植物の硫黄欠乏応答の制御機構を調べるため、硫黄欠乏応答性プロモーターGFPを持つシロイヌナズナを利用して、硫黄欠乏応答に異常の見られる変異株の単離、解析を行っている。今回はsulfur-deficiency-insensitive 1 (sdi1)の解析について報告する。sdi1-1は、硫黄欠乏応答の指標であるGFP蛍光が、硫黄十分条件で野生型株より強く欠乏条件で弱い変異株であった。硫黄同化に重要なAPR1などの硫黄欠乏による遺伝子発現誘導の程度がsdi1-1では野生型株より小さく、また、野生型株で硫黄欠乏により増加するO-アセチルセリンやGly、Glnなどの遊離アミノ酸もsdi1-1ではあまり変化しなかった。原因遺伝子がマッピングされた5番染色体の48 kbの領域にはフェレドキシン依存性グルタミン酸合成酵素GLU1が存在し、sdi1-1ではGLU1の塩基配列に変異が見つかった。GLU1遺伝子に変異を持つ独立に取得された変異株でも、APR1などの遺伝子発現やアミノ酸蓄積がsdi1-1と同様に硫黄欠乏条件で誘導されなくなっていることを確認した。GLU1は野生型株で硫黄欠乏時に発現が抑制された。これらの結果からSDI1はGLU1であり、GLU1は硫黄欠乏応答にも重要であることが示唆された。光呼吸や窒素同化に重要であるとされるGLU1と植物の硫黄欠乏応答の関係について議論したい。

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It is reported that overexpression of cytosolic glutamine synthetase (GS1) from pea enhanced the growth of transgenic tobacco. We also showed that overexpression of Dof1 from Arabidopsis into tobacco moderately improved plant growth under lower nitrogen. To exam if the co-expression of both Dof1 and GS1 genes into tobacco will coordinately increase plant growth or not under normal conditions, we introduced GS1 from Arabidopsis into transgenic tobacco overexpressing Dof1. The over-expression of GS1 and Dof1 was confirmed by RT-PCR analyses. The double transgenic tobacco was grown under strong light and supplied with lower nitrogen nutrition. We observed that the growth of double transgenic tobacco was largely increased and flowered very earlier as compared with control and transgenic tobacco singly overexpressing Dof1. The intermediates related to carbon and nitrogen metabolism in the transgenic tobacco were also analyzed for revealing the effects of the co-expression of Dof1 and GS1 on transgenic tobacco.

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我々はヒメツリガネゴケを材料として硝酸還元酵素（Nia）及び亜硝酸還元酵素（Nii）の遺伝子発現制御機構の解析を行っており、現在までに、niaおよびniiの発現がアンモニアの同化産物であるグルタミンにより抑制されることを明らかにした。今回は硝酸イオンと亜硝酸イオンによる転写活性化について解析を行った結果を報告する。グルタミン合成酵素の阻害剤MSXを加えてフィードバック阻害を解除した条件下で硝酸イオンの効果を調べたところ、nia、niiは硝酸イオン添加2時間後と8時間以降に発現レベルが高まる二相性の応答を示した。8時間以降の応答は、硝酸イオンだけでなく亜硝酸イオンによっても引き起こされた。二相性の遺伝子発現誘導は以前に報告した硝酸イオン能動輸送体遺伝子（NRT2）のものとよく似ていた。ただし、niiのひとつであるnii1;2の場合は、2時間後の遺伝子発現も亜硝酸イオンによって誘導され、細胞内への亜硝酸イオンの蓄積を防ぐための迅速なnii活性化機構の存在が示唆された。全般的な硝酸イオン、亜硝酸イオンに対する応答が類似しているにも関わらず、nia、nii、NRT2のプロモーター領域に共通の特異的塩基配列を見出すことはできなかった。

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植物の硝酸吸収・同化系遺伝子は協調的に制御されているため、中間代謝産物である亜硝酸は蓄積されにくいものと考えられている。しかし、嫌気的条件などにより亜硝酸還元が阻害されることにより、一過的に植物体内に亜硝酸の集積が認められる。硝酸吸収・同化系は、代謝産物である還元態窒素により調節を受けることが知られているが、近年亜硝酸をシグナルとした調節機構の存在が示唆された。そこで本研究では、イネ培養細胞を用いて、硝酸の吸収および還元に及ぼす亜硝酸の影響について検討した。
イネ（日本晴）培養細胞の生育は、培地への亜硝酸の添加濃度に依存して大きく低下した。硝酸の吸収および還元に対する亜硝酸の影響を、重窒素トレーサーを用いて調べた結果、亜硝酸を培地に添加後1時間以内に硝酸の還元が阻害され、その効果は培地への亜硝酸添加濃度に依存して大きくなった。一方、重窒素でラベルされた硝酸の細胞への取り込みは、添加した亜硝酸が低濃度の範囲では阻害されたが、高濃度の領域では阻害効果が軽減した。その結果、吸収した硝酸の還元態窒素への同化効率は、亜硝酸の添加濃度に依存して大きく低下した。また、今回供試した濃度範囲においては、亜硝酸は硝酸吸収に比べて硝酸還元をより強く阻害した。現在、硝酸同化系の遺伝子発現に対する亜硝酸の影響を解析中であり、合わせて報告する予定である。

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Decrease in Rubisco in transgenic plants leads to decrease of chlorophyll (Chl). We observed that reduce of Rubisco by gene silence in a transgenic petunia with magenta flower not only lowered Chl content but also changed composition and distribution of pigments in flowers. The shoots with moderate reduce in Rubisco produced flowers with thicker color with red stripes on flower petals (type I). The shoots with severe reduce in Rubisco produced flowers with thicker color and purple stripes or spots on flower petals (type II). Our measurement showed that total flower pigment in type I and type II flowers was 1.22 and 1.35 fold of normal flower, respectively. TLC analyses suggested that cyanidin was increased largely in type I and type II flowers and a lot of dephinidin were produced in type II flowers. We are investigating the mechanism controlling this phenomenon.

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miRNAやsiRNAと呼ばれる19-25塩基程度のsmall RNAは、発達過程やストレス応答の際に特異的な発現や発現量の変化を示す。これらを介した目的遺伝子の発現抑制は、正常な成長や環境変化に対応・適応するために生物が獲得した遺伝子発現制御機構の1つとして多くの種で研究が進められている。本研究では、イネ生殖器官の中でも特に雄性器官に着目し、雄性器官の発達に関与する新規small RNAの単離・解析を目的とした。
日本晴の成熟葯を用いてsmall RNA cDNAライブラリーを作製し、ランダムに選抜した約900クローンの塩基配列を決定した。BLAST・RAP-BLAST・miRBase等による解析から、前駆体としてステム・ループ構造を形成し得る約40種の候補配列を得た。この中には、2種の既報miRNA（miR166、miR167）が含まれていたことから、候補配列には新規small RNAが含まれると推測した。
ノザン解析により、上記の2種のmiRNAが葯の発達過程において蓄積していることを確認した。このことから、イネの雄性器官形成・成熟過程においてもsmall RNAによる遺伝子発現制御機構が存在していると推察した。
現在、さらにクローニングを続けると共に各候補配列の発現解析を行っている。

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UDP-glucose pyrophosphorylase (UGPase) はglucose-1-phosphateからUDP-glucoseの合成を可逆的に行う酵素であり、植物の炭水化物代謝(糖タンパク質・糖脂質の糖鎖合成、カロース・ペクチンなどの細胞壁合成)に重要な役割をしていることが知られている。シロイヌナズナゲノムには2個のAtUGP遺伝子（AtUGP1、AtUGP2）が存在した。このAtUGP1及びAtUGP2遺伝子はアミノ酸レベルで92%の高い相同性を示した。RT-PCR発現解析より、2つの相同遺伝子は根、葉、生殖器官など、植物全体で発現していた。次に、AtUGP1及びAtUGP2遺伝子におけるT-DNA挿入変異体を解析したところ、atugp1, atugp2の単一変異体では、その表現型は野生型と変化がみられなかった。しかし、atugp1/atugp2二重変異体では、植物個体が著しく矮小化し、雄性不稔も観察された。雄性不稔について、葯の形態観察を行ったところ、花粉母細胞までは正常に胞原細胞が分化していたが、四分子期のcallose膜の異常により、結果として小胞子の異常な形態が観察された。最終的には成熟花粉は全く形成されず、胞子体型雄性不稔性を示した。以上の結果から、AtUGP1/AtUGP2遺伝子は植物の生長・葯でのcallose合成に関与していることが示唆された。

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植物は適切な花粉との受精のために様々な生殖システムを進化させてきた。中でも、雌ずい上で不適切な花粉、花粉管を積極的に排除する機構である受粉時の不和合性に関しては、自家不和合性(SI)の自他認識機構解明を中心に解析が進められてきた。しかし、生殖的隔離を行う場としての受粉機構という観点では、分子レベルでの解析はほとんどなされていない。一般に、近縁なSI種と自家和合性(SC)種の交雑では、SC種の柱頭にSI種の花粉を受粉させた時には和合となるのに対して、逆交雑時には不和合になるという一側性不和合性(UI)の存在が知られている。これは、受粉時の雌ずい上では、自他認識以外にも何らかの情報伝達機構が存在していることを示唆している。
本研究では、自家不和合性アブラナの系統中に種内一側性不和合性現象が見られることを明らかにし、さらにこの現象を制御する柱頭、花粉両因子について遺伝学的解析を行った。B. rapa の「おそめ」系統柱頭とトルコ由来系統花粉との間で特異的にみられるUI表現型はSIに酷似し、花粉は乳頭細胞上で発芽できない、また発芽しても乳頭細胞内に侵入することはできず、不和合性となる。遺伝分析の結果から、この現象を支配する柱頭側因子(SUI)と花粉側因子(PUI)が存在し、さらにSUI, PUIそれぞれ自家不和合性遺伝子座(S遺伝子座)とは独立な1因子で制御されることを明らかにした。

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シロイヌナズナには広く実験種として用いられているCol-0, Lerをはじめ、非常に多くの野生株が存在する。これらの野生株は、形態、花成の形成時期、ストレス耐性などにおいて様々な表現型を示すことから、近年これらのナチュラルバリエーションを利用した遺伝学的な解析が進められている。私たちは実験種であるCol-0と、その他の野生株とのF2世代以降において、葉の色素異常、葉の形態異常を示す固体が現れることを発見した。これらの表現型は親である、Col-0や野生種では世代を回しても現れず、掛け合わせたF2世代以降で初めて現れる。つまり、Col-0と他の野生種双方の遺伝子セットをそれぞれホモで有した場合のみ現れる。このメカニズムとしては、冗長性を有していた遺伝子対の1つずつがそれぞれの親株で変異型であり、変異型の遺伝子セットを有したことで表現型が現れた、あるいは、相互作用によって機能する遺伝子セットが機能しなくなるなどが考えられる。この表現型の原因遺伝子をCol-0側、掛け合わせに用いた野生株側共にマッピングすれば、表現型を指標に冗長性を示す遺伝子セット、あるいは相互作用する遺伝子セットを明らかにすることが出来る。本発表ではF2世代において現れた様々な表現型を紹介するとともに、子葉のみにおいてペールグリーン化を示した原因遺伝子のマッピングを試みたので、新しい遺伝学的解析方法の一例として紹介する。

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被子植物において、柱頭に接着した花粉は、吸水・発芽した後、花粉管が花柱を通過して胚珠への誘導が起こる。その後、精核が卵核と融合して受精卵を形成する。この過程において行われていると考えられる花粉と雌蕊との相互作用には不明な点が多い。我々は不稔性を示すebi (enndann-buchikowasi)変異体を同定し、解析を行った。相互交配、遺伝分析の結果から、不稔性の原因は雌性側にあり、単因子劣性の胞子体型の変異であることが分かった。原因遺伝子を単離した結果、機能未知のドメインを持つ新奇タンパク質をコードしていた。このドメインを持つタンパク質は高等植物にだけ観られ、シロイヌナズナのゲノムにはEBI遺伝子と相同性を示す遺伝子は46個存在していた。発現解析の結果、EBI遺伝子は、全身で発現していたが、花序において発現が上昇していた。また、GFPとの融合タンパク質をBY-2で発現させたところ細胞質に局在することが分かった。

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細胞質雄性不稔性(CMS)はF₁ハイブリッド育種に重要な形質であり，核とミトコンドリアとのゲノム障壁によって生じると考えられる．我々は，由来が異なる3種類のイネ細胞質雄性不稔系統を用いての細胞質雄性不稔性のメカニズム解明を目的としている．本研究では，そのうちCMS系統で発現が減少していたプロテインキナーゼの機能解析を行ったので結果を示す．OsNek3はイネの3種類のCMSにおいて発現が減少している因子である．正常型細胞質を持つ台中65においては，OsNek3の栄養器官での発現は微量であり，成熟葯や成熟花粉で高いmRNA蓄積が見られた．OsNek3へのTos17挿入は，アリルosnek3-1, osnek3-2共に胞子体型の雄性不稔形質と完全連鎖していたことから，OsNek3の機能欠損は葯の形成阻害を引き起こすものと考えられた．以上から，OsNek3は雄性器官の発達に必須な因子であることが考えられた．プロテインキナーゼであるOsNek3を介したシグナル伝達系がCMS誘発機構の下流に位置している可能性も考えられ，今までブラックボックスであったミトコンドリアとCMSの関連を説明するために貴重な情報と成りうると考えている．

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片親由来の遺伝子のみが選択的に発現するゲノムインプリンティングは、DNAのメチル化やヒストン修飾などのエピジェネティックな情報によって制御されることが知られている。植物におけるゲノムインプリンティングは雌性配偶体の中央細胞および胚乳で特異的に起こり、胚乳の発生を制御している。インプリンティングの確立には、雌性配偶体で特異的に発現するDNAグリコシラーゼを介したDNA脱メチル化が関わることが報告されている。しかしながらその作用機構はまだ不明な点が多い。
そこで、インプリンティング遺伝子FWAの発現をGFPでモニターする系を用いて中央細胞および胚乳におけるFWAのゲノムインプリンティングに異常が見られる変異体を単離し、インプリンティングの制御に関わる新規因子の同定を試みた。本発表ではFWA-GFPの活性化が見られず、胚乳の核分裂が遅延する表現型を示すalarm clock for FWA imprinting 1変異体について報告する。

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VOZ(Vascular plant One Zink-finger protein)は、zinc-fingerモチーフを持つ新規DNA結合タンパク質であり、高等植物に普遍的に存在する植物特異的な転写因子である(Mitsuda et al. (2004) Plant Cell Physiol. 45: 845-8549)。シロイヌナズナには二種のVOZ(AtVOZ1, AtVOZ2)が存在し、voz1/ voz2二重変異体が長日条件下で花成遅延を示すことから、光周性花成誘導への関与が示唆されている。しかし、in vivoでのVOZの標的遺伝子は不明であり、その分子的な役割は未知である。さらに、ヒメツリガネゴケなどの花成を示さない植物にもVOZが存在することから、VOZが（花成以外の）高等植物間で共通の生命現象に寄与していることも推測される。本研究では、VOZの分子機能の解明に向けた端緒として、酵母Two hybridスクリーニング を行い、新規相互作用因子の探索を試みた。その結果、相互作因子の候補が多数得られ、その中にはAtVOZ1およびAtVOZ2と協調して機能することが推測される転写関連因子も含まれていた。現在、これらの候補因子とVOZとの相互作用をin vitroおよびin plantaにおいて検証しており、それらの結果も併せて報告する。

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我々は「新形質花き」の作出を目指し、トレニアを用いて重イオンビーム照射による変異導入を行っている。その中に、第2ウォールが萼化した表現型を示すトレニアmutantが2系統見出された。花器官形成のABCモデルから、これらmutantの表現型はクラスB遺伝子機能の欠損に原因があると予想された。本研究は、変異が導入された遺伝子の特定と、トレニアの花器官形成に関わる情報の収集を目的とする。
トレニアのクラスB遺伝子であるTfGLOおよびTfDEFの発現を、野生型および上記mutantを用いRT-PCRにて解析した結果、2種のmutantではTfDEFは発現していたがTfGLOの発現が全く認められなかった。野生型および2種のmutantについてTfGLOゲノム領域を単離し配列を決定した結果、TfGLO遺伝子発現の欠失に直接の要因と推測される変異は見られなかった。このことから、2種のmutantにおけるTfGLO遺伝子の欠損は、上流の発現調節因子の変異に起因すると推察された。すでにシロイヌナズナ等でクラスB遺伝子の発現調節因子として報告されているAPETALA1、LEAFYおよびUFOの発現をRT-PCRで解析した結果、UFO特異的にmRNA量の減少が認められたので報告する。
なお、本研究は、「農林水産研究高度化事業」によるものである。

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シロイヌナズナにおいて、有力な時計関連因子としてMYB型転写因子のCCA1とそのホモログであるLHYがある。さらに我々が見いだした5種類のPRRファミリー因子（TOC1/PRR1、PRR3、PRR5、PRR7、PRR9）も時計機構の中心的な因子として考えられている。これら時計関連因子の変異体（機能欠損・構成的発現植物体）は、一般的に成長初期段階においての光照射にそれぞれが特徴的な感受性の変化を示すことが知られている。たとえば、cca1 lhy機能欠損変異体は赤色光高感受性で短胚軸、toc1機能欠損変異体は赤色光低感受性で長胚軸となる。このことは、概日時計機構と赤色光シグナル伝達系との間に密接な遺伝学的関連があることを示している。今回、我々は様々な時計関連因子と赤色光シグナル伝達系の機能欠損植物体、構成的発現植物体を組み合わせた多重変異体を用いることにより、各因子間の遺伝的上下関係について詳細に解析した。得られた結果より、我々は概日時計機構の因子からどのように赤色光シグナル伝達系へと情報が伝達され、光形態形成に影響を与えているのかを考察する。また、近年報告された時計に制御された遺伝子PIF4,PIF5(PIL6)によって制御される、明暗周期条件下における胚軸伸張制御のモデルについても同時に考察する。

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概日時計はバクテリアから植物、ヒトにいたるまで広く保存された生理現象である。植物ではモデル植物であるアラビドプシスを用いた分子遺伝学的解析から、多くの概日時計に関わる遺伝子が単離・解析されてきた。一方で単子葉植物であるイネなどからアラビドプシス時計遺伝子のホモログが単離されているが、それらの機能解析は報告少なく、植物間での概日時計機構の保存性についての詳細は未だわかってはいない。これまでに私たちはイボウキクサ（Lemna gibbaG3）を用いアラビドプシスの時計遺伝子であるLHY/CCA1, GI, ELF3のホモログ（LgLHYH1, LgLHYH2, LgGIH1, LgELF3H1）を単離してきた。そこでこれら時計遺伝子ホモログの過剰発現、またはRNAiコンストラクトを生物発光レポーターとともに一過的遺伝子導入法を用いウキクサに導入し、生物発光の変化を連続的にモニターすることで、それら遺伝子の機能解析を行った。その結果、ウキクサでは2種類のLHYホモログが機能的にも分化している可能性を見出すとともに、GIホモログがアラビドプシスGIよりも強く概日時計に関与していることを示唆する結果を得た。これらの結果から植物の概日時計は大枠としては植物間で保存されているが、それぞれの構成因子がもつ働きの度合いに違いがあることが示唆された。

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概日時計は日長による花成時期の制御（光周的花芽誘導）に深く関わる。我々の研究室では2種類のウキクサ（長日植物のL. gibba G3と短日植物のL. paucicostata 6746）を用いて概日時計および光周的花芽誘導の分子生物学的な研究を行っている。本研究で我々はシロイヌナズナで日長情報と花成誘導を結ぶ遺伝子CO (CONSTANS)のホモログ、LgCOH1とLpCOH1、を両ウキクサから単離した。シロイヌナズナのCOは夜に発現のピークを迎える概日リズムを示す。またCOの過剰発現体および欠失変異体では概日リズムの性質に変化が見られなかったことから、概日時計の出力系に位置づけられている。LgCOH1は昼に発現のピークを迎える日周リズムを示したことから、COとは異なる機能を持つ可能性が考えられた。我々はパーティクルガンによってウキクサに概日リズムの発光レポーターを導入し、概日リズムを発光として検出する系を開発している。また、発光レポーターと目的遺伝子の過剰発現やRNAiを行うエフェクターを同時に導入することで、機能解析を行うことができる。発光レポーターとLgCOH1の過剰発現コンストラクトをウキクサに導入し発光測定を行ったところ、発光の概日リズムはLgCOH1の過剰発現によって消失した。本研究ではこれらの結果をもとにウキクサのCOホモログが概日時計に機能をもつ可能性について発表する。

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Lemna属のウキクサ(アオウキクサ属、単子葉類)は1950年代から花成誘導・光周性・概日リズム等の研究に用いられてきた。特に1964年に短日性のL. paucicostata 6746を用いてHillmanが行った光周性花芽誘導の実験は、生物一般の光周性反応における概日時計の役割を明示した点で重要な業績であった。また、同属のL. gibba G3は明確な長日性を示すことから、光周性の重要な実験材料として生理学的解析が続けられてきた。一方で、分子生物学的解析はほとんどなされていなかったため、私たちは2001年より光周性花芽誘導と概日時計の分子機構の解明を目指した新たな解析手法の開発を行ってきた。それからの研究を通して、分子生物学的解析を行う上で応用可能な様々な特質をウキクサが持っていることを見いだしてきた。本発表では、私たちがこれまでに取り組んできたレポーター系・機能解析系・光周性誘導実験系・純系株の確立・遺伝学的実験系を含め、実験生物としての可能性を広く議論する。

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シアノバクテリア（Synechococcus elongatus PCC 7942）は、概日時計を示す最も単純な生物である。3つの時計タンパク質KaiA、KaiB、KaiCをATPと共に試験管内で混合するとKaiCのリン酸化レベルが安定な概日振動を示すことから、この化学振動子がシアノバクテリアの時計システムの中枢であると考えられている。シアノバクテリア細胞内では、概日時計によってゲノムワイドな遺伝子発現制御が行われており、KaiCのリン酸化振動による発現制御が予想される。一方、KaiCタンパク質量に概日振動が見られ、kaiC過剰発現で転写抑制がおこることからKaiCの量的変動も遺伝子発現に影響を与えると考えられる。分子遺伝学的解析から、概日遺伝子発現に関与する分子も明らかになりつつあるが、細胞内の動的な概日遺伝子発現制御を理解するためには、KaiCの量的変動やリン酸化レベルの変動による速度論的解析が不可欠である。そこで本研究では、IPTG誘導性のtrcプロモーターからkaiC を発現させる系を用い、kaiC発現のステップアップ、あるいはステップダウンに対するKaiCリン酸化レベルの応答、遺伝子発現パターンの経時変化を解析した。その結果、転写抑制はkaiC発現量依存的な振る舞いを示すが、野生株に近い条件では概日振動に調和した時間スケールで起こる特性があること、KaiCの蓄積量あるいはそのリン酸化レベルはそれぞれ異なった様式で遺伝子発現を制御していることが明らかになった。

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維管束のネットワーク状のパターンは前形成層のそれが形成されるときに決まる。しかしながら、発生中の器官原基で前形成層へと分化する細胞がどのように選ばれ、連続的でありながら側方抑制的な細胞列のパターンを生じるのかはよくわかっていない。また、未分化な細胞がどのように運命決定され前形成層細胞へと分化するのかについてもよくわかっていない。一方、維管束を構成する複数の細胞がどのように増殖制御等されて、細胞列の束になるのかもよくわかっていない。これらを明らかにするためには、前形成層が形成される初期過程で働く遺伝子を同定し、その機能を明らかにする必要がある。私たちは、葉脈パターンが異常な突然変異体を複数単離し、葉脈形成に関わる遺伝子の同定と解析を行っている。NO VEIN (NOV)遺伝子は葉脈形成に必要な遺伝子として同定された。これまでに、前形成層形成に必要なこと、葉と胚において発生に伴ってダイナミックに変化するオーキシンの分布パターン形成に必要なこと等を明らかにしている。一方、621C-27遺伝子は正常な葉脈パターン形成及び木部細胞列数の決定に関わる遺伝子として同定され、正常な前形成層パターン形成に必要であることなどを明らかにしている。本発表では、NOV、621C-27遺伝子が、葉脈形成のみならず、根の維管束形成や胚発生過程においても細胞運命の決定に重要な働きをもつこと等を報告する。

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被子植物の受精卵は、不等分裂し将来の発生運命が異なる2個の娘細胞(頂端細胞および基部細胞)を生じる。いくつかの動物種においては、受精点(精子侵入点または精子融合点)が初期胚発生の過程において位置情報として機能していることが知られている。本研究では、植物における受精点と受精卵の第一分裂面の位置関係を明らかにするため、イネ in vitro 受精系を用いた解析を行った。
精細胞と卵細胞を単離し、精細胞膜を蛍光レクチンで染色したのち、卵細胞と in vitro 受精させることにより受精点を標識した。その後の受精卵培養の際に蛍光標識された受精点が消失してしまうことから、受精卵の固定培養法を確立し、その後の発生過程を観察した。その結果、受精点と第一分裂面の位置との関連性は明確には見られなかった。このことから、イネ受精卵では受精点が第一分裂面決定への位置情報として機能していないことが示唆された。
また、卵細胞自体の極性に注目すると、in vivo では、珠孔側に細胞質に富んだ領域と核、合点側に液胞に富んだ領域が偏在していることが確認されている。単離した卵細胞においてもこの細胞局在は維持されており、また、その極性は受精卵中において再構成されることが示唆された。これら極性の形成・維持にアクチン繊維が関わっている可能性が高いことから、卵細胞および受精卵のアクチンを可視化し、卵細胞および受精卵における動態観察を進めている。

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多くの被子植物の胚発生様式は、シロイヌナズナに代表されるアブラナ科植物のように規則正しくはない。単子葉植物であるイネはモデル植物として多くの研究が蓄積してきているが、初期の胚発生の発生様式に関しては未だ明確には示されておらず、また胚発生に重要な役割をもつIAA の胚内分布に対する知見もほとんど得られていない。本研究では、イネの初期胚の発生様式を組織化学的手法による詳細な観察により明らかにした。イネ初期胚発生時における細胞構造を明確にするために、受粉前～受粉後96時間の子房を化学固定し、樹脂包埋後、卵、胚、助細胞など周辺構造を観察した。受粉前の胚のう内では、2個の助細胞が背側に並んで配置され、卵はそれら細胞に接して腹側に位置した。卵は受精後、第一分裂面が助細胞の配置と平行な面、珠孔-合点軸に対しては斜めな面に入ることで、小さな頂端細胞と大きめの基部細胞からなる2細胞胚を生じる。4細胞胚では、この分裂面に対して垂直に分裂面が入る様子が確認された。その後、約100細胞よりなる球状胚までは卵割様の分裂を行い、受粉後72時間後では、細胞分裂・伸長によって縦長の球状胚となった。そして少なくとも受粉後90時間後には器官分化期胚が観察された。当該研究室では、抗PIN抗体によるトウモロコシ幼葉鞘におけるPINの分布について一定の知見を得つつあり、現在、イネ初期胚におけるPIN分布の可視化を試みている。

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真核生物において、mRNAのpoly(A)付加はmRNA生合成において重要な過程であり、遺伝子の発現に密接に関わっている。酵母などで同定されているCLP1は、cleavage and polyadenylation factor Iを構成するsubunitの一つである。そこで植物におけるCLP1の機能解析を目的に、シロイヌナズナにおけるオーソログであるAtCLP1についてT-DNA挿入変異体の同定を試みたが、ホモ個体を得ることができなかった。ヘテロ個体の自殖系統の分離比から、胚発生時において異常の原因が生じていることが示された。胚の発達過程を観察したところ球状胚期において発達が停止している胚が観察された。発現解析により、全身で発現が検出され、またGFPとの融合タンパク質を用い局在を観察したところ、核に局在することが分かった。AtCLP1遺伝子は胚発生に重要であり、mRNA biogenesis に関わっていることが示唆された。

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ニンジン不定胚発生阻害因子4-hydroxybenzyl alcohol（4HBA）は、胚発生能力を有する細胞（embryogenic cells）より放出され、液体培養時には不定胚発生を阻害する。我々は、2007年度年会において、胚発生能を誘導したニンジン実生胚軸を固形培地上で培養した際、4HBAの類縁化合物であるvanillyl alcohol（VA）が不定胚発生を阻害せずにむしろ促進することを報告した。組織学的観察、および胚のマーカー遺伝子の発現解析の結果は、4HBAおよびVA が初期の胚発生過程を阻害し、その後の胚発達は促進することを示唆していた。そこで、モデル植物であるシロイヌナズナを用いて、不定胚発生への4HBAおよびVAの阻害・促進効果について調べた。その結果、シロイヌナズナ吸水種子からの不定胚発生は、1x10^-6 Mの4HBAで阻害され、1x10^-5 MのVAによりわずかに促進された。一方、ニンジン不定胚形成について、不定胚誘導時の一定期間のみに4HBAおよびVAを与えることで、阻害・促進作用を示す時期の特定を試みている。

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種子成熟や発芽過程において鉄や亜鉛などの微量元素は重要な役割を果たす。微量元素欠乏条件下で生育した植物や微量元素の輸送に異常がある植物では、正常な種子形成や幼植物の生育が行われない。一方で植物体内において金属元素を輸送する金属のキレーターも種子成熟過程や発芽過程に重要と考えられる。ニコチアナミン（NA）は植物に広く存在する金属のキレーターであり、植物体内の金属輸送や金属の恒常性の維持に関わる。ムギネ酸類はイネ科植物に特異的な金属のキレーターであり、NAを前駆体として合成され、イネではデオキシムギネ酸(DMA)が合成される。
本研究では、イネの種子成熟過程および種子発芽過程における金属元素の輸送、NAおよびDMAなど金属のキレーターの役割を明らかにすることを目的とし、成熟過程および発芽過程のイネ種子における鉄、亜鉛、マンガン、銅の分布を放射光マイクロビームを用いた蛍光X線分析により明らかにした。これらの結果に基づき、イネ種子の成熟過程および発芽過程における金属元素の輸送を考察する。

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植物ホルモンABAが種子休眠の制御に重要な役割を担うことは広く知られている。シロイヌナズナのfus3変異体は種子休眠性を失うこと、ならびにFUS3がABA生合成を正に制御することが報告されている。しかしながら、FUS3によるABA生合成の制御メカニズムの詳細はほとんど知られていない。我々は、FUS3下流の休眠制御メカニズムを解析するために、エストロゲン誘導性FUS3異所発現形質転換植物を変異原処理し、実生でのFUS3発現による成長停止が緩和した変異体を多数分離している。得られた変異体についてGA生合成阻害剤耐性を指標に二次スクリーニングを行い、FUS3下流のABA生合成制御メカニズムに異常がある可能性のある変異体候補を分離した。これらのうちfga2変異体は、種子休眠性の低下ならびに発芽時に強いGA生合成阻害剤耐性を示した。興味深いことに、fga2変異体実生はFUS3の発現に依存して胚軸が著しく伸長することが観察された。FGA2がFUS3の下流でのABA生合成制御に関与するか否かをさらに詳しく解析するために、現在、FGA2のマップベースクローニングを試みている。これらの結果に基づき、FGA2およびFUS3の種子成熟過程でのABA生合成における機能について考察する。

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穂発芽は作物における種子の品質低下につながることから、育種における重要な選抜対象形質である。穂発芽の程度は種子休眠の程度に依存し、休眠が浅いと、容易に穂発芽を引き起こす。我々はイネの種子休眠の遺伝的調節機構を解明するために穂発芽耐性QTLの単離に取り組むとともに容易に穂発芽を引き起こす突然変異系統の解析にも取り組んでいる。
ミュータントパネルデータベース（Tos17）から、易穂発芽を示す164系統を選び、穂発芽の程度を再確認したところ、40系統で明瞭な易穂発芽性が観察された。これらの中から、カロテノイドやABA合成に異常をきたしている可能性のあるアルビノや薄緑色を呈する系統を除き、16系統を選抜した。種子休眠あるいはABAシグナル伝達系路に関わる遺伝子あるいは関わると予想される遺伝子の配列を解読した。その結果、M25,M26およびM100の3系統は穂発芽耐性遺伝子Sdr4の変異体であることが判明した。また、M125系統はOsVP1 の変異体（32bpの欠失）であることが明らかとなった。OsVP1の変異を固定し、発現を解析した結果、Sdr4の発現レベルが低下していた。これまでに解析した易穂発芽系統の生理実験等の結果とあわせて報告する。

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γオリザノールは、植物ステロールまたはトリテルペンアルコールとフェルラ酸のエステル化合物の混合物の総称であり、十数種ある構成成分の中でも、β-sitosterol、cycloartenyl ferulate、24-methylene cycloartanyl ferulate、campesteryl ferulateが主要な構成成分である。γオリザノールは玄米重量の約0.04％含まれており、二次代謝産物の中では多く存在する分子であるが、その機能は明らかになっていない。そこで我々は、登熟過程におけるイネ種子中の、γオリザノール含量の推移について解析を行った。登熟の各段階において、種子全粒からγオリザノールを抽出し、HPLCにより測定した結果、γオリザノールは登熟初期の段階において生合成が開始され、登熟の中期から後期にかけて時間と共に含量が増加することが明らになった。また、γオリザノール成分の構成比を解析したところ、登熟が進むにつれ、β-sitosterolの割合は減少し、逆にcycloartenyl ferulateの割合は増加していた。これらの知見から、登熟期間中において、γオリザノールは構成成分を変化させながら増加していることが明らかになった。

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アマモ（Zostera marina）は、海中の砂泥地に生育し、地下茎および種子によって繁殖する単子葉植物である。陸上植物では、種子の発達・成熟・休眠・発芽に関して、多くの生物学的知見が蓄積されてきた。それに対して、アマモの種子に関する研究はほとんど進んでいない。そこで我々は、アマモ種子の発達と発芽について生理学的観点から解析を試みた。まず、天然のアマモ群落（横須賀市走水地先）において、さまざまな開花後日数の果実および種子を採取し、その長軸長・重量・含水率から発達段階を規定した。果実の長軸長と乾燥重量は開花後28日目に最大となり、成熟した種子は開花後35日目に母植物体より分離された。また、種子発達後期には種子を含む果実の含水率の低下が観察された。続いて、成熟種子を用いて発芽特性の解析を行った。アマモ種子の発芽は、水温15℃から20℃、海水濃度22.5‰以下で促進された。また、マンニトールあるいはポリエチレングリコールを用いて、さまざまな浸透圧条件下での発芽を解析したところ、浸透圧が低いほど発芽が促進されることが示された。これらの結果より、アマモの種子発達は陸上植物と類似していること、種子発芽は低温と低浸透圧によって誘導されることが明らかになった。現在、発芽時の含水率の変化や植物ホルモン（アブシシン酸、ジベレリン）の効果についても解析を進めている。

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シロイヌナズナ表皮のトライコームは昆虫食害に対する構造的なバリアとして機能するが、傷害を受けた植物体はさらにトライコーム密度の高い葉を形成するようになる。これは表皮細胞がトライコームに分化する頻度の可塑的な変化であり、ジャスモン酸の生合成及びSCF^COI1複合体を介したシグナル伝達が必須である。glabrous1-2 (gl1-2) 変異体は通常の育成条件ではトライコームをほとんど形成しないが、ジャスモン酸処理によりトライコーム形成が回復する。私達はgl1-2を変異原処理し、ジャスモン酸に対するトライコーム増加応答が消失するものとしてunarmed9（urm9）を単離した。urm9はgl1-2と独立な劣性変異であり、単独変異体では正常な形態のトライコームを形成する。またurm9は花粉稔性や成長阻害などのジャスモン酸応答に関しては野生型同様であり、URM9はトライコームの密度制御に特異的に関与する新規遺伝子であると考えられた。詳細なマッピングと候補遺伝子シークエンスの結果、urm9の座乗領域に二つの塩基置換を見出した。現在、T-DNA挿入アリルとのアレリズムテスト及び遺伝子導入による相補性検定を進めており、原因遺伝子の確定を急いでいる。

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プトレシンやスペルミジンに代表されるポリアミンは，多くの生物に存在する低分子塩基化合物で，多面的な生理活性を持つことが知られている。シロイヌナズナの花茎の伸長に特異的な欠損を示すacaulis5 (acl5)変異株の原因遺伝子ACL5は，これまでスペルミン合成酵素をコードしていると考えられていたが，最近になってスペルミンよりもその構造異性体であるサーモスペルミンを合成する酵素をコードしている可能性が示唆された。
acl5変異株に外部からポリアミンを加えてその影響を調べたところ，スペルミンでは茎の伸長の回復が見られなかったが，サーモスペルミンを与えると不完全ながら花茎の伸長が回復することが確認された。遺伝子発現を調べた実験では，サーモスペルミンを加えてから時間を追うごとにacl5変異株におけるacl5遺伝子の発現量が低下し，24時間後には野生株のレベルまで減少して，サーモスペルミンの合成について負のフィードバックの制御機構が働いていることが示唆された。

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植物の地上部組織は茎頂分裂組織から形成され、従って植物の形態や体制（側方分岐、ニ叉分岐）にとって茎頂分裂組織の振舞いは非常に重要である。例えば通常ミヤコグサの茎は側方分岐を示すが、klavier変異体ではしばしば茎が帯化しニ叉分岐を行うことが知られている。茎頂分裂組織の形成、維持には特定の遺伝子群が関与しており、それらが空間的に相互作用を行うことにより秩序を維持していると考えられる。そこで茎頂分裂組織の基本的な振舞いを理解することを目的に、単純な数理モデルを構築し数値解析的手法により解析を試みた。
茎頂分裂組織をニ次元空間として扱い、細胞内および細胞間ダイナミクスと して反応拡散系を用いた。茎頂分裂組織は細胞分裂による増殖を行う一方、分裂組織の最大細胞数を設定して、それ以上の細胞数ではcentral zoneから最も 遠い細胞を分裂組織から離脱させるものとした。解析の結果、ダイナミクスの パラメータを変化させることにより、シロイヌナズナやミヤコグサなどで見られる側方分岐 (lateral branching)、マツバランやklavier変異体などで見られるニ叉分岐 (dichotomous branching)、シロイヌナズナclavata変異体などで見られる帯化 (fasciation)など、茎頂分裂組織の基本的な形態や分裂様式を再現することができた。

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多細胞生物は細胞が規則正しく配置することで組織および器官を形成する。シロイヌナズナの根では維管束組織を取巻くように内側から内鞘、基本組織（内皮、皮層）、表皮、側部根冠が同心円状に形成される。これまでに放射パターン形成の分子機構への理解は、内皮細胞層の形成過程におけるGRAS型転写調節因子であるSHORT-ROOT (SHR）及びSCARCROW (SCR）の機能などに限られている。
本研究においては、放射パターン形成に機能する新たな分子経路を明らかにするために、共焦点レーザー顕微鏡を用いて根端部の細胞パターンに異常を示すシロイヌナズナ変異体を複数単離した。劣性変異体である5gf32変異体は、通常2層の細胞層（1層の内皮と1層の皮層）から形成される基本組織に3層の細胞層が観察され、さらに同一組織の細胞が明確な同心円パターンを示さなかった。本発表では、分化マーカー遺伝子の発現に基づいた5gf32変異体の詳細な表現型解析と5GF32遺伝子とSHR/SCR経路との遺伝学的解析から、根における放射パターン形成における5GF32遺伝子の機能について討論する。

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シロイヌナズナ BOP1・BOP2遺伝子の機能欠損型 bop1/bop2二重変異体は、葉柄上に葉身を形成し、野生型と比較して葉成長が長期間継続する。一方、イワタバコ科 Monophyllaea属植物の葉は、基部領域の細胞分裂活性が継続することで無限成長する。両者は葉の基部領域で細胞分裂が継続するという共通点を持っていることから、現在我々は、葉の有限性を司る機構を知る一環として、 Monophyllaea属植物の BOPホモログ ( MgBOP1・MgBOP2)の機能解析を行っている。まず MgBOP1あるいは MgBOP2を、35Sプロモーターを用いてシロイヌナズナ bop1/bop2で強制発現させた形質転換体を作成した結果、 Monophyllaea属BOP遺伝子はシロイヌナズナ bop1/bop2を相補することが明らかになった。さらに Monophyllaea属植物での BOP遺伝子の発現は、葉の基部領域・petiolodeと呼ばれる茎状の器官・根で強く見られ、シロイヌナズナ BOP遺伝子の発現部位とよく似ていた。そのため、 BOP遺伝子自身の機能欠損が、 Monophyllaea属の葉の無限成長の原因である可能性は低い。本発表ではさらに、シロイヌナズナでBOP遺伝子と相互作用することの知られる遺伝子群が、 Monophyllaea属の葉の無限成長に関わる可能性についても検討したので、それについて報告する。

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植物における道管は、縦に連なった細胞が連続的に管状要素と呼ばれる細胞に分化することで形成される。その際の分化誘導因子として、私たちのグループではヒャクニチソウ単離葉肉細胞からアラビノガラクタンタンパク質xylogenを見出した。シロイヌナズナにおいても、これと相同性の高いタンパク質をコードしている遺伝子は数多く存在し、このうちヒャクニチソウxylogenと最も相同性の高いAtXYP1およびAtXYP2はxylogenとして協調的に働いていると考えられている。シロイヌナズナxylogenホモログに関する網羅的な発現解析を行った結果、その中でも主にxylogenとしての機能を担っているのは根や節を中心として維管束に発現の見られるAtXYP2であると考えられた。次に、AtXYP2内部にGFPを導入したレポーター遺伝子を導入したトランスジェニック植物を作製して観察を行ったところ、AtXYP2は細胞膜に局在することが観察された。現在、その極性輸送の過程を解明するため、組織や分化段階ごとの動態の観察を行っている。また、xylogenは脂質と結合するnsLTP、糖鎖修飾を受けるAGPの構造を併せ持っているが、これらの構造が持つ意味合いは明らかでない。そのため、これらの構造の欠損を導入した植物を用いて機能解析を進めており、これらの解析についてもあわせて報告する予定である。

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植物ホルモンであるオーキシンは、極性輸送と呼ばれる細胞間輸送システムにより生合成された部位から移動し、偏差的な分布を形成する。オーキシンの排出キャリアーであるPIN-FORMED (PIN) タンパク質が細胞膜上に極性をもって局在し、その極性が細胞間で揃うことでオーキシンの極性輸送が可能となる。これまでに、Ser/Thr kinaseであるPINOID (PID)、そしてNPH3様タンパク質MACCHI-BOU 4/ENHANCER OF PINOID (MAB4/ENP)がPINタンパク質の細胞内局在を制御することが示されている。
MAB4/ENPタンパク質はNPH3ドメインとタンパク質間相互作用に関わるBTB/POZドメインを有しているが、その詳細な機能は未知である。我々はMAB4/ENPの機能を明らかにすることを目的に、MAB4/ENPと相互作用する因子の探索をYeast Two-hybrid法を用いて行った。その結果、いくつかの候補因子を単離、同定することに成功した。本発表では、MAB4/ENP相互作用因子の解析結果について報告する。また、MAB4/ENPと機能重複的に働くことが予想されるMAB4ファミリー遺伝子群の解析結果も合わせて発表する。

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側根形成は維管束植物の根系構築に不可欠な発生現象である。多くの植物種において、オーキシンが側根形成を制御していることが知られているが、そのメカニズムにはまだ不明な点が多い。われわれは、オーキシンシグナルから側根形成にいたる分子カスケードの解明を目指し、シロイヌナズナを材料に研究を進めてきた。変異体を用いた分子遺伝学的な解析より、側根形成においてSLR/IAA14やAuxin Response Factor 7 (ARF7)およびARF19によるオーキシン応答性の転写制御が重要であること、さらにこれらの下流でLATERAL ORGAN BOUNDARIES domain 16 (LBD16)およびLBD29が機能することがすでに明らかになっている (奥島ら、2007)。LBDタンパク質群も転写因子として機能すると考えられるため、現在、側根形成で働くLBD16の下流遺伝子の同定を目的に、マイクロアレイを用いた解析を行っている。arf7 arf19二重変異体は側根形成能を顕著に欠くが、LBD16の過剰発現により部分的に側根形成能が回復する。このことを利用し、arf7 arf19二重変異体背景でLBD16の時期特異的な機能活性化に伴って発現上昇する遺伝子を探索している。本発表では、複数のLBD16下流遺伝子候補について、発現解析やノックアウト変異体の解析の結果を報告する。

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近年、CLV3/ESR-related（CLE）タンパク質の一つであるCLAVATA3 (CLV3)がヒドロキシル化されたプロリンを2つ持つ12アミノ酸からなるペプチドとして植物内で存在することが発見され、植物の発生制御に関わる細胞間および細胞内情報伝達においてのペプチドホルモンとその受容体と想定される受容体様キナーゼ（RLK）の重要性がますます注目されるようになっている。特にシロイヌナズナの茎長分裂組織のサイズ制御に関わるCLAVATA (CLV)の系はこれまでの遺伝学的研究から、CLAVATA1によりコードされるロイシンリッチリピート（LRR）型のRLKとCLAVATA2産物であるLRR型の受容体様タンパク質を含むレセプター複合体によりCLV3ペプチドが認識されることで茎長分裂組織のサイズ増大に関わる情報伝達を抑制していると推定されているが、このCLV系をはじめ、CLEペプチドはその植物内での成熟、移行、受容、その後に続く受容細胞内での情報伝達等、その詳細な分子機構は未だ不明である。そこで我々はこのCLV系に特に注目し、これらの点を明らかにしようと試みている。まず、CLVシグナリングに関わる更なる因子を明らかにするために、CLV3合成ペプチド非感受性突然変異体を探索している。また、抗体や形質転換植物等の遺伝学的、生化学的ツールを作成中である。これらの研究の進展について紹介したい。

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高等植物3量体Gタンパク質は、植物ホルモン、光、エリシターなどの情報伝達に関与している。イネ3量体Gタンパク質αサブユニット遺伝子（Gα）欠失変異体（d1）は、矮性、短粒、濃緑葉などの表現型を示すため、Gαは伸張成長や形態形成に関わっていると推定されている。Gβサブユニット遺伝子（Gβ）に関しては、RNAi法による発現抑制個体を解析した結果、Gαとは異なった表現型を部分的に示し、αとβサブユニットは、互いに異なった機能を有する可能性がある。
今回は、Gαおよびβが発現している組織・器官等を詳細に解析するため、それぞれの遺伝子のプロモーター領域に、レポーター遺伝子であるβ-glucronidase遺伝子（GUS）を連結したコンストラクト（Gα promoter::GUSおよびGβ promoter::GUS）を作出し、形質転換体における発現解析を行った。Gα promoter::GUS形質転換体は、伸長している葉、伸長している節間、発達中の外穎・内穎で、強い発現がみられた。完全に伸長した組織では、レポーター遺伝子の発現は弱かった。これらの結果は、細胞伸長の初期に、3量体Gタンパク質シグナリングが重要な働きをしていることを示唆している。GαとGβが協調的に発現しているか否かに留意して、Gβ promoter::GUS形質転換体の解析を進めている。この結果も併せて報告する。

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大部分の植物の葉は扁平な構造をもつが、ネギ（Allium fistulosum L.）を含む一部の植物では、葉身の内部に空洞を形成する。この空間がどのような役割を担っているのか、またどのような気体組成なのかよくわかっていない。ネギの葉身の生育段階を追って観察すると、若い葉の内部は液胞が発達した細胞で満たされているが、発達につれて空洞が形成されることがわかる。さらに、空洞形成過程中の極限られた一時期に限り、粘性の高い液体（多糖類溶液）が蓄積する。葉身内部を観察するために、一度葉身を切断すると生育がそこで停止するため、連続的な観察は困難である。しかしながら、Magnetic Resonance Imaging (MRI)法は生物組織の内部を非破壊的に観察することが可能であるため、同じ個体を用いて連続的にネギの葉身の発達過程を観察することができる。今回、MRI法と組織切片の観察を対応させ、いつ、どのようにしてネギの葉身が空洞化するのかを調査した。さらに、ガスクロマトグラフィーを用いて葉身内部の無機ガスを分析したところ、外環境より二酸化炭素濃度が高く、酸素濃度が低いことがわかった。本発表では、ネギの葉身の発達に関する基本的な特徴をまとめたので報告する。

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As plants grow, cell division plays a key role in proper development and appropriate shape. Recent study of Kip-related proteins (KRPs), which are inhibitor of cyclin-dependent kinase (CDK), indicated that negative regulation of cell division plays an important role in plant morphogenesis. To investigate how KRPs affect leaf morphology, we have characterized transgenic Arabidopsis overexpressing KRP gene families. In this study, we have observed the common phenotype, for example, reduced sized leaves with serration and reduced fertility from transgenic plants of each type of KRPs overexpression. Interestingly, the phenotype of bifurcate leaves with serration was observed only in transgenic plants overexpressing Group III KRPs. In addition, rolling up and curvature phenotype of leaves was observed in transgenic plants overexpressing KRP6. Taken together, we will discuss about the roles of KRPs in the regulation of cell division in leaf morphogenesis from our results.

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Agrobacteium rhizogenesの腫瘍化遺伝子rolBは形質転換植物細胞を根に分化させる機能を持つが、その分子機構はよく分かっていない。我々は、35Sプロモーターで過剰発現するrolBを導入したタバコBY-2細胞は、増殖能が低下しデンプン粒が蓄積することを見出した。一方、非形質転換BY-2細胞はオーキシン枯渇時にデンプン粒を蓄積し、サイトカイニン添加で促進されることが知られている。そこで、rolB形質転換BY-2細胞のデンプン粒蓄積が同様な機構で起こるのか調べた。BY-2細胞からRNAを単離し、定量RT-PCR法でデンプン合成及び分解系の遺伝子の転写レベルを測定した。オーキシン枯渇時の非形質転換BY-2細胞では、ADP-glucose pyrophosphorylase、granule-bound starch synthase、starch branching enzyme遺伝子のいずれも転写促進され、デンプン合成系が活性化されるが、rolB形質転換細胞ではこれらの遺伝子の転写促進は見られなかった。一方、デンプン分解系のα-amylase、β-amylase、α-1,4-glucan phosphorylase遺伝子の転写産物を調べた結果、α-amylase遺伝子の転写産物が減少しており、その転写抑制が考えられた。また、rolB形質転換BY-2細胞のα-amylase活性の低下も確認された。以上より、rolB形質転換BY-2細胞のデンプン粒蓄積にはデンプン分解系抑制の関与が示唆され、培養細胞のメリステム形成に先立つ組織のデンプン粒蓄積に類似していると思われる。

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植物の器官は茎頂分裂組織(SAM)に由来する．植物の成長に伴って起こるSAM のアイデンティティの転換は植物の形態形成に重要である．本研究では花分裂組織(FM) への転換に着目し，イネの穂の形態が異常な変異体tawawa1 (taw1) を解析している．
taw1 は穂の分枝である枝梗が野生型より多く，1穂の小穂(イネの花) 数は約2倍である．イネのSAM は数個の1次枝梗原基を分化してから退化し，taw1 では1次枝梗が増加するので，SAM の退化が遅れていると考えた．また，1次枝梗や2次枝梗にできる側生器官の数に差はないが，野生型ではほとんどが小穂なのに対して，taw1 では枝梗が多い．したがって，taw1 では側生分裂組織のFM への転換が遅延すると考えられた．小穂で最初に形成される副護穎，護穎がtaw1 では葉状化し，さらに花器官にも異常が見られる．これらからTAW1 は小穂としてのアイデンティティの獲得に必要だと考えた．出葉速度や分げつ性に野生型と変異体で差がなく，栄養成長相のSAM には影響しないと考えられた．
マッピングによりTAW1 遺伝子を同定した．TAW1 は生殖成長相の茎頂で発現し，変異体での転写レベルは野生型に比べ顕著に下がっていた．
イネのFM遺伝子は未報告であり，TAW1 はその点で興味深い．また，植物ホルモンやFM への転換を抑制する遺伝子との相互関係も議論したい．

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トマトの栽培においては、低温や日照不足による花器発育不全、高温による花粉発芽や花粉管伸長抑制、通風不良から来る受粉不良などによって、結果不良になるという問題を生じる。このため、結果促進には花粉媒介昆虫の利用やオーキシン系のホルモン剤である4-クロロフェノキシ酢酸(4-CPA：トマトトーン)等の処理がなされているが、これらはコストや労働負担を増大させる。これらのことから、トマト栽培における結果安定と省力化のためには、果実形成や結果性機構の解明及び優れた形質を持つ単為結果性トマトの育成が求められている。本研究では、果実形成や結果に関与すると考えられるチトクロームP450(CYP78 Aサブファミリー)の機能解析を行い、トマト果実形成に関与する重要因子の解明及び同遺伝子を制御した単為結果性トマトの作出を試みる。
Degenerate PCR法及びRACE法によりトマトからCYP78 Aサブファミリーの全長cDNAを4種類(LeCYP78A1-4)単離し、発現解析を行った。これらのうち、LeCYP78A2のトマト子房での発現は受粉後1日目から急激に増大し、2日目には受粉していない子房の100倍以上の発現量を示した。また、除雄した子房に4-CPAを処理したところ、その発現は処理1日目から未処理の子房の100倍以上に増大した。現在、LeCYP78A2遺伝子をシロイヌナズナ及びトマトに導入し、その機能解析を試みている。

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PTBはhnRNP typeIに属するRNA結合タンパク質である。動物細胞においては、mRNAの細胞内輸送、代謝および選択的スプライシングの制御といった様々な役割を担い、発生・分化などに深く関与することが明らかにされている。植物PTBタンパク質のデータベース検索により、シロイヌナズナにおいては2種のPTB(AtPTB1,2)が同定され、AtPTB1および2は成熟花粉粒と柱頭で強く発現し、さらに、珠柄においても発現することが示された。双方の変異体(ptb1^-/-およびptb2^-/-)を得たが、これら変異体の発生・分化・成長には異常に見られなかった。二重変異体(ptb1^-/-ptb2^-/-)の作出を試みたが、当該変異体を得ることができなかったことから、PTBが植物の生殖、発生または成長に不可欠な遺伝子と推定された。ptb1^-/-ptb2^+/-および ptb1^+/-ptb2^-/-変異体の花粉を観察したところ、ptb1^-/-ptb2^+/-では約1/3の花粉粒で発達異常が見られた。また、ptb1^-/-ptb2^+/-および ptb1^+/-ptb2^-/-変異体とも、花粉の発芽率が野生型の約半分程度であることが示された。現在、ptb1^-/-ptb2^+/-で見られる花粉粒異常が花粉の形成・成熟のどの過程で起きているのかを、成熟花粉が四分子のままである変異体(qrt)を用いて解析を進めている。また、以前の発表者の研究により、イネPTBが核-細胞質を移動している可能性が示唆されていることから、AtPTB1,2-GFP融合タンパク質の各組織における細胞内局在性を調べる予定である。

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花粉壁の外層を構成するエキシンは、雄性配偶子の保護や花粉媒介者への接着、柱頭による認識など様々な役割を果たすと言われている。エキシンは花粉自身と葯壁のタペート細胞の働きによって形成されると言われているが、その機構やそれに関わる遺伝子についてはまだほとんどわかっていない。そこでシロイヌナズナを材料に用いて、変異原処理した個体の花粉を走査型電子顕微鏡で観察するという手法でスクリーニングを行い、エキシンの構造に異常を示す新奇突然変異体の探索を試みた。
現在までに約2000個体の花粉を観察し、エキシンが異常なkaonashi（kns）突然変異体を12ライン得た。野生型のエキシンは規則的な網目模様をしているが、変異体の多くはそのパターンに異常を示した。今まで報告例のない表現型も多く、本スクリーニングによってエキシンの形成に関わる未知の遺伝子が多数同定できると期待している。kns突然変異体の多くではそれほど顕著な稔性の低下が見られなかったが、これはエキシンの構造が必ずしも受粉の成否を決めるわけではないことを示している。現在エキシンの編目模様が細かくなるkns2と、エキシン層が非常に薄くなるkns4について、マップベースクローニングによる原因遺伝子の同定を進めている。

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花粉母細胞の減数分裂により生じた小胞子は、その後の花粉成熟過程で受粉・発芽・受精に備えた体制を構築する。四分子期一過的、タペート層特異的に発現し、PHDフィンガーモチーフを含む核タンパク質をコードする、シロイヌナズナMS1遺伝子は、初期の花粉成熟過程を制御する転写因子である。ms1突然変異体では特徴的な花粉壁エキシン構造が見られないことから、MS1はエキシン形成に必要な遺伝子群を制御していることが示唆された。一方、MS1に制御される遺伝子には、一連の脂質及びフェニルプロパノイドの生合成・代謝系遺伝子群が含まれていた。エキシンは、スポロポレニンと呼ばれる脂質とフェニルプロパノイドから成る重合体を主成分とすることから、これら遺伝子はスポロポレニンの生合成酵素遺伝子の可能性がある。メタボローム、遺伝学、分子生物学等を用いた解析から、これら遺伝子群の機能を考察する。

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SBP-boxファミリーは植物特異的な転写因子群であり、シロイヌナズナには16遺伝子(SPL1～16)が属する。SPL10はSPL11と78%の相同性を示し、5’UTRおよびプロモーター領域も保存されていること、発現パターンも類似していることから、重複した機能を持つことが予測される。事実、spl10変異体は表現型が表れず、spl10 spl11二重変異体の解析が必要である。しかしながら、SPL10とSPL11はゲノム上で隣接しており、掛け合わせによる二重変異体の作成が困難である。そこで、内在の転写因子や重複した機能を持つ転写因子に対してドミナントに働くキメラリプレッサーを用いた解析(CRES-T法)を行った。SPL10にリプレッションドメインを付加し、これを植物体内で過剰発現させると、頂芽優勢の欠失、花柄が短くなることによる花序形態の異常、花器官・さやの形態異常が見られた。電子顕微鏡による観察、および切片の観察より、さやのreplum領域の拡大と、valve細胞の形態異常が明らかになった。花器官では、がくの形態が花の発生初期から異常が見られた。以上のことから、SPL10は器官形成において重要な役割を果たしていると推測される。さらに、これらの表現型を引き起こしている原因遺伝子について考察する。

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シロイヌナズナvip6/elf8遺伝子（At2g06210）の欠損は早期花成の表現型をもたらすが、それはVIP6/ELF8タンパク質を成分として含むPAF1複合体が花成抑制因子FLCの遺伝子発現の活性化に必要であるからとされている（Oh et al., 2004; He et al., 2004）。しかし、これら二つの論文で用いられているものを含む複数のSalk研究所T-DNA挿入ラインと、私たちがかずさDNA研究所のT-DNAタグラインから独自に同定した1ラインのすべてのラインにおいて、抗生物質耐性を示す発芽種子の遺伝子型はすべてヘテロであり、その原因はホモ挿入個体が胚性致死となるためであることを昨年度の本学会で報告した。しかしながらその後、ごく稀ではあるがホモ挿入個体が得られることが判明した。ホモ挿入個体は矮性で茎が細く、茎生葉が小さく、野生型に比べ多くの花が咲き、老化が早く起こったが、種子は全く得られなかった。花の形態を詳細に観察すると、萼の周縁部が花弁のように白くなり、花弁が発達不全で外部からほとんど見えず、花糸がほとんど伸びず、先端の葯も緑色で、葯内部での花粉形成が確認できなかった。以上のように、vip6/elf8遺伝子は有性生殖に必須の遺伝子であることが示された。

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ゼニゴケ（Marchantia polymorpha L.）は雌雄異株の植物であり、ゲンマと呼ばれる無性芽で増殖するほか、有性生殖も行い増殖する。ゼニゴケは一年に2回、雌器托および雄器托と呼ばれる傘状の組織（生殖器）を形成し、その下に造卵器および造精器を形成して有性生殖を行う。また、生殖器は長日下で誘導されることが知られている。しかし、そのメカニズムについては未だ不明なことが多く、分子遺伝学的な解析もほとんど行われていない。
最近、シロイヌナズナのFTタンパク質およびイネのFTホモログ（Hd3a）が日長の感受と花芽形成を結びつける花成ホルモン（フロリゲン）の正体であることが示された（Coupland et al. 2007, Shimamoto et al. 2007）。同じく日長によって制御されている可能性があるゼニゴケの生殖器の誘導にも、FTホモログが関与している可能性が考えられた。そこで、ゼニゴケのFTホモログを単離し、解析を行った。EST情報を元にFTと相同性の高い配列を2つ単離し、それぞれMpFT1、MpFT2と命名した。MpFT1はシロイヌナズナFTに対して、アミノ酸レベルで37%、MpFT2は42%の相同性を示した。MpFT1とMpFT2は葉状体と生殖器のどちらでも発現していた。現在、MpFT1とMpFT2の機能欠失体を作成しその表現型の解析を行っている。

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