厳密に制御した実験条件下で同一遺伝型の植物個体にわたってサンプリングしたメタボロミクスデータは、代謝物レベル間で有意な相関関係をもつ。過去の研究では代謝相関ネットワークのトポロジについて調べられていたが、相関ネットワーク内で密に連結した代謝物ノード群 (相関モジュールと呼ぶ) が「遺伝型依存あるいは組織依存の代謝経路」と対応するかどうかは不明であった。我々はガスクロマトグラフ質量分析計 (GC-MS) を用いて、シロイヌナズナの3種の遺伝型 [Col-0, methionine overaccumulation 1 (mto1), transparent testa4 (tt4)] の根サンプルについて代謝一斉分析を行った。この根データと発表済みの地上部データとを合わせて、地上部と根との間あるいは遺伝型間で代謝相関比較を行った。また、構築した代謝相関ネットワークに対し、グラフクラスタリングを用いて相関モジュールを抽出した後、各モジュールについてKEGG pathway enrichment analysisを行った。その結果、グラフクラスタリングアプローチが代謝経路に関連した遺伝型依存的あるいは組織依存的な代謝物相関クラスタを与えることを示す。

抄録全体を表示

高感度かつ高選択性の検出が可能なタンデムマススペクトラム（MS/MS）解析は、多様な植物代謝産物の構造推定に利用可能である。本発表では、植物代謝産物のMS/MS情報を文献の調査と標準化合物の測定によって収集したWEBデータベースRiken mass spectrometry (ReSpect, http://spectra.psc.riken.jp/) を紹介する。これまでに8459 件のMS/MSとそのメタデータをMassBankデータ形式 (http://www.massbank.jp/) に統一して収録している。また、これらのデータは全てダウンロードして利用可能である。ReSpectのスペクトル検索機能は、クエリー（テキスト形式のMS/MS情報：各：m/z 値と相対強度値）と収録データ間でコサイン類似度を計算し、ユーザが設定した閾値に従ってスコアが高い順に収録されたスペクトルを表示する。すなわち、クエリーと一致または類似するMS/MSを自動的に検索することができる。このReSpectのスペクトル検索機能およびデータリソースを利用すれば、MS/MS解析した未同定の植物代謝産物候補の構造推定情報を付与することが可能になる。現在、ReSpectおよびこのデータリソースを利用し、予め標的を絞らない非ターゲット解析で取得したMS/MSの大規模な構造推定に挑戦している。

抄録全体を表示

本研究では，グルコシルセラミド（GlcCer）を精製せずに，植物のGlcCer分子種をより簡便に同定・定量する方法を開発したので報告する。全脂質を弱アルカリ処理し，生じた遊離脂肪酸をSep-Pak Plus Silica Cartriges(Waters)で除いた後，GlcCerを含む脂質画分をLC/MS/MSによって分析した。メタノール/ギ酸(1000/1, v/v)，および，水/ギ酸(1000/1, v/v)の二液グラジエント，流速0.2 mL/min，カラム温度40oCによってGlcCer分子種を分離した。分子種の同定・定量は，タンデム四重極型質量分析計(ACQUITY TQD, Waters)を使用し,MRM+モードで行った。GlcCer分子種のプロダクトイオンの検出は，LCB部分で行った。東ソーのカラムTSKgel ODS-100Z (炭素含量20%, 粒子径3 micro m, TOSOH)を使用し，長さの異なる3種類のカラムによって各分子種の分離の程度を比較した。その結果，250 mmの長さのカラムを使用することによって，C16からC26までの構成脂肪酸（2－ヒドロキシ脂肪酸）を有する分子種において，定量解析できるレベルでのLCBの8位のシス/トランス異性体に基づく2つの分子種を分離することができた。

抄録全体を表示

タデ科植物であるエゾノギシギシは葉にシュウ酸を高蓄積する多年生草本である。その一方で、そのシュウ酸蓄積機構に関する知見は少ない。当研究室におけるメタボローム解析の結果から、葉のシュウ酸の蓄積量とシュウ酸前駆物質（クエン酸、アスコルビン酸）との間に高い正の相関があること、茎の炭素化合物が葉のシュウ酸合成に影響を及ぼすことが示された（Miyagi et al, Metabolomics, 2010a, b）。そこで、本研究では茎の炭素源が葉のシュウ酸蓄積に及ぼす影響を調べるために¹³CO₂を用いたトレーサー実験を行った。すなわち、¹³CO₂処理した植物における¹³C-シュウ酸とその周辺代謝物の濃度をCE-MSで測定した。その結果¹³C-シュウ酸が葉に高蓄積すること、茎では¹³C-クエン酸等の濃度が減少する一方で新生葉のシュウ酸合成に茎の炭素化合物が使用されることが示された。さらに、高CO₂がシュウ酸等の代謝物に及ぼす影響を調べるため、1000 ppm CO₂および栄養塩処理個体の代謝物解析を行った。その結果、葉では栄養塩処理によって主にアミノ酸の濃度が増加するのに対し、CO₂処理により有機酸が増加した。一方、CO₂と栄養塩を同時に処理した個体にシュウ酸濃度の増加が見られ、バイオマス量が著しく増加した。

抄録全体を表示

リンドウは岩手県を代表する花卉であり、全国一の生産量を誇っている。リンドウの品種維持の方法として、現在ではクローン苗培養が用いられているが、培養条件に関わる研究は全く行われておらず、未だ培養不可能なリンドウが数多く残されている。
そこで本研究では、最適な培養条件の確立に向け、主要栄養素であるリン及びカリウム含量を改変したMS培地における、リンドウの生長と代謝物変化を調査した。カリウム欠乏（－K）条件では明らかな影響は見られなかったが、リン欠乏（－P）条件では著しい生育阻害が観察された。興味深いことに、-P条件ではリンドウの越冬器官である越冬芽が形成されることが明らかとなった。そこで、それぞれの条件で育成したクローン苗及び越冬芽から得られた代謝物データを多変量解析した結果、それぞれの条件で特徴的に変動する代謝物群が検出された。-K条件ではATPやNAD等の一時的な増加が観察され、ポリアミンであるプトレシンの顕著な蓄積が観察された。一方、-P条件では、TCA回路の代謝物や、糖リン酸やヌクレオチド等のエネルギー物質が顕著に減少した。この結果から、Pはクローン苗の生育に必須であり、生育不適環境と認識した苗が生存の為に越冬芽を形成したと考えられた。これらの知見は、クローン培養及び圃場におけるリンドウの栽培に有益であり、特に越冬芽の形成と萌芽の調節は新たな栽培技術としての貢献が期待できる。

抄録全体を表示

近年オゾン層の減少により、地表に到達するUV-B照射量は増加傾向にある。UV-Bは植物の生長に深刻なダメージを与えることが知られており、UV-Bストレスに対する植物の防御機構を解明することは、今後UV-B耐性作物の作出を行う上で重要である。我々は、植物が生産するUV-B防御物質の生産機構を解明するため、フラボノイド生合成経路内の鍵酵素遺伝子を欠損したシロイヌナズナ変異体2種類(TRANSPARENT TESTA [tt] 4 およびtt5)およびシナポイルマレート生合成の鍵酵素遺伝子に変異を持つsinapoylglucose accumulator 1 (sng1)を用い、短期および長期UV-B照射による代謝物群の変化を調べた。短期UV-B照射処理により、4種の遺伝型に共通して一次代謝物群の蓄積量が変化したのに対し、二次代謝物群の蓄積は観測されなかった。長期UV-B照射処理の結果、UV-B吸収能力のある二次代謝物群の蓄積が観測されたことから、初期の一次代謝物群の変動は二次代謝物群の生産のために起こると考えられた。次に、野性型、tt4およびsng1に対し、短期UV-B処理における転写物プロファイルを行った。その結果、変異体ではUV-B防御に重要な役割を持つ物質群を失うことで、変異体は早く老化が進むこと、さらにUV-B照射によって特異的に誘導される老化関連遺伝子群を特定した。

抄録全体を表示

液胞膜上には30種を超えるトランスポーターがあると推定されているが、その多くの機能は未解明である。本研究では、液胞膜上に存在することが分かっているトランスポータータンパク質遺伝子（At3g21690）を過剰発現させたシロイヌナズナ植物体の代謝物解析を行なった。
実験手法としてフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析装置(FTICR-MS)を用いて当該遺伝子過剰発現植物体での代謝物解析を行った。比較対象としてコントロール形質転換植物体と、液胞膜上に局在するが当該遺伝子のコードするものとは機能的に無関係と思われるトランスポータータンパク質遺伝子の過剰発現植物体を用いた。
過剰発現形質転換植物体においてコントロールと比べてグルコシノレートの増加が認められ、イソチオシアネートのピークも増加が認められた。また、野生株（Col-0）植物体ロゼット葉から単離した液胞画分よりグルコシノレートと考えられる質量ピークが検出された。これらの事からグルコシノレートが標的遺伝子にコードされるトランスポーターの輸送基質候補と考えられる。現在この検証を目的として、単離液胞取得が比較的容易な培養細胞系において液胞膜輸送関連因子とグルコシノレート生合成を制御するMYB転写因子の二重過剰発現体の作成を行っている。本研究はJST・CRESTの支援をうけて実施された。

抄録全体を表示

精密質量分析装置の高分解能により、天然同位体存在比を考慮したモノアイソトピック質量値が分離され、精密質量値から化合物の組成式が計算される。天然物に存在する酸素原子の中には、大気中の酸素がP450等の一原子酸素添加酵素によって取り込まれるものが知られており、多数のP450等を持つ高等生物では大気中の酸素を取り込む頻度が高いと予想される。代謝物とそれに含まれる酸素原子の由来の関係を明らかにするために、同位体酸素環境下で生育した光合成生物（ミヤコグサ、ヒメツリガネゴケ等）の代謝物をLC- Orbitrap-MSにより分析し、代謝物に取り込まれた同位体酸素原子を中心に解析を行った。
1週間及び4週間同位体酸素環境下で生育（22度、16時間明所：8時間暗所）したミヤコグサ地上部の代謝産物を分析したところ、4週間生育した植物のみで、主にフラボノイドの非糖部に同位体酸素原子が取り込まれたことを確認した。一方、同位体酸素環境下4週間生育（22度、24時間明所）したヒメツリガネゴケ地上部では、同位体酸素原子が取り込まれた代謝物は確認されていない。現在、4週間生育したミヤコグサ地上部の代謝産物に関して、フラボノイドを含め、同位体酸素原子が取り込まれた化合物のアノテーション解析を行っている。MS/MS分析による同位体酸素原子が取り込まれたフラボノイドの非糖部の詳細な部分構造解析を行っている。

抄録全体を表示

フォトトロピン（phot）は、被子植物において光屈性、気孔開口、葉緑体定位運動、葉の平坦化などに関わる青色光受容体である。本研究では、photが関与する青色光応答メカニズムを明らかにするため、現生陸上植物の最も基部に位置する苔類の1種、ゼニゴケをモデルとして用いた。まず、ゼニゴケの原糸体および葉状体について、青色光に対する応答を調べた。一方向からの青色光照射により、ゼニゴケが青色光に対して正の屈性を示すことを明らかにした。また、原糸体に対して偏光を照射することで、ゼニゴケの原糸体が青色偏光の振動面に対して垂直な方向へと生長する偏光屈性を示すことを明らかにした。さらに葉状体において、青色光に対する葉緑体光定位運動を観察した。同定された原糸体の光屈性を指標として、γ線照射した胞子から青色光応答変異株の単離を行った。次に、ゼニゴケphot遺伝子（MpPHOT）を単離した。MpPHOTは1分子種であり、系統解析では、種子植物の基部に位置するコケ植物のPHOTのクレードに分類された。ホウライシダphot2変異体を用いた相補実験により、Mpphotが葉緑体の逃避反応を制御できることが示された。ゼニゴケはphotを介した青色光応答反応についての基本的な仕組みを備えたモデルであると期待される。

抄録全体を表示

プロテインホスファターゼ1（PP1）は触媒サブユニット（PP1c）と調節サブユニットからなるホロ酵素であり、孔辺細胞において青色光受容体フォトトロピンと気孔開口の駆動力を形成する細胞膜H⁺-ATPaseの間の情報伝達を正に制御する。しかしながら、PP1が青色光情報を伝達する分子機構や、PP1の活性、細胞内局在、基質特異性を決定する調節サブユニットの実体については不明である。本研究では、孔辺細胞に発現する植物に特異的な調節サブユニットとしてPRS2（PP1 Regulatory Subutnit2）を得た。シロイヌナズナには9つのPRS2様タンパク質が存在し、このうちの2つはPP1cの認識に必要なRVxFモチーフを介してPP1cと結合することが分かった。シロイヌナズナのprs2二重変異体では青色光に応答した気孔開口、H⁺放出、細胞膜H⁺-ATPaseのリン酸化の低下が見られたが、フォトトロピンの自己リン酸化は正常に見られた。prs2変異体に野生型PRS2を形質転換すると気孔開口は回復したが、RVxFモチーフ変異型PRS2では回復しなかった。さらに、PP1c阻害剤であるトートマイシンは、prs2変異体とよく似た阻害作用を示した。以上の結果は、PRS2はPP1調節サブユニットとして機能し、フォトトロピンとH⁺-ATPase間の情報伝達を制御する可能性を示唆する。

抄録全体を表示

シロイヌナズナのフォトトロピン（phot1、phot2）は、気孔開口の青色光受容体である。フォトトロピンが青色光を受容すると、下流の未知の情報伝達系を経て細胞膜H⁺-ATPaseが活性化され気孔が開口する。一方、RPT2（ROOT PHOTOTROPISM2）はフォトトロピンに依存した根の光屈性の情報伝達因子として同定された因子である。以前シロイヌナズナのphot2とRPT2の両方を欠くphot2rpt2二重変異体では青色光による気孔開口が起こらないことが報告され、RPT2の気孔開口への関与が考えられた。そこで本研究ではシロイヌナズナのrpt2変異体およびフォトトロピンとの二重変異体について、気孔開度及び孔辺細胞における青色光に応答したH⁺-ATPaseの活性化について詳細に調べた。その結果、rpt2変異体だけでなくphot2rpt2二重変異体においても青色光に応答した気孔の開口や孔辺細胞H⁺-ATPaseの活性化がみられ、この応答は野生株と同等であった。これにより、これまでの報告と異なりRPT2は青色光に応答した気孔開口の情報伝達に必須でないと考えられる。

抄録全体を表示

青色光は、孔辺細胞に発現する青色光受容体フォトトロピンに受容され、細胞膜H⁺-ATPaseのC末端から2番目のスレオニンのリン酸化を引き起こすことにより活性化し、気孔開口の駆動力を形成する。これまで、青色光に依存したH⁺-ATPaseのリン酸化は、孔辺細胞プロトプラスト（GCPs）を用いた生化学的解析により行われてきた。しかしながら、生化学実験に用いるGCPsの調整には、大量のロゼット葉（5,000枚以上）と長時間の作業時間（約8時間）を要するという問題点があった。そこで本研究では、一枚のロゼット葉より単離した表皮組織を用い、免疫組織染色による孔辺細胞H⁺-ATPaseの検出を試みた。まず、H⁺-ATPaseに対する特異的抗体を用いて免疫組織染色を行った結果、孔辺細胞において強いシグナルが検出された。次に、H⁺-ATPaseのC末端から2番目のリン酸化スレオニンを特異的に認識する抗体（anti-pThr₉₄₇）を用いて検出を行った。その結果、野生株では表皮組織に青色光照射することにより、孔辺細胞H⁺-ATPaseのリン酸化が検出されたが、フォトトロピン二重変異体では全く検出されなかった。以上の結果は、一枚のロゼット葉由来の表皮組織を用いた免疫組織染色により、青色光・フォトトロピンに依存した孔辺細胞のH⁺-ATPaseのリン酸化を検出することが可能であることを示している。

抄録全体を表示

Green light is a major constituent of sunlight and is enriched in the leaf canopy. Compared with the stomatal responses to red light or blue light, virtually nothing is known for the stomatal responses to green light. Using intact sunflower leaves, we demonstrated that green light induces stomatal opening and suggested the existence of a green light receptor (Wang et al., 2008, PCE 31: 1307; PCP in press). This time, we present our recent data of the stomatal response to green light.
Stomatal opening in response to green light seems to be a phenomenon common to several herbaceous species, including sunflower, tobacco, and Arabidopsis thaliana. When the photosynthetic rate and stomatal conductance (Gs) of these leaves attained their steady states by a saturating red light, a weak green light pulse induced a further increase in Gs. It suggests that green light may employ a photosynthesis-independent pathway to induce stomatal opening. Moreover, a cyptochrome double mutant of A. thaliana showed significantly smaller green light response than the wild type. From these, we propose that cryptochromes to be a most likely candidate for green light receptor to mediate stomatal opening.

抄録全体を表示

植物の光屈性や葉緑体光定位運動、気孔開口などに関わる青色光受容体フォトトロピン（phot）は、N末端側に光受容ドメインとしてFMNを結合したLOVドメイン（LOV1，LOV2）とC末端側にSer/Thrキナーゼを持つ。暗所においてLOV2がキナーゼ活性抑制ドメインとして機能している。青色光により光反応が引きおこされ、保存されたCys残基とFMNの間で一過的にアダクトを形成するとLOV2のJαヘリックスで構造変化が生じ、キナーゼ活性抑制が解除され、photの自己リン酸化や基質分子のリン酸化が起こると考えられている。シロイヌナズナの二つのホモログの一つであるphot1のLOV2について、構造モデルを基にFMNからJαヘリックスに至る分子内シグナル伝達経路として（1）イソアロキサジン環‐N476‐K475と（2）FMNのリン酸基‐R529‐E537を推定した。経路上の同アミノ酸残基に対してAlaを導入したLOV2-キナーゼペプチドを作成し、光反応、ペプチドマップによる構造変化、リン酸化活性測定を行った。経路（1）上の変異ペプチド（N476A，K475A）は野生型と同様な光反応と構造変化を示したが、キナーゼ活性を示さなかった。一方、経路（2）上の変異ペプチドは野生型と同様だった。FMN近傍の変化はN476‐K475を経由し、キナーゼ活性を制御することが示唆された。

抄録全体を表示

我々はグルココルチコイド受容体を利用した機能誘導系を組み込んだ、シロイヌナズナの網羅的転写因子過剰発現系統から、光形態形成に異常を示す変異体の単離を試みた。その結果、DEXを添加した培地上で生育させると、明所でのみ胚軸長が野生型よりも徒長し、子葉面積も減少するといった表現型を示す変異体を単離した。この変異体の単色光下における表現型の観察を行ったところ、赤色光、遠赤色光条件下では胚軸の表現型が、赤色光下では子葉の表現型が観察された。これらの観察結果から、変異体の表現型がフィトクロム依存的な細胞内情報伝達経路の異常により引き起こされていると推測される。
この変異体に導入されていた遺伝子は、ZAT9として知られている機能未知のC2H2ジンク・フィンガー型転写因子をコードしていた。ZAT9とGFPとの融合タンパク質の細胞内局在を観察した結果、融合タンパク質が核内に局在している事が確認された。興味深い事にこの局在は暗所では観察されなかった。この核内局在を単色光下で観察したところ、青色光、赤色光、遠赤色光下で核内への局在が確認された。またZAT9が制御している遺伝子群をマイクロアレイ解析により調査した結果、フィトクロム依存的な細胞内情報伝達経路に関わる遺伝子群の発現が変動している事が解った。本発表ではZAT9が光形態形成の制御にどの様に関わっているのか議論する。

抄録全体を表示

CRES-T法は、任意の転写因子に抑制ドメインを付加し植物体内で発現させることにより、目的の転写因子のみならず重複転写因子の働きも広く強力に抑制することのできる技術である。これまでに、CRES-T系統ライブラリーの網羅的スクリーニングが各種条件下で行われてきており、ストレス耐性などを持つ各種有用植物の作出や、転写因子が関わる制御機構の解明に広く貢献している。
本研究では、転写因子の新規機能発見および新たな有用系統の単離を目指し、弱光条件下でシロイヌナズナCRES-T系統ライブラリーを栽培し、野生型と比較して異常な形質を示す系統の探索および解析を行っている。このスクリーニングにより、直接的もしくは間接的に各種光応答に関与する因子に加え、通常の光量下でのスクリーニングでは発見しにくい形質を持つ系統なども単離できると期待される。
これまでに、弱光下で異常形質を示す約250個体を単離し、その中から選抜した80個体における原因転写因子（もしくは転写関連因子）を同定した。現在、単離された系統の弱光下と通常光量下での形質の比較や、個々の形質に応じたさらなる解析を進めている。

抄録全体を表示

植物の主要な光受容体であるフィトクロム蛋白質は、光受容に働くN末端領域と、キナーゼドメインを持つC末端領域の、2つの領域から成る。従来フィトクロムは、C末端領域内のキナーゼ活性により下流にシグナルを伝達すると信じられてきたが、我々の研究によりその「常識」が覆され、フィトクロムの最も主要な分子種であるフィトクロムB（phyB）のシグナル発信ドメインが、C末端領域ではなくN末端領域であることが証明された。そこで我々は、phyBシグナル伝達経路の徹底的な見直しが必要であると考え、phyB N末端領域の新奇下流因子を順遺伝学的に効率よく同定することを目的として、遺伝子機能冗長性の問題を克服するための以下の3つの工夫を凝らした挑戦的な劣性変異体スクリーニング法を開発した。1) 僅かな表現型をできる限り誇張して変異体の単離を容易にするために、シロイヌナズナのcry1phyB二重変異体背景でphyB N末端領域を過剰発現させた形質転換植物を親株として用いる。これで、野生株を親株とした時に比べて表現型を5.4倍誇張できる。2) さらに、T-DNAタギング法を用いることで、僅かな表現型しか持たない変異体の原因遺伝子クローニングを可能にする。3) 形質転換植物をタギングする際に問題となる、導入遺伝子のサイレンシングを抑える。本発表では、本スクリーニング法の詳細と解析の経過について報告する。

抄録全体を表示

イネフィトクロムB(phyB)変異体は、赤色光下で第一葉や第二葉葉鞘は徒長し、薄緑である。この変異形質が回復した変異体PBS-19及びPBS-25をphyB-3にγ線を照射して得た変異プールから単離し、解析した。野生型の農林8号は、赤色光下でも葉緑体の発達が認められたが、phyB-3変異体での葉緑体は小さくチラコイド膜の発達も認められない。その一方で、回復体は葉緑体が野生型なみに回復し、PBS-25ではチラコイド膜で満たされていた。第一葉や第二葉葉鞘の赤色光強度に対する伸張抑制は野生型と同等に回復していた。興味深いことに、通常、赤色光下では直立し、青色光下で傾斜する第2葉が、回復体では赤色光においても第2葉が傾斜していた。
原因遺伝子（or 変異）を同定するために、日本晴遺伝子背景のphyB-1とこれら回復変異体を掛け合わせ、ポジショナルクローニングを試みている。

抄録全体を表示

イネにはPHYA、PHYB、PHYCの3種類のフィトクロムが存在する。PHYAタンパク質は、緑化した植物では蓄積量が少ないため解析が難しいが、我々は、タンパク質の抽出法の改善により、イネ緑葉においてPHYAの免疫ブロット分析を行えるようにした。本研究では第5葉が完全展開したイネを用いて、PHYAの発現量を調べた。第5葉身のPHYAタンパク質蓄積量は、葉鞘にくらべ少なかった。第4、5葉身のPHYA蓄積量に差はなかったが、第5葉鞘に内包され光があまり照射されない第6葉身では、第4、5葉身よりも蓄積量が多かった。第5葉身・葉鞘でのPHYAタンパク質量は、明期に入ると減少し、明期の終わりから暗期の終わりにかけて徐々に増加した。このときのPHYA転写産物量は、葉身ではタンパク質量との相関がみられたが、葉鞘では相関が小さく、変化も小さかった。エンドウなどにおいて、PHYAの発現調節にPHYBが抑制的に働くことが報告されている。そこで、イネphyB、phyCおよびphyBphyC変異体を用いた解析を行った結果、PHYAの蓄積には、主にPHYB一部PHYCが抑制的に働くことが示唆された。このように、PHYAの蓄積量はダイナミックに変動するにもかかわらず、この時期のphyA変異体表現型は認められていないことから、緑葉におけるPHYAの働きをさらに研究する必要がある。

抄録全体を表示

イネには、植物の赤色・遠赤色光受容体であるフィトクロムは、phyA, phyB, phyCの3分子種がある。イネフィトクロムの単独あるいは2重、3重変異体の解析から、3分子種が多岐にわたる光応答反応で協調しつつも役割を分担して機能することが示された。そこで、イネのPHYA, PHYB, PHYC、それぞれの遺伝子のプロモーター::GUSを作製して発現特性について解析した。その結果、PHYAが維管束特異的な発現パターンを示す一方で、PHYBとPHYCは発現も組織特異性も低く、分子種によって異なる発現特性をもつことが明らかとなった。また、PHYAの維管束特異的な発現は光環境によって影響を受ける事が示された。発現特性の生物学的意義を考察するために、オウンプロモーター::フィトクロム遺伝子によるフィトクロム変異体の機能相補解析に加えて、PHYAとPHYB間でのプロモータースワップ系統を作製、機能相補解析を行った。その結果、光形態形成においては、PHYAプロモーター::PHYBはphyB変異を相補できるがPHYBプロモーター::PHYAはphyA変異を相補できないことが判明した。さらに、出穂期について解析を行ったところ、長日条件においては光形態形成と同様の結果であったが、短日条件下においては、PHYBプロモーター::PHYAもphyA変異を部分的に相補することができることが分かった。

抄録全体を表示

鉄は植物を含む全ての生物にとって必須である。呼吸や光合成、DNA合成などの多くの生体反応に重要である。イネ科植物は鉄の要求性が高まると、三価鉄キレーターであるムギネ酸類を根で合成し、分泌する。分泌されたムギネ酸類は土壌中の不溶態鉄を可溶化し、「鉄・ムギネ酸類」錯体として根で吸収される。トウモロコシはC₄植物に属し、弱酸性や中性土壌では非常に生育が早いイネ科植物である。しかしながら、アルカリ土壌では容易に鉄欠乏となって、クロロシス症状を示し、生育は阻害される。トウモロコシのys1変異体およびys3変異体はいずれも葉脈間クロロシスを示し、鉄吸収に関わる変異体である。ys1変異体は「鉄・ムギネ酸類」錯体トランスポーターYS1に変異があり、「鉄・ムギネ酸類」錯体を吸収できない。ys3変異体はムギネ酸分泌量が著しく減少していることが報告されているが、その原因遺伝子は未だ特定されていない。トウモロコシは全ゲノム配列が決定されているが、機能の同定された遺伝子はシロイヌナズナやイネに比べて少ない。本研究では、トウモロコシのマイクロアレイ解析を用いて鉄欠乏により発現の変化する遺伝子を同定し、イネの遺伝子情報と比較しながら解析を行った。また、ys1、ys3変異体で発現の変化していた遺伝子についても解析を行ったので、報告する。

抄録全体を表示

植物は鉄欠乏に応答して鉄の吸収・利用に関与する遺伝子群の発現を誘導する。これまでに我々は、イネ科植物の鉄欠乏応答に関与する種々のシス配列およびトランス因子を同定・解析してきたが、この応答を引き起こすシグナルの実体は不明のままである。鉄欠乏応答性シスエレメントIDE1（Iron Deficiency-responsive Element 1）に特異的に結合するイネのABI3/VP1型転写因子IDEF1（IDE-binding Factor 1）は、イネに鉄欠乏応答と耐性を付与する主要な転写因子である。IDEF1の発現はイネの一生を通じて根、葉、花、種子などほぼ全ての器官で検出され、鉄栄養条件により発現量やパターンは変化しない。IDEF1は鉄十分条件および鉄欠乏初期において鉄の吸収・利用に関与する鉄欠乏誘導性遺伝子の大多数を正に制御する一方で、鉄欠乏進行期においては制御する遺伝子が異なり、鉄の利用に関与する一部の遺伝子や鉄欠乏応答性のlate embryogenesis abundant (LEA) 遺伝子などを制御する。以上のことから、IDEF1は植物体内の鉄栄養条件を感知する何らかのメカニズムを有すると考えられる。そこで本発表では、イネ科植物のIDEF1ホモログの配列を同定・比較し、鉄栄養条件の感知に関与する可能性のあるドメインを探索した結果を報告する。

抄録全体を表示

植物は根において鉄を可溶化し吸収する機構を持っている。根における鉄吸収の機構は全身性の長距離シグナルと根における局所的シグナルに制御されることが知られている。しかし、長距離シグナルそのものついては未知であり、また、どのような制御機構を経て根における鉄吸収を活性化させているのかは知られていない。これを明らかにするために我々はマイクロアレイを用いてシロイヌナズナの鉄欠乏応答を解析した。
根において鉄欠乏に応答する遺伝子を、長距離シグナルと局所的シグナルそれぞれに影響を受ける強度によって分類した。長距離シグナルに応答した遺伝子群、局所的シグナルに応答した遺伝子群をGene Ontologyに基づいて分類したところ、これら2つのシグナルはそれぞれ別の機能を持つ遺伝子群を制御することが分かった。さらに我々は、全身性の長距離シグナルを生産するために働く遺伝子を見つけるために、地上部と地下部で共通して鉄欠乏に応答する遺伝子に注目した。意外にも地上部と地下部の鉄欠乏で共通して発現量が増加した遺伝子は8つのみであり、4つのbHLH転写因子とニコチアナミン合成酵素を含んでいた。我々の結果と近年のいくつかの報告から、鉄キレート剤であるニコチアナミンが鉄吸収のための長距離シグナルとして働く可能性を示唆された。

抄録全体を表示

シロイヌナズナ(Col-0)の主根の伸長は鉄が過剰になると抑制され、鉄欠乏条件では促進される。従って、植物は鉄濃度を感知・応答して根の伸長を制御するメカニズムを備えていると考えられる。しかし鉄を含む栄養塩による根の伸長制御には未知の部分が多い。鉄による植物の形態制御機構を明らかにすることを目的に、我々は鉄濃度に対する根の伸長制御が異常になった突然変異体を選抜するための新規実験系を構築し、突然変異体を得たので報告する。予備検討の結果、1/2 MS培地から鉄およびリンを培地から除いた改変培地（選抜培地）上で生育させたシロイヌナズナ幼植物体の主根の伸長速度が10 mm/day程度であるのに対して、この選択培地にさらに鉄を後から添加すると主根の伸長速度が処理後1日目から8 mm/day以下になることを見いだした。これを元に、速中性子線(65 Gy)を照射した約8,000粒のM2種子を上記選抜培地に播種し、生育途中に鉄を添加しても根の伸長速度が低下しない突然変異体の選抜を試みた。その結果、60個体の突然変異体を単離し、そのうち少なくとも4系統で形質が後代へ遺伝することを確認した。既知の鉄関連突然変異体との比較から、今回得た突然変異体は新規の鉄関連変異体である可能性が高い。

抄録全体を表示

イネモノガラクトシルジアシルグリセロール合成酵素 (OsMGD)（UDP-galactose + diacylglycerol → UDP + monogalactosyldiacylglycerol）の過剰発現タバコを作出した。本酵素の発現は、イムノブロット、酵素活性で確認した。本植物でmonogalactosyldiacyl-glycerol, digalactosyldiacyl glycerolの両糖脂質が増加した。本酵素の細胞内局在性は葉緑体の内膜であった。過剰発現タバコの葉緑体で、チラコイド膜のグラナ構造が密であることが電顕観察で確認された。過剰発現タバコは塩に耐性を示すことが、成長、クロロフィル蛍光測定で確認された。興味深いことに本植物はリン欠乏ストレスに耐性を示した。過剰発現植物は糖脂質を増加させ、葉緑体の膜構造を強化させることで、塩ストレス耐性を示したと思われる。リン欠乏によるリン脂質の低下を糖脂質が代替することでリン欠乏耐性が上昇したと思われる。

抄録全体を表示

プロリントランスポーター（ProT）はもとはプロリンに特異的なトランスポーターとして単離されたが、それらはグリシンベタイン(ベタイン)も輸送する。本研究では、ベタインを蓄積する植物(シュガービート、アマランサス、アトリプレックス)と、蓄積しない植物（アラビドプシス）のBet/ProTの輸送特性を比較検討した。その結果これらのトランスポーターはプロリンよりもベタインに高い親和性を示した。ベタインとプロリンの取り込みはpH依存性を示し、プロトン脱共役剤であるCCCPで阻害された。これらのトランスポーターは、コリンを取り込めないミュータントにおいてベタインよりもコリンに高い親和性を示した。コリンの取り込みは、細胞外のpHに依存せず、CCCPにも弱くしか阻害されなかった。また、ナトリウムイオンでは誘導されなかった。In situハイブリダイゼーションの結果、シュガービートのBet/ProT1は塩で誘導され、篩部と木部柔細胞に局在した。これらの結果の生理的意味および輸送機構について報告する。

抄録全体を表示

最近、マルチ遺伝子型Na⁺/H⁺アンチポーター(Mrp)がラン藻に存在することが明らかになった。このアンチポーターの活性と生理的役割を明らかにするために、耐塩性ラン藻Aphanothece halophyticaからMrp遺伝子を単離した。Aphanothece halophytica のMrp遺伝子(Ap-mrp)はmrpCD1D2EFGAB (Ap-mrp)とクラスターを形成しており、その上流にNapA タイプ Na⁺/H⁺アンチポーター(Ap-napA1-2) および重炭酸イオントランスポーター (Ap-bicA) 遺伝子が配置していた。Ap-mrp遺伝子クラスターをアンチポーター欠損変異株である大腸菌TO114で発現させた。 Ap-mrpを発現させたTO114株は、Na⁺およびLi⁺に対する耐性が向上した。Ap-mrpを発現させたTO114株の反転膜を用いてAp-mrpのアンチポーター活性について解析を行った。また、淡水性ラン藻Synechococcus elongatus PCC 7942のmrpA欠損株を作出した。これらの結果について報告する。

抄録全体を表示

アルカリフォスファターゼ (APase) は、リン含有化合物からリン酸を遊離する為、生物がリン酸を栄養源として利用する際に重要な役割を担っていると考えられている。しかしながら、現在までにシアノバクテリアの APase についての報告は少ない。最近の海洋性バクテリアに関するメタゲノム解析の結果、アルカリフォスファターゼ D（PhoD）が、古典的な PhoA および PhoX よりも多く存在することが示された。今回、我々は耐塩性シアノバクテリア Aphanothece halophytica より PhoD 遺伝子を単離した。大腸菌を用いて PhoD 蛋白質を発現・精製し、PhoD の生化学的性質を検討したところ、PhoD は Ca²⁺ 依存性の APase であることが明らかになった。また、phoD 遺伝子は、リン欠乏環境下のみならず、塩ストレス環境下においても誘導された。さらに、phoD 遺伝子を導入した淡水性シアノバクテリアを用いて解析した結果、PhoD がシアノバクテリアの細胞外に分泌されることが明らかになった。これらの結果について報告する。

抄録全体を表示

近年，環境ストレス（高温, 低温, 活性酸素, 塩ストレス, 乾燥）により植物のラフィノース属オリゴ糖合成の律速酵素であるガラクチノール合成酵素遺伝子(GolS)の発現が強く誘導され,ラフィノース属オリゴ糖を蓄積することで乾燥・高温耐性を獲得することがシロイヌナズナやトマト(湯浅ら, 本学会, 2009)を用いた研究により示された．先行研究において過酸化水素処理したダイズの乾燥耐性の向上が示された．そこでダイズの乾燥応答におけるGmGolSの発現変動と調節メカニズムについて活性酸素とストレス応答性ホルモンの役割を解析した．半定量的RT-PCRにより，乾燥ストレス処理に応答してダイズのガラクチノール合成酵素ホモログGmGolSの発現上昇が示された．同時にダイズのエチレン合成酵素遺伝子GmACS, エチレン応答性転写因子GmERFの発現が上昇した．シロイヌナズナとトマトでGolS発現を誘導することが示された過酸化水素をダイズに処理した時, GmGolS発現増加と共にGmACS, GmERFの発現が増加した．また抗Ein3抗体によるイムノブロットにより，ERFの発現を制御するエチレン特異的転写因子GmEin3のタンパク質レベルの増加が観察された．以上の結果より，乾燥ストレスに応答したGmGolSの発現誘導に活性酸素およびエチレンシグナルの関与が示唆された．

抄録全体を表示

divinyl chlorophyllide reductase (DVR)はクロロフィル合成系においてBリングのビニル基をエチル基に還元する。シロイヌナズナのDVR（AtDVR)は変異体を利用して同定されたが、AtDVRと相同な遺伝子をもたないラン藻が存在する。ラン藻のモデル生物として利用されているSynechocystis sp. PCC6803のゲノムにもAtDVRと相同な遺伝子は存在しない。AtDVRと相同性のある遺伝子を持たないラン藻に共通に存在する遺伝子がラン藻のDVRであると仮定し、ゲノムを比較することによりSynechocystis sp. PCC6803のSlr1923がDVRであると予測された。その破壊株ではビニル基が還元されない。そこでSlr1923の組み換え体を作製したところ、ビニル基を還元し、Slr1923がDVR（SyDVR)であることが示された。
ラン藻の中にはSyDVRではなく、AtDVRと相同な遺伝子をもつものがある。そのような遺伝子がビニル基を還元する活性を持つかどうか調べた。海洋性のラン藻Synechococcus WH8102はSyDVRではなくAtDVRと相同な遺伝子を持つ。その組み換え体を作製したところ、ビニル基を還元し、DVRであることが示された。
以上より、ラン藻には二種類のDVRが存在することが明らかとなった。

抄録全体を表示

クロロフィル-c(Chl-c)は、酸素発生型光合成を行う藻類などに幅広く分布するエナンチオマー型クロロフィル色素である（他のクロロフィル類はジアステレオマー型）。Chl-cは、ポルフィリン骨格を有し、その17位にアクリレート基が結合している。また、その7,8-位の置換基によりChl-c₁ (7-methyl-8-ethyl)、Chl-c₂ (7-methyl-8-vinyl)、Chl-c₃ (7-methoxycarbonyl-8-vinyl)などの類縁体が存在する。このような構造的多様性を持つChl-cは、微細藻類の分類・同定の分子マーカーとしても利用されている。我々は、珪藻由来のChl-c₁とChl-c₂及び円石藻由来のChl-c₃に対して、NMR・CD・キラルHPLCを用いて詳細な立体構造解析を行ってきた。その結果、これら3種類のChl-c子では、エナンチオマー型光学異性構造として、(13²R)構造のみを有すことが確認された。この自然界における立体選択性を一般化するために、上記の微細藻類に加えて、他のChl-c含有光合成生物種についても網羅的に解析を行った。その結果、(13²S)構造を有す異性体（プライム体）が検出されなかったことから、Chl-c分子は、植物などでよく見られるChl-bと同様に、光合成系における補助集光色素と結論づけられた。

抄録全体を表示

クロロフィル生合成系のプロトクロロフィリド（Pchlide）還元反応には、進化的起源が異なる2種類の酵素、暗所作動型酵素（DPOR）と光依存型酵素（LPOR）が存在する。被子植物は、Pchlide還元をLPORのみで行っているため、暗所ではPchlideが蓄積し、エチオプラストにおいてLPORとの基質複合体を主要成分とする特殊な構造プロラメラ体（PLB）を形成する。PLBという特徴的な構造の形成が、LPOR固有の性質によるのか、被子植物への進化の過程で新たに付与された性質なのか不明である。本研究では、ラン藻Leptolyngbya boryanaのDPOR欠損株でラン藻のLPORを大量発現させる系を構築しLPORの存在状態に関する一連の解析を行った。L. boryana のLPORを大量発現するchlL欠損株を暗所で生育させ、電子顕微鏡で観察したところ、チラコイド膜とは明らかに異なる異常な構造体が認められた。抗LPOR血清を用いた免疫蛍光顕微鏡観察によりこの異常構造体がLPORを含むことが示唆された。明所シフト後の緑化速度比較、粗抽出液による活性測定の結果、ラン藻LPORはPchlide蓄積に依存して異常構造体を形成する性質を有するが、活性がNADPH添加に依存する点でPLBに光活性型として蓄積する被子植物のLPORと大きく異なることが示唆された。

抄録全体を表示

植物中の炭素動態を理解することは、植物の生長を理解するためには-重要である。本発表では、炭素11標識二酸化炭素とポジトロンイメージング技術を用いたダイズ中の炭素動態のイメージング手法の開発について発表する。この方法によって、光合成によって葉で固定された炭素が各シンク器官へと転流する様子を定量的に可視化することができる。さらに、今回は、体内の標識した炭素の総量が保存され、シンク・ソース間における定量的な解析を可能にするための改良を加えた。改良を加えた本手法を用いてフィージビリティスタディを実施した。ダイズ個体内の炭素動態画像の経時変化を元に、各器官における炭素濃度時間変化データが得られた。投与した炭素総量保存下における各データから、本手法の有用性を議論する。

抄録全体を表示

近年、私達はチラコイド膜を構成する脂質であるジガラクトシルジアシルグリセロールの合成能を欠損したSynechocystis sp. PCC 6803の変異株（dgdA株）から単離した光化学系II（PSII）では、二量体が減少して単量体が増加し、その単量体にはPsb28などのように二量体には存在しない蛋白質が蓄積することを報告した。このことは、Psb28がPSIIのアセンブリーに関与する可能性を示している。本研究ではPSIIにおけるPsb28の機能を明らかにするため、Synechocystis sp. PCC 6803を用いてpsb28破壊株やdgdA株との2重破壊株（psb28/dgdA株）を作製し、Psb28の欠損が高温や強光下での光合成特性に与える影響を解析した。psb28破壊株は通常の培養条件では野生株と同様の増殖を示したが、psb28/dgdA株は野生株やdgdA株に比べて増殖遅延を示した。38℃以上の強光条件下ではpsb28破壊株の増殖も野生株に比べ若干遅くなり、psb28/dgdA株の増殖遅延はさらに顕著になった。光合成光阻害の実験により、psb28破壊株は野生株に比べ光阻害を受けやすいことがわかった。以上の結果は、高温、脂質欠損等PSIIの光修復速度を通常より上昇させる必要のある条件で、Psb28はPSIIの修復サイクルに重要な役割を果たしている可能性を示唆している。

抄録全体を表示

好熱性シアノバクテリアT. elongatusのゲノムには光化学系II（PSII）反応中心タンパクD1（PsbA1）をコードする遺伝子が3つあり、これらの発現様式は培養条件によることが知られている。通常ではpsbA1が、光ストレスを受けるとpsbA3が発現する。PsbA1もしくはPsbA3で構成されるPSIIの性質を調べると、PsbA3-PSIIの方が酸素発生活性が1.7倍ほど高く、また阻害剤の結合やサブユニット間の相互作用の強さが違うことを見出してきた（杉浦ら、BBA, 2008&2010）。これらの違いは、PsbAを構成する344アミノ酸残基のうちの21個の違いによるとされ、特に活性の差は、一次電子受容体フェオフィチン（Ph）に近接する残基（D1-130）の違いがもたらすPhの電位差によることを電位計測から結論付けた。すなわち、PsbA3-PSIIのPhの電位が17 mVほど高く、一次電子供与体P680の電位が不変ならば、電子供与体・受容体間の自由エネルギー変化がその分大きくなっているといえ、それが活性を高めている要因だとした。しかし、自由エネルギー変化の差を熱発光分析により検討すると、単純にPhの電位変動だけでは説明できないことが分かった。そこで二次電子受容体Q_Aの電位計測を行うとこれにも差異があることを見出した。本発表ではPh・Q_A間の電子伝達特性と活性の相関を議論する。

抄録全体を表示

クラミドモナスを嫌気的かつ硫黄欠乏条件下で培養すると、Fe型ヒドロゲナーゼであるHYD1およびHYD2が誘導されて水素を発生するとされている。我々は，このモデル緑藻における種々の代謝変化を転写レベルで包括的に理解することを目指して，次世代シーケンサーを用いて解析を進めている。緑藻クラミドモナスのゲノムは121Mbpと推定されており，その遺伝子アノテーションはJGIのデータベースにまとめられているが，実際の転写産物を正確に反映していない場合がある。そこで我々は，日本で野生株として使われてきたC9株（mating-type minus）を用いてゲノムの包括的発現データベースの構築を進めている。C9株をあらかじめ従属栄養（TAP）培地で培養した細胞を，イオウ源を除いた培地に移して，約24時間培養すると水素発生を始めた。この細胞と、TAP培地で24時間通気培養した細胞から全RNAを抽出し、硫黄欠乏によるヒドロゲナーゼのmRNAレベルの発現の変化を検討した。また水素発生能が誘導される際に，発現誘導される遺伝子群を網羅的に同定するため、次世代シーケンサーGenome Analyzer IIx (Illumina)によるRNA-seqを行い、現在解析中である。

抄録全体を表示

緑藻クラミドモナスの光化学系1複合体は14種のサブユニット（PsaA-L，PsaN-O）から構成され，温和な条件下で精製すると9種のアンテナ複合体（Lha1-9）を結合する超分子複合体として得られる。クラミドモナスの光化学系1超分子複合体の一部のサブユニットは，遊離もしくは分解により精製の過程で失われやすい。したがって，完全な構造を保持した標品を得るには，短時間・温和な条件での精製法が必要である。そこで本研究では，光化学系1超分子複合体標品の精製方法を改善したので報告する。まず，野生型クラミドモナスのチラコイド膜をドデシルマルトシドで可溶化し，グリセロール濃度勾配超遠心法にかけ，光化学系1複合体を分画した。従来のショ糖密度勾配超遠心法より光化学系2複合体の混入の少ない標品が得られた。可溶化時のドデシルマルトシドの濃度を最適化すると光化学系2複合体の混入がさらに低下することが分かった。得られた標品には，PsaNとPsaO以外のサブユニットは存在した。これら2種のサブユニットを結合した標品の単離には，異なる界面活性剤を使用する必要がある。得られた標品のサブユニット組成の他に，脂質組成などの分析結果も報告する予定である。

抄録全体を表示

Sll1252はシアノバクテリアSynechocystis sp. PCC 6803の光化学系II（系II）複合体に見出された新規タンパク質である。Sll1252の機能解明のために、当該遺伝子の欠失変異体を作出し、その形質を解析した。通常培養下では、増殖速度および細胞形態には影響は見られなかった。Cl^-、Ca²⁺欠乏条件下で培養すると、変異体の増殖と酸素発生活性が大きく抑えられた。系IIの機能が抑えられたにもかかわらず、光照射下では系IIの電子受容体側はより還元的となり、系Iの電子供与体側はより酸化的となった。そして、環状電子伝達系によるP700の再酸化速度、およびシトクロムb₆/f複合体からのP700への電子伝達は遅くなっていたが、プラストシアニンからP700への電子伝達は正常であった。したがって、シトクロムb₆/f複合体にも障害が起こっていることが明らかとなった。さらに変異体では、Cl^-欠乏条件下でとくに、IsiAが増加した。これらのことから、Sll1252は光合成電子伝達経路の励起バランス調節を行うためのプラストキノンプールの酸化還元状態の感知機構に関わり、環境ストレス回避に重要であることが示された。

抄録全体を表示

Emiliania huxleyiは海洋に広く生息する単細胞藻類であり，紅藻の二次共生により生じたハプト植物門に属する．そのため，葉緑体が4枚の包膜を持つ点や，貯蔵多糖がβ‐グルカンである点など，緑色植物とは異なる特徴を持つ．我々は，先行研究において，E. huxleyiがC₃光合成を行うが，同時にβ-carboxylationによりC₄化合物を光合成初期産物として生成することを示した．E. huxleyiのESTデータベースからβ-carboxylation酵素を探索したところ，動物などの非光合成生物が持つと考えられているpyruvate carboxylase (EhPYC) の配列が見つかった．本研究では，ウェスタンブロットにより，EhPYCはタンパク質レベルで発現していることを確認し，さらに免疫染色（間接蛍光抗体法）によりEhPYCが葉緑体に局在することを示した．また，His-tagを付加したリコンビナントEhPYCは，PYC活性を示した．以上の結果より，EhPYCは偽遺伝子などではなく，実際にPYCとして葉緑体で機能していると考えられる．PYCによる葉緑体内でのC₄化合物生成はこれまでに報告がなく，今後はその生理的役割を明らかにすることが重要である．

抄録全体を表示

ショ糖合成系の律速因子である細胞質FBPaseを強化した形質転換タバコは、高CO₂環境下では側枝数、葉数が野生株より増加することを明らかにしてきた。このことは、植物体内におけるショ糖分配の変化がシグナルとなり、側枝数、葉数を制御することを示唆している。そこで、ショ糖分配の変化が側枝形成に及ぼす影響を分子レベルで明らかにするために、ラン藻由来FBPase-IIを細胞質で発現させたシロイヌナズナ(AcF)を作出し、形態形成に関わる植物ホルモン応答遺伝子群の発現解析を行った。通常CO₂(360 ppm)下ではAcF株は野生株と同様の生育を示したが、高CO₂(1000 ppm)下ではAcF株は側枝数が増加し、生重量は野生株の1.2～1.5倍に増大していた。そこで、形態変化が見られる直前の5週齢の植物体からRNAを単離し、RT-PCRにより伸長成長、腋芽形成に関わる植物ホルモンの生合成に関わる遺伝子群および植物ホルモン応答遺伝子群の発現量の比較を行った。その結果、AcF株ではNIT3（オーキシン）、IPT3, CKX4（サイトカイニン）、GA3OX1, KAO2（ジベレリン）、MAX3, CRTISO（ストリゴラクトン）等の植物ホルモン生合成系遺伝子、および種々の植物ホルモン応答遺伝子群の発現量に変化が見られた。現在、各部位からRNAを単離し、リアルタイムPCRにより詳細に解析を行っている。

抄録全体を表示

クラミドモナスでは、低CO₂条件下でピレノイドが発達し無機炭素濃縮機構(CCM)が誘導されるが、このときピレノイドデンプンも発達しgranule-bound starch synthase (GBSS)量が増加する。本研究では、GBSS I欠損株(sta2)を用いてピレノイドデンプンの発達を調べ、野生株との比較からGBSS Iの機能を推定した。野生株を連続光照射下、5% CO₂を含む空気(H-CO₂)で対数増殖期まで培養した後、0.04% CO₂を含む通常の空気(L-CO₂)に移したところ、6時間後にはピレノイドデンプンが増加するにも関わらず、culture当たりのデンプン含量はほとんど変わらないことがわかった。また、形態の変化を野生株とGBSS I欠損株で比較したところ、欠損株でもピレノイドやピレノイドデンプンはできるが、ピレノイドデンプンの厚みが薄くなることが判明した。さらに、GBSS活性は、ピレノイドデンプンの示す結晶性の高いA型結晶構造の形成に必要であることが示された。以上のことから、GBSSはピレノイドデンプンの形態と構造に影響を及ぼすことが明らかとなった。(Izumo et al., Plant Science, in press)

抄録全体を表示

海洋性珪藻Phaeodactylum tricornutumの葉緑体局在型carbonic anhydrase (PtCA1)の発現は高CO₂環境下においてcAMPを介して転写レベルで抑制されている。ptca1プロモーター領域にはCO₂/cAMP応答性配列(CCRE1-3)が存在しているが、CO₂シグナル伝達機構と転写因子の詳細はわかっていない。そこで、P. tricornutum のゲノムデータベース上に存在する8種類のヒトATF6ホモログをCCRE結合候補因子(PtbZIP1-8)とし、その解析を行なった。まず、PtbZIP1-8をクローニングし、大腸菌での発現を行なった。可溶化したPtbZIPsを分子内に導入したHisタグを使ってNi-セファロースカラムを用いて精製し、ゲルシフトアッセイを行なった。DNAプローブにはCy5標識されている、同一のCCREが5つ並んでいる配列と、CCRE1、2を含むネイティヴなプロモーター配列を用いた。その結果、PtbZIP7ではCCREs特異的な結合が見られたが、PtbZIP1、PtbZIP2においては非特異的と考えられた。続いて、PtbZIP7の局在解析とqPCRによる発現量解析の結果、CO₂濃度に関わらず、発現量は一定で核に局在していることが明らかになった。

抄録全体を表示

海洋性珪藻 Phaeodactylum tricornutum が持つ葉緑体型カーボニックアンヒドラーゼの一つ PtCA1 は、cAMP をセカンドメッセンジャーとして、転写レベルで環境 CO₂ 濃度に応答する事が知られている。我々はこれまでに、ptca1 プロモーターには三つのシスエレメント CCRE (CO₂/cAMP responsive element) が並んで存在する事、CO₂ 濃度上昇による発現抑制には、少なくとも CCRE1/2 或いは CCRE2/3 の組み合わせが必要である事を示した。また、cAMP 非依存的な CO₂ 応答性経路の存在も P. tricornutum で示唆されている。本研究では、P. tricornutum の CO₂ 応答性遺伝子候補から半定量的 RT-PCR 法により三つの低 CO₂ 発現誘導型遺伝子の CO₂ 応答性を確認した。次にプロモーター活性評価のため各遺伝子の推定プロモーター領域を単離し、それらを uidA 遺伝子と連結した後、P. tricornutum 細胞に導入し GUS レポーターアッセイを行った。その結果、距離を隔てて二つの CCRE を持つ Pptsbt4 は cAMP 依存的な CO₂ 応答性を示したが、取得領域上流のデリーション解析を行った結果、cAMP と CO₂ に応答する領域は独立していることが示唆された。

抄録全体を表示

光エネルギーを化学エネルギーに変換する光化学系タンパク質は，葉緑体チラコイド膜に存在している．葉緑体の電子顕微鏡観察によって，チラコイド膜には数層に重なる領域（グラナ）と単層で存在する領域（ストロマラメラ）があることが知られている． 生化学的解析により，グラナには光化学系2（PSII）が多く，ストロマラメラには光化学系1（PSI）が多く存在していると考えられている．PSIIとPSIが安全に，且つ効率良く機能するために，光を集めるタンパク質（LHCII）が，それぞれの間を行き来することで，光エネルギー吸収量を調節していることが示唆されている．これをステート遷移と呼び，近年の生化学的解析によって，ステート遷移時のチラコイド膜タンパク質の相互作用などが明らかとなってきた．しかし，グラナとストロマラメラといった異なる領域が存在するチラコイド膜で，LHCIIがPSIIとPSIの間を実際に行き来するといった相互作用は未だ直接観察されたことがない．本研究では，原子間力顕微鏡を用いて，チラコイド膜に存在する光化学系タンパク質をナノスケールで直接観察することを試みた．その結果，チラコイド膜のほぼ全ての領域において，光化学系タンパク質を含む膜タンパク質が密に存在している様子が観察された．これらの結果は，LHCIIの移動によるタンパク質間相互作用やエネルギー伝達経路のモデルを考える上で重要な知見となる．

抄録全体を表示

光ファイバー分光器に接続したファイバープローブを用いて、陸上植物葉内の微細光環境の測定を行った。多くの陸上植物の葉では、葉内に入射した光は、表皮や柵状組織、海綿状組織で吸収・散乱されて、上面から下面に向かって質的・量的に大きく変化すると予想される。本研究では数層の柵状組織と海綿状組織を持つソラマメ葉でこの変化を測定した。まず、散乱光を模したハロゲン光源を用いて葉上面から照射した光の変化を、葉片に垂直に下面から挿入したプローブで50μmごとに測定した。柵状組織では青色光(λ=480nm)と赤色光(λ=680nm)が効率よく吸収され、組織下面の光強度は21%に低下した。海綿状組織では緑色光(λ=550nm)も吸収されて5.8%となった。プローブを異なる角度で挿入して様々な方向の光を測定しても、散乱光源では同様の結果を得た。次に直射日光を模したレーザー光(λ=680nm)を用いて同様の実験を行った。その結果、レーザー光は上面表皮と柵状組織で散乱して、垂直方向の成分を失うが、その多くは散乱光となり、葉内下層で吸収されていた。

抄録全体を表示

AtDUR3は、窒素欠乏状態の根で高く発現し、高親和型尿素輸送の中心的な役割を担うという生理学的な役割があるが、その翻訳後制御機構や相互作用因子による活性調節など、生化学的な性質は不明な点が多い。尿素は、細胞質でウレアーゼによりアンモニウムと二酸化炭素へ速やかに分解されるので、その細胞内への輸送活性は翻訳段階で制御される可能性がある。シロイヌナズナ細胞膜タンパク質のリン酸化プロテオーム解析やリン酸化部位予測プログラムによる解析およびトポロジーの予測から、AtDUR3タンパク質のリン酸化による活性調節部位を11か所予測した。これらのアミノ酸に点変異を導入し、リン酸化と脱リン酸化を模倣した変異AtDUR3を作製した。これらの変異AtDUR3を尿素輸送欠損酵母株に形質転換し、尿素を単一の窒素源とする培地上で生育させたところ、野生型AtDUR3と比較して、変異AtDUR3を導入した酵母の相補能が変化することから、AtDUR3がリン酸化によって制御される可能性が示唆された。また、スプリットユビキチンシステムを用いて、AtDUR3と相互作用するタンパク質をシロイヌナズナcDNAライブラリーからスクリーニングし、相互作用候補として、11遺伝子を選抜した。現在、相互作用因子の共発現や、変異の導入がAtDUR3の尿素輸送能力をどのように変化させるか、安定同位体標識された尿素を用いて解析を進めている。

抄録全体を表示

植物にとって窒素は極めて重要な栄養素であり、植物における窒素同化の制御や調節の仕組みの解明は極めて重要である。我々は単細胞紅藻Cyanidioschyzon merolae（シゾン）をモデル系として、光合成真核細胞における窒素飢餓応答の解析を進めている。今回我々は、窒素飢餓時におけるシゾン細胞の挙動について観察し、色素量の減少や細胞の小型化について解析したので報告する。また遺伝子発現レベルでの窒素飢餓応答機構についても解析した。DNAマイクロアレイ解析の結果、窒素枯渇条件下において窒素同化遺伝子群と共にR2R3型MYB転写因子遺伝子(CmMYB1）の発現が誘導されることが明らかになった。また、CmMYB1のタンパク質レベルでも窒素枯渇条件下で顕著な誘導が観察され、それらの核への局在が確認された。クロマチン免疫沈降・ゲルシフト解析の結果、CmMYB1が窒素枯渇下特異的に窒素同化遺伝子群のプロモーター領域に結合していることが明らかとなった。更に、CmMYB1遺伝子欠損株においては、窒素枯渇下における窒素同化遺伝子群の発現誘導は全く観察されなかった。これらのことから、CmMYB1が窒素枯渇下において窒素同化遺伝子群の発現を正に制御している転写因子であることが明らかになった(1)。
【参考文献】
(1) Imamura et al. (2009) PNAS 106, 12548-1255

抄録全体を表示

イネ葉緑体型PEPC（Osppc4）はイネ属に特異の有機酸合成系に関与しており、炭素骨格を供給することで葉身の窒素同化に重要な役割を担っている。窒素同化におけるOsppc4の作用機作を明らかにするため、水耕液のアンモニア濃度を急激に高めた際、PEPCと窒素同化関連酵素の遺伝子発現が葉身と根でどのように変動するか調べた。
アンモニア濃度を高めると、葉身ではOsppc4とgln2（プラスチド局在性グルタミン合成酵素をコード）の発現が速やかに誘導された。Osppc2aとOsppc2b（細胞質型PEPCをコード）の発現も若干増加したが、他の遺伝子はほとんど発現誘導を受けなかった。一方根では、ほぼすべてのPEPC遺伝子、窒素同化関連遺伝子の発現が誘導されたが、Osppc4とOsppc1（根の主要な細胞質型PEPC）がもっとも速やかな発現誘導を示した。遺伝子発現誘導にともなって、Osppc4タンパク質量も増大した。以上の結果は、Osppc4が土壌中のアンモニア濃度の増加に速やかに応答してイネの窒素同化能を調節する可能性を示している。

抄録全体を表示

光化学系Iの還元側では電子が複数の経路に分配される。直鎖型と循環型電子伝達系ではそれぞれNADP+とプラストキノンを還元する。その他にアミノ酸代謝系へ還元力を供給し，さらにチオレドキシン系を還元し酵素の活性制御をする。本研究では、光化学系I及びその周辺の電子伝達が影響を受けた変異体の単離と原因遺伝子の同定をシロイヌナズナで試みた。これまでに、EMS処理M2種子から生育した個体の蛍光誘導期現象をPAMによりスクリーニングし，光化学系IIの還元型QAの再酸化が遅延した系統を単離した。この中の2系統である32-33及び7-2-33について、原因遺伝子の同定をマップベースクローニングで行った結果、両系統でフェレドキシン依存性グルタミン酸合成酵素(Fd-GOGAT)をコードするGUL1にアミノ酸置換変異が見つかった。GUL1の過剰発現により32-33の蛍光誘導期現象は正常に戻ることから、原因遺伝子はGULであると結論した。32-33ではFd-GOGATの蓄積量がクロロフィル当たりで25％程度に減少し，泳動度もわずかに小さい。一方、光化学系I、光化学系II、シトクロームb6fの蓄積量は野生型と大きく変わらなかった。現在、変異体の光化学系I還元側の電子伝達活性を詳細に調べるため、P700の酸化還元速度を解析中で、その結果についても報告する予定である。

抄録全体を表示

Self-incompatibility (SI) is widespread in flowering plants as a genetic system to prevent self-fertilization. We now know that SI is controlled by a single multi-allelic locus (named S-locus). In the Brassicaceae, SI is determined by the female determinant SRK (S-locus receptor kinase) expressing on stigmatic papilla cells and its ligand and the male determinant SP11 (S-locus protein 11) on the surface of pollen grains. When self-pollen attaches on the papilla cell surface, interaction between SRK and SP11 activates an SI signal to reject self-pollen. It is also known that SI can be overcome by supplying 4-5% CO₂ gas, and this method has been effectively used on the large-scale production of parental inbred lines in F₁-hybrid breeding. However, nearly nothing is known about the molecular mechanism of the SI breakdown system by the CO₂ treatment.
In this study two inbred lines of Brassica rapa with different reaction level of SI to CO₂ and their F₁ and F₂ progeny were used, looking for new insights into the SI overcome induced by the CO₂ treatment. Our results indicate that the CO₂ sensitivity is S-haplotype independent and further investigation is in progess.

抄録全体を表示