナより基本転写因子TAF10を単離し、解析を行っている。TAFsはTFIID複合体の構成因子であり、TFIIDを介した転写開始に必須と考えられていたが、近年いくつかのTAFが組織・時期特異的な発現を示すことが明らかとなっている。我々はこれまで、TAF10が植物において維管束組織に強い発現を示すこと、シロイヌナズナの35SプロモーターによるTAF10異所的過剰発現体が、未熟葉の大量発生などの形態異常を示すことを明らかにしてきた。
　今回我々は、シロイヌナズナを用いたTAF10 promoter :: GUS形質転換植物の解析により、TAF10のより詳細な発現解析を行った。その結果、胚軸の上部に恒常的な強い発現が観察された。また、側根、ロゼット葉、花芽、花弁、雄蕊、雌蕊、胚珠、種など様々な組織の分化・発生段階において一過的な発現を示すことが明らかとなった。この結果は、植物のTAF10がこれらの器官における発生の一時期において特定の遺伝子の転写に関与することを示唆している。また、T-DNAタグラインにより得られた複数のTAF10発現抑制系統から、花成遅延や抽台時に複数の花茎が形成されるなどの表現型が観察された。これらの結果をまとめ、TAF10の機能に関する最新の仮説を報告する。加えて、in situ法によるTAF10の詳細な発現場所の解析結果もあわせて報告する。

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　植物の研究は全ゲノム情報が明らかになっているモデル植物・シロイヌナズナを中心にして進んでいる。今後は他の植物種においても、ゲノム解析と突然変異体解析を両立しえるモデル植物を指定し研究を進め、シロイヌナズナで得られている知見と比較検討することで、植物共通の分子機構、種特異的な制御機構を明らかにし、進化や種の多様性の研究に発展させていくことが重要になっていくと考えられる。
　マメ科植物ミヤコグサは、ゲノムが比較的小さく遺伝子導入法も確立しており、研究成果がダイズなどの有用植物に適用できることなど、シロイヌナズナの次の双子葉モデル植物として最近世界的に注目されている。しかしながら、ミヤコグサの育成管理には比較的整備された温室と人手が必要であり、突然変異体株の作成及び突然変異体選抜が困難なことがミヤコグサを用いた研究が進まない大きな原因となっている。
我々は現在ミヤコグサ突然変異体群の作成及び形態形成異常突然変異体の選抜を進めている。これらの突然変異体を一般に広く公開することによって、日本の植物基礎研究の基盤整備に少なからず貢献できるものと考えている。当日は、単離した形態異常突然変異体の報告及び今後の公開予定について話を行う。

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ニコチアナミン合成酵素(NAS)によって合成されるニコチアナミンは全ての高等植物に必須である。我々はトウモロコシから3つのnas遺伝子(zmnas)を単離し、解析した。興味深いことにZmNAS2タンパク質は部分的に重複したNAS配列を持っていた。zmnas1とzmnas2は根においてのみ発現しており、その発現は鉄欠乏によって誘導され、鉄の再添加によって抑制された。一方、zmnas3は恒常的に葉で発現しており、発現量は鉄欠乏によって減少し、鉄の再添加によって増加した。鉄欠乏によるnas遺伝子の地上部での発現抑制は初めての知見である。ウェスタンブロッティング解析により、ZmNAS1とZmNAS2は鉄欠乏状態のトウモロコシの根において主要なNASタンパク質であることが分かった。in vitroでのNAS活性測定を行ったところ、ZmNAS1とZmNAS3は活性を示したが、ZmNAS2は活性を示さなかった。タマネギの表皮細胞においてGFPとの融合タンパク質を発現させ，ZmNASタンパク質の細胞内局在を調べた。ZmNAS1-GFPとZmNAS2-GFPは細胞質中の小顆粒に局在していたが、ZmNAS3-GFPは細胞質内全体に存在していた。以上のZmNASの性質の違いは異なるNASによって合成されるニコチアナミンが，それぞれ異なる役割を担っていることを示唆するものである。

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　植物脂質を構成するトリエン脂肪酸は、環境ストレスに対する適応反応に重要な役割を果たしている。しかし、これらは主に双子葉植物での知見であり、単子葉植物でも共通して同様のメカニズムを持つかどうかは不明である。本研究においてはイネにおけるトリエン脂肪酸の役割を明らかにするため、トリエン脂肪酸の合成を触媒するω-3デサチュラーゼ遺伝子（FAD）のクローニングと機能解析を行った。イネにおいては、サザン解析の結果から、FADをコードする遺伝子が3つ存在することが示唆されている。イネのゲノムデータベースを検索したところ、シロイヌナズナのFAD遺伝子と相同性の高い3つの読み枠が見つかった。それぞれのゲノミックおよびcDNAクローンの全配列を決定し、一次構造を比較したところ、そのうちの1つは既知の小胞体局在型OsFAD3だった。残りの2つはシロイヌナズナAtFAD7に対し推定アミノ酸配列で73％、78%と高い相同性を示し、ともにN端にAtFAD7と相同性のあるシグナルペプチド領域を持っていた。また、この2つの遺伝子のmRNAは、根組織よりも葉組織で顕著に蓄積していることから、葉緑体局在型のFADをコードすると考えられた。これらのFAD遺伝子をOsFAD7-1、OsFAD7-2と名付けた。現在RNAiの手法を用いてFADノックアウト株を作製しており、それらの解析結果もあわせて報告する。

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高等植物の生体膜脂質にはトリエン脂肪酸が特徴的に多く含まれている。この脂肪酸は、傷害ストレスに対する応答および温度環境の変化に対する適応において重要な役割を果たしている。トリエン脂肪酸の生成は膜内在性酵素であるω-3デサチュラーゼにより触媒される。シロイヌナズナではこの酵素をコードする3つの遺伝子が同定されており、FAD3 が小胞体局在型、FAD7 およびFAD8 が葉緑体局在型のアイソザイムをそれぞれコードしている。これらの遺伝子は各種環境ストレスに対し、mRNAレベルにおいて異なった発現応答を示す。しかしながら、酵素活性の生化学的検出および特異抗体の作製における困難さゆえに、ω-3デサチュラーゼのタンパク質レベルにおける制御に関してはほとんど明らかにされていない。われわれは翻訳後におけるω-3デサチュラーゼの動態解析を行うために、c-Mycエピトープタグを融合した改変型FAD3、FAD7、FAD8酵素を設計し、それぞれを発現する形質転換シロイヌナズナを作製した。ω-3デサチュラーゼの欠損変異体の表現型相補により、これらの改変型酵素が内在の酵素と同等レベルの活性を持つことが確認された。本研究では、上記形質転換シロイヌナズナを利用し、傷害および温度ストレスに伴うω-3デサチュラーゼタンパク質の量的変化を解析した。mRNAレベルにおける発現解析との比較から得られた知見について報告する。

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CO₂は濃度依存的に気孔の開閉を誘導する因子であり、例えば低CO₂条件下では気孔は開口し蒸散量が上昇し葉面温度が低下する。このような植物におけるCO₂感知のメカニズムを調べるために、CO₂濃度依存的な葉温変化に異常をきたしたアラビドプシス突然変異体を単離した。このうち野生株よりも高温を示す2つのht 変異体(high leaf temperature mutant)について現在解析をおこなっている。ht1 変異体はCO₂濃度の上昇に対し過敏な葉温変化を示し、ht2 変異体はCO₂濃度変化にあまり依存せず常に高温を示す。また、見た目の表現型もht1 とht2 では異なりht1 は野生株と区別がつかないのに対しht2 は花軸が短く、成長が遅い。マッピングによる解析の結果ht1 は1番染色体に、ht2 は5番染色体に位置することが明らかとなった。ht2 は引き続き詳細なマッピングを進めているところであり、ht1 は絞り込んだ候補遺伝子の相補性検定を行っているところである。更なる表現型の解析についても報告を行う。

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　高等植物は病原菌感染に対して、O₂^-生成を端緒とした過敏感反応を引き起こすことにより抵抗性を示す。O₂^-生成はNADPH oxidaseにより行なわれると考えられているが、その調節機構はよくわかっていない。我々は2002年分子生物学会年会においてリノレン酸がNADPH oxidaseの活性調節に関与することを報告した。トリエン脂肪酸であるリノレン酸は、生体膜脂質を構成する主要な不飽和脂肪酸である。in vitroのNADPH oxidase活性測定系において種々の不飽和脂肪酸について調べた結果、リノレン酸は顕著にNADPH oxidaseを活性化した。シロイヌナズナにおいて、トリエン脂肪酸合成の鍵酵素であるω-3不飽和化酵素は、小胞体型FAD3、葉緑体型FAD7、FAD8の3つが同定されている。NADPH oxidaseを活性化するオゾン処理によりin vivoでのO₂^-生成を調べたところ、fad7fad8変異体においてO₂^-生成レベルが低下していた。また、fad7fad8変異体におけるPseudomonas syringae pv. maculicola (avrRps4)に対する抵抗性が低下していた。さらに、オゾン処理によって葉緑体脂質のトリエン脂肪酸含量が著しく低下した。これらの結果から、葉緑体のリノレン酸が過敏感反応におけるNADPH oxidaseの調節に重要な役割を果たすと考えられた。

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我々は、オゾンによる植物の障害の機構を明らかにするため、オゾン感受性突然変異体を用いて研究を行っている。突然変異原処理を行ったシロイヌナズナCol gl1 180000個体及びWs-2 13000系統から、オゾン暴露時の可視障害を指標として、9系統の突然変異体を選抜した。まず、これらの突然変異体の他のストレス要因に対する感受性を調べた。低温、強光、パラコート（除草剤）、二酸化硫黄ガス及び紫外線でそれぞれ処理したときの突然変異体の可視障害を野生型と比べたところ、オゾンと紫外線以外の4つのストレス要因に対する感受性は様々で、異なった組み合わせのパターンを示すことが分かった。このことから、オゾン感受性の原因は単一ではなく、複数であることが推察された。更に、Colバックグラウンドである4系統の突然変異体の分子マーカーを用いたラフマッピングでは、原因遺伝子の座乗染色体はそれぞれ異なることが示された。
オゾンによる障害には、傷害ホルモンであるエチレンが関与していることが知られている。Colの突然変異体におけるオゾン暴露中のエチレン生成量を測定したところ、野生型よりもやや高いエチレン生成量を示すものが2系統あった。これらの系統では高いエチレン生成によりオゾン障害が促進されていると考えられる。一方、障害を防ぐ抗酸化物質であるアスコルビン酸含量には、突然変異体と野生型との差は見出されなかった。

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オゾンに植物が暴露されると、植物の生体内で活性酸素を生じ障害を引き起こすことが知られているが、詳細な機構は未解明である。そこで、本研究では、オゾンに対し、野生型よりも感受性の高い突然変異体を用いて、オゾン感受性の原因となる遺伝子を探索し、その機能を調べることにより、植物の環境ストレス応答および耐性機構を解明することを目的とした。
シロイヌナズナ突然変異体（ T-DNAタギングライン ）の中から、野生型と比べオゾンにより可視障害がでやすくなっている個体を選抜した。そのうちの一系統について、植物の傷害に関わるホルモンであるエチレンの生成量の測定を行ったところ、野生型よりもオゾン暴露時におけるエチレン生成量が高いことがわかった。また、植物の防御反応に関わることが知られているジャスモン酸の感受性を根の伸長によって調べたところ、この変異体は、野生型と比べ、ジャスモン酸に対する感受性が低いことがわかった。そこでこの変異体をoji1 (Ozone-sensitive, Jasmonate-Insensitive 1)とした。低濃度のジャスモン酸スプレーにより、オゾン暴露時におけるエチレン生成量およびイオンの漏出が野生型においてのみ抑えられた。
以上の結果からoji1 のオゾン感受性の原因は、ジャスモン酸を感受できないことにより、オゾン暴露時のエチレン生成が抑制されないためであることが示唆される。

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短日植物であるアサガオ(Pharbitis nil Choisy, strain Violet)の花芽誘導の分子メカニズムを調べるため、子葉で花芽誘導特異的に発現する、DnaJドメインのみを持つシャペロン様タンパク質遺伝子PNJ1を単離した。このcDNAの3’非翻訳領域には、mRNAの不安定化に働くとされるDSTコンセンサス配列が存在し、厳密な発現調節が示唆されたため、光による発現調節を詳細に調べた。子葉のPNJ1 mRNA発現は暗条件で誘導された。暗処理開始直後に、PNJ1 mRNA発現レベルは一過的に増加した。さらに連続暗条件を続けるとPNJ1 mRNAレベルは、主観的夜に最大になる概日リズムを示した。一方、暗所で蓄積したPNJ1 mRNAは白色光照射により速やかに減少した。赤色光と青色光は、PNJ1 mRNAの減少に対して異なる作用を示した。連続赤色光によりPNJ1 mRNAレベルは一過的に減少するものの、その後回復した。赤色光照射直後のPNJ1 mRNAの半減期は約4.3分と極めて短かかった。これに対し、連続青色光ではPNJ1 mRNAレベルが徐々に減少し、最終的にほとんど消失した。以上より、白色光照射によるPNJ1 mRNA減少は、赤色光と青色光の作用の和で表わせることが示された。

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　陸上植物は環境に応じて様々な反応を示す。様々な反応のうちの一つに陽葉・陰葉の分化があげられる。陽葉は明るいところ、陰葉は暗いところで形成される葉であり、両者を比較した研究は数多くなされてきた。その結果、陽葉は光合成に関わるタンパク量が陰葉よりも多く、また葉や柵状組織の厚さが陰葉よりも厚くなっている等の事実が明らかになっている。
　我々はすでに、新しくできる葉の形態は成熟した葉の光環境に依存して決定されていることを報告した（Yano & Terashima (2000), 1pD16）。しかし意外なことに、発生過程は詳細には記載されていない。そこで今回は、陽葉と陰葉の発生過程を詳細に解析した結果を報告する。
　材料には一年生草本植物のシロザ Chenopodium album L. の、発芽直後から強光または弱光下で（360 or 60 μmol quanta m^-2 s^-1 PPFD）栽培した植物を用いた。また、葉身の長さが安定する第10葉以降のものを解析の対象とした。GA-Osの二重固定後、Spurr樹脂に包埋、厚さ1 μm の横断ならびに並皮切片を作成し、切片画像から各種の測定を行った。
　データの評価には相対的な葉齢の指標となるLPI（Leaf Plastochron Index）を用いて比較した。

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地上部に白色光を照射したとき、遠赤色光に富む光が植物体内を通って根まで到達する。したがって土壌中の根の光環境は、昼夜で遠赤色光から暗闇へと変化すると考えられる。しかし、このような場合の遠赤色光の役割についてはあまり研究が行われておらず、根における遠赤色光誘導遺伝子の報告もほとんどない。そこで、遠赤色光が根の遺伝子発現に与える影響を調べるために、理研シロイヌナズナ完全長cDNAマイクロアレイ（約7000個の完全長cDNAクローンを含む）を用いて、暗順応、及び遠赤色光により誘導される遺伝子の網羅的な解析を行った。16L8Dの日長条件で育成したシロイヌナズナ（Ler）に対して、3日間の暗順応処理を行ったところ、42の遺伝子の転写産物が3倍以上増加した。この中には既知の暗誘導遺伝子（UBQ3）が含まれていた。一方、暗順応した植物にFRを4時間照射した場合には、3倍以上増加した遺伝子はなく、2倍以上増加した遺伝子もわずか17であった。このうちの一部の遺伝子は遠赤色光でわずかに誘導されることがノーザン解析でも確認された。したがって、遠赤色光により根で誘導される遺伝子は少数でその変化率も小さいことが示唆された。現在さらに多数の遺伝子のノーザン解析を進めており、その結果をあわせて報告する。

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植物の根は、重力のみに従って地中に伸長していくのではなく、土壌の水分や養分などを探索し、また物理的刺激である土壌の硬さや質、間隙の大きさなどを感知して、よりよい環境を主体的に求めて成長していくと考えられる。そこで、本研究では根の土壌の硬さに対する認識応答の分子機構を解明する目的で、シロイヌナズナの根の硬軟認識検定法を用いて突然変異体の選抜・解析と、AFLP-based mRNA fingerprinting (AMF)法による接触屈性関連遺伝子の探索を行った。
　濃度の異なるphytagel培地を上下二層に積層したのち、上層表面にシロイヌナズナを播種し、実生の根が上層から濃度の高い下層培地に到達したときに境界面で屈曲するか、あるいは下層を貫入するかどうかで硬軟認識の判定を行った。この硬軟認識検定法を用いて、T-DNA挿入種子約5,000個体から突然変異体の選抜を行ったところ、野生株とは異なる貫入率を示す2つの変異候補株を得た。現在候補株の遺伝性ならびに変異表現型解析を行っている。
　また、この検定法を用いて、より硬い下層培地に接触する前の野生株の根と、接触直後の根、および接触後上下二層の境界面で屈曲した根から、それぞれのcDNAを調製し、AMF法により発現パターンを比較検討した。接触時、または屈曲時に特異的な発現を示すバンドについては、ノザンブロット解析により再現性を確認し、現在、配列の決定したバンドについて接触屈性との関わりを検討している。

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Root of higher plants takes different growth patterns in response to environmental stimuli; for example, Arabidopsis root on the surface of agar plates at an angle of 45^o to the vertical exhibits a wavy growth pattern that is caused by periodic reversion of rotation of the root tip. This is thought to be an obstacle-escaping response. Previously we found that some terpenoids, plant volatiles, induce accumulation of defense genes in plant tissues. Here we report that a monoterpene induce Arabidopsis roots being placed in a vertical position to take wavy growth pattern similar to obstacle-touching stimulus. It induces more wavy growth pattern on root being placed at 45^o than 90 ^o. It has little effect on the gravity sensitivity, auxin accumulation and cell division at the root tips. Other monoterpenes, of which chemical structures are similar to the volatile, induce expanded root tip but not wavy pattern.

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　アブシジン酸（ABA）は、種子形成時において種子貯蔵物質の合成を促進し、種子形成後は種子の休眠を保つ働きをしている。このような、ABAの生理作用はABA量とABAのシグナル伝達の相互作用によって調節されている。その相互作用の中心的な制御機構のひとつがABA生合成のフィードバック制御である。ABA生合成のフィードバック制御機構を明らかにするために、シロイヌナズナのABA非感受性変異体abi3, abi4,abi5を用いて、種子のABA量を調べた。その結果、abi3欠失変異体種子でABAの増加が見られた。さらに、ABI3タンパク質には3つの保存領域（B1, B2, B3）があり、それぞれのドメインのアミノ酸置換変異体の種子におけるABA量を調べた。B2,B3ドメインに変異を持つabi3変異体においてABA量が増加していたが、B1ドメインに変異を持つものでは野生型と比べて有意なABA量の増加は見られなかった。また、abi5変異体においても、乾燥種子でABA量が増加していた。一方、abi4変異体では、乾燥種子のABA量に変化はなかったが、種子の吸水過程において、ABA生合成遺伝子の発現が顕著に減少していた。これらの結果から、種子におけるABA生合成の正の制御因子としてabi4が関与しており、負の制御因子としてabi3,abi5が関与していることが示唆された。

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アブシジン酸（ABA）は、種子の成熟および休眠性の獲得と維持に重要な役割を果たしており、種子発芽時にABAを添加すると発芽遅延や発芽阻害がおこる。しかし、ストレス応答に関連したABA 誘導性遺伝子に比べて、この発芽阻害における遺伝子発現の変化についての知見は非常に乏しい。そこで、種子休眠のメカニズムを理解する一歩としてシロイヌナズナの種子を3 μM ABA存在下で吸水させ、DNAマイクロアレイ(Affymetrix)および定量的RT-PCRを用いて遺伝子の発現解析を行った。その結果、吸水24時間後では通常の吸水との遺伝子発現の違いは小さく2倍以上の差異を示すものは約500遺伝子であり、それらの発現レベルは比較的低い部分に集中していることが明らかとなった。発芽の過程で発現が誘導されるGermin遺伝子などは、ABA存在下で誘導が抑制されるものが多く、反対に発芽の過程で発現レベルの下がる種子貯蔵タンパク質遺伝子などでは減少が緩やかになるものが多かった。また、これまで様々な植物種でABA活性を有することが示されているアナログの(-)-(R)-ABAを用いて同様の実験を行ったところ、(-)-(R)-ABAが天然型と似たメカニズムで ABA誘導性遺伝子を活性化していることが示唆された。

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　我々はこれまでにシロイヌナズナにおける4つのアルデヒド酸化酵素（AAO）遺伝子のうちのAAO3がABA生合成の最終段階の反応に関与する事を明らかにしてきた。aao3突然変異体は葉が萎れやすいというABA欠損の特徴的な表現型を示す。これに対しaao3種子では内生ABA量は野生型に比べて減少しているものの、顕著な休眠性の低下がみられない。このため、種子におけるABA生合成に主要な役割を持つAAOの検討を行った。aao3種子はジベレリン合成阻害剤であるウニコナーゾール存在下で発芽する事ができ、種子登熟期のaao3長角果ではABA生合成の鍵酵素であるNCED遺伝子の発現が顕著に増加していた。これに対し種子登熟期に発現量が最も高いAAO4遺伝子の突然変異体の種子においてはウニコナゾール存在下での発芽、内生ABA量、ABA合成酵素遺伝子の発現量はいずれも野生型と同程度だった。さらにAAO1、AAO2はアブシジンアルデヒドの酸化活性をほとんど持たない事からAAO3が種子におけるABA合成にも主要な役割を果たしている事が考えられた。しかしながらaao3突然変異体の表現型はモリブデン補酵素の欠損により全てのAAOの機能を失っているaba3突然変異体よりも弱い事から、複数のアルデヒド酸化酵素遺伝子内での機能重複性が予想される。現在、AAO遺伝子の二重突然変異体の作成を進め更に詳細な検討を加えている。

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アブシジン酸（ABA）は、乾燥、高塩などの環境ストレス応答に関わる植物ホルモンとして知られている。我々はこれまでに、シロイヌナズナアルデヒド酸化酵素の一つであるAAO3が、ABA生合成の最終段階を触媒することを明らかにしてきた。AAO3はその発現量が植物の葉の乾燥処理によって急速に誘導される事から、ストレスに応答したABA生合成に重要な役割を果たしている事が考えられる。本研究ではストレスに応答したABA生合成におけるAAO3の役割、さらには植物のストレス応答機構を明らかにする一端として、AAO3遺伝子発現調節の解析をおこなった。AAO3は、乾燥、浸透圧の増加によって主に地上部（葉）において発現誘導されたが、これらの処理は根におけるAAO3遺伝子発現には大きな影響を与えなかった。これに対し、塩（NaCl）処理は根におけるAAO3の発現を有意に誘導した。さらに、AAO3の地上部と根における発現はABAによっても誘導された。これらのことは異なるストレス条件下においてAAO3遺伝子の発現が器官特異的に複雑に制御されていることを示唆している。また、AAO3遺伝子上流域には、既知のストレスもしくはABA誘導性のシス配列が存在しない事から、植物のストレス応答における新たな遺伝子発現制御機構が存在すると考えられた。現在、詳細な発現制御機構を解明するため、プロモーター解析を進めている。

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アブシジン酸（ABA）は種子の成熟から植物体の乾燥や塩ストレスへの応答やその耐性の獲得まで、多岐にわたって働くことが知られている。しかし、ABA情報伝達経路およびその制御機構については未だ不明な点が多い。本研究ではABA情報伝達経路の解明を目的とし、遺伝学的手法によるABA関連突然変異体の単離を試みた。
ABA認識が変化した突然変異体の探索を目的として、ABA類似化合物（ARI）存在下でABA応答を示す個体のスクリーニングを行った。ARIはABA分解阻害剤としての働くことが予想されたため、今回のスクリーニングには内性ABA含量が低下したaba2-1変異体に変異を導入した種子を用いた。この結果、6個体の変異体候補を得た。これらの変異体候補は、野生型が発芽できる程度のABA濃度下でも発芽が抑制されることから、ABA高感受性変異体であると思われる。現在、これらが新規の変異であるかを調べている。また、分子シャペロンであるHSP90がDrosophilaにおいて遺伝的多様性の緩和に働くことが示されている。そこで、HSP90の働きを阻害することにより表現型として現れる変異があると考え、HSP90阻害剤存在下でABA関連突然変異体のスクリーニングを行った。その結果についても報告する。

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アブシジン酸(ABA)は、種子登熟、気孔の閉鎖や環境ストレスに対する応答機構に関わることが知られている。我々はこのような重要な作用を持つABAの情報伝達経路の一端を明らかとするため、遺伝学的手法を用い、解析することにした。これまでに、種子発芽において、ABA高感受性を示す8個のahg変異体(ABA hypersensitive germination,　昨年の本大会でair (ABA inhibitor responsive)と報告したが、このシンボルはすでに使用されていることが判明し、ahgと改名)を単離した。これらのうち、表現型が比較的強いahg1,2,3は、Colでは発芽可能な0.3μM ABA存在下において発芽せず、ahg4,5もahg1,2,3ほどではないがABAに対し、感受性を示した。さらにahg1～4についてSSLPマーカーを用い、マッピングを行ったところ、これらは新奇ABA高感受性変異体であると示唆された。
　現在、他の要因(NaCl,KCl,mannitol,glucose,sucrose)による発芽への影響や、他の植物ホルモンにより、根や胚軸の生長に影響があるか詳細に解析を行っている。また、マッピングによる各AHG遺伝子座の同定も試みている。

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乾燥ストレスによる遺伝子発現調節機構を明らかにするため、シロイヌナズナの乾燥誘導性遺伝子RD22遺伝子の転写調節機構について研究を行っている。RD22遺伝子は乾燥ストレスによって増加した植物ホルモンのアブシジン酸(ABA)を介して誘導される。RD22遺伝子のプロモーターにはABA Responsive Element(ABRE)が存在せずMYC認識配列及びMYB認識配列がABAを介した乾燥応答性のシスエレメントとして働いている。これまでに、これらのシス配列に結合するMYC相同性因子AtMYC2とMYB相同性因子AtMYB2を単離し、両因子を共に過剰発現させた形質転換植物ではABAに対する感受性が増すこと、RD22遺伝子が過剰に発現することを明らかにした。更にAtMYC2遺伝子破壊植物ではABAに対する感受性が減少し、RD22遺伝子の発現が抑えられていた。今回我々はcDNAマイクロアレイ解析を行い、AtMYC2とAtMYB2の制御下にある遺伝子群を明らかにした。AtMYC2とAtMYB2のABAシグナリングにおける役割について考察する。

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メロンCMe-ACS2遺伝子はアラビドプシスのマルチレスポンス型ACC合成酵素遺伝子（At-ACS6）とアミノ酸レベルで相同性が高く、CMe-ACS2も同様に種々の刺激に応答することが示唆される。我々はメロンの葉に様々な処理を行い、CMe-ACS2遺伝子の発現を調べたところ、傷害及び低温、NaClといったストレス処理により発現が誘導されることが分かった。また我々はCMe-ACS2のプロモーター領域に存在するオーキシン応答エレメント（TGTCTC）の近傍に、ストレス応答エレメント（GCCGAC）があることを見いだしていた。このDRE/CRTを含む40bpの領域で酵母ワンハイブリッド法を用いてcDNAライブラリーからスクリーニングを行い、3種類の転写調節因子をクローニングした。これらはいずれもAP2/ERFDNA結合ドメインを持つタンパク質をコードし、AP2/ERFドメインのアミノ酸配列より、3つのうち1つはDREBサブファミリー、2つはERFサブファミリーに分類された。これらの転写調節因子がCMe-ACS2のストレス応答発現に関与しているかを検討する。

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　ACC合成酵素（ACS）はエチレン生合成経路の律速段階の反応を触媒する酵素で、発現は主に転写段階で制御されている。しかし、我々は翻訳後の制御を予測して解析した結果、トマトの傷害誘導性ACC合成酵素LE-ACS2のC末端がCa²⁺に依存してリン酸化されることを明らかにした。このリン酸化は酵素活性には影響を与えないが、リン酸化型のLE-ACS2の半減期が長く、非リン酸化型は半減期が短い、即ちタンパク質の代謝回転に関わっていることを明らかにした。
　そこで我々は、リン酸化による翻訳後制御機構を解明するために、LE-ACS2をリン酸化するprotein kinaseの同定を試みた。まず傷害処理をしたトマト果実からcDNAライブラリーをλZAPIIファージベクターで作製した。次にLE-ACS2が発現するように形質転換した大腸菌BL21に、このファージーライブラリーを感染させた。IPTGでcDNAとLE-ACS2を共発現させ、LE-ACS2のSer460リン酸化部位を認識する特異抗体を用いて、LE-ACS2をリン酸化するprotein kinaseをスクリーニングした。
　その結果、あるCa²⁺-dependent protein kinase (CDPK)がクローニングされた。このCDPKはエリシターやosmotic stressにより発現が誘導されるタバコのNtCDPK2とよく類似していた。現在、このCDPKの基質特異性などの生化学的性質や、発現様式を解析している。

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Although abscisic acid-β-D-glucopyranosyl ester (ABA-GE) had been known to be a physiologically inactive conjugated ABA, the putative compound causing the allelopathic effect of Citrus junos fruit peel was isolated and the chemical structure of the inhibitor was determined as ABA-GE. In addition, an ABA-GE-cleaving enzyme, apoplastic β-D-glucosidase, which releases free ABA from the ABA-GE conjugate pool in the plant tissues, was recently found. In this research, growth inhibiting activity of C. junos, C. unshiu and C. hassaku fruit peel and ABA-GE concentration in their peel were determined, and a good correspondence between ABA-GE concentrations in C. junos, C. unshiu and C. hassaku fruit peel and the inhibitory activities of their aqueous methanol extracts was found. These results coupled with the effectiveness of ABA-GE on inhibition of growth suggested that ABA-GE may play an important role in the allelopathic activity of C. junos, C. unshiu and C. hassaku fruit peel.

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Early developmental stage of rice (Oryza sativa L. cv. Koshihikari) seedlings was found to release a growth inhibitor, momilactone B into the neighboring environment from their roots. In the present study, the release level of momilactone B from rice seedlings during their interior life cycle was monitored. Release level of momilactone B was increased with the their growth. At day 15 after transferred to hydroponics, the level of momilactone B in the culture solution was 1.8 nmol per seedling compared with the endogenous level of 0.32 and 0.63 nmol per root and shoot, respectively, which suggests that rice seedlings may release momilactoneB into the culture solution actively. Release level of momilactoneB and its effectiveness as a growth inhibitor suggest that it may act as an allelochemical by inhibiting growth of neighboring plants, indicating that momilactoneB might play an important role in rice defense system against weed.

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低窒素条件下におけるキュウリの黄化阻害に対するABAの作用
井上淳也¹、岡真理子²、藤山英保²
（¹鳥取大院・農、²鳥取大・農）

　低窒素条件下で生育させた植物においては成熟葉から黄化が始まり、やがて植物体全体が黄化する。しかしながら、アブシジン酸（ABA）を添加すると葉の黄化阻害が認められた。この場合、添加したABAの濃度が高いほど無処理のものと比較してクロロフィル含量が増加しており、特にその効果は子葉において顕著であった。また、ABAの処理期間の影響を調べたところ、処理期間が2日間では無処理の場合と同様に植物体の黄化が認められた。しかしながら、2週間、4週間、6週間にわたってABAを処理したキュウリでは処理期間が長いほど黄化が顕著に阻害された。このことから、植物体の黄化は一過的なABAの影響により阻害されるのではなく、ABA が存在して作用することにより阻害されることが示された。低窒素条件下におけるこのようなABAの黄化阻害機構を明らかにするために植物体内の窒素含量を調べたところ、地上部・根ともに窒素量の増加が認められ、特に硝酸態窒素の増加が顕著であった。この結果から、低窒素条件下で生育させたキュウリにおいて、ABAは硝酸態窒素の吸収あるいは蓄積を促進することが示唆された。

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アブシジン酸(ABA)生合成系における9-シスエポキシカロテノイドジオキシゲナーゼ(NCED)を標的部位とする特異的生合成阻害剤の創製を目的として研究を行った。ABA生合成阻害剤の試験系にはホウレンソウの気孔開閉試験、ABA内生量測定とNCEDのin vitro 試験をあわせて用いた。また阻害剤によるRD29B::LUCシロイヌナズナ種子における発光阻害試験も併せて行い、最終的に新規阻害剤を見いだしアバミンと命名した。アバミンはNCEDの酵素活性を阻害していただけでなく、全ての生物試験系において内生ABAの作用を抑制する効果を示した。また実際にアバミン処理した植物のABA内生量も減少させていた。以上より、アバミンはABA生合成阻害剤であることを明らかにした。またアバミン処理したクレス中ではNCEDの基質を含むカロテノイドが蓄積されていること、シロイヌナズナ種子における高温処理による発芽阻害試験においても、アバミンの処理でもABA欠損変異体であるaba2-1とaba3-1と同等の発芽率を示すことを確認した。

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目的：アブシシン酸（ABA）は、8'-hydroxy-ABAを経てより安定なphaseic acid（PA）に異性化した後、dihydrophaseic acid（DPA）とepi-DPAにまで代謝される。植物中のABA濃度は生合成とともにこの代謝によって調節されている。したがって、代謝物質の定量も重要である。定量分析用の内部標準物質として、ABAでは3',5',7'位重水素化体が利用されている。しかし、PAやDPAsの重水素化体は報告されていない。そこで、これらの重水素化体の調製を目的とした。
方法と結果：[3',3',5',5'-²H₄]PAはジアゾメタン処理によって重水素が容易に脱落した。次に、8'-hydroxy-ABAとの平衡反応を利用してPAの7'位重水素化を試みた。PAをNaOD溶液で26日間処理後、短時間NaOH溶液処理により3',5'位重水素を除去し、[7',7',7'-²H₃]PAを得た。この重水素はジアゾメタン処理やpH 3-8の水溶液中でもほとんど脱落しなかった。DPAsの7'位重水素化体は[7',7',7'-²H₃]PAを還元することにより調製した。これらを内部標準物質として使うことにより、ABA代謝物質の正確な定量分析が可能となった。

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ycf33遺伝子は調べられた全ての葉緑体とラン藻に見出されている。さらに全ゲノム配列が決定されたA. thaliana の核にも存在していることが分かり、この遺伝子産物は全ての光合成生物の葉緑体に存在していると考えられる。Synechocystis 6803でこの遺伝子を欠失させた変異体は環状電子伝達系に影響が見られることを既に報告した。培養条件を変えたときの阻害剤の影響について報告する。
　環状電子伝達活性の指標となるDCMU存在下でのP700の再還元速度は野生株、突然変異体共大きな違いはなかったが、塩化水銀を加えると野生株、突然変異体ともに再還元速度にかなりの阻害が見られた。特に変異体のほうが低濃度でその効果が高かった。両者とも高濃度のCO₂ (3%)で培養した細胞を空気を通気して24時間培養するとその効果は低くなり、最初から空気で培養したものでは塩化水銀の効果がほとんど無くなったが、この割合は変異体のほうが大きかった。このことから高濃度のCO₂によって出現する、塩化水銀感受性の環状電子伝達経路が存在し、変異体ではこれが利用経路ではないかと考えられる。

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緑色硫黄細菌Chlorobium tepidumでは全ゲノム塩基配列がTIGRにより明らかにされたが、そこには酸素発生型光合成生物のferredoxin-NAD(P)⁺還元酵素（FNR）と類似性の高いタンパク質をコードする遺伝子は存在しなかった。われわれはこの細菌からFNR活性を持つタンパク質を精製しそのN末端アミノ酸配列を決定したが、このタンパク質は生理的条件下ではホモダイマーとして存在し、データベース検索から得られた推定アミノ酸配列は、NADPH-チオレドキシン還元酵素（TR）と相同性が高いなど、これまでに報告のない新たなタイプのFNRであることがわかった。ゲノムデータベースより、この細菌FNRと相同性の高いアミノ酸配列をもつ他の生物のタンパク質を検索した結果、ジスルフィド還元酵素群、特にTRと高い相同性を示す5つの遺伝子が見つかった。しかもこの5つの遺伝子は真正のTRとは異なり、チオレドキシン還元に必須な2つのシステインを含むモチーフを持っていなかった。この5つの遺伝子のうち、グラム陽性細菌Bacillus subtilisには2つの遺伝子が存在している。これらの遺伝子産物が緑色硫黄細菌同様にFNRとして機能している可能性を探るため、われわれはB. subtilisからFNR活性を持つタンパク質の精製を試みた。

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　ミトコンドリア内膜やバクテリアの細胞膜に存在する呼吸鎖複合体I（プロトン輸送性NADH脱水素酵素）は、酸化的リン酸化に重要な役割を果たしており、NuoEFGサブユニットを基質酸化部位とする0.5～1 MDaの超分子複合体である。シアノバクテリアや高等植物の色素体でも循環的光リン酸化や暗呼吸に複合体Iが働いているが、シアノバクテリアと色素体のゲノムはNuoEFG遺伝子を欠き、光合成系複合体Iのサブユニット構造と基質特異性は未だ明らかでない。本研究では、パプリカの赤色果実からミトコンドリアの混入の少ない有色体を単離し、チラコイド膜のNAD(P)H脱水素酵素の性質を検討した。
　チラコイド膜をシュクロースモノラウレートで可溶化後、陰イオン交換HPLCでNAD(P)H酸化活性を示す2つの画分を得た。FNRは両画分の間に溶出されることが免疫化学的に確認された。画分1のNADH酸化活性はpH 6～8の範囲でほぼ一定で、NADHとNADPHに対する親和性は0.97 mMで一致した。一方、pH 6.5に最大活性を示す画分2は、NADPHよりも3倍高い親和性をNADH (0.28 mM) に対して示し、見かけの分子量は非変性電気泳動で約0.4 MDa、ゲルろ過で約0.3 MDaと推定され、色素体複合体 Iと考えられる。現在、両画分の酵素の単離精製と基質特異性の検討を進めている。

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In cyanobacteria,respiratory and photosynthetic electron transport chains are closely linked each other. It has been demonstrated that several NAD(P)H dehydrogenases are involved in respiratory electron transport and/or cyclic electron transport around photosystem I. However, few of them have been purified and characterized, and some of them have not been identified. Native PAGE analysis revealed that thermophilic cyanobactrium Synechococcus vulcanus contains several NAD(P)H dehydrogenases. Among them, a 140 kDa band (NADH-specific dehydrogenase) and a 80 kDa band (NADPH-specific dehydrogenase) were increased in cells incubated under oxidative stress conditions. This result suggests that these enzymes play some role in protection against oxidative stress conditions, and that they are involved in cyclic electron transport around photosystem I. Both enzymes were purified by using the combination of anion exchange chromatography and electroelution from gel slices after native PAGE. Subunits composition and enzymatic property of these enzymes will be discussed.

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光エネルギ－を化学エネルギ－へ変換する光化学系は数多くのコファクタ－とサブユニットを含む複合体を形成する。そこでの光化学反応機構は詳細に解析され、複合体タンパクをコードする遺伝子のクロ－ニングや発現制御の解析も活発に行われてきた。さらに最近では、複合体の三次元構造の解析が大きく進展した。しかし、光化学系複合体の構成成分がチラコイド膜へ分子集合する機構はほとんど理解されていない。緑藻Chlamydomonas reinhardtiiで光化学系1の分子集合に必須であるYcf4タンパクは、1800kDaの複合体（Ycf4-複合体）の成分であり、Ycf4にTAP （Tandem Affinity Purification）タグを融合すると、アフィニティクロマトグラフィ－で精製できることをこれまでに示した。本研究では精製方法を改善し、得られたYcf4-複合体の構成サブユニットを同定した。まずドデシルマルトシドで可溶化したチラコイド膜からYcf4-複合体をショ糖密度勾配超遠心とイオン交換カラムにより部分的に精製した後、アフィニティクロマトグラフィ－で精製を行った。得られた最終標品には、28kDaのYcf4の他に15～68kDaのサイズの14以上のバンドが検出された。数多くのサブユニットを含むことはYcf4-複合体のサイズが大きいという実験結果と一致する。

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葉緑体ゲノムにコードされるYcf4は、光化学系1（系1）複合体のアセンブリーに必須のタンパクである。しかし、Ycf4タンパクが系I複合体の複雑なアセンブリー機構にどのように関与するかは不明である。本研究では、緑藻クラミドモナスのycf4遺伝子に部位特異的突然変異を導入し、系I複合体のアセンブリーが部分的に変異をもつクラミドモナスの形質転換体の作出を試みた。これまでにYcf4のN末端側から9と10番目、および17と18番目のアルギニンを正電荷のないグルタミンに一方ないし両方を置換した形質転換体（ R9Q、R10Q、R9/10Q、R17Q、R18Q、R17/18Q ）、Ycf4に2ケ所存在する膜貫通領域の間の親水領域の一部を欠失させた形質転換体、N末端側から2残基ずつ欠失させた形質転換体を作出した。これまでの解析の結果、R9とR10を置換した形質転換株では、LHCIを結合した系1複合体（PS1-LHC1 supercomplex）の蓄積量が減少していることが分かった。Ycf4は系1のコア複合体ばかりでなく、LHC1が系1コア複合体へ結合する過程にも関与することが示唆された。その他の形質転換体の系1複合体の分子集合が受けた影響を報告する予定である。

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強光応答に関する変異株を単離することを目的とし、シアノバクテリアSynechocystis sp. PCC 6803について、強光条件下で蛍光カメラを用いてクロロフィル蛍光挙動を測定し、野生株と異なる挙動を示すΔsll1961を単離した。この株について、弱光および強光下で24時間培養後、パルス変調蛍光法を用いて光合成状態を調べた。強光培養したΔsll1961株では、励起光照射直後の蛍光強度の上昇が遅く、光化学系Iの電子伝達活性が上昇している可能性が示唆された。そこで、弱光および強光条件下での培養24時間後に、液体窒素温度における蛍光スペクトルを用いて光化学系複合体の量比を調べた。弱光から強光に移すと、野生株では光化学系IIに対する光化学系Iの比が減少したが、Δsll1961はこの減少が抑えられた。以上の結果から、Δsll1961は強光下で光化学系IIに対する光化学系Iの量を減少させることができない株であることが明らかとなった。強光下で光化学系量比を調節するメカニズムについては全く知られていないので、この株を解析する事によってこのメカニズムを明らかにしたいと考えている。Sll1961はその配列の相同性から、転写調節因子をコードしている可能性が考えられ、現在、強光培養した野生株とΔsll1961についてDNAマイクロアレイを行なうことにより、そのターゲットを探索中である。

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［序、実験内容］Acaryochloris marina (A. marina)の光化学系1（PSI）はクロロフィルdを主要構成色素としている。我々は、A. marina PSIの励起エネルギー移動と電荷分離ダイナミクスをフェムト秒過渡吸収測定（励起波長630 nm）により調べ、クロロフィルaが主要色素であるPSIとの差異を報告してきた（昨年度の本年会等）。　本研究では、より詳細な励起エネルギー移動のダイナミクスを知り、かつ、励起移動の変化が電荷分離ダイナミクスに与える影響を理解するために、730nmの励起光を用いてA. marina PSIのフェムト秒過渡吸収測定を行った。また、比較のため、700nmの励起光を用いてspinach PSIのフェムト秒過渡吸収測定も行った。電荷分離ダイナミクスは、P740還元型サンプルとP740酸化型サンプルの差から見積もった。［結果］A. marina PSIにおける励起エネルギーの平衡化には3－5ピコ秒がかかるが、この時間領域でも励起波長に関わらず（電荷分離による）励起状態の実質的減衰が見られた。また、電荷分離中間体由来の過渡的な褪色信号（負の吸収変化）が680 nmに現れるが、これは、励起波長に関わらず、電子供与体クロロフィルP740の褪色より速く現れることがわかった。

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電子移動を伴う化学反応で生成した不対電子対（RP）は、熱平衡に到達するまでの間、合成スピン(S = 1)としてのスピン相関（スピン分極）を保つ。　通常は磁場中での各エネルギー準位のスピン数はボルツマン分布にしたがうが、相 関を示す生成直後の不対電子対ではスピン数が逆転した負温度状態を形成する。このため強い特徴的なESR信号を示し、レーザー閃光照射による光反応直後のRPスピンエコーは通常と比較してスピン回転平面で の位相が90°ずれたout of phase echoを示す。
　今回我々は、out of phase echoにパルスラジオ波を共鳴させることでラジカル対の信号中に埋もれたNMR信号の検出を試みた。　ホウレンソウ光化学系I（PS I）粒子の電子受容体鉄硫黄センター分子種をハイドロサルファイト添加で還元した後、80Kでのレーザー閃光励起により反応中心クロロフィルP700と受容体フィロキノンA₁のラジカル対（P700^-A₁^-を200マイクロ秒間生成させた。このラジカル対寿命に合わせてラジオ波を印加し、いくつかのNMR信号を検出した。この信号はP700分子のプロトンとA₁のプロトンのNMR信号の重ね合わせと考えられる。　また、このNMR信号はA.marina膜中PS Iでも観測され、ホウレンソウ中とは異なる信号パターンとして観測されている。　現在詳細を検討中である。

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Nostoc sp. KU001が窒素固定の為に分化させるヘテロシスト細胞(heterocyst)と、通常細胞(vegetative cell)の細胞毎の蛍光・吸収スペクトルと細胞内色素分布を、高分解能顕微分光法により調べた。heterocystとvegetative cellは色素組成が異なり、培養光条件に応じて各々補色適応を示し、細胞の色素組成が変わる。これを細胞毎に確認した。測定装置は、共焦点レーザー顕微鏡に分光器を配置し、冷却CCD（スペクトル測定用、－85℃）と冷却PMT（構造スキャン用、－30℃）で光を検出する。空間分解能0.2μm、波長分解能1nm以下で、フィラメントを構成する各細胞のスペクトル測定が可能である。同一培養光条件下でも、heterocystとvegetative cellのフィコビリンとクロロフィルの蛍光極大波長には差がある。各細胞は細胞サイズには無関係に、異なった蛍光・吸収スペクトルを示す。heterocystのPE（フィコエリスリン）、PC（フィコシアニン）含量はvegetative cellの半分以下で、PEの蛍光収率は高い。異なる培養条件下で得られた個々のheterocyst、vegetative cellの細胞内色素分布と蛍光収率を解析することで、細胞集団全体の平均値を見る従来型のマクロな分光法では得られない、細胞毎のゆらぎに関する情報が得られた。

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クロロフィルd (Chl d) を主要色素として酸素発生光合成を行なうAcaryochloris marina (A.marina) 生細胞を用いて熱発光測定を行なった。未処理試料熱発光は42℃付近にピークを示し、このバンドはDCMU存在下では減少し、21℃付近に新たなピークが出現した。これより42℃付近のバンドはS₂Q_B^-、21℃付近のバンドはS₂Q_A^-状態からの熱発光と考えられる。これを同じ条件下のシアノバクテリアSynechocystis PCC6803と比較するとS₂Q_A^-由来のピーク温度は3℃高く,S₂Q_B^-由来のピーク温度は15℃ほど高温側であった。Chl d をもつA.marinaの光化学系IIでは、Q_AとQ_B間のエネルギー差が大きい事を示していると考えられる。短波長カットフィルタを用いた実験よりA.marinaはホウレンソウよりも長波長側おそらく励起状態のChl dから熱発光を出すと考えられる。フラッシュ数に依存して熱発光バンドのピーク温度は変化した。これらの結果と遅延蛍光の実験データを理論式で解析し、熱力学パラメータを求め、酸化還元エネルギ－準位の評価、検証を行なった。

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　海産大型緑藻ミルは、共役二重結合に共役したケトカルボニル基を持つという特殊な分子構造をしたカロテノイド、シフォナキサンチン (Sxn) を光合成色素として持つ。色素−タンパク質複合体内では Sxn の吸収帯は約 30 nm レッドシフトし、この色素からクロロフィル(Chl) への高いエネルギー移動効率によって、緑色光しか届かない海洋環境でも高い光合成活性を維持できることが知られている。今回、エネルギー移動過程をフェムト秒蛍光アップコンバージョン法によって解析した。また特異な吸収極大である 530 nm の吸収帯がどのような分子機構によって形成されるかについて考察をした。
　その結果、(1) 530 nm 吸収帯は蛍光寿命から第2励起準位であること、(2) Sxn から Chl へのエネルギー移動は第1励起準位のみから起こり、フコキサンチンやペリディニンと共通であることも確認された。これによって量子収率が1に近いエネルギー移動効率が維持されていることが判明した。一方、530 nm 吸収帯に対応する蛍光の偏光度は 0.29 であるが、Sxn 溶液ではほぼ理論値に合致した 0.38 であることから、Sxn 間の相互作用による新しい電子状態の形成という可能性も考えられた。現在進行中の色素タンパク質の分光特性と併せて議論をする。

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アカリオクロリスは近赤外光を吸収するクロロフィルd(Chl d) と少量のChl aを30:1の比で持つ。系II反応中心でのChl dとChl aの役割を調べるために、光反応で電荷分離・電子移動が起こった後、逆反応の電荷再結合で発せられる遅延蛍光を測定した。光励起後0.1-2.9ミリ秒領域での発光をBecquerel型燐光計で測定し、これが720nmに発光ピークを示すChl d由来の遅延蛍光であることがわかった。レーザー閃光照射後1-100マイクロ秒での遅延蛍光も、720nmに発光ピークを示した。ミリ秒領域・マイクロ秒領域ともに、Chl aの寄与を示す680nm付近の発光ピークは確認されなかった。また、ミリ秒遅延蛍光の励起スペクトルはフィコビリンとChl dの吸収に対応する630nmと720nmに各々極大を示し、そのピーク比は1:1であった。フィコビリンとChl dの吸収スペクトルのピーク比は1:2であり、フィコビリンから反応中心へのエネルギー移動の効率を95％と仮定すると、見かけ上のChl dの励起効率は0.49と計算され、Chl dの約半分が系IIに属していることが示された。これは17％のChl aのみが系IIに属することが遅延蛍光から推定されるSynechocystis PCC6803とは大きく異なる。

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The inhibitory effects of formate on oxygen evolving PS II membranes as a function of formate concentrations and pH values were investigated by O2 evolution and EPR measurements. To investigate the inhibition of the donor side of formate-treated PS II, YZo decay kinetics were measured by time-resolved EPR. Different formate concentrations affect only light-induced intensities of YZo EPR signal, while the pH values affect both light-induced intensities and decay rates of YZo. Intensity is proportional to formate concentration and decay rate is faster on low pH side. At 260 K, t1/e value of YZo decay kinetics is about 10 s at pH 5.0 and about 20 s at pH 6.0, respectively.

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　花の模様の中でも広く親しまれているものに、花弁が地の色とは別の色で縁取られている「覆輪花」があり、その縁の部分は覆輪と呼ばれている。カーネーション (Dianthus caryophyllus) の花弁に含まれるフラボノイド系色素には、無色から淡黄色のフラボノール、赤から紫色のアントシアニンがあり、アントシアニン生合成系の種々の酵素によって生合成され液胞に輸送、蓄積されることによって花色として発現する。本研究ではカーネーションにおいて覆輪を形成する要因を解明することを目的とし、色素分析、アントシアニン生合成系の酵素の遺伝子発現様式の解析等を行った。その結果、赤地に白色覆輪花では白色部分のアントシアニン含有量が微量であるとともに、有機酸が著しく蓄積していることが示された。また、白色部分で CHS (chalcone synthase) の発現が抑えられていることが見い出された。暗赤色地に赤色覆輪花では DFR (dihydroflavonol 4-reductase) 以降の遺伝子が花の成長初期段階から発現していることが示された。さらに、アントシアニンの液胞への輸送に関与することが示唆されている GST (glutathione S-transferase) 相同遺伝子をカーネーションから 2 種単離し、そのうち 1 種が花特異的に発現し、DFR 以降の遺伝子群と同様の挙動を示すことが見い出された。

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　フラボノイドは、植物の花における黄から赤や青の色調を発現している主要な植物色素である。フラボノイドの多くは配糖体化酵素（GT）により細胞内で配糖体化され、液胞に蓄積する。この配糖体化はフラボノイド化合物の水溶性化を増大するだけでなく、その花弁の色調を変化させる。カーネーションにおいて、その黄色花弁はカルコン2'-グルコシドの蓄積、赤色花弁はアシル化アントシアニジン3,5-ジグルコシドの蓄積が見られる。そこで我々は、黄色花弁および赤色花弁からのGT遺伝子の単離および解析を行った。これまでに報告されているGT遺伝子における保存領域から構築した degenerate primer を作成し、黄色および赤色品種のカーネーション cDNA から相同的GT遺伝子断片を取得した。またその遺伝子全長をタンパク質として発現させ、その酵素の活性を HPLC等で確認した。その結果、カルコン2'-GT（C2'GT）およびフラボノイド3-GT（F3GT）を検出した。特にC2’GTはカルコン以外のフラボノイド化合物にも配糖体化の触媒活性を有する広い基質特異性を有し、その糖結合位置にも違いが見られた。このことからC2'GTは花色の分子育種において黄色花、新規花色の作出の重要な遺伝子ツールになるものと考えられる。

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　アントシアニン色素は、橙色から青色までの幅広い花色を作り出している。しかしアントシアニンの生合成に関わる酵素の発現が失われると色素合成ができないため、カルコンなど中間代謝物の蓄積により黄色や白色花となると考えられている。カーネーションにおいて花色が黄色を呈する要因の一つとしてトランスポゾン (dTdic1) の挿入によるCHI (chalcone isomerase)、およびDFR (dihydroflavonol 4-reductase) 遺伝子の発現量の減少が見いだされている。この二つの遺伝子がブロックされることによって中間産物である 4,2’,4’,6’-Tetrahydroxychalcone が CHGT (chalcone 2’-glucosyltransferase) により配糖体化され、chalcone 2’-glucosideが蓄積し、黄色を呈することが考えられた。そこで本研究では、このCHGTcDNA をクローニングし、その基質特異性を決定した。さらに黄色およびオレンジ色花色カーネーションにおけるそれらの遺伝子発現様式について解析を行った結果、カーネーションの花弁におけるCHGTの発現は、他のアントシアニン合成酵素と比べて低いことが見い出された。またオレンジ花色花はCHGT とDFR の微妙な発現時期の違いによる、chalcone 2’-glucoside　とアントシアニンの共存により発色していることが見いだされた。

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カーネーションをはじめとする花色の主要素であるアントシアニンは古くから研究が盛んに行なわれておりその合成経路ならびに酵素遺伝子は既に明らかにされている。このアントシアニン合成に関与する一連の酵素の1つである4-coumarate:CoA ligase (4CL) は色素合成のみならずリグニンの合成経路の初発の反応をも触媒することが知られている。今回我々はカーネーション( Dianthus caryopthyllus )の花及び根から配列の異なる3つの 4CL cDNA ( Dc4CL1, Dc4CL2, Dc4CL3 )を単離した。アミノ酸配列の比較検討を行なったところ Dc4CL2 の Dc4CL3 に対する相同性が77.6％であるのに対し、Dc4CL1 の Dc4CL2, Dc4CL3 に対する相同性はそれぞれ37.1%, 36.8%と低いことが分かった。またさらにノーザンハイブリダイゼーション解析を行なったところ、Dc4CL1 は花のみにおいて特異的に発現していることに対して、Dc4CL2 および Dc4CL3 はリグニンの蓄積が著しい根や茎における発現が高いなど、各4CLは植物の器官において異なる発現パターンを示すことが明らかとなった。これらの結果からカーネーションおいて4CLは少なくとも 3 種類存在し、それらはアントシアニン合成、あるいはリグニン合成とおのおの異なる代謝経路を触媒していることが推測された。

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　我々はこれまでにアグロバクテリウム法により青花リンドウにアンチセンスCHS（Chalcone synthase)遺伝子を導入し、白花化に成功している。今回、これら形質転換白花化リンドウの特性評価試験を行った結果について報告する。
　特性評価項目は除草剤抵抗性、花粉稔性、草丈、開花日とし、調査を行った。アンチセンスCHS遺伝子導入白花化リンドウはbar遺伝子を選抜マーカー遺伝子として有することから除草剤に対する抵抗性付与が期待される。そこで、馴化後3年目の鉢栽培中の形質転換体2系統を用いて、除草剤ハービー液剤（ビアラフォス18％含有、（株）明治製菓）に対する抵抗性試験を実施した。ハービー液剤はリンドウ栽培では通常200倍希釈で株間除草に用いられるが、導入元品種'アルビレオ'は実用濃度の200倍希釈液散布で枯死しするのに対し、形質転換体は正常に生育し、本除草剤に対して抵抗性を示した。また、形質転換体の花粉稔性、草丈を調査した結果、元品種に比較して有意な差は認められなかった。なお開花日については形質転換体で1週間～10日程度早まる傾向が見られたが、温室内での鉢栽培によるバラツキのためと推定された。現在、花弁特異的プロモーターによるヘアピンRNA形成ベクターでの高効率のCHS遺伝子の抑制についても検討を進めており、培養器内で開花した系統の中には白色から薄青色まで多様な花色を示す系統が観察されている。

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